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包含抗HB-EGF抗体作为活性成分的药物组合物
技术领域
本发明涉及治疗癌症的方法和抗癌剂。
发明背景
可结合肝素的表皮生长因子样生长因子，或HB-EGF，是属于EGF配体家族的一种生长因子。HB-EGF基因敲除小鼠显示非常有害的表型，如心脏功能衰竭伴心脏肥大和出生后快速死亡(非专利文献1)。这表明HB-EGF对于妊娠期间心脏的形成做出了极大的贡献。另一方面，在成年人中，其表达分布在较广范围的组织中，如肺、心脏、脑和骨骼肌中(非专利文献2)，HB-EGF不仅在妊娠期间，而且在维持成年人的生物功能方面，都具有非常重要的作用(非专利文献3)。
HB-EGF在体内以两种不同的结构存在：在表达HB-EGF的细胞的细胞表面表达的膜结合HB-EGF(下文称为proHB-EGF)和不含细胞的分泌型(下文称为sHB-EGF或活性型HB-EGF)。图1示意性地显示了proHB-EGF和sHB-EGF的结构。proHB-EGF前体蛋白由208个氨基酸组成，从N-末端开始，由信号肽、前肽、肝素结合域、EGF样结构域、近膜结构域、跨膜结构域和胞质域组成。信号肽从proHB-EGF前体蛋白上裂解下来导致proHB-EGF的作为1型跨膜蛋白质表达。随后，proHB-EGF受到蛋白酶的消化，这被称为胞外域脱落，由73-87个氨基酸残基组成的sHB-EGF被释放到胞外环境中。这种sHB-EGF仅由肝素结合域和EGF样结构域这两个结构域组成，并作为活性配体结合EGF受体(Her1)和EGF受体4(Her4)。这导致通过下游的ERK/MAPK信号路径，在例如NIH3T3细胞、平滑肌细胞、上皮细胞、角化细胞、肾小管细胞等多种细胞中诱导增殖(非专利文献4)。由于将突变引入参与胞外域脱落的区域内，只表达proHB-EGF的细胞发生增殖能力的实质性减少。另外，只表达proHB-EGF的转基因小鼠具有与HB-EGF敲除小鼠同样的表型。基于这些发现，作为生长因子的HB-EGF的功能被认为主要由分泌型HB-EGF承担(非专利文献5和6)。
另一方面，也知道proHB-EGF在体内具有不同于sHB-EGF的独特功能。即，起初已知proHB-EGF作为白喉毒素(DT)的受体发挥功能(非专利文献7和8)。但是，随后的研究证明proHB-EGF在细胞表面与诸如DRAP27/CD9的分子以及整联蛋白α₃β₁和硫酸肝素形成复合物，并参与细胞粘附和迁移。也已表明通过EGF受体(下文称为EGFR)经近分泌机制作用，proHB-EGF抑制邻近细胞的生长并诱导邻近细胞的死亡。因此，关于HB-EGF作为EGFR配体的作用方面，已知膜结合proHB-EGF和分泌型sHB-EGF传送完全相反的信号(非专利文献5和8)。
HB-EGF对例如癌细胞的多种细胞株的细胞增殖、细胞运动和浸润具有强烈的促进活性。另外，已报道广泛范围的癌症类型(例如，胰癌、肝癌、食道癌、黑素瘤、结直肠癌、胃癌、卵巢癌、子宫颈癌、乳癌、膀胱癌和脑瘤)比正常组织中的HB-EGF表达增加，提示HB-EGF深入地参与了癌增生或恶性转化(非专利文献4和10)。
因此，基于这些发现，继续研究通过抑制HB-EGF活性抑制癌细胞生长。对于使用抗HB-EGF中和抗体抑制HB-EGF作用的努力，尤其报道了以下效应：对3T3细胞中的DNA合成的抑制(非专利文献11)，对角化细胞生长的抑制(非专利文献12)、对神经胶质瘤细胞生长的抑制(非专利文献13)和对骨髓瘤细胞中的DNA合成的抑制(非专利文献14)。
同时，也已继续研究了特异性结合HB-EGF的减毒白喉毒素(CRM197)作为HB-EGF抑制剂的应用。事实上，在小鼠异种移植模型(移植有卵巢癌细胞株)上的有效性测试中，接受CRM197的组呈现出较好的肿瘤缩小效应(非专利文献15)。另外，也使用CRM197在癌症患者中进行了临床试验(非专利文献16)。
本说明书中引用的参考文献在下面列出。本文完整引用这些文献的内容作为参考。没有承认这些文献作为本发明的现有技术：
非专利文献1：Iwamoto R，Yamazaki S，Asakura M等人，Heparin-binding EGF-like growth factor and ErbB signaling is essentialfor heart function.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2003；100：3221-6.
非专利文献2：Abraham JA，Damm D，Bajardi A，Miller J，Klagsbrun M，Ezekowitz RA.Heparin-binding EGF-like growth factor：characterization of rat and mouse cDNA clones，protein domainconservation across species，and transcript expression in tissues.Biochem Biophys Res Commun，1993；190：125-33.
非专利文献3：Karen M.，Frontiers in Bioscience，3，288-299，1998.
非专利文献4：Raab G，Klagsbrun M.Heparin-binding EGF-likegrowth factor.Biochim Biophys Acta，1997；1333：F179-99.
非专利文献5：Yamazaki S，Iwamoto R，Saeki K等人，Mice withdefects in HB-EGF ectodomain shedding show severe developmentalabnormalities.J Cell Biol，2003；163：469-75.
非专利文献6：Ongusaha P.，Cancer Res，(2004)64，5283-5290.
非专利文献7：Iwamoto R.，Higashiyama S.，EMBO J.13，2322-2330(1994).
非专利文献8：Naglich JG.，Metherall JE.，Cell，69，1051-1061(1992).
非专利文献9：Iwamoto R，Handa K，Mekada E.Contact-dependentgrowth inhibition and apoptosis of epidermal growth factor(EGF)receptor-expressing cells by the membrane-anchored form ofheparin-binding EGF-like growth factor.J.Biol.Chem.1999；274：25906-12.
非专利文献10：Miyamoto S，Cancer Sci.97，341-347(2006).
非专利文献11：Blotnick S.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，(1994)91，2890-2894.
非专利文献12：Hashimoto K.，J.Biol.Chem.(1994)269，20060-20066.
非专利文献13：Mishima K.，Act Neuropathol.(1998)96，322-328.
非专利文献14：Wang YD.Oncogene，(2002)21，2584-2592.
非专利文献15：Miyamoto S.，Cancer Res.(2004)64，5720-
非专利文献16：Buzzi S.，Cancer Immunol Immunother，(2004)53，1041-1048.
发明内容
本发明的一个目的是提供一种新型的包含抗HB-EGF抗体的药物组合物。更具体的目的是提供一种使用抗HB-EGF抗体、包含抗HB-EGF抗体的新型细胞增殖抑制剂、包含抗HB-EGF抗体的新型抗癌剂以及新型抗HB-EGF抗体治疗癌症的新方法。
本发明人已发现抗HB-EGF(其是一种在癌细胞中高度表达的蛋白质)的抗体显示内化活性。本发明人也已发现抗HB-EGF抗体显示抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖的细胞介导的细胞毒性(CDC)。基于这些发现，本发明人也发现抗HB-EGF抗体对于治疗HB-EGF表达上调的癌症(最明显的是卵巢癌)有效，由此实现了本发明。
当本发明人通过用HB-EGF蛋白免疫小鼠产生单克隆抗体时，他们发现获得的抗体具有内化活性。另外，当细胞毒性物质与获得的内化抗HB-EGF抗体结合并测定细胞死亡诱导活性时，注意到显著的细胞死亡诱导活性。而且，当测定获得的抗HB-EGF抗体的ADCC活性和CDC活性时，发现抗HB-EGF抗体显示ADCC活性和/或CDC活性。
因此，本申请提供了选自下面的(1)-(24)的单克隆抗体和低分子量抗体衍生物：
(1)一种具有内化活性的抗HB-EGF抗体；
(2)一种结合有细胞毒性物质的抗HB-EGF抗体；
(3)具有内化活性的如(2)所述的抗体；
(4)一种具有ADCC活性或CDC活性的抗HB-EGF抗体；
(5)进一步具有内化活性的如(1)-(4)中任一项所述的抗体；
(6)一种选自下面的[1]-[13]的抗体：
[1]包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：14的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：16的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：18的氨基酸序列的重链可变区的抗体；
[2]包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：20的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：22的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：24的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
[3]包含如[1]所述的重链和如[2]所述的轻链的抗体；
[4]包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：26的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：28的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：30的氨基酸序列的重链可变区的抗体；
[5]包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：32的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：34的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：36的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
[6]包含如[4]所述的重链和如[5]所述的轻链的抗体；
[7]包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：76的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：77的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：78的氨基酸序列的重链可变区(HE-39H链)的抗体；
[8]包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：79的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：80的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：81的氨基酸序列的轻链可变区(HE-39L链-1)的抗体；
[9]包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：82的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：83的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：84的氨基酸序列的轻链可变区(HE-39L链-2)的抗体；
[10]包含如[7]所述的重链和如[8]所述的轻链的抗体；
[11]包含如[7]所述的重链和如[9]所述的轻链的抗体；
[12]具有与[1]-[11]中任一项所述抗体的活性相当的活性的抗体；和
[13]与[1]-[12]中任一项所述的抗体结合相同的表位的抗体。
(7)一种包含如(1)-(6)中任一项所述的抗体的药物组合物；
(8)一种包含结合在如(1)-(6)中任一项所述的抗体上的细胞毒性物质的药物组合物；
(9)如(7)或(8)所述的药物组合物，其是细胞增殖抑制剂；
(10)如(9)所述的药物组合物，其是抗癌剂；
(11)如(10)所述的药物组合物，其中，所述癌症是胰癌、肝癌、食道癌、黑素瘤、结直肠癌、胃癌、卵巢癌、子宫颈癌、乳癌、膀胱癌、脑瘤或血液癌；
(12)一种利用抗HB-EGF抗体将细胞毒性物质递送到细胞内的方法；
(13)一种用结合在抗HB-EGF抗体上的细胞毒性物质抑制细胞增殖的方法；
(14)如(13)所述的方法，其中，所述细胞是癌细胞；
(15)如(12)-(14)中的任一项所述的方法，其中，所述细胞毒性物质是化学治疗剂、放射性物质或毒性肽；
(16)抗HB-EGF抗体将细胞毒性物质转运到细胞内的用途；
(17)具有内化活性的抗HB-EGF抗体在抑制细胞增殖中的用途；
(18)如(17)所述的用途，其中，所述抗HB-EGF抗体进一步包含中和活性；
(19)如(18)所述的用途，其中，所述抗HB-EGF抗体进一步包含ADCC活性或CDC活性；
(20)如(16)-(19)中的任一项所述的用途，其中，所述细胞是癌细胞；
(21)如(16)-(19)中的任一项所述的用途，其中，所述细胞毒性物质结合在抗HB-EGF抗体上；
(22)一种制备药物组合物的方法，包括以下步骤：
(a)提供抗HB-EGF抗体；
(b)确定(a)的抗体是否具有内化活性；
(c)选择具有内化活性的抗体；和
(d)将细胞毒性物质结合于(c)中选择的抗体上；
(23)如(22)所述的制备方法，其中，所述药物组合物是抗癌剂；
(24)一种使用抗HB-EGF抗体诊断癌症的方法；
(25)如(24)所述的诊断方法，包括使用结合有标记物质的抗HB-EGF抗体；
(26)如(24)或(25)所述的诊断方法，其中，检测掺入细胞内的抗HB-EGF抗体；
(27)一种结合有标记物质的抗HB-EGF抗体；
(28)如(27)所述的抗体，其具有内化活性。

附图简述
图1是示意性地描述用作免疫原的proHB-EGF、sHB-EGF和HB-EGF Fc的结构的图；
图2a是示意性地描述HB-EGF与EGFR Ba/F3细胞结合的影响的图；
图2b是显示EGFR Ba/F3细胞增殖对HB-EGF浓度的依赖性的曲线图；
图3a是显示HB-EGF抗体(HA-1、HA-3、HA-9、HA-10和HA-20)对EGFR_Ba/F3细胞的HB-EGF依赖性生长的中和活性的曲线图；
图3b是显示HB-EGF抗体(HB-10、HB-13、HB-20、HB-22和HC-74)对EGFR Ba/F3细胞的HB-EGF依赖性生长的中和活性的曲线图；
图3c是显示HB-EGF抗体(HC-15、HC-19、HC-26和HC-42)对EGFR_Ba/F3细胞的HB-EGF依赖性生长的中和活性的曲线图；
图4是HB-EGF中和抗体的可变区序列的比较；
图5是显示抗体HA-20、HB-20和HC-15对活性型HB-EGF的结合活性的曲线图；
图6是显示抗体HA-20、HB-20和HC-15对proHB-EGF的结合活性的图；
图7是显示HB-EGF抗体抑制固相上HB-EGF与EGFR之间的结合的示意图；
图8是显示对于EGFR/HB-EGF结合模式的基于ELISA的分析模型的示意图；
图9是显示在对于EGFR/HB-EGF结合模式的基于ELISA的分析模型中检测到的HB-EGF浓度曲线的图；
图10是显示抗体HA-20、HB-20和HC-15抑制HB-EGF与EGFR结合的图；
图11是比较抗体HA-20、HB-20和HC-15抑制EGFR_Ba/F3细胞的生长的曲线图；
图12a是显示在含有8％FCS的培养基中，抗体HA-20、HB-20和HC-15抑制卵巢癌细胞株RMG-1的生长的图；
图12b是显示在含有2％FCS的培养基中，抗体HA-20、HB-20和HC-15抑制卵巢癌细胞株RMG-1的生长的图；
图13是通过将结合抗原的抗体(HB-EGF靶向抗体与肥皂草毒蛋白(saporin)标记抗体的复合物)内化到细胞内而诱导细胞死亡的过程的示意图；
图14是显示HA-20、HB-20和HC-15抗体诱导SKOV-3细胞(原始细胞株)和HB-EGF_SKOV3细胞(HB-EGF高表达的SKOV-3细胞)细胞死亡的内化介导的活性的图；
图15是显示HA-20、HB-20和HC-15抗体对ES-2细胞上的HB-EGF的结合活性的图；
图16是显示HA-20、HB-20和HC-15对ES-2卵巢癌细胞的内化介导的细胞死亡诱导活性的图；
图17显示对卵巢癌细胞株(RMG-1、MCAS)表达HB-EGF的FACS分析的图；
图18是在软琼脂集落形成试验中，分析抗体HA-20和HC-15抑制RMG-1细胞增殖的中和活性的图；
图19是在软琼脂集落形成试验中，分析抗体HA-20和HC-15对RMG-1卵巢癌细胞的内化介导的增殖抑制活性的图；
图20是在软琼脂集落形成试验中，分析抗体HA-20和HC-15对MCAS卵巢癌细胞的内化介导的增殖抑制活性的图；
图21显示对几种血液癌细胞株表达HB-EGF的FACS分析的图；
图22显示HA-20和HC-15抗体对几种血液癌细胞株的内化介导的增殖抑制；
图23a是分析肥皂草毒蛋白标记的HA-20抗体(HA-SAP)、肥皂草毒蛋白标记的HC-15抗体(HC-SAP)和肥皂草毒蛋白标记的对照抗体(IgG-SAP)显示的对各种实体癌细胞株和正常人内皮细胞的增殖抑制活性的图；
图23b是分析肥皂草毒蛋白标记的HA-20抗体(HA-SAP)和肥皂草毒蛋白标记的HC-15抗体(HC-SAP)显示的对各种血液癌细胞株的增殖抑制活性的图；
图24是将抗体HE-39对活性型HB-EGF的结合活性与抗体HA-20、HB-20及HC-15对活性型HB-EGF的结合活性进行比较的曲线图；
图25是显示抗体HE-39和抗体HA-20、HB-20及HC-15对在DG44细胞中过量表达的proHB-EGF的结合活性的图；
图26是显示HA-20、HB-20、HC-15和HE-39抗体抑制HB-EGF与EGFR结合的能力的曲线图；
图27显示比较HA-20、HB-20、HC-15和HE-39抗体显示的对EGFR_Ba/F3细胞的生长抑制活性的曲线图；
图28是HE-39抗体的可变区序列的比较；
图29a显示通过对HE-39抗体进行另外的有限稀释而获得的单克隆抗体(HE39-1、HE39-5、HE39-14)对DG44细胞中过量表达的proHB-EGF的结合活性；
图29b是一张图片，其中，对于HE-39抗体经另外的有限稀释获得的单克隆抗体(HE39-1、HE39-5、HE39-14)，通过RT-PCR确认各个可变区(VH、VL-1、VL-2)的表达；
图30是显示抗体HE-39、HA-20和HC-15显示的对HB-EGF_DG44细胞的内化介导的细胞死亡诱导活性的图；
图31a是示意性地显示HB-EGF的结构(上图)、GST蛋白质与成熟HB-EGF或各个结构域(肝素结合域、EGF样结构域)之间的融合蛋白的结构(下图)的图；
图31b显示在大肠杆菌(E.coli)中表达的GST融合蛋白的SDS-PAGE和CBB染色(左侧)及用HE-39抗体进行Western印迹分析(右侧)的结果；
图32a显示HB-EGF的EGF样结构域(EGFD)的氨基酸序列和分成3个片段(EGFD5、EGFD6、EGFD7)的EGF样结构域的氨基酸序列；这些序列与GST蛋白质的C末端融合用于表位作图；
图32b显示在大肠杆菌中表达的GST融合蛋白(GST-EGFD、GST-EGFD5、GST-EGFD6、GST-EGFD7)的SDS-PAGE和CBB染色(左图)及用HE-39抗体进行Western印迹分析(右图)的结果；
图33a是各种抗HB-EGF抗体显示的对在Ba/F3细胞中过量表达的HB-EGF的结合活性的FACS分析图；在纵轴上显示作为G-平均值的荧光强度；和
图33b显示各种抗HB-EGF抗体显示的对HB-EGF_Ba/F3细胞的ADCC活性(上图)和各种抗HB-EGF抗体显示的对HB-EGF_Ba/F3细胞的CDC活性(下图)；纵轴显示由于ADCC介导的或CDC介导的细胞毒性而从细胞中释放的铬的量。
发明优选的实施方式
HB-EGF的分子形式
HB-EGF是属于EGF配体家族的一种生长因子；编码人HB-EGF的基因的序列以GenBank登记号NM_001945(SEQ ID NO：49)公开，HB-EGF的氨基酸序列以GenBank登记号NP_001936(SEQ IDNO：50)公开。在本发明的范围内，“HB-EGF蛋白”是包括全长蛋白质及其片段的术语。在本发明的范围内，“片段”指包含HB-EGF蛋白质的任何区域的多肽，其中，该片段可能不显示天然存在的HB-EGF蛋白的功能。
在本文用作片段的特定实施方式的sHB-EGF是由73-87个氨基酸残基组成的分子，并且当在表达HB-EGF的细胞的细胞表面上表达的proHB-EGF在被称为胞外域脱落的过程中被蛋白酶裂解时，在体内产生。已知多种sHB-EGF分子；这些sHB-EGF分子具有下面的结构：其中，羧基末端是位于proHB-EGF分子中的第149位点的脯氨酸残基，proHB-EGF分子由SEQ ID NO：50所示的208个氨基酸组成，而氨基末端是位于proHB-EGF分子中的第63位点的天冬酰胺残基、位于proHB-EGF分子中的第73位点的精氨酸残基、位于proHB-EGF分子中的第74位点的缬氨酸残基或位于proHB-EGF分子中的第77位点的丝氨酸残基。
抗HB-EGF抗体
本发明的抗HB-EGF抗体是可结合HB-EGF蛋白的抗体，但对其来源(小鼠、大鼠、人类等)、类型(单克隆抗体、多克隆抗体)和构型(工程抗体、低分子量抗体、修饰抗体等)没有限制。
用于本发明的抗HB-EGF抗体优选地特异性结合HB-EGF。用于本发明的抗HB-EGF抗体也优选地是单克隆抗体。
具有内化活性的抗体是用于本发明的抗体的一种优选实施方式。“具有内化活性的抗体”指一经结合细胞表面上的HB-EGF就被转运到细胞(细胞质、囊泡、其它细胞器等)内的抗体。
可以使用本领域的技术人员已知的方法确定抗体的内化活性的存在/不存在。例如，可以通过以下步骤来测定内化活性：将结合标记物的抗HB-EGF抗体接触表达HB-EGF的细胞，并检查标记物是否掺入细胞内；或将结合细胞毒素的抗HB-EGF抗体接触表达HB-EGF的细胞，并检查在表达HB-EGF的细胞中是否诱导细胞死亡。更具体地说，例如，可以使用下文提供的实施例中所述的方法确定抗体的内化活性的存在/不存在。
在抗HB-EGF抗体具有内化活性的情况下，抗HB-EGF抗体优选地是能够结合proHB-EGF的抗体，更优选地是比结合sHB-EGF更强烈地结合proHB-EGF的抗体。
细胞毒性物质
用于本发明的抗体的另一种优选的实施方式是结合有细胞毒性物质的抗体。这样的结合有细胞毒性物质的抗体可以掺入细胞内，导致细胞毒性物质介导的已掺入抗体的细胞死亡的诱导。因此，结合有细胞毒性物质的抗体优选地也具有内化活性。
用于本发明的细胞毒性物质可以是能够诱导细胞的细胞死亡的任何物质，且可以包括毒素、放射性物质、化疗剂等。用于本发明的细胞毒性物质包括前药，其在体内经历向活性细胞毒性物质的转化。可以经过酶转化或非酶转化来进行前药活化。
在本发明的内容中，毒素指微生物、动物或植物来源的各种细胞毒性蛋白质多肽等。用于本发明的毒素可以包括以下：白喉毒素A链(Langone J.J.等人，Methods in Enzymology，93，307-308，1983)、假单胞菌外毒素(Nature Medicine，2，350-353，1996)、蓖麻毒蛋白A链(Fulton R.J.等人，J.Biol.Chem.，261，5314-5319，1986；Sivam G.，等人，Cancer Res.，47，3169-3173，1987；Cumber A.J.等人，J.Immunol.Methods，135，15-24，1990；Wawrzynczak E.J.等人，Cancer Res.，50，7519-7562，1990；Gheeite V.等人，J.Immunol.Methods，142，223-230，1991)、去糖基化蓖麻毒蛋白A链(Thorpe P.E.等人，Cancer Res.，47，5924-5931，1987)、相思豆毒蛋白A链(Wawrzynczak E.J.等人，Br.J.Cancer，66，361-366，1992；Wawrzynczak E.J.等人，Cancer Res.，50，7519-7562，1990；Sivam G.等人，Cancer Res.，47，3169-3173，1987；Thorpe P.E.等人，Cancer Res.，47，5924-5931，1987)、多花白树毒蛋白(gelonin)(Sivam G.等人，Cancer Res.，47，3169-3173，1987；Cumber A.J.等人，J.Immunol.Methods，135，15-24，1990；Wawrzynczak E.J.等人，Cancer Res.，50，7519-7562，1990；Bolognesi A.等人，Clin.Exp.Immunol.，89，341-346，1992)、PAP-s(来自种子的美洲商陆抗病毒蛋白；Bolognesi A.等人，Clin.Exp.Immunol.，89，341-346，1992)、briodin(Bolognesi A.等人，Clin.Exp.Immunol.，89，341-346，1992)、肥皂草毒蛋白(Bolognesi A.等人，Clin.Exp.Immunol.，89，341-346，1992)、苦瓜毒蛋白(momordin)(Cumber A.J.等人，J.Immunol.Methods，135，15-24，1990；Wawrzynczak E.J.等人，CancerRes.，50，7519-7562，1990；Bolognesi A.等人，Clin.Exp.Immunol.，89，341-346，1992)、木鳖子蛋白(momorcochin)(Bolognesi A.等人，Clin.Exp.Immunol.，89，341-346，1992)、香石竹毒蛋白(dianthin)32(Bolognesi A.等人，Clin.Exp.Immunol.，89，341-346，1992)、香石竹毒蛋白30(Stirpe F.，Barbieri L.，FEBS Letter，195，1-8，1986)、塑莲根毒蛋白II(modeccin)(Stirpe F.，Barbieri L.，FEBS Letter，195，1-8，1986)、槲寄生毒蛋白(viscumin)(Stirpe F.，Barbieri L.，FEBS Letter，195，1-8，1986)、塑莲根毒蛋白I(volkesin)(Stirpe F.，Barbieri L.，FEBS Letter，195，1-8，1986)、商陆毒蛋白(dodecandrin)(Stirpe F.，Barbieri L.，FEBS Letter，195，1-8，1986)、小麦毒蛋白(tritin)(StirpeF.，Barbieri L.，FEBS Letter，195，1-8，1986)、软瓜蛋白(luffin)(StirpeF.，Barbieri L.，FEBS Letter，195，1-8，1986)和括蒌种子毒蛋白(trichokirin)(Casellas P.，等人，Eur.J.Biochem.，176，581-588，1988；Bolognesi A.等人，Clin.Exp.Immunol.，89，341-346，1992)。
本发明中的放射性物质指含有放射性同位素的物质。对放射性同位素没有特别的限制，可以使用任何放射性同位素。可用的放射性同位素的例子是³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H、¹³¹I、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re等。
本发明中的化疗剂指除了上文列举的毒素和放射性物质之外的细胞毒性物质，包括：例如，细胞因子、抗肿瘤药、酶等。用于本发明的化疗剂没有特别限制，但优选低分子量的化疗剂。据信，低分子量的化疗剂具有较低的干扰抗体功能的可能性，甚至在化疗剂已结合抗体之后依然如此。在本发明的内容中，低分子量的化疗剂一般指100-2000的分子量，优选200-1000的分子量。对本发明中的化疗剂没有特别的限制，可用的化疗剂的例子如下：美法仑(melphalan)(Rowland G.F.等人，Nature，255，487-488，1975)、顺铂(cis-platinum)(Hurwitz E.和Haimovich J.，Method in Enzymology，178，369-375，1986；Schechter B.等人，Int.J.Cancer，48，167-172，1991)、卡白(carboplatin)(Ota Y.等人，Asia-Oceania J.Obstet.Gynaecol.，19，449-457，1993)、丝裂霉素C(mitomycin C)(NoguchiA.等人，Bioconjugate Chem.，3，132-137，1992)、阿霉素(多柔比星)(Shih L.B.等人，Cancer Res.，51，4192-4198，1991；Zhu Z.等人，Cancer Immunol.Immunother.，40，257-267，1995；Trail P.A.等人，Science，261，212-215，1993；Zhu Z.等人，Cancer Immunol.Immunother.，40，257-267，1995；Kondo Y.等人，Jpn.J.Cancer Res.，86，1072-1079，1995；Zhu Z.等人，Cancer Immunol.Immunother.，40，257-267，1995；Zhu Z.等人，Cancer Immunol.Immunother.，40，257-267，1995)、柔红霉素(daunorubicin)(Dillman R.O.等人，CancerRes.，48，6097-6102，1988；Hudecz F.等人，Bioconjugate Chem.，1，197-204，1990；Tukada Y.等人，J.Natl.Cancer Inst.，75，721-729，1984)、博来霉素(bleomycin)(Manabe Y.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，115，1009-1014，1983)、新制癌菌素(neocarzinostatin)(Kitamura K.等人，Cancer Immunol.Immunother.，36，177-184，1993；Yamaguchi T.等人，Jpn.J.Cancer Res.，85，167-171，1994)、氨甲蝶呤(methotrexate)(Kralovec J.等人，Cancer Immunol.Immunother.，29，293-302，1989；Kulkarni P.N.等人，Cancer Res.，41，2700-2706，1981；Shin L.B.等人，Int.J.Cancer，41，832-839，1988；Gamett M.C.等人，Int.J.Cancer，31，661-670，1983)、5-氟尿苷(5-fluorouridine)(Shin L.B.Int.J.Cancer，46，1101-1106，1990)、5-氟-2′-脱氧尿苷(deoxyuridine)(Goerlach A.等人，Bioconjugate Chem.，2，96-101，1991)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)(Hurwitz E.等人，J.Med.Chem.，28，137-140，1985)、氨基蝶呤(aminopterin)(Kanellos J.等人，Immunol.Cell.Biol.，65，483-493，1987)、长春新碱(vincristine)(Johnson J.R.等人，Br.J.Cancer，42，17，1980)、长春地辛(vindesine)(Johnson J.R.等人，Br.J.Cancer，44，472-475，1981)、白介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、干扰素(INF)、羧肽酶(carboxypeptidase)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)、β-内酰胺酶(lactamase)和胞苷脱氨酶(cytidine deaminase)。
本发明可以使用一种细胞毒性物质或两种或多种细胞毒性物质的组合。
上述细胞毒性物质可以通过共价键或非共价键与抗HB-EGF抗体结合或偶联。制备与这些细胞毒性物质结合的抗体的方法是公知的。
细胞毒性物质可以通过例如这些物质本身存在的连接基团直接结合抗HB-EGF抗体，或者可以通过如连接体或中间支持体(intermediary support)的另一种物质间接结合抗HB-EGF抗体。在抗HB-EGF抗体与细胞毒性物质直接结合的情况下，连接基团包括基于利用SH基团的二硫键。具体来说，抗体的Fc区域内的分子内二硫键可以用如二硫苏糖醇的还原剂还原；细胞毒性物质中的二硫键可以被类似地还原；且两个物质可以通过二硫键彼此连接。可以通过用如Ellman试剂的活化促进剂初步活化抗体或细胞毒性物质以促进两个物质之间的二硫键的形成。用于实现抗HB-EGF抗体与细胞毒性物质之间直接结合的其它方法的例子如下：使用席夫碱(Schiff base)的方法、碳二亚胺法、活性酯法(N-羟基琥珀酰亚胺法)、使用混合酐的方法和使用重氮反应的方法。
也可以通过经另一种物质的间接结合实现抗HB-EGF抗体与细胞毒性物质之间的结合。对于用于间接结合的其它物质没有特别的限制，该其它物质可以包括具有至少两个选自氨基、羧基、巯基等的基团(包括单一类型或两个或多个类型的组合)的化合物，也可以包括肽连接体和具有结合抗HB-EGF抗体的能力的化合物。下面是具有至少两个选自氨基、羧基、巯基等的基团(包括单一类型或两个或多个类型的组合)的化合物的例子：N-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP；Wawrzynczak E.J.等人，Cancer Res.，50，7519-7562，1990；Thorpe P.E.等人，Cancer Res.，47，5924-5931，1987)、琥珀酰亚胺6-(3-[2-吡啶二硫基]丙酰胺基)己酸酯(LC-SPDP；Hermanson G.T.，BIOCONJUGATE Techniques，230-232，1996)、磺基琥珀酰亚胺6-(3-[2-吡啶二硫基]丙酰胺基)己酸酯(磺基-LC-SPDP；Hermanson G.T.，BIOCONJUGATE Techniques，230-232，1996)、N-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫基)丁酸酯(SPDB；Wawrzynczak E.J.等人，Br.J.Cancer，66，361-366，1992)、琥珀酰亚胺氧羰基-α-(2-吡啶二硫基)甲苯(SMPT；Thorpe P.E.等人，Cancer Res.，47，5924-5931，1987)、琥珀酰亚胺6-(α-甲基-[2-吡啶二硫基]甲苯酰胺)己酸酯(LC-SMPT；Hermanson G.T.，BIOCONJUGATE Techniques，232-235，1996)、磺基琥珀酰亚胺6-(α-甲基-[2-吡啶二硫基]甲苯酰胺)己酸酯(磺基-LC-SMPT；Hermanson G.T.，BIOCONJUGATE Techniques，232-235，1996)、琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺苯基)丁酸酯(SMPB；Hermanson G.T.，BIOCONJUGA TE Techniques，242-243，1996)、磺基-琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺苯基)丁酸酯(磺基-SMPB；Hermanson G.T.，BIOCONJUGATE Techniques，242-243，1996)、间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS；Hermanson G.T.，BIOCONJUGATE Techniques，237-238，1996)、间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-MBS；Hermanson G.T.，BIOCONJUGATE Techniques，237-238，1996)、S-乙酰基巯基琥珀酸酐(SAMSA；Casellas P.等人，Eur.J.Biochem.，176，581-588，1988)、3，3’-二硫代双丙亚氨酸二甲酯(dimethyl 3，3′-dithiobispropionimidate)(DTBP；Casellas P.等人，Eur.J.Biochem.，176，581-588，1988)、2-亚氨基硫杂环戊烷(2-iminothiolane)(Thorpe P.E.等人，Cancer Res.，47，5924-5931，1987)等。
能够用来将HB-EGF抗体与细胞毒性物质结合的其它物质的例子是肽、抗体、聚-L-谷氨酸(PGA)、羧甲基葡聚糖、葡聚糖、氨基葡聚糖、抗生物素蛋白-生物素、顺乌头酸、谷氨酸二酰肼、人血清白蛋白(HSA)等。
另外，也可以通过基因工程技术将细胞毒性蛋白质结合在抗体上。作为具体的实例，可以将上述编码细胞毒性肽的DNA与编码抗HB-EGF抗体的DNA符合读框地融合，且可以通过并入表达载体内构建重组载体。将载体转染到合适的宿主细胞内，并培养产生的转化细胞，以表达并入的DNA并获得包含与毒性肽结合的抗HB-EGF抗体的融合蛋白。在制备具有抗体的融合蛋白时，药物蛋白质或蛋白质毒素一般位于抗体的C-末端侧。另外，肽连接体可以介于抗体和药物蛋白或蛋白质毒素之间。
中和活性
用于本发明的抗HB-EGF抗体可以具有中和活性。
中和活性一般指抑制显示对细胞具有生物活性的配体的生物活性的能力，激动剂为这样的配体的一个例子。因此，具有中和活性的物质指与这样的配体结合或与结合该配体的受体结合从而抑制该配体或该受体的结合的物质。由于中和活性而被阻止与配体结合的受体于是不能表现出通过该受体进行的生物活性。显示这样的中和活性的抗体一般称为中和抗体。可以通过将在配体和测试物质存在下的生物活性与在存在配体而不存在测试物质的情况下的生物活性进行比较，测定特定测试物质的中和活性。
EGF受体被认为是此处所述的HB-EGF的主要受体。在这种情况下，由于配体的结合形成二聚体，因而酪氨酸激酶(它是细胞内的自身结构域)被活化。活化的酪氨酸激酶导致通过自身磷酸化形成磷酸化的含酪氨酸的肽，各种信号转导辅助分子与该肽结合。主要有PLCγ(磷脂酶Cγ)、Shc、Grb2等。在这些辅助分子中，前两者另外还被EGF受体的酪氨酸激酶磷酸化。从EGF受体信号转导的主要路径是磷酸化沿Shc、Grb2、Sos、Ras、Raf/MAPK激酶/MAP激酶的顺序转导的路径。此外还认为存在从PLCγ到PKC的路径，这是第二路径。这种细胞内的信号级联在每种细胞类型中是不同的，因而可以为每种需要的靶细胞确定合适的靶分子。对于上述的因素没有限制。可以通过测定体内信号活化评价中和活性。可以适当地使用用于测定体内信号活化的可商购的试剂盒(例如，来自GEHealthcare Biosciences的蛋白激酶C活化测定系统)。
也可以通过集中于位于体内信号级联下游的靶基因的转录的诱导来检测体内信号活化。使用报道分子测定概念检测靶基因的转录活性的变化。具体地说，报道基因(例如，绿色荧光蛋白(GFP)或萤光素酶)可以位于靶基因的转录因子或启动子区域的下游，且通过测定报道基因活性可以根据报道基因活性测定转录活性的变化。
另外，由于通过EGF受体的信号转导一般沿促进细胞生长的方向作用，可以通过测定靶细胞的生长活性评价中和活性。
具有中和活性和内化活性的抗体可以是非常有效的对抗高表达HB-EGF的癌症的抗癌剂。
ADCC活性和/或CDC活性
用于本发明的抗HB-EGF抗体可以具有抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖的细胞毒性(CDC)。
在本发明中，CDC活性指由补体系统引起的细胞破坏活性。另一方面，ADCC活性指如下描述的活性：其中，特异性抗体附着于靶细胞上的细胞表面抗原上，Fcγ受体递呈细胞(免疫细胞等)通过其Fcγ受体与结合抗原的抗体的Fc区域结合，然后攻击靶细胞。
本发明中可以使用已知方法确定抗体是否显示ADCC活性和抗体是否显示CDC活性(例如，Current Protocols in Immunology.第7章：Immunologic Studies in Humans.编者：John E.Coligan等人，JohnWiley & Sons，Inc.(1993)，等等)。
具体地说，首先制备效应细胞、补体溶液和靶细胞。
(1)效应细胞的制备
例如，从CBA/N小鼠中取出脾，并在RPMI1640培养基(Invitrogen Corporation)中分离脾细胞。然后通过以下步骤来制备效应细胞：用含有10％胎牛血清(FBS，HyClone)的相同培养基洗涤，接着调整细胞浓度为5×10⁶/毫升。
(2)补体溶液的制备
可以通过用含有10％FBS(Invitrogen Corporation)的培养基10倍稀释幼兔补体(Cedarlane Laboratories Ltd.)来制备补体溶液。
(3)靶细胞的制备
为了放射性标记靶细胞，在含有10％FBS的DMEM培养基中、37℃下，用0.2mCi⁵¹Cr^-铬酸钠(GE Healthcare Biosciences)培养表达HB-EGF蛋白的细胞1小时。例如，癌细胞(例如，卵巢癌细胞)或用编码HB-EGF蛋白的基因转化的细胞可以用作表达HB-EGF蛋白的细胞。在放射性标记之后，用含有10％FBS的RPMI1640培养基洗涤细胞3遍，并通过调节细胞浓度为2×10⁵/毫升来制备靶细胞。
可以通过以下方法测定ADCC活性和CDC活性。为了测定ADCC活性，向96孔U形底板(Becton，Dickinson and Company)中加入50μL靶细胞和50μL抗HB-EGF抗体，并在冰上反应15分钟。然后加入100μL效应细胞，并在CO₂孵箱中培养4小时。采用0或10μg/mL的最终抗体浓度。培养后，回收100μL上清液，并用γ计数器(COBRA II AUTO-GAMMA，MODEL D5005，PackardInstrument Company)测定放射性。使用获得的数值，由公式(A-C)/(B-C)x100计算细胞毒性(％)，其中，A是特定样品的放射性(cpm)，B是向其中加入1％NP-40(Nacalai Tesque，Inc.)的样品的放射性(cpm)，C是只含有靶细胞的样品的放射性(cpm)。
另一方面，当要测定CDC活性时，向96孔平底板(Becton，Dickinson and Company)中加入50μL靶细胞和50μL抗HB-EGF抗体，并在冰上反应15分钟。接着加入100μL补体溶液，并在CO₂孵箱中培养4小时。采用0或3μg/mL的最终抗体浓度。培养后，回收100μL上清液，并用γ计数器测定放射性。可以通过与测定ADCC活性相同的方式计算细胞毒性。
具有内化活性和ADCC活性和/或CDC活性的抗体可以是非常有效的对抗高表达HB-EGF的癌症的抗癌剂。另外，具有中和活性和ADCC活性和/或CDC活性的抗体可以是非常有效的对抗高表达HB-EGF的癌症的抗癌剂。而且，具有内化活性加中和活性加ADCC活性和/或CDC活性的抗体可以是非常有效的对抗高表达HB-EGF的癌症的抗癌剂。
抗体的产生
可以使用已知方法获得本发明的单克隆抗HB-EGF抗体。本发明的抗HB-EGF抗体尤其优选哺乳动物来源的单克隆抗体。哺乳动物来源的单克隆抗体尤其包括由杂交瘤产生的单克隆抗体和由已经通过基因工程技术用包含抗体基因的表达载体转化的宿主产生的单克隆抗体。
通过使用已知技术可以制备产生单克隆抗体的杂交瘤，例如，以下所述的技术。首先根据通常的免疫方法，使用HB-EGF蛋白作为致敏抗原免疫动物。通过通常的细胞融合技术将从免疫动物获得的免疫细胞与已知的伴侣细胞融合以获得杂交瘤。使用通常的筛选技术，通过筛选产生需要的抗体的细胞，选择这些杂交瘤中的产生抗HB-EGF抗体的杂交瘤。
具体地说，例如可以如下进行单克隆抗体的产生。首先，通过HB-EGF基因的表达可以获得用作获得抗体的致敏抗原的HB-EGF蛋白。例如，公开了作为GenBank登记号NM_001945(SEQ ID NO：49)的人HB-EGF基因的碱基序列。因此，将编码HB-EGF的基因序列插入已知的表达载体中，然后用表达载体转化合适的宿主细胞；随后从宿主细胞内或从培养上清液中纯化需要的人HB-EGF蛋白。也可以以同样的方式使用纯化的天然HB-EGF蛋白。可以使用一种通常的色谱技术或其组合纯化蛋白质，例如，离子色谱、亲和色谱等，采用一个运行或多个运行。用于本发明的免疫原也可以是通过将一种来自HB-EGF蛋白的需要的部分多肽与一种不同的多肽融合获得的融合蛋白。例如，来自抗体的肽标签或Fc片段可以用来产生将要用作免疫原的融合蛋白。可以通过将编码需要的两种或多种多肽片段的基因符合读框地融合并将融合基因插入上述表达载体中来制备表达融合蛋白的载体。在Molecular Cloning第2版(Sambrook，J.等人，Molecular Cloning第2版，9.47-9.58，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中描述了产生融合蛋白的方法。
以所述方式纯化的HB-EGF蛋白可以用作用来免疫哺乳动物的致敏性抗原。来自HB-EGF的部分肽也可以用作致敏性抗原。例如，下面的肽可以用作致敏性抗原：
通过化学合成由人HB-EGF的氨基酸序列获得的肽；
通过将人HB-EGF基因的一部分并入表达载体内并表达该部分而获得的肽；和
通过用蛋白质降解酶降解人HB-EGF蛋白获得的肽。
对于用作部分肽的HB-EGF区域或部分肽的大小没有限制。优选的区域可以选自构成HB-EGF的胞外域的氨基酸序列(SEQ ID NO：50的氨基酸序列中的位点22-149)。构成将要用作致敏性抗原的肽的氨基酸的数目优选为至少3个，例如至少5个或至少6个。更具体地说，8-50个残基、优选10-30个残基的肽可以用作致敏性抗原。
对于可以用上述的致敏性抗原免疫的哺乳动物没有特别的限制。为了通过细胞融合技术获得单克隆抗体，优选地考虑与将要在细胞融合中使用的伴侣细胞的相容性选择免疫动物。一般优选啮齿类作为免疫动物。特别地，小鼠、大鼠、仓鼠或兔可以用作免疫动物。猴也可以用作免疫动物。
可以根据已知方法用致敏性抗原免疫上述动物。例如，作为一般的方法，可以通过皮下或腹膜内注射致敏性抗原免疫哺乳动物。具体地说，可以以4-21天的时间表多次向哺乳动物施用致敏性抗原。例如，用磷酸盐缓冲液(PBS)或生理盐水将致敏性抗原稀释至适当的稀释倍数。也可以与佐剂组合施用致敏性抗原。例如，可以通过与弗氏完全佐剂混合并乳化来制备致敏性抗原。合适的载体也可以用于致敏性抗原免疫。尤其是在使用低分子量的部分肽作为致敏性抗原的情况中，理想地用与诸如白蛋白、匙孔血蓝蛋白等蛋白质载体结合的致敏性肽抗原实现免疫。
以所述的方式免疫动物并观察到预期的血清抗体效价升高之后，从哺乳动物收集免疫细胞，并进行细胞融合。脾细胞是尤其优选的免疫细胞。
使用哺乳动物骨髓瘤细胞作为与上述免疫细胞融合的细胞。骨髓瘤细胞优选地具有合适的选择标记以支持筛选。选择标记指在特定培养条件下可以出现(或不出现)的性状。已知的选择标记包括次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶缺陷(下文缩写为HGPRT缺陷)和胸苷激酶缺陷(下文缩写为KT缺陷)。HGPRT缺陷或TK缺陷的细胞显示次黄嘌呤-氨嘌呤-胸腺嘧啶敏感性(下文缩写为HAT敏感性)。HAT敏感的细胞不能在HAT选择培养基上进行DNA合成并死亡；但是，当与正常细胞融合时，DNA合成能够使用正常细胞的补救途径而继续，也能在HAT选择培养基上发生生长。
可以在含有6-硫代鸟嘌呤或8-氮鸟嘌呤(8AG)的培养基上选择HGPRT缺陷的细胞，而可以在含有5′-溴脱氧尿苷的培养基上选择TK缺陷的细胞。正常细胞将这些嘧啶类似物掺入其DNA内并死亡，而这些酶缺陷的细胞不会掺入这些嘧啶类似物于是能够在选择培养基上存活下来。称为G418抗性的另一种选择标记基于新霉素抗性基因提供对2-脱氧链霉胺型抗生素(庆大霉素类似物)的抗性。适于细胞融合的各种骨髓瘤细胞是已知的。例如，可以使用以下骨髓瘤细胞：P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123，1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81，1-7)、NS-1(Kohler，G.和Milstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)、MPC-11(Margulies，D.H.等人，Cell(1976)8，405-415)、SP2/0(Shulman，M.等人，Nature(1978)276，269-270)、FO(de St.Groth，S.F.等人，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)和R210(Galfre，G.等人，Nature(1979)277，131-133)。
可以根据已知方法，例如，根据Kohler和Milstein的方法(Kohler，G.和Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)73，3-46)，进行上述免疫细胞与骨髓瘤细胞之间的细胞融合。
更具体地，例如可以在细胞融合促进剂的存在下，在通常的营养培养液体中进行细胞融合。例如，聚乙二醇(PEG)或仙台病毒(HVJ)可以用作融合促进剂。需要的话，为了提高融合效率，可以加入如二甲亚砜的辅剂。
可以自由选择免疫细胞与骨髓瘤细胞的比例。例如，优选地相对于骨髓瘤细胞以1X-10X使用免疫细胞。例如，用于细胞融合的培养液可以是RPMI1640培养基或MEM培养基，它们非常适于上述骨髓瘤细胞株的生长，或是用于这种类型的细胞培养的常用的培养基。也可以向培养基中加入如胎牛血清(FCS)的血清补充物。
通过在上述培养液中充分混合规定量的免疫细胞和骨髓瘤细胞并混合已预加热至大约37℃的PEG溶液，通过细胞融合形成需要的融合细胞(杂交瘤)。例如，可以以一般为30-60％(w/v)的浓度将具有1000-6000的平均分子量的PEG加入到细胞融合过程中。然后，通过重复加入上述的合适的培养液、离心及除去上清液的过程除去杂交瘤生长不需要的细胞融合剂等。
可通过使用适合用于细胞融合的骨髓瘤所显示的选择标记的选择性培养基来选择以所述方式获得的杂交瘤。例如，可通过在HAT培养基(含有次黄嘌呤、氨嘌呤和胸腺嘧啶的培养基)上的培养选择HGPRT缺陷或TK缺陷的细胞。因此，当HAT敏感的骨髓瘤细胞用于细胞融合时，由与正常细胞的细胞融合产生的细胞能够在HAT培养基上选择性地生长。在HAT培养基上的培养持续足以使除了需要的杂交瘤之外的细胞(未融合的细胞)死亡的一段时间。具体地说，一般可通过几天至几周的培养来选择需要的杂交瘤。通常的有限稀释方法可以用来筛选并单克隆产生需要的抗体的杂交瘤。或者，也可以通过WO 03/104453中所述的方法产生识别HB-EGF的抗体。
可以通过基于已知的抗原-抗体反应的筛选程序适当地进行需要的抗体的筛选和单克隆。例如，抗原可以与载体(例如，如聚苯乙烯的珠或可商购的96孔微量滴定板)结合，然后与杂交瘤培养上清液反应。接着，在洗涤载体后，细胞与(例如)酶标记的第二抗体反应。如果培养上清液中存在需要的致敏性抗原反应性抗体，那么第二抗体将通过抗体结合到载体上。最终可通过检测结合到载体上的第二抗体确定培养上清液中需要的抗体的存在/不存在。例如，通过有限稀释法可以克隆产生需要的抗原结合性抗体的杂交瘤。在本文中，适当地使用基本上相同的HB-EGF蛋白作为抗原，包括那些用于免疫的HB-EGF蛋白。例如，包含HB-EGF的胞外域或包含来自该区域的部分氨基酸序列的寡肽可以用作抗原。
除了上述通过用抗原免疫非人类动物产生杂交瘤的方法，也可以通过人类淋巴细胞的抗原致敏获得需要的抗体。具体地说，首先在体内用HB-EGF蛋白致敏人类淋巴细胞。然后将免疫致敏的淋巴细胞与合适的融合伴侣融合。例如，具有永久细胞分裂能力的人源骨髓瘤细胞可以用作融合伴侣(参考日本专利公开第H1-59878号)。通过该方法获得的抗HB-EGF抗体是具有结合HB-EGF蛋白的活性的人抗体。
也可以通过向具有完整的人抗体基因所有组成成分(repertoire)的转基因动物施用作为抗原的HB-EGF蛋白获得人抗HB-EGF抗体。可以通过与合适的融合伴侣进行细胞融合或者通过如用EB病毒感染的处理使来自免疫动物的产生抗体的细胞无限增殖化。可以从产生的无限增殖化细胞中分离针对HB-EGF蛋白的人抗体(参考国际公开WO 94/25585、WO 93/12227、WO 92/03918和WO 94/02602)。而且，也可以通过克隆无限增殖化细胞克隆产生具有希望的反应特异性的抗体的细胞。当采用转基因动物作为免疫动物时，动物的免疫系统将人HB-EGF识别为外源性的。这使得能够容易地获得针对人HB-EGF的人抗体。以所述方式构建的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在通常的培养基中传代培养。杂交瘤也可以在液氮中长期保存。
可以根据通常的方法培养上述杂交瘤，且可以从产生的培养上清液中获得需要的单克隆抗体。或者，可以将杂交瘤注射到与该细胞相容的哺乳动物中，且可以从哺乳动物的腹水中获得单克隆抗体。前述方法很好地适于产生高纯度的抗体。
本发明也可以使用由从抗体生产细胞克隆的抗体基因编码的抗体。可以通过将克隆的抗体基因掺入合适的载体中接着通过转染宿主来实现抗体的表达。已经建立了分离抗体基因并将其插入载体内和转化宿主细胞的方法(参考，例如，Vandamme，A.M.等人，Eur.J.Biochem.(1990)192，767-775)。
例如，可以从产生抗HB-EGF抗体的杂交瘤细胞获得编码抗HB-EGF抗体的可变区(V区)的cDNA。一般首先从杂交瘤中提取总RNA。可以用来从细胞中提取mRNA的方法是，例如，胍超离心法(Chirgwin，J.M.等人，Biochemistry(1979)18，5294-5299)和AGPC法(Chomczynski，P.等人，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)。
可以使用例如mRNA纯化试剂盒(GE Healthcare Biosciences)纯化提取的mRNA。或者，用于从细胞中直接提取mRNA的试剂盒也是可商购的，如QuickPrep mRNA纯化试剂盒(GE HealthcareBiosciences)。如这些的试剂盒也可以用来从杂交瘤中获得总mRNA。可以使用逆转录酶由获得的mRNA合成编码抗体V区的cDNA。例如，可以使用AMV逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒(SeikagakuCorporation)合成cDNA。另外，5′-Ampli FINDER RACE试剂盒(Clontech)和基于PCR的5′-RACE法(Frohman，M.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A.，等人，Nucleic Acids Res.(1989)17，2919-2932)也可以用来合成和扩增cDNA。而且，在这样的cDNA合成方法中可以将以下合适的限制性酶切位点引入cDNA的两端。
从获得的PCR产物中纯化靶cDNA片段，然后与载体DNA连接；将以这种方式制备的重组载体转染到(例如)大肠杆菌内，并选择菌落；可以由显示菌落形成的大肠杆菌制备需要的重组载体。另外，如二脱氧核苷酸链终止法的已知方法可以用来确认重组载体是否具有靶cDNA的碱基序列。
为了获得编码可变区的基因，也可以采用使用可变区基因扩增引物的PCR。首先，为了获得cDNA文库，使用提取的mRNA作为模板合成cDNA。可以方便地使用可商购的试剂盒来合成cDNA文库。实际上，从只是少量的细胞获得的mRNA的量非常少，因而直接纯化具有低收率。因此，一般在加入明显不包含抗体基因的载体RNA之后进行纯化。或者，在那些可以提取一定量的RNA的情况下，甚至可以只用来自抗体生产细胞的RNA实现有效的提取。例如，在某些情况下，不是必须向从至少10个或至少30个、优选至少50个抗体生产细胞的RNA提取中加入载体RNA。
使用获得的cDNA文库作为模板，通过PCR可以扩增抗体基因。用于基于PCR扩增抗体基因的引物是已知的。例如，可以根据文献中的信息(例如，J.Mol.Biol.(1991)222，581-597)设计用于扩增人抗体基因的引物。这些引物具有随免疫球蛋白亚类变化的碱基序列。因此，当采用未知亚类的cDNA文库作为模板时，考虑所有的可能性进行PCR。
具体地说，例如，当目标是获得编码人IgG的基因时，可以使用具有扩增编码重链的γ1-γ5和轻链的κ链和λ链的基因的能力的引物。为了扩增IgG可变区基因，对于3′-侧引物，通常使用与对应于铰链区的区域退火的引物。另一方面，对于5′-侧引物，可以使用适于每个亚类的引物。
基于用于每种重链和轻链亚类的基因扩增引物制备PCR产物，作为各自独立的文库。使用这样合成的文库，可以重建包含重链加轻链组合的免疫球蛋白。可以使用重建的免疫球蛋白对HB-EGF的结合活性作为指标，筛选需要的抗体。
本发明的抗体与HB-EGF的结合更优选地是特异性结合。例如，通过以下步骤可以进行对于结合HB-EGF的抗体的筛选：
(1)将HB-EGF与包含由从杂交瘤获得的cDNA编码的V区的抗体接触；
(2)检测HB-EGF与该抗体的结合；和
(3)选择结合HB-EGF的抗体。
检测抗体与HB-EGF结合的方法是已知的。具体地说，测试抗体可与固定在载体上的HB-EGF反应，然后与识别该抗体的标记抗体反应。在洗涤后，可以检测载体上的标记抗体，作为测试抗体与HB-EGF结合的指示。如FITC的荧光物质或如过氧化物酶的酶蛋白质或β-半乳糖苷可以用作标记。固定形式的表达HB-EGF的细胞也可以用来评价抗体的结合活性。
也可以采用使用噬菌体载体的淘选(Panning)作为使用结合活性作为指示的抗体筛选方法。当如上所述获得抗体基因作为重链亚类和轻链亚类文库时，使用噬菌体载体的筛选是有利的。通过与适当的连接体序列连接可以将编码重链和轻链可变区的基因制成单链Fv(scFv)。可以将编码scFv的基因插入噬菌体载体内，以获得在其表面上表达scFv的噬菌体。将噬菌体与靶抗原接触，回收结合抗原的噬菌体能够回收编码具有需要的结合活性的scFv的DNA。需要时，可通过重复这一过程富集具有需要的结合活性的scFv。
在本发明中，编码抗体的多核苷酸可以编码抗体的全长或可以编码抗体的一部分。所述的抗体的部分可以是抗体分子的任一部分。抗体片段是以下在某些情况中用于表示抗体的一部分的术语。本发明中优选的抗体片段包含互补决定区(CDR)。本发明中更优选的抗体片段包含构成可变区的全部3个CDR。
一旦获得编码目标抗HB-EGF抗体的V区的cDNA，则通过识别已被插入cDNA的两个末端的限制性酶切位点的限制性内切酶消化cDNA。优选的限制性内切酶识别并消化在构成抗体基因的碱基序列中出现可能性较低的碱基序列。为了在载体中以正确的方向插入1个拷贝的消化片段，优选产生粘性末端的限制性内切酶。可以通过将如前所述消化的编码抗HB-EGF抗体V区的cDNA插入合适的表达载体内，获得抗体表达载体。在这点上，通过将编码抗体恒定区(C区)的基因与前述的编码V区的基因符合读框地融合，可获得嵌合抗体。本文中，嵌合抗体指恒定区和可变区具有不同的来源的产物。因此，在本发明的范围中，“嵌合抗体”除了如小鼠-人的异种嵌合抗体(heterochimeric antibodies)外也包括人-人同种嵌合抗体(allochimeric antibodies)。也可以通过将前述V区基因插入已携带恒定区的表达载体内构建嵌合抗体表达载体。
具体地说，例如，用于消化前述V区基因的限制性内切酶的限制性内切酶识别序列可以预先设置于携带编码需要的抗体恒定区(C区)的DNA的表达载体的5′侧。将二者用同样的限制性内切酶组合消化并符合读框地融合，导致嵌合抗体表达载体的构建。
为了产生本发明的抗HB-EGF抗体，可以以一定的方式将抗体基因掺入表达载体内，使得表达在表达控制区的控制之下发生。抗体表达的表达控制区包括，例如，增强子和启动子。然后可以通过用所述表达载体转化合适的宿主细胞获得表达编码抗HB-EGF抗体的DNA的重组细胞。
为了表达抗体基因，可以将编码抗体重链(H链)的DNA和编码抗体轻链(L链)的DNA掺入单独的表达载体中。通过用掺有H链的载体和掺有L链的载体同时转化(共转染)同一宿主细胞，可以表达具有H链和L链的抗体分子。或者，可以将编码H链和L链的DNA掺入一个表达载体中，然后可转化宿主细胞(国际公开WO94/11523)。
对于通过分离抗体基因并转染合适的宿主来产生抗体，已知许多宿主/表达载体组合。这些表达系统中的任一种可以应用于本发明中。当真核细胞用作宿主时，可以使用动物细胞、植物细胞或真菌细胞。可用于本发明的动物细胞的具体例子是哺乳动物细胞(例如，CHO、COS、骨髓瘤、幼仓鼠肾(BHK)、Hela、Vero等)、两栖动物细胞(例如，非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞等)和昆虫细胞(例如，sf9、sf21、Tn5等)。
对于植物细胞，已知基于来自烟草属如烟草(Nicotiana tabacum)等的细胞的抗体基因表达系统。愈伤组织培养的细胞可以用于植物细胞转化。
以下这些例如可以作为真菌细胞使用：酵母(例如，酵母属(Saccharomyces)如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，毕赤酵母属(Pichia)如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)等)和丝状真菌(例如，曲霉属(Aspergillus)如黑曲霉(Aspergillus niger))。
使用原核细胞的抗体基因表达系统也是已知的。以细菌为例，如大肠杆菌、枯草杆菌等细菌可以用于本发明。
当使用哺乳动物细胞时，可以通过功能性地连接一种有效的、常用的启动子、待表达的抗体基因和位于该抗体基因3′-末端下游的polyA信号来构建表达载体。启动子/增强子的一个例子是人巨细胞病毒直接早期启动子/增强子。
可以用来表达本发明的抗体的其它启动子/增强子有，例如，病毒启动子/增强子和来源于哺乳动物细胞的启动子/增强子，如人延伸因子1α(HEF1α)。能够提供可用的启动子/增强子的具体例子有逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒和猿猴病毒40(SV40)。
可以根据Mulligan等人(Nature(1979)277，108)的方法使用SV40启动子/增强子。另外，可以根据Mizushima等人(Nucleic AcidsRes.(1990)18，5322)的方法容易地利用HEF1α启动子/增强子进行希望的基因表达。
对于大肠杆菌，可以通过功能性地连接一种有效的、常用的启动子、用于抗体分泌的信号序列和待表达的抗体基因来实现所研究的基因的表达。例如，启动子可以是lacZ启动子或araB启动子。可以根据Ward等人(Nature(1989)341，544-546；FASEBJ.(1992)6，2422-2427)的方法使用lacZ启动子。或者，可以根据Better等人(Science(1988)240，1041-1043)的方法使用araB启动子进行希望的基因表达。
关于用于抗体分泌的信号序列，pelB信号序列(Lei，S.P.等人，J.Bacteriol.(1987)169，4379)可以在大肠杆菌周质中生产的情况中使用。在已分离出周质中产生的抗体之后，可以通过使用如盐酸胍和尿素的蛋白质变性剂来改造(重折叠)抗体结构，使其显示需要的结合活性。
例如，插入表达载体内的复制起点可以是来源于SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的复制起点。另外，为了扩增宿主细胞系统中的基因拷贝数，可以将选择标记插入表达载体中。具体地说，可用的选择标记有氨基糖苷转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等。
可以通过将所研究的表达载体转染到宿主细胞内并在体外或体内培养转化的宿主细胞来产生靶抗体。可以根据已知方法进行宿主细胞培养。例如，可以使用DMEM、MEM、RPMI1640或IMDM作为培养基；也可以加入如胎牛血清(FCS)的血清补充物。
可以通过已知用于蛋白质纯化的常用方法来纯化如上述表达和产生的抗体；可以使用一种这样的方法或使用这些方法的适当的组合。可以使用以下方法的合适的选择和组合来分离和纯化抗体：例如，亲和柱(例如，蛋白A柱)、柱色谱、过滤、超滤、盐析、透析等(Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow，David Lane，ColdSpring Harbor Laboratory，1988)。
除了前述的宿主细胞以外，转基因动物也可以用来产生重组抗体。即，可以从已向其中引入编码靶抗体的基因的动物获得所研究的抗体。例如，可以通过在编码乳汁中天然产生的蛋白质的基因中符合读框地插入抗体基因来制备融合的基因。例如，山羊β-酪蛋白可用作分泌到乳汁中的蛋白质。可以将包含掺入抗体基因的融合基因的DNA片段注射到山羊胚胎内，并且可以将注射过的胚胎引入雌山羊中。可以作为与乳汁蛋白质的融合蛋白获得需要的抗体，所述乳汁蛋白质来自由植入胚胎的山羊生出的转基因山羊(或其后代)所产生的乳汁。另外，为了增加转基因山羊产生的包含所需抗体的乳汁的量，可以对转基因山羊适当地使用激素(Ebert，K.M.等人，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
来源于动物抗体的C区可以用作本发明的重组抗体的C区。可以使用命名为Cγ1、Cγ2a、Cγ2b、Cγ3、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2和Cε的小鼠抗体H链C区，还可以使用命名为Cκ和Cλ的L链C区。除了小鼠抗体，来自例如大鼠、兔、山羊、绵羊、骆驼、猴子等的动物抗体也可以用作动物抗体。这些序列是已知的。为了改进抗体或提高其产生的稳定性，可以修饰C区。当抗体将要向人施用时，在本发明中可以制备人工改造的基因重组抗体，目的是例如降低在人体中的外来抗原性。这样的基因重组抗体包括，例如，嵌合抗体和人源化抗体。
可以使用已知方法产生这些工程抗体。嵌合抗体指这样的抗体，其中，可变区与具有与可变区不同来源的恒定区连接。例如，一种具有来自小鼠抗体的重链可变区和轻链可变区和来自人抗体的重链恒定区和轻链恒定区的抗体是小鼠-人-异种嵌合抗体。可以通过将编码小鼠抗体可变区的DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接并将其掺入表达载体中来构建表达嵌合抗体的重组载体。然后培养被载体转化的重组细胞，以使掺入的DNA表达，然后可以回收培养基中的产生的嵌合抗体。人抗体的C区用于嵌合抗体和人源化抗体的C区。对于H链，例如，Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2和Cε可以用于C区。对于L链，Cκ和Cλ可以用于C区。这些C区的氨基酸序列是已知的，编码这些氨基酸序列的碱基序列也是已知的。另外，为了改善抗体本身或提高抗体生产的稳定性，可以修饰人抗体的C区。
嵌合抗体通常由非人类动物来源的抗体的V区和人源抗体的C区构建。相反地，人源化抗体由非人类动物来源的抗体的互补决定区(CDR)、动物来源的抗体的框架区(FR)和人源抗体的C区构成。为了降低在人体中的抗原性，人源化抗体可用作本发明的治疗剂中的活性成分。
抗体的可变区典型地由夹在4个FR之间的3个CDR构成。CDR是实质上确定抗体的结合特异性的区域。CDR的氨基酸序列具有丰富的多样性。另一方面，构成FR的氨基酸序列经常显示高度的同源性，甚至在具有不同的结合特异性的抗体之间。由于此原因，某种抗体的结合特异性能够典型地通过CDR移植而转移给另一种抗体。
人源化抗体也被称为重构人抗体。具体地说，例如，已知其中来自如小鼠抗体的非人类动物抗体的CDR已被移植到人抗体中的人源化抗体。也已知一般的用于获得人源化抗体的基因重组技术。
具体地说，例如，已知重叠延伸PCR是一种将小鼠抗体CDR移植到人FR内的方法。在重叠延伸PCR中，将编码待移植的小鼠抗体CDR的碱基序列添加到用于合成人抗体FR的引物中。为4种FR中的每一种制备引物。选择显示与小鼠FR高度同源性的人FR一般有利于在向人FR上移植小鼠CDR中保持CDR功能。因此，一般优选使用这样的人FR，其氨基酸序列显示与邻近待移植的小鼠CDR的FR的氨基酸序列具有高度同源性。
另外，设计将要连接的碱基序列，使其能够彼此符合读框地连接。分别使用各自的引物合成人FR。以这种方式，获得其中编码小鼠CDR的DNA附着在每个FR上的产物。设计编码每种产物中小鼠CDR的碱基序列，使其彼此重叠。然后，使用人抗体基因作为模板合成的产物的重叠CDR区彼此退火，并进行互补链合成反应。该反应导致人FR经小鼠CDR序列连接。
最后，将包含与3个CDR连接的4个FR的可变区基因通过使已添加合适的限制性酶识别序列的引物在其5′末端和3′末端退火，进行全长扩增。通过将如上所述获得的DNA和编码人抗体C区的DNA插入表达载体中，使它们符合读框地融合，以此构建人型抗体的表达载体。将这样制成的载体插入到宿主中并建立重组细胞；培养该重组细胞以表达编码人源化抗体的DNA；由此在培养细胞的培养基中产生人源化抗体(参考欧洲专利公开EP 239,400和国际公开WO 96/02576)。
可以通过定性和定量地测定和评价如前所述构建的人源化抗体对抗原的结合活性来适当地选择当跨过CDR连接时能够使CDR形成高质量的抗原结合位点的人抗体FR。必要时也可以在FR上进行氨基酸置换，以使重构人抗体的CDR能够形成良好适应的抗原结合位点。例如，可以使用用于将小鼠CDR移植到人FR上的PCR方法，将氨基酸序列中的突变引入FR中。具体地说，可以将部分碱基序列突变引入到将与FR退火的引物中。然后将碱基序列突变引入到使用这些引物合成的FR中。通过用上述方法测定和评价突变的、氨基酸取代的抗体的抗原结合活性，可以选择具有需要的性质的突变FR序列(Sato，K.等人，Cancer Res.，1993，53，851-856)。
也已知获得人抗体的方法。例如，可以在体外用需要的抗原或表达需要的抗原的细胞致敏人淋巴细胞。然后可以通过将致敏的淋巴细胞与人骨髓瘤细胞融合获得需要的能够结合抗原的人抗体(参考日本专利公开第H1-59878号)。例如，U266可以用于用作融合伴侣的人骨髓瘤细胞。
也可以通过用需要的抗原免疫具有完整人抗体基因全部组成成分(repertoire)的转基因动物获得需要的人抗体(参考国际公开WO93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096和WO 96/33735)。也已知使用人抗体文库通过淘选获得人抗体的技术。例如，通过噬菌体展示方法可以在噬菌体表面上表达作为单链抗体(scFv)的人抗体V区，并可以选择结合抗原的噬菌体。然后可以通过分析选择的噬菌体的基因确定编码结合抗原的人抗体的V区的DNA序列。一旦确定了结合抗原的scFv的DNA序列，就可以将V区序列与需要的人抗体C区的序列符合读框地融合，这之后通过将其插入合适的表达载体中构建表达载体。可以将表达载体转染到如上所述的合适的表达细胞中，并可以通过编码人抗体的基因的表达获得人抗体。这些方法是已知的(国际公开92/01047、WO92/20791、WO 93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO 95/01438和WO 95/15388)。
在与HB-EGF蛋白发生结合的范围内，本发明的抗体不仅包括由IgG代表的二价抗体，还包括由IgM代表的多价抗体和单价抗体。本发明的多价抗体包括其中所有抗原结合位点相同的多价抗体，和其中某些或所有抗原结合位点不同的多价抗体。本发明的抗体不限于全长抗体分子，也包括低分子量抗体及其修饰，只要它们能够结合HB-EGF蛋白。
低分子量抗体包括通过删除完整抗体(例如，完整的IgG)的一部分产生的抗体片段。抗体分子的部分删除是允许的，只要存在结合HB-EGF抗原的能力。用于本发明的抗体片段优选地包含重链可变区(VH)或轻链可变区(VL)或这两者。VH或VL的氨基酸序列可以包括取代、添加和/或插入。而且，只要仍然存在结合HB-EGF抗原的能力，也可以删除VH或VL的一部分或这两者的一部分。也可以将可变区嵌合或人源化。抗体片段的具体例子是Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv。低分子量抗体的具体例子是Fab、Fab′、F(ab′)2、FV、scFv(单链Fv)、双抗体和sc(Fv)2(单链(Fv)2)。本发明的低分子量抗体也包括这些抗体的多聚体(例如，二聚体、三聚体、四聚体、多聚体)。
也可以通过酶处理抗体产生抗体片段来获得抗体片段。例如，已知木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、纤维蛋白溶酶等为产生抗体片段的酶。或者，可以构建编码这样的抗体片段的基因，并将其插入表达载体中，接着由合适的宿主细胞表达(参考，例如，Co，M.S.等人，J.Immunol.(1994)152，2968-2976；Better，M.& Horwitz，A.H.Methodsin Enzymology(1989)178，476-496；Plueckthun，A.& Skerra，A.Methods in Enzymology(1989)178，476-496；Lamoyi，E.Methods inEnzymology(1989)121，652-663；Rousseaux，J.等人，Methods inEnzymology(1989)121，663-669；和Bird，R.E.等人，TIBTECH(1991)9，132-137)。
消化酶切割特定的抗体片段位点以产生具有如下所述的特定结构的抗体片段。当对这些酶促产生的抗体片段应用基因工程技术时，可以删除抗体的任意部分。
木瓜蛋白酶消化：F(ab)2或Fab
胃蛋白酶消化：F(ab′)2或Fab′
纤维蛋白溶酶消化：Facb
双抗体表示通过基因融合构建的二价抗体片段(Holliger，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，6444-6448(1993)、EP 404,097、WO93/11161等)。双抗体是由两个多肽链构成的二聚体。一般地，构成双抗体的每个多肽链是通过连接体连接为一个相同链的VL和VH。用于双抗体的连接体一般足够短而使得VL和VH不能彼此结合。具体地说，例如，大约5个氨基酸残基组成连接体。由于此原因，在同一多肽链上编码的VL和VH不能形成单链可变区片段，与单独的单链可变区片段形成二聚体。因此，双抗体具有两个抗原结合位点。
通过将抗体的H链V区与L链V区连接获得scFv。scFv中的H链V区与L链V区通过连接体且优选地通过肽连接体彼此连接(Huston，J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85，5879-5883(1988))。scFv中的H链V区和L链V区可以来源于本文所述的任何抗体。对于连接V区的肽连接体没有特别的限制。例如，可以使用任何具有大约3-25个残基的单肽链作为连接体。
例如，可以使用前述的PCR技术连接V区。为了通过PCR连接V区，首先使用编码来自编码抗体H链或H链V区的DNA序列的氨基酸序列的全部或所需部分的DNA和编码来自编码抗体L链或L链V区的DNA序列的氨基酸序列的全部或所需部分的DNA作为模板。
使用具有对应于待扩增DNA的两个末端处的序列的引物对，通过PCR分别扩增编码H链V区的DNA和编码L链V区的DNA。然后制备编码肽连接体区域的DNA。也可以使用PCR合成编码肽连接体的DNA。在所用的引物的5′侧之前，加入能够与分别合成的每种V区扩增产物连接的碱基序列。然后使用装配PCR引物和用于[H链V区DNA]-[肽连接体DNA]-[L链V区DNA]的每种DNA进行PCR反应。装配PCR引物是与[H链V区DNA]的5′侧退火的引物和与[L链V区DNA]的3′侧退火的引物的组合。即，装配PCR引物形成能扩增编码待合成的scFv的全长序列的DNA的引物集。另一方面，向[肽连接体DNA]上添加可与每个V区DNA连接的碱基序列。结果，这些DNA连接在一起，而且，最终通过装配PCR引物产生全长scFv作为扩增产物。一旦已产生编码scFv的DNA，就可以通过通常的方法获得含有该DNA的表达载体以及由该表达载体转化的重组细胞。另外，可以培养这样获得的重组细胞，并可以通过编码scFv的DNA的表达获得scFv。
sc(Fv)2是低分子量抗体，其中，两个VH和两个VL通过(例如)连接体连接成单链(Hudson等人，J.Immunol.Methods，231，177-189(1999))。例如，可以通过用连接体连接scFv制备sc(Fv)2。
优选特征性地具有在序列中排列的两个VH和两个VL的抗体，从单链多肽的N-末端侧起，为VH、VL、VH、VL([VH]连接体-[VL]连接体-[VH]连接体-[VL])。
两个VH和两个VL的序列不特别限于上述的排列，它们可以排列成任一序列。可以提供下面的序列作为例子。
[VL]连接体-[VH]连接体-[VH]连接体-[VL]
[VH]连接体-[VL]连接体-[VL]连接体-[VH]
[VH]连接体-[VH]连接体-[VL]连接体-[VL]
[VL]连接体-[VL]连接体-[VH]连接体-[VH]
[VL]连接体-[VH]连接体-[VL]连接体-[VH]
连接抗体的可变区的连接体可以是，例如，可以通过基因工程插入的肽连接体或合成的化合物连接体，例如，如Protein Engineering，9(3)，299-305(1996)中所公开的。在本发明中，优选肽连接体。肽连接体的长度没有特别限制，可以由本领域的技术人员考虑到预期应用适当地选择。一般地，肽连接体中有1-100个氨基酸残基，优选3-50个氨基酸残基，更优选5-30个氨基酸残基，尤其优选12-18个氨基酸残基(例如，15个氨基酸残基)。
肽连接体的氨基酸序列可以是不干扰scFv的结合作用的任何序列。
或者，也可以使用合成的化学连接体(化学交联剂)连接V区。本发明中可以使用那些典型地用于交联如肽化合物的交联剂。例如，可以使用以下化合物：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、双磺基琥珀酰亚胺辛二酸酯(BS3)、二硫代双琥珀酰亚胺丙酸酯(DSP)、二硫代双磺基琥珀酰亚胺丙酸酯(DTSSP)、乙二醇双琥珀酰亚胺琥珀酸酯(EGS)、乙二醇双磺基琥珀酰亚胺琥珀酸酯(磺基-EGS)、二琥珀酰亚胺酒石酸酯(DST)、二磺基琥珀酰亚胺酒石酸酯(磺基-DST)、二[2-(琥珀酰亚胺氧羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)、二[2-(磺基琥珀酰亚胺氧羰基氧基)乙基](磺基-BSOCOES)等。
当连接4个抗体可变区时，通常需要3个连接体。多个连接体可以是彼此相同的，或者可以使用不同的连接体。双抗体和sc(FV)2是本发明优选的低分子量抗体。为了获得这样的低分子量抗体，可以用酶(例如，木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等)处理抗体以产生抗体片段，或者可以构建编码这些抗体片段的DNA并插入表达载体中，接着在合适的宿主细胞中表达(参考，例如，Co，M.S.等人，J.Immunol.(1994)152，2968-2976；Better，M.和Horwitz，A.H.Methods Enzymol.(1989)178，476-496；Plueckthun，A.和Skerra，A.Methods Enzymol.(1989)178，497-515；Lamoyi，E.Methods Enzymol.(1986)121，652-663；Rousseaux，J.等人，Methods Enzymol.(1986)121，663-669；与Bird，R.E.和Walker，B.W.Trends Biotechnol.(1991)9，132-137)。
另外，也可以以结合有如聚乙二醇(PEG)等各种分子的修饰抗体的形式使用本发明的抗体。可以通过对本发明的抗体的化学修饰获得这些修饰抗体。本领域中已经建立了抗体修饰方法。
本发明的抗体也可以是双特异性抗体。双特异性抗体是在同一抗体分子内具有识别不同表位的可变区的抗体，其中，这些表位可以存在于不同的分子中或者可以存在于一个分子中。因此，在本发明的范围中，双特异性抗体可以具有识别HB-EGF分子上的不同表位的抗原结合位点。使用这样的双特异性抗体，两个抗体分子可以与一个HB-EGF分子结合。因此，可以预期有更强的细胞毒性。本发明的“抗体”也包括这些抗体。
本发明也包括识别除HB-EGF以外的抗原的双特异性抗体。例如，本发明包括识别不同于HB-EGF的抗原的双特异性抗体，其中，该抗原在作为与HB-EGF相同的靶标的癌细胞的细胞表面上特异性地表达。
已知产生双特异性抗体的方法。例如，可以通过连接两个识别不同抗原的抗体产生双特异性抗体。连接的每个抗体可以是具有H链和L链的半分子或可以是只具有H链的四分之一分子。或者，也可以通过融合产生不同单克隆抗体的杂交瘤产生能产生双特异性抗体的融合细胞。另外也可以通过基因工程技术产生双特异性抗体。
本发明的抗体也可以是具有改造的糖链的抗体。已知可以通过工程改造抗体上的糖链提高抗体的细胞毒性。
下面是具有改造的糖链的抗体的例子：糖基化改造的抗体(例如，WO 99/54342)、已删除存在于糖链中的岩藻糖的抗体(例如，WO 00/61739、WO 02/3140、WO 2006/067847、WO 2006/067913)和携带具有等分GlcNAc的糖链的抗体(例如，WO 02/79255)。
岩藻糖阴性的抗体是本发明优选的糖链改造的抗体的一个例子。连接到抗体上的糖链可以是连接到抗体分子中天冬酰胺的侧链N原子上的N-糖苷连接的糖链，或可以是连接到抗体分子中丝氨酸或苏氨酸的侧链羟基上的O-糖苷连接的糖链；但是，在本发明中，岩藻糖的存在/不存在是与N-糖苷连接的糖链有关的问题。
在本发明的范围中，岩藻糖阴性的抗体表示基于特定组合物中的抗体上的N-糖苷连接的糖链，在至少20％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％的N-糖苷连接的糖链中已删除岩藻糖。
可以通过本领域技术人员熟知的方法制备岩藻糖阴性的抗体；例如，可以通过在几乎不具有或不具有添加α-1，6核心岩藻糖的能力的宿主细胞中表达抗体蛋白而产生。几乎不具有或不具有添加岩藻糖的能力的宿主细胞包括但不限于：YB2/3HL.P2.G 11.16Ag.20大鼠骨髓瘤细胞(缩写为YB2/0细胞，作为ATCC CRL 1662保藏)、FTVIII敲除CHO细胞(WO 02/31140)、Lec13细胞(WO 03/035835)和岩藻糖转运蛋白阴性细胞(例如，WO 2006/067847、WO2006/067913)。
可以通过本领域中技术人员已知的方法分析糖链。例如，可以通过如N-糖苷酶F(Roche)对抗体的作用从抗体上释放糖链。然后，使用纤维素柱通过固相提取将样品脱盐(Shimizu Y.等人，Carbohydrate Research 332(2001)，381-388)，接着浓缩至干并用2-氨基吡啶荧光标记(Kondo A.等人，Agricultural and BiologicalChemistry 54：8(1990)，2169-2170)。在从使用纤维素柱通过固相提取获得的PA标记的糖链中除去试剂之后，通过离心机浓缩获得纯化的PA标记的糖链，并使用ODS柱通过反相HPLC分析进行测定。另外，在制备PA标记的糖链之后，也可以进行二维作图(two-dimensional mapping)，其中，使用ODS柱的反相HPLC分析与使用胺柱的正相HPLC分析相结合。
在下面的[1]-[13]中描述的抗体是可以用于本发明的抗体的例子。
[1]包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：14的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：16的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：18的氨基酸序列的重链可变区的抗体；
[2]包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：20的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：22的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：24的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
[3]包含如[1]所述的重链和如[2]所述的轻链的抗体；
[4]包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：26的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：28的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：30的氨基酸序列的重链可变区的抗体；
[5]包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：32的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：34的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：36的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；
[6]包含如[4]所述的重链和如[5]所述的轻链的抗体；
[7]包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：76的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：77的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：78的氨基酸序列的重链可变区的抗体；(HE-39重链)
[8]包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：79的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：80的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：81的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；(HE-39L链-1)
[9]包含具有作为CDR1的SEQ ID NO：82的氨基酸序列、作为CDR2的SEQ ID NO：83的氨基酸序列和作为CDR3的SEQ ID NO：84的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；(HE-39L链-2)
[10]包含如[7]所述的重链和如[8]所述的轻链的抗体；
[11]包含如[7]所述的重链和如[9]所述的轻链的抗体；
[12]具有与[1]-[11]中任一项所述的抗体的活性相当的活性的抗体；和
[13]与[1]-[12]中任一项所述的抗体结合相同表位的抗体。
对于上述[12]中的抗体，“相当的活性”指对于HB-EGF的结合活性是[1]-[11]中任一项所述的抗体的结合活性的至少70％、优选至少80％、更优选至少90％，或者，在与细胞毒性物质结合的情况下，抗肿瘤活性是[1]-[11]中任一项所述的抗体的抗肿瘤活性的至少70％、优选至少80％、更优选至少90％。
向多肽中引入突变是本领域技术人员熟知的一种产生与特定多肽功能相当的多肽的方法。例如，本领域技术人员熟知，可以通过使用位点特异性诱变将合适的突变引入本发明的抗体中，产生显示与本发明抗体相当的活性的抗体(Hashimoto-Gotoh，T.等人(1995)Gene 152，271-275；Zoller，M.J.和Smith，M.(1983)Methods Enzymol.100，468-500；Kramer，W.等人(1984)Nucleic Acids Res.12，9441-9456；Kramer，W.和Fritz，H.J.(1987)Methods Enzymol.154，350-367；Kunkel，T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，488-492；和Kunkel(1988)Methods Enzymol.85，2763-2766)。也可以通过自然突变产生氨基酸突变。本发明的抗体也包括这样的抗体：其具有通过在本发明抗体的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸突变而产生的氨基酸序列，并且显示与本发明抗体的活性相当的活性。关于在这样的突变体中突变的氨基酸的数目，可以考虑一般不超过50个氨基酸，优选不超过30个氨基酸，更优选不超过10个氨基酸(例如，不超过5个氨基酸)。
优选地，氨基酸残基被突变为保留氨基酸侧链的特征的另一种氨基酸残基。例如，已基于氨基酸侧链的特征建立了下面的分类。
疏水性氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)
亲水性氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)
具有脂族侧链的氨基酸(G，A，V，L，I，P)
具有含羟基侧链的氨基酸(S，T，Y)
具有含硫侧链的氨基酸(C，M)
具有含羧基或含酰胺侧链的氨基酸(D，N，E，Q)
具有含碱侧链的氨基酸(R，K，H)
具有含芳基侧链的氨基酸(H，F，Y，W)
(圆括号中给出了氨基酸的单字母符号)
对于一种多肽，其具有通过从特定氨基酸序列中删除和/或向特定氨基酸序列中添加一个或多个氨基酸残基和/或通过用另一种氨基酸替换特定氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基而产生的修饰氨基酸序列，已知这样的多肽能够保持其生物活性(Mark，D.F.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666；Zoller，M.J.和Smith，M.，Nucleic Acids Research(1982)10，6487-6500；Wang，A.等人，Science 224，1431-1433；Dalbadie-McFarland，G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79，6409-6413)。即，一般地，当在特定多肽的氨基酸序列中将一个特定分类中的氨基酸替换为该分类中的其它氨基酸时，保持该特定多肽的活性的可能性较高。以上提供的氨基酸分类中，同一分类中的氨基酸之间的置换在本发明中被称为保守置换。
在上述的[13]中，本发明也提供了与本发明公开的抗HB-EGF抗体结合相同的表位的抗体。例如，可以通过以下方法获得这样的抗体。
可以根据测试抗体和特定抗体对于相同表位的竞争来确定两者是否具有相同的表位。例如，可以通过相互阻断分析(reciprocalblocking assay)检测抗体之间的竞争。例如，竞争性ELISA分析是一种优选的相互阻断分析。具体地说，在相互阻断分析中，在微量滴定板的孔上包被HB-EGF蛋白；在存在或不存在候选竞争性抗体的情况下预孵育；然后加入本发明的抗HB-EGF抗体。已经与孔中的HB-EGF蛋白结合的本发明抗HB-EGF抗体的量与竞争结合相同表位的候选竞争性抗体(测试抗体)的结合活性间接相关。即，测试抗体对同样的表位的亲和力越高，与HB-EGF蛋白包被的孔结合的本发明的抗HB-EGF抗体就越少，测试抗体与HB-EGF蛋白包被的孔结合的量就越大。
可以通过提前标记抗体方便地测定与孔结合的抗体的量。例如，可以使用抗生物素蛋白-过氧化物酶偶联物和合适的底物测定生物素标记的抗体。基于如过氧化物酶的酶标记的相互阻断分析作为竞争性ELISA分析尤其是已知的。可以用某些其它可被检测或测定的标记物标记抗体。具体地说，放射性标记和荧光标记也是已知的。
另外，当测试抗体具有来源于与本发明的抗HB-EGF抗体不同的物种的恒定区时，也可以使用识别该抗体恒定区的标记过的第二抗体测定与孔结合的抗体的量。或者，甚至当抗体来源于相同的物种但种类不同时，可以使用能区分各个种类的第二抗体测定与孔结合的抗体的量。
与在不存在候选竞争性抗体的情况下进行的对照测试中获得的结合活性对比，当候选抗体可以阻断至少20％、优选至少20％-50％、甚至更优选至少50％的抗HB-EGF抗体的结合时，这样的候选竞争性抗体是与本发明的抗HB-EGF抗体结合基本上相同的表位的抗体或竞争结合相同的表位的抗体。
例如，识别HB-EGF蛋白中具有序列APSCICHPGYHGERCHGLSL的区域的抗体是与[10]或[11]中的抗体结合相同表位的抗体的一个优选的例子。
抗体的结合活性
可以利用已知的方法测定抗体的抗原结合活性(Antibodies：ALaboratory Manual.Ed Harlow，David Lane，Cold Spring HarborLaboratory，1988)。例如，可以使用酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、放射性免疫测定(RIA)或免疫荧光法。Antibodies：A Laboratory Manual的第359-420页所述的方法是用于测定抗体对细胞中表达的抗原的结合活性的方法的一个例子。
另外，特别是采用流式细胞仪的方法可以合适地用来测定悬浮于(例如)缓冲液中的细胞表面上表达的抗原与针对该抗原的抗体之间的结合。可用的流式细胞仪的例子如下：FACSCanto^TM II、FACSAria^TM、FACSArray^TM、FACSVantage^TM SE和FACSCalibur^TM(上述装置来自BD Biosciences)和EPICS ALTRA HyPerSort、Cytomics FC 500、EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC和Cell LabQuanta/Cell Lab Quanta SC(上述装置来自Beckman Coulter)。
在一种测定测试HB-EGF抗体对抗原的结合活性的便利方法的例子中，测试抗体与表达HB-EGF的细胞反应，并用识别测试抗体的FITC标记的第二抗体染色。用FACSCalibur(Becton，Dickinson andCompany)测定荧光强度，并用CELL QUEST软件(Becton，Dickinsonand Company)分析。
增殖抑制活性
可以方便地使用以下方法来评价或测定由抗HB-EGF抗体引起的细胞增殖抑制效应。在一种可以用来评价或测定体外细胞增殖抑制效应的方法中，测定活细胞对加入培养基中的[³H]标记的胸苷的摄取作为DNA复制能力的指标。更方便的方法包括MTT法和染料排除法，其中使用显微镜检测细胞排斥染料(例如，台盼蓝)的能力。MTT法利用以下事实：活细胞具有将四唑盐MTT(溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑)转化为蓝色甲产物的能力。更具体地，向测试细胞的培养液中加入配体和测试抗体，并在经过特定时间之后，向培养液中加入MTT溶液，并通过静置一段特定时间使MTT掺入细胞内。结果，黄色化合物MTT被细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶转化为蓝色化合物。溶解蓝色产物以提供着色，对其吸光度的测定提供活细胞计数的指标。除了MTT，如MTS、XTT、WST-1、WST-8等试剂也是可商购的(Nacalai Tesque，Inc.)并可以适当地使用。在活性测定中，以与抗HB-EGF抗体同样的方式使用对照抗体；对照抗体是与抗HB-EGF抗体具有相同的同种型而没有上述细胞增殖抑制活性的结合抗体。当抗HB-EGF抗体显示比对照抗体更强的细胞增殖抑制活性时，该抗体具有细胞增殖抑制活性。
携带肿瘤的小鼠模型也可以用作评价或测定体内细胞增殖抑制活性的方法。例如，可以将其生长受HB-EGF促进的癌细胞皮下或皮内地移植到非人类测试动物内，之后可以在移植当天或第二天开始每天或以多天的间隔静脉内或腹内施用测试抗体。可以通过测量随时间变化的肿瘤大小来评价细胞增殖抑制活性。如同体外评价一样，施用具有相同同种型的对照抗体，且当接受抗HB-EGF抗体的组的肿瘤大小明显小于接受对照抗体的组的肿瘤大小时，该抗体具有细胞抑制活性。当使用小鼠作为非人类测试动物时，适当地采用裸(nu/nu)鼠；由于胸腺的遗传缺失，裸(nu/nu)鼠缺乏T-淋巴细胞功能。使用这种类型的小鼠可以在评价或测定由于施用的抗体导致的细胞增殖抑制活性时，排除测试动物中的T-淋巴细胞的贡献。
抑制细胞增殖的方法
本发明提供了通过将表达HB-EGF的细胞与本发明的抗体接触而抑制该细胞增殖的方法。存在于本发明的细胞增殖抑制剂中的本发明的抗体是上述的结合HB-EGF蛋白的抗体。除了这些细胞需表达HB-EGF以外，对于可以与抗HB-EGF抗体接触的细胞没有特别限制，但优选疾病相关的细胞。癌细胞是疾病相关的细胞的一种优选的例子。癌症优选地是胰癌、肝癌、食道癌、黑素瘤、结直肠癌、胃癌、卵巢癌、子宫颈癌、乳癌、膀胱癌、脑瘤或血液癌。血液癌包括，例如，骨髓瘤、淋巴瘤和白血病。
使用抗HB-EGF抗体的递送方法
本发明涉及一种使用抗HB-EGF抗体将细胞毒性物质递送到细胞内的方法。该方法中使用的抗体是上述的结合有细胞毒性的抗HB-EGF抗体。可以通过将表达HB-EGF的细胞与结合有细胞毒性物质的抗HB-EGF抗体接触实现细胞毒性物质的递送。在本发明中，对于向其递送毒性物质的细胞没有特别的限制，但优选疾病相关的细胞。癌症细胞是疾病相关的细胞的一个例子。癌症优选地是胰癌、肝癌、食道癌、黑素瘤、结直肠癌、胃癌、卵巢癌、子宫颈癌、乳癌、膀胱癌、脑瘤或血液癌。血液癌包括，例如，骨髓瘤、淋巴瘤和白血病。
可以在体外或体内进行本发明的接触。对于其中加入抗体的状态，例如，可以适当地使用通过冷冻干燥获得的固体或溶液。在那些以水溶液形式加入抗体的情况中，可以是只含有纯抗体的水溶液，或者可以是含有(例如)表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲液、悬浮剂、张度剂(tonicity agent)、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、掩味剂等的溶液。对于加入的浓度没有特别的限制，而培养液中的合适的终浓度优选地为1pg/mL-1g/mL，更优选1ng/mL-1mg/mL，甚至更优选1μg/mL-1mg/mL。
在本发明中，也可以通过向其中已植入或移植表达HB-EGF的细胞的非人类动物给药，或通过向荷有表达HB-EGF的癌细胞的动物给药，进行体内“接触”。给药方式可以是口服给药或肠胃外给药。尤其优选肠胃外给药，相应的给药途径可以包括注射、经鼻给药、经肺给药、经皮给药等。至于注射给药的例子，作为细胞增殖抑制剂或抗癌剂的本发明的药物组合物可以通过如静脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射或皮下注射全身施用或局部施用。可以根据受试动物的年龄和症状选择适当的给药方式。在施用水溶液的情况中，该溶液可以是只含有纯抗体的水溶液，或者可以是含有如表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲液、悬浮剂、张度剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、掩味剂等的溶液。剂量可以选自例如每次给药0.0001mg-1000mg/kg体重。或者，剂量可以选自每位患者0.001-100000mg。但是，本发明的抗体的剂量不限于上述剂量。
药物组合物
另一方面，本发明的一个特征是包含可结合HB-EGF蛋白的抗体的药物组合物。本发明的另外一个特征是细胞增殖抑制剂，尤其是抗癌剂，其包含可结合HB-EGF蛋白的抗体。优选向患有癌症的受试者或处于癌症危险的受试者施用本发明的细胞增殖抑制剂和本发明的抗癌剂。
在本发明中，包含可结合HB-EGF蛋白的抗体的细胞增殖抑制剂也涉及包括向受试者施用可结合HB-EGF蛋白的抗体的步骤的抑制细胞增殖的方法，以及可结合HB-EGF蛋白的抗体在产生细胞增殖抑制剂中的用途。
另外，在本发明中，包含可结合HB-EGF蛋白的抗体的抗癌剂涉及包括向受试者施用可结合HB-EGF蛋白的抗体的步骤的预防或治疗癌症的方法，以及可结合HB-EGF蛋白的抗体在产生抗癌剂中的用途。
除了该抗体需具有结合HB-EGF蛋白的能力以外，对于本发明的药物组合物(例如，细胞增殖抑制剂或抗癌剂；同样适用于下文)中存在的抗体没有特别的限制，且也可以使用此处作为实例提供的任何抗体。
本发明的药物组合物的施用方式可以是口服给药或肠胃外给药。尤其优选肠胃外给药，且相应的给药途径可以包括注射、经鼻给药、经肺给药、经皮给药等。至于注射给药的例子，可以通过如静脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射或皮下注射全身施用或局部施用本发明的药物组合物。可以根据患者的年龄和症状选择适当的给药方式。剂量可以选自例如每次给药0.0001mg-1000mg/kg体重。或者，剂量可以选自每位患者0.001-100000mg。但是，本发明的药物组合物不限于上述剂量。
本发明的药物组合物可以根据通常的方法制备(例如，Remington’s Pharmaceutical Science，最新版本，Mack PublishingCompany，Easton，USA)，且可以包含药学上可接受的载体和药学上可接受的添加剂。例子是表面活性剂、赋形剂、着色剂、香料、防腐剂、稳定剂、缓冲液、悬浮剂、张度剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、流动性促进剂、掩味剂等，但对于前述没有限制，且可以适当地使用其它常用的载体。具体的例子有轻硅酐(light silicicanhydride)、乳酸、微晶纤维素、甘露醇、淀粉、羧甲纤维素钙、羧甲纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯乙缩醛二乙氨基醋酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、中链脂肪酸甘油三酯、聚氧乙烯硬化蓖麻油60、蔗糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐等。
生产药物产品的方法
本发明另外提供了生产药物组合物尤其是抗癌剂的方法，包括以下步骤：
(a)提供抗HB-EGF抗体；
(b)确定(a)的抗体是否具有内化活性；
(c)选择具有内化活性的抗体；和
(d)将细胞毒性物质结合在(c)中选择的抗体上。
可以通过上述方法确定内化活性的存在/不存在。另外，抗HB-EGF抗体和细胞毒性物质可以是上述的抗HB-EGF抗体和细胞毒性物质。
癌症诊断
根据HB-EGF表达在如胰癌、肝癌、食道癌、黑素瘤、结直肠癌、胃癌、卵巢癌、子宫颈癌、乳癌、膀胱癌、脑瘤和血液癌等宽范围的癌症中增加的事实，本发明在另外一方面提供了使用抗HB-EGF抗体诊断疾病的方法，尤其是使用抗HB-EGF抗体诊断癌症的方法。
可以通过检测已掺入细胞中的抗HB-EGF抗体进行本发明的诊断方法。本发明中使用的抗HB-EGF抗体优选地具有内化活性，且优选地用标记物质标记。
因此，本发明的诊断方法的一种优选实施方式是使用已用标记物质标记且具有内化活性的抗HB-EGF抗体的诊断方法。上述的抗HB-EGF抗体可以用于将要与标记物质结合的抗HB-EGF抗体。
结合在抗HB-EGF抗体上的标记物质没有特别的限制，可以使用本领域技术人员已知的那些标记物质，例如，荧光染料、酶、辅酶、化学发光物质、放射性物质等。具体的例子有放射性同位素(例如，³²p、¹⁴C、¹²⁵I、³H、¹³¹I等)、荧光素、罗丹明、丹磺酰氯、伞形酮(umbelliferone)、萤光素酶、过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、辣根过氧化物酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶、微过氧化物酶、生物素等。当使用生物素作为标记物质时，优选加入生物素标记的抗体，接着加入附着在如碱性磷酸酶的酶上的生物素。可以使用已知方法将标记物质附着在抗HB-EGF抗体上，例如，戊二醛法、马来酰亚胺法、吡啶二硫化物法、高碘酸法等。可以通过本领域技术人员已知的程序将标记物质附着在抗体上。
当癌症是通过本发明的方法诊断的疾病时，对于癌症的类型没有特别限制，但癌症优选地是胰癌、肝癌、食道癌、黑素瘤、结直肠癌、胃癌、卵巢癌、子宫颈癌、乳癌、膀胱癌、脑瘤或血液癌。血液癌包括，例如，骨髓瘤、淋巴瘤和白血病。
可以在体内或在体外进行本发明的诊断。
例如，可以按照包括以下步骤的方法进行体外诊断：
(a)提供从受试者收集的样品；
(b)将来自(a)的样品与结合有标记物质的抗HB-EGF抗体接触；和
(c)检测已掺入细胞中的抗体。
对于收集的样品没有特别的限制，可以包括从受试者收集的细胞和从受试者收集的组织。本发明中使用的样品也包括从测试样品获得的次级样品，例如，细胞培养液或通过固定从活生物体收集的组织或细胞而制备的样本。
例如，可以按照包括以下步骤的方法进行体内诊断：
(a)向受试者施用标记的抗HB-EGF抗体；和
(b)检测已掺入癌细胞中的抗体。
本领域技术人员可以根据诸如标记物质的类型、待诊断的疾病等适当地设定抗HB-EGF抗体的剂量。可以使用上述方法制备标记的抗HB-EGF抗体。
本发明另外提供了生产诊断试剂尤其是癌症诊断试剂的方法，包括以下步骤：
(a)提供抗HB-EGF抗体；
(b)确定(a)的抗体是否具有内化活性；
(c)选择具有内化活性的抗体；和
(d)将标记物质与(c)中选择的抗体结合。
可以通过上述的方法确定内化活性的存在/不存在。另外，抗HB-EGF抗体和标记物质可以是上述的抗HB-EGF抗体和标记物质。
说明书中明确引用的所有专利和参考文献的内容完整引入本文作为参考。日本专利申请2006-286824和2007-107207(该申请构成本申请引用的优先权的基础)的说明书和附图的内容也完整引入本文作为参考。
实施例
通过下面提供的实施例更详细地描述本发明，但本发明并不限于这些实施例。
免疫
1-1.免疫原的产生
1-1-1.HB-EGF表达载体的构建
为了构建HB-EGF表达载体，首先如下所述克隆HB-EGF基因。使用人类心脏cDNA(human Marathon Ready cDNA，ClontechLaboratories，Inc.)作为模板，使用Pyrobest Taq聚合酶(Takara BioInc.)进行RT-PCR，并克隆全长HB-EGF基因。
EGF-1：ATGAAGCTGCTGCCGTCGGTG(SEQ ID NO：51)
EGF-2：TCAGTGGGAATTAGTCATGCCC(SEQ ID NO：52)
(94℃/30秒，65℃/30秒，72℃/60秒：35个循环)
使用获得的PCR产物作为模板，在下面给出的条件下进行第二次PCR，获得全长HB-EGF cDNA片段，其中分别在5′和3′末端添加了SalI和NotI酶切序列。
EGF-3：TAAGTCGACCACCATGAAGCTGCTGCCGTCGGTG(SEQ ID NO：53)
EGF-4：
TTTGCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTGGGAATTAGTCATGCCCAAC(SEQ ID NO：54)
(94℃/30秒，65℃/30秒，72℃/60秒：25个循环)
用SalI和NotI消化该片段，并将该片段插入同样已用SalI和NotI消化的用于动物细胞的表达载体(pMCN)中，从而构建HB-EGF表达载体(pMCN_HB-EGF)。
1-1-2.HB-EGF_Fc融合蛋白表达载体的构建
使用HB-EGF的胞外域与小鼠IgG2a的Fc区的融合蛋白(HB-EGF_Fc)作为获得HB-EGF中和抗体的免疫原。用于免疫的融合蛋白的结构如图1所示。
如下所述构建小鼠Fc区/HB-EGF融合蛋白的表达载体。首先，使用HB-EGF表达载体(pMCN_HB-EGF)作为模板，在下面的条件下使用Pyrobest Taq聚合酶(Takara Bio Inc.)进行PCR。
EGF-5：AAAGAATTCCACCATGAAGCTGCTGCCGTC(SEQ IDNO：55)
EGF-6：
TATCGGTCCGCGAGGTTCGAGGCTCAGCCCATGACACCTC(SEQID NO：56)
(94℃/30秒，68℃/30秒，72℃/30秒：25个循环)
然后用EcoRI和CpoI消化获得的PCR产物。将产生的DNA片段插入到含有小鼠IgG2a_Fc的动物细胞表达载体(pMCDN_mIgG2a_Fc)的EcoRI和CpoI之间，以构建HB-EGF-Fc表达载体(pMCDN_HB-EGF-Fc)。
1-1-3.HB-EGF_Fc产生株的产生
通过以1.5kV、25μF电穿孔(来自Bio-Rad Laboratories，Inc.的基因脉冲器)，将已通过使用pvuI消化而线性化的15μgHB-EGF-Fc表达载体pMCDN_HB-EGF-Fc转染到悬浮于PBS(-)中的DG44细胞(1×10⁷细胞/mL，800μL)内。在用含有青霉素/链霉素(PS)的生长培养基(CHO-S-SFM II，Invitrogen Corporation)稀释到合适的细胞计数之后，将细胞接种到96孔板上，第二天加入500μg/mL G418(遗传霉素，Invitrogen Corporation)。大约2周后，在显微镜下选择具有单克隆的孔，并使用每孔10μL培养上清液进行SDS-PAGE。使用PVDF膜和山羊抗HB-EGF抗体(AF-259-NA，R&DSystems，Inc.)和HRP-抗山羊抗体(ACI3404，BioSource)，通过Western印迹法筛选产生HB-EGF-Fc的细胞株。选择最高产量的细胞株并进行扩大培养。
1-1-4.HB-EGF_Fc蛋白质的纯化
使用Hi Trap Protein G HP 1mL柱(Amersham Biosciences#17-0404-01)从获得的HB-EGF_Fc产生株的培养上清液中纯化HB-EGF_Fc蛋白质。以1mL/分钟的流速吸附培养上清液，接着用20mL 20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗涤，然后用3.5mL 0.1M甘氨酸-HCl(pH2.7)洗脱。在Eppendorf管中以0.5mL的级分回收洗脱物，其中每管已包含50μL 1M Tris-HCl(pH9.0)。测定OD_280nm。合并含有靶蛋白质的级分，加入PBS(-)以达到2.5mL的总量，然后使用PD-10柱(Amersham Biosciences#17-0851-01)用PBS(-)替换缓冲液。使纯化的蛋白质通过0.22μm的过滤器(Millipore#SLGV033RS)并在4℃储存。
1-2.免疫
用完全佐剂(DIFCO DF263810)制备HB-EGF_Fc蛋白质的乳剂用于首次免疫，用不完全佐剂(DIFCO DF263910)制备用于第二次和随后的免疫。通过以50μg/鼠的剂量皮下注射(1mL Thermo注射器，26号针头)免疫三只动物[(MRL/lpr，雄性，鼠龄：4周)(balb/c，雌性，鼠龄：6周)，都购自Charles River Japan]。在首次免疫两周后，给予第二次免疫，并且以一周的间隔给予总共4-5次免疫。对于最后一次免疫，将HB-EGF_Fc(50μg)悬浮于100μL PBS中，并注射到尾静脉中；3天后进行细胞融合。
1-3.杂交瘤的产生
如下进行细胞融合。无菌条件下从小鼠中取出脾，并通过在培养基1(RPMI1640+PS)中研磨制备单细胞悬浮液。使悬浮液通过70μm的尼龙筛(Falcon)以除去脂肪组织等，并对细胞计数。将获得的B细胞与小鼠骨髓瘤细胞(P3U1细胞)以大约2∶1的细胞计数比例混合；加入1mL 50％PEG(Roche，cat#783 641)；并进行细胞融合。将融合细胞悬浮于培养基2(RPMI1640+PS，10％FCS，HAT(Sigma，H0262)，5％BM Condimed H1(Roche#1088947))中，以200μL/孔的量分配到适当数目的96孔板(10个板)中，并于37℃培养。一周后，使用培养上清液筛选杂交瘤，并分析杂交瘤。源自两只Balb/c小鼠的杂交瘤分别被命名为HA系列和HB系列，源自一只Mrl/lpr小鼠的杂交瘤被命名为HC系列。
抗HB-EGF中和抗体的筛选
2-1.表达HB-EGF的人细胞株的产生
2-1-1.HB-EGF_DG44株的产生
如下建立表达HB-EGF的DG44细胞株。首先，将如1-1-1所述构建的15μg HB-EGF表达载体pMCN_HB-EGF用pvuI消化，并通过使用与1-1-3中所述相同的程序的电穿孔将其转染到DG44细胞内。然后，挑选出G418抗性株，并用山羊抗HB-EGF抗体(R&DSystems，Inc.)和FITC-标记的抗山羊IgG抗体对细胞染色。用FACSCalibur(Becton，Dickinson and Company)分析在细胞表面上表达的HB-EGF，并选择高表达的克隆。
2-1-2.HB-EGF_Ba/F3株的产生
如下建立在细胞膜上表达HB-EGF的Ba/F3细胞株。用蛋白酶处理在细胞膜上表达的HB-EGF并切下进入培养基中。因此，首先构建在蛋白酶酶切位点处突变的proHB-EGF的表达载体。
使用pMCN-HB-EGF作为模板，使用下面的两组条件和PyrobestTaq聚合酶(Takara Bio Inc.)进行单独的PCR。
PCR反应1
EGF-3：TAAGTCGACCACCATGAAGCTGCTGCCGTCGGTG(SEQ ID NO：53)
EGF-7：
CGATTTTCCACTGTGCTGCTCAGCCCATGACACCTCTC(SEQ IDNO：57)
(94℃/30秒，68℃/30秒，72℃/30秒：20个循环)
PCR反应2
EGF-8：
TGGGCTGAGCAGCACAGTGGAAAATCGCTTATATACCTA(SEQID NO：58)
EGF-4：
TTTGCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTGGGAATTAGTCATGCCCAAC(SEQ ID NO：54)
(94℃/30秒，68℃/30秒，72℃/30秒：20个循环)
然后混合通过PCR反应1和2获得的两个DNA片段；使用Pyrobest Taq聚合酶(Takara Bio Inc.)进行重组反应(94℃/30秒，72℃/60秒：5个循环)；接着在以下条件下使用1μL的前述反应溶液作为模板进行PCR。
EGF-3：TAAGTCGACCACCATGAAGCTGCTGCCGTCGGTG(SEQ ID NO：53)
EGF-4：
TTTGCGGCCGCTCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTGGGAATTAGTCATGCCCAAC(SEQ ID NO：54)
(94℃/30秒，68℃/30秒，72℃/60秒：22个循环)
用SalI和NotI消化获得的PCR产物，接着将片段插入同样已用SalI和NotI消化的用于动物细胞的表达载体(pMCN)中，以构建proHB-EGF表达载体(pMCN-MHB-EGF)。
然后如下所述产生表达proHB-EGF的Ba/F3细胞株。用pvuI酶切15μg以上构建的proHB-EGF表达载体pMCN-MHB-EGF，然后通过以0.33kV、950μF电穿孔(来自Bio-Rad Laboratories，Inc.的基因脉冲器)将其转染到悬浮于PBS(-)中的Ba/F3细胞(1×10⁷细胞/mL，800μL)中。然后在96孔板中在含有1ng/mL IL-3和500μg/mLG418的培养基(RPMI140，10％FCS，PS)中培养这些细胞，两周后，挑选出G418抗性株。用山羊抗HB-EGF抗体(R&D Systems，Inc.)和FITC-标记的抗小鼠IgG抗体(Beckman Coulter，PN IM0819)对细胞染色，并根据FACS(Becton，Dickinson and Company)选择呈现出高水平表达细胞表面HB-EGF的克隆。
2-2.表达HB-EGF的SKOV-3细胞的产生
如下所述建立表达HB-EGF的SKOV-3细胞株。在含有10％FCS和青霉素/链霉素(P/S)的生长培养基(McCoy’s 5A培养基，InvitrogenCorporation)中培养一种卵巢癌细胞株SKOV-3(购自ATTC)。
用pvuI消化1-1-1中构建的15μg HB-EGF表达载体pMCN_HB-EGF。接着通过以1.5kV、25μF电穿孔(来自Bio-RadLaboratories，Inc.的基因脉冲器)，将其转染到悬浮于PBS(-)中的SKOV-3细胞(1×10⁷细胞/mL，800μL)中。使用上述生长培养基稀释到合适的细胞计数后，将细胞接种到96孔板中。第二天以500μg/mL的量加入G418(遗传霉素，Invitrogen Corporation)。大约2周后，选择G418抗性单克隆并通过Western印迹法筛选表达HB-EGF的细胞株。选择最高产量的细胞株并用于随后的实验中。
2-3.显示HB-EGF-依赖性生长的EGFR_Ba/F3细胞株的产生
2-3-1.pCV-hEGFR/G-CSFR的构建
为了评价本发明的抗体的活性，构建表达由人EGFR的胞外区和小鼠G-CSFR的胞外区组成的嵌合受体(hEGFR/mG-CSFR)的载体。当HB-EGF与表达该嵌合受体的细胞结合时，对该细胞的效应如图2a所示。
为了克隆编码人表皮生长因子受体(EGFR)的胞外区的基因，用人类肝cDNA(Marathon Ready cDNA，Clontech Laboratories，Inc.)作为模板，使用下面列出的引物组进行PCR。SEQ ID NO：59和SEQID NO：60分别显示人EGFR的碱基序列(MN_005228)和氨基酸序列(NP_005219)。
EGFR-1：ATGCGACCCTCCGGGACGGC(SEQ ID NO：61)
EGFR-2：CAGTGGCGATGGACGGGATCT(SEQ ID NO：62)
(94℃/30秒，65℃/30秒，72℃/2分钟：35个循环)
从琼脂糖凝胶上切下扩增的cDNA(大约2Kb)，并插入到pCR-TOPO载体(Invitrogen Corporation)中。分析插入该质粒中的片段的碱基序列，并确认获得的EGFR基因具有正确的序列。然后用上述获得的质粒作为模板，使用下面的引物组进行PCR。
EGFR-5：TTGCGGCCGCCACCATGCGACCCTCCGGGACGGC(SEQ ID NO：63)
EGFR-6：
ACCAGATCTCCAGGAAAATGTTTAAGTCAGATGGATCGGACGGGATCTTAGGCCCATTCGT(SEQ ID NO：64)
(94℃/30秒，68℃/30秒，72℃/2分钟：25个循环)
获得编码EGFR胞外区并具有5′NotI位点和3′BglII位点的基因片段。用NotI-BglII消化该片段，并将其插入pCV_mG-CSFR中的NotI-BamHI之间。
通过用来自人G-CSF的poly(A)添加信号替换pCOS1(国际公开第WO 98/13388号)的poly(A)添加信号来构建表达质粒载体pCV。用EcoRI和XbaI消化pEF-BOS(Mizushima S.等人，Nuc.Acids Res.18，5322(1990))以获得源自人G-CSF的poly(A)添加信号片段。将此片段插入pBacPAK8(Clontech Laboratories，Inc.)的EcoRI/XbaI位点处。用EcoRI消化之后，平端处理并用BamHI消化两个末端，从而产生在5′末端添加有BamHI位点和具有平端化3′末端的含有来源于人G-CSF的poly(A)添加信号的片段。该片段在BamHI/EcoRV位点与pCOS1的poly(A)添加信号交换，产生被命名为pCV的表达质粒载体。
pCV_mG-CSFR在pCV中包含从位点623处的天冬酰胺残基到C末端的小鼠G-CSF受体，其是胞内区域。在SEQ ID NO：65中显示小鼠G-CSF受体的碱基序列(M58288)，在SEQ ID NO：66中显示小鼠G-CSF受体的氨基酸序列(AAA37673)。但是，由于在pCV_mG-CSFR的插入序列的N-末端区的编码cDNA序列中产生了BamHI位点(限制性酶切位点)，SEQ ID NO：66中位点632处的甘氨酸残基被谷氨酸残基替换。
通过证实插入pCV_mG-CSFR中的基因片断的碱基序列，完成了表达由人EGFR的胞外区和小鼠G-CSFR的胞内区组成的嵌合受体hEGFR/mG-CSFR的载体pCV_hEGFR/mG-CSFR的构建。
在SEQ ID NO：67和SEQ ID NO：68中分别显示由表达载体表达的蛋白质(即，人EGFR/小鼠G-CSFR嵌合受体)的碱基序列和氨基酸序列。
2-3-2.HB-EGF依赖性细胞株的产生
通过以0.33kV、950μF电穿孔(基因脉冲器，Bio-RadLaboratories，Inc.)，将通过用pvuI消化而线性化的15μghEGFR/mG-CSFR嵌合受体表达载体pCV_hEGFR/mG-CSFR转染到Ba/F3细胞内。在含有10ng/mL HB-EGF和500μg/mL G418的培养基(RPMI1640，10％FCS，PS)中培养这些细胞2周，并挑选出出现的集落。
然后在下面的实验中确定获得的细胞株是否显示出依赖于HB-EGF浓度的生长。在0-100ng/mL HB-EGF(R&D Systems，Inc.，259-HE)的存在下，以1×10³细胞/孔的密度向96孔板上接种EGFR_Ba/F3细胞，接着培养3天。然后根据说明书使用WST-8试剂(细胞计数试剂盒-8，Dojindo Laboratories)确定细胞计数。
结果表明，以依赖于HB-EGF浓度的方式促进建立的EGFR_Ba/F3细胞株的生长(图2b)。
2-4.杂交瘤筛选
2-4-1.对结合HB-EGF的抗体的筛选(初步筛选)
为了获得抗HB-EGF中和抗体，首先筛选结合HB-EGF的抗体。使用ELISA和FACS来筛选结合抗体。
2-4-1-1.ELISA
杂交瘤培养上清液通过在1μg/mL HB-EGF蛋白(R&D Systems，Inc.，259-HE)包被的ELISA板(NUNC)中孵育1小时发生反应。接着与碱性磷酸酯酶(AP)标记的抗小鼠IgG(Zymed Laboratories，Inc.，#62-6622)反应1小时，之后通过加入1mg/mL底物(Sigma，S0942-50TAB)显色。用读板器(Bio-Rad Laboratories，Inc.)测定OD₄₀₅，并选择ELISA阳性孔。
2-4-1-2.FACS
向HB-EGF_Ba/F3细胞(大约1×10⁵细胞)加入杂交瘤培养上清液，并在4℃孵育1小时。然后加入FITC标记的抗小鼠IgG抗体(Beckman Coulter，PN IM0819)，并在4℃孵育30分钟。然后通过FACS(Becton，Dickinson and Company)分析每一种杂交瘤培养上清液对细胞表面HB-EGF的结合活性。
2-4-1-3.有限稀释
为了将根据ELISA或FACS分析显示HB-EGF结合活性的克隆分为单克隆，进行有限稀释(LD)。测定阳性孔中的细胞计数，并向96孔板上接种以提供3个细胞/孔。在培养大约10天后，再次通过对已经出现集落的孔中的培养上清液进行ELISA或FACS分析结合活性。使用这一系列步骤，在HA系列中获得5个显示HB-EGF结合活性的单克隆，在HB系列中获得4个显示HB-EGF结合活性的单克隆，在HC系列中获得5个显示HB-EGF结合活性的单克隆。
2-4-1-4.亚型确定
使用IsoStrip(Roche#1,493,027)确定抗体亚型。用PBS(-)稀释10倍的杂交瘤培养上清液用于亚型确定。
表1分离的抗体的特征

2-4-2.抗体纯化
使用HiTrap Protein G HP 1mL柱(Amersham Biosciences#17-0404-01)，从获得的单克隆杂交瘤的80mL培养上清液中纯化抗体。以1mL/min的流速吸附杂交瘤上清液，接着用20mL 20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗涤，然后用3.5mL 0.1M甘氨酸-HCl(pH2.7)洗脱。在Eppendorf管中以0.5mL的级分回收洗脱物，其中每个管已包含50μL 1M Tris-HCl(pH9.0)。测定OD_280nm。合并含有抗体的级分，加入PBS(-)以达到2.5mL的总量，然后使用PD-10柱(Amersham Biosciences#17-0851-01)用PBS(-)替换缓冲液。使纯化的抗体通过0.22μm的过滤器(Millipore#SLGV033RS)，并如下详细研究各个纯化的抗体的性质。
2-4-3.在EGFR_Ba/F3细胞中的生长中和活性的分析(第二筛选)
分析每种纯化的抗体对EGFR_Ba/F3的HB-EGF依赖性生长的中和活性。在HB-EGF(80ng/mL)的存在下，以2×10⁴细胞/孔的密度向96孔板上接种EGFR_Ba/F3细胞，并以0-200ng/mL的量加入特定的纯化抗体。培养3天后，使用WST-8(细胞计数试剂盒-8)测定细胞计数。
结果表明，HA系列中的HA-20、HB系列中的HB-20和HC系列中的HC-20显示强中和活性(图3a-3c)。
HB-EGF中和抗体(HA-20、HB-20、HC-15)的性质的分析
3-1.HA-20、HB-20和HC-15的可变区的克隆和氨基酸序列的测定
使用Trizol(#15596-018，Life Technologies)从大约5×10⁶个杂交瘤中纯化总RNA。使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(ClontechLaboratories，Inc.，#PT3269-1)，根据试剂盒提供的手册，由1μg获得的总RNA进行全长cDNA合成。对于每种抗体，使用获得的cDNA作为模板和使用Advantage 2PCR Enzyme System(ClontechLaboratories，Inc.#PT3281-1)，扩增编码重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的基因。
轻链可变区的克隆引物
UPM-k(VL-k)
UPM：试剂盒提供
VL-k：GCT CAC TGG ATG GTG GGA AGA TG(SEQ ID NO：69)
重链可变区的克隆引物
HA-20：UPM-VH-G1
HB-20，HC-15：UPM-VH-2a
UPM：试剂盒提供
VH-G1：GGG CCA GTG GAT AGA CAG ATG(SEQ ID NO：70)
VH-2a：CAG GGG CCA GTG GAT AGA CCG ATG(SEQ ID NO：71)
94℃/5秒，72℃/2分钟，5个循环
94℃/5秒，70℃/10秒，72℃/2分钟5个循环
94℃/5秒，68℃/10秒，72℃/2分钟，27个循环
将在前述步骤中扩增的基因片段TA-克隆到pCRII-TOPO(Invitrogen TOPO TA-克隆试剂盒，#45-0640)内，并测定每个插入片段的碱基序列。测定的可变区序列如图4所示。
3-2.活性型HB-EGF的结合活性的分析
为了比较这样获得的3种抗体(HA-20、HB-20、HC-15)结合活性型HB-EGF蛋白的能力，进行下面的实验。HA-20、HB-20或HC-15抗体在1μg/mL HB-EGF蛋白(R&D Systems，Inc.，259-HE)包被的板(NUNC)中以各种浓度反应。接着与碱性磷酸酯酶(AP)标记的抗小鼠IgG(Zymed Laboratories，Inc.，#62-6622)反应1小时，并加入1mg/mL底物(Sigma，S0942-50TAB)用于显色。用读板器测定OD₄₀₅，并根据用特定抗体获得的结合曲线计算达到50％结合的抗体浓度(ED₅₀)。至于对活性型HB-EGF的结合活性，观察到0.2-1.4nM的ED₅₀值，因而发现在所有情况中存在强结合活性(图5)。
表2.抗体HA-20、HB-20和HC-15结合HB-EGF的ED₅₀值mAb HB-EGF结合(ED50，nmol/L)

3-3.对proHB-EGF的结合活性的分析
然后分析获得的3种抗体对proHB-EGF的结合活性。在含有10％FCS的生长培养基(Ham’s F12培养基，Invitrogen Corporation)中培养RMG1细胞(卵巢癌细胞株，购自Japan Health SciencesFoundation)，已知其内在地表达HB-EGF。每种抗体(10μg/mL)在4℃下与内在地表达HB-EGF的RMG1细胞以及Ba/F3细胞(HB-EGF_Ba/F3)、表达HB-EGF的DG44细胞(HB-EGF_DG44)和SKOV-3细胞(HB-EGF_SKOV-3)(后三者是过量表达HB-EGF的细胞)反应1小时，接着用FITC标记的抗小鼠IgG抗体(BeckmanCoulter，PN IM0819)染色。然后通过FACS(Becton，Dickinson andCompany)分析每种抗体与细胞表面HB-EGF的结合。
图6所示的图中比较了根据FACS分析，HA-20、HB-20和HC-15抗体对RMG1细胞中内在表达的proHB-EGF和Ba/F3、DG44和SKOV-3细胞中过量表达的proHB-EGF的结合活性。灰色波形显示在缺乏第一抗体的情况下的染色图(对照)，而实线显示在存在特定抗体的情况下的染色图。横轴表示染色强度，纵轴表示细胞数。如图6所示，HB-20和HC-15识别在细胞膜上过量表达的HB-EGF和卵巢癌细胞株在细胞膜上内在表达的HB-EGF，而HA-20根本不结合或只是非常弱地结合。这些结果表明，HA-20是一种强力地结合活性型HB-EGF而不识别proHB-EGF的抗体。
3-4.中和活性的分析
3-4-1.抑制EGFR/HB-EGF结合的能力的固相分析
3-4-1-1.EGFR-Fc蛋白质的产生
为了构建在固相条件下可以检验HB-EGF与其受体(EGFR)之间的结合的ELISA系统，首先制备EGFR的胞外区与人IgG1的Fc区的融合蛋白(EGFR-Fc)作为受体蛋白质。HB-EGF抗体在固相上抑制HB-EGF与EGFR之间的结合的模式如图7所示。
首先构建EGFR-Fc表达载体。使用以下的引物并使用在实施例2-3-1中构建的pCV_hEGFR/mG-CSFR作为模板进行PCR。
EGFR-7：GTTAAGCTTCCACCATGCGACCCTCCGGGAC(SEQID NO：72)
EGFR-8：GTTGGTGACCGACGGGATCTTAGGCCCATTCGTTG(SEQ ID NO：73)
(94℃/30秒，72℃/30秒：25个循环)
用BstEII和HindIII酶切扩增的编码EGFR的胞外区的基因片段，并将其插入pMCDN2-Fc中的BstEII-HindIII之间。确认插入的基因片段的碱基序列，以完成表达人EGFR的胞外区与人IgG1的Fc区的融合蛋白(EGFR-Fc)的载体(pMCDN2_EGFR-Fc)的构建。由表达载体表达的蛋白质(即，EGFR-Fc)的碱基序列和氨基酸序列分别在SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：75中显示。
然后如下建立产生EGFR-Fc蛋白质的细胞株。首先用pvuI消化15μgEGFR-Fc表达载体pMCDN2_EGFR-Fc，然后通过电穿孔将其转染到DG44细胞内。随后通过Western印迹法分析在G418抗性株的培养上清液中产生的EGFR-Fc蛋白质。因此，通过SDS-PAGE分离10μL特定培养上清液；印迹在PVDF膜上；并用HRP标记的抗人IgG抗体(Amersham，NA933V)检测靶蛋白。选择产生水平最高的克隆，进行扩大培养，并回收培养上清液。
如下进行EGFR-F蛋白质的纯化。获得的EGFR-Fc产生株的培养上清液以1mL/min的流速吸附在HiTrap Protein G HP 1mL柱(Amersham Biosciences#17-0404-01)上。在用20mL 20mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗涤后，用3.5mL 0.1M甘氨酸-HCl(pH2.7)洗脱蛋白质。为了鉴别包含靶蛋白的级分，通过SDS-PAGE分离各10μL的回收级分，接着进行Western印迹法和考马斯亮蓝染色。使用PD-10柱(Amersham Biosciences#17-0851-01)用PBS(-)替换缓冲液。纯化的蛋白质通过0.22μm的过滤器(Millipore#SLGV033RS)，并在4℃储存。
3-4-1-2.使用ELISA对HB-EGF与EGFR之间的结合的分析
纯化的EGFR-Fc以0.5μg/mL的浓度在抗人IgG抗体包被的ELISA板中反应1小时。0-250ng/mL HB-EGF(R&D Systems，Inc.，259-HE)反应1小时，接着用生物素标记的抗HB-EGF抗体(R&DSystems，Inc.，BAF259)和AP标记的链霉抗生物素蛋白(Zymed，#43-8322)检测结合EGFR-Fc的HB-EGF蛋白。使用ELISA分析EGFR/HB-EGF结合模式的模型如图8所示。结果表明，用固相系统从大约4ng/mL的浓度开始可以检测到HB-EGF与EGFR的结合(图9)。
3-4-1-3.对HB-EGF/EGFR结合的抗体介导的抑制活性的分析
使用前述的固相系统分析2-4-2中获得的抗体对HB-EGF/EGFR结合的抑制活性。向固定有EGFR-Fc的ELISA板中加入各抗体和HB-EGF(50ng/mL)，并在室温下反应1小时。用TBS-T洗板并通过前述步骤检测结合EGFR的HB-EGF(图10)。
对于全部抗体都观察到浓度依赖性的抑制结合的活性，确定HA-20、HB-20和HC-15有特别强的结合抑制。
3-4-2.对EGFR_Ba/F3细胞的生长抑制活性
比较HA-20、HB-20和HC-15对EGFR_Ba/F3细胞的HB-EGF依赖性生长的中和活性。如上所述，在HB-EGF(80ng/mL)的存在下，以2×10⁴细胞/孔的密度向96孔板中接种EGFR_Ba/F3细胞，并加入特定的纯化抗体。培养3天后，使用WST-8(细胞计数试剂盒-8)测定细胞计数，并构建生长曲线。根据获得的结果，计算处于最大抑制效应的50％时的抗体浓度(EC₅₀值)。
根据结果，HC-15显示对EGFR_Ba/F3细胞有最强的生长抑制效应(EC₅₀＝3.8nM)，接下来是HA-20(EC₅₀＝32.6nM)和HB-20(EC₅₀＝40.3nM)(图11)。
表3.HA-20、HB-20和HC-15抗体显示的对EGFR_Ba/F3细胞的生长抑制效应的ED₅₀值

3-4-3.对RMG-1细胞的生长抑制活性
如下分析对RMG-1细胞的中和活性。将RMG-1细胞(6×10³细胞/孔)接种到96孔板中的含有8％或2％FCS的Ham’s F12培养基中，然后加入特定抗体。培养一周后，使用WST-8试剂测定细胞计数。
根据结果，HA-20以抗体浓度依赖性的方式抑制RMG-1细胞的生长(图12)。在2％FCS浓度时，生长抑制活性尤其明显。
3-5.由抗体的内化活性介导的细胞毒性的分析
3-5-1.内化活性介导的细胞死亡诱导的评价系统
使用肥皂草毒蛋白(毒素)标记的抗小鼠IgG抗体(Mab-ZAP，Advanced Targeting Systems)评价通过抗体内化诱导细胞死亡的活性。首先通过混合第一抗体和Mab-ZAP并在室温下反应15分钟，制备间接毒素标记的抗体，并向靶细胞加入。当加入的抗体内化到细胞内时，Mab-ZAP也与第一抗体一起掺入到细胞中，导致在细胞内释放的肥皂草毒蛋白诱导细胞死亡。这在图13中示意性地显示。
3-5-2.在高表达HB-EGF的细胞株中内化介导的细胞死亡的诱导
使用HC-15检测抗体通过内化活性诱导细胞死亡的能力。以2×10³细胞/孔的密度向96孔板中接种SKOV-3细胞和HB-EGF_SKOV3细胞(过量表达HB-EGF的SKOV-3细胞)。过夜培养后，Mab-ZAP以100ng/孔的量与获得的抗HB-EGF抗体(100ng/孔)反应，并向细胞加入。加入抗体4天后，使用WST-8进行活细胞计数。对于仅微弱地表达HB-EGF的原始SKOV-3细胞，任何抗体都没有观察到诱导细胞死亡的能力；但是，对于过量表达HB-EGF的SKOV-3细胞，每种抗体在Mab-ZAP存在下都观察到细胞死亡诱导活性。尤其观察到结合proHB-EGF的HB-20和HC-15的强细胞死亡诱导活性(图14)。
3-5-3.在卵巢癌株中内化介导的细胞死亡诱导
3-5-3-1.对卵巢癌株(ES-2)的细胞毒性的分析
3-5-3-1-1.各抗体对ES-2的结合活性
然后研究在内在地表达HB-EGF的卵巢细胞株(ES-2)中诱导细胞死亡的能力。ES-2细胞(卵巢癌细胞株，购自ATTC)在含有10％FCS和青霉素/链霉素(P/S)的生长培养基(McCoy’s 5A培养基，Invitrogen Corporation)中培养。
首先使用FACS分析每种抗体与ES-2细胞的细胞表面结合的能力。用1mM EDTA剥离细胞；在4℃下在FACS缓冲液(含有2％FCS和0.05％NaN₃的PBS)中，细胞和特定的抗体(10μg/mL)反应1小时；并用FITC标记的抗小鼠IgG抗体(Beckman Coulter，PNIM0819)在4℃下染色30分钟。使用FACS(Becton，Dickinson andCompany)分析与细胞表面上表达的HB-EGF结合的抗体。
图15提供了经FACS分析比较HA-20、HB-20和HC-15抗体对ES-2细胞的结合活性的图。灰色波形表示在缺乏第一抗体的情况下的染色图(对照)，而实线表示在存在特定抗体的情况下的染色图。横轴表示染色强度，纵轴表示细胞数。如图15所示，尤其是对于HC-15，检测到与ES-2细胞的细胞膜上表达的HB-EGF的结合。
3-5-3-1-2.在ES-2中诱导细胞死亡的能力
研究了每种抗体对ES-2细胞的内化介导的细胞毒性。以2×10³细胞/孔的密度向96孔板中接种ES-2细胞。过夜培养后，特定抗体(100ng/孔)与Mab-ZAP(100ng/孔)反应，并向细胞加入。3天后，使用WST-8进行活细胞计数。根据图16所示的结果，对于显示最强的HB-EGF结合活性的HC-15，在Mab-ZAP的存在下观察到细胞死亡诱导活性。
3-5-3-2.抑制卵巢癌细胞株(RMG-1、MCAS)生长的能力的分析
3-5-3-2-1.HC-15对MCAS和RMG-1的结合活性
然后使用单独的卵巢癌细胞株(RMG-1、MCAS)研究抗体抑制生长的能力。MCAS细胞(购自JCRB)在含有20％FCS的生长培养基(Eagle基本必需培养基，Invitrogen Corporation)中培养。
为了研究MCAS和RMG-1在细胞表面上是否表达HB-EGF和表达程度，使用HC-15抗体进行FACS分析。用1mM EDTA剥离细胞；在4℃下在FACS缓冲液(含有2％FCS和0.05％NaN₃的PBS)中，细胞和HC-15抗体(10μg/mL)反应1小时；并用FITC标记的抗小鼠IgG抗体(Beckman Coulter，PN IM0819)在4℃下染色30分钟。使用FACS(Becton，Dickinson and Company)分析与细胞表面上表达的HB-EGF结合的抗体。
图17提供了经FACS分析比较HC-15抗体对RMG-1和MCAS细胞的结合活性的图。显示出在RMG-1细胞和MCAS细胞的细胞表面上都表达HB-EGF。
3-5-3-2-2.使用软琼脂集落形成试验对抗体抑制RMG-1和MCAS增殖能力的分析
然后使用软琼脂集落形成试验研究抗体对RMG-1和MCAS细胞的不依赖贴壁的增殖的活性。如下所述进行软琼脂集落形成试验。
为了制备琼脂底，以100μL/孔的浓度向96孔板的每孔中加入含有0.6％琼脂(3∶1NuSieve，Cambrex)的MEM培养基。然后以8000细胞/孔的密度将细胞悬浮于含有0.3％琼脂的培养基中。将每种测试物(抗体、Mab-ZAP)与细胞一起混合到琼脂中；以100μL/孔的浓度将制备物滴加到琼脂底上。在37℃下培养3周到1个月后，用1％氯化碘硝基四唑盐(Sigma，18377)对出现的集落染色，并在显微镜下检查集落。
首先分析各抗体(HA-20、HC-15)对RMG-1细胞集落形成的作用。将HA-20或HC-15抗体混合到RMG-1细胞中以提供50μg/mL，并在大约3周后观察琼脂中形成的集落。根据结果，与未添加组相比，在HC-15抗体添加组中RMG-1细胞的集落形成受到抑制(图18)。因而发现，HC-15抗体仅单独通过其中和活性就可以抑制RMG-1细胞的不依赖贴壁的集落形成。
然后分析HA-20和HC-15抗体的毒素介导的抑制集落形成的活性。将Mab-ZAP(1μg/mL)连同RMG-1细胞、MCAS细胞和HA-20或HC-15抗体(10μg/mL)一起混合到琼脂中，并培养大约3周到1个月。对形成的集落染色，并通过显微镜观察。
根据结果，观察到由于在RMG-1细胞(图19)和MCAS细胞(图20)中同时加入HC-15抗体和Mab-ZAP导致集落形成的抑制。根据前述，证明HC-15抗体不仅通过其中和活性也通过其内化活性，能够抑制卵巢癌细胞形成集落的能力。
3-5-4.在血液癌细胞株中内化介导的细胞死亡的诱导
3-5-4-1.血液癌细胞株的HB-EG表达的分析
然后检查对于血液癌是否也可观察到HC-15的内化介导的抗肿瘤效应。在含有10％FCS的RPMI1640(Invitrogen Corporation)中培养以下细胞：RPMI8226(多发性骨髓瘤，购自ATCC)、Jurkat(急性T细胞白血病，购自ATCC)、HL-60(急性骨髓性白血病，购自JCRB)、THP-1(急性单核细胞性白血病，购自JCRB)和U937(单核细胞性白血病，购自JCRB)。
进行FACS分析以研究这些细胞的HB-EGF表达。HC-15(10μg/mL)抗体与特定的细胞株(2×10⁵细胞)在冰上反应60分钟，并用FITC标记的抗小鼠IgG抗体(Beckman Coulter，PN IM0819)染色。然后通过FACS(Becton，Dickinson and Company)分析抗体与细胞表面上表达的HB-EGF的结合。
图21给出了基于FACS分析比较各个血液癌细胞株表达HB-EGF的图。表明THP-1和U937显示出特别强的HB-EGF表达。相反，Jurkat和RPMI8226几乎未见表达。
3-5-4-2.对血液癌细胞株的细胞毒性的分析
以1-2×10⁴细胞/孔的密度向96孔板中接种特定的血液癌细胞株。然后Mab-ZAP以100ng/孔的量与特定的抗HB-EGF抗体(100ng/孔)反应，并向细胞加入。加入抗体5天后，使用WST-8测定活细胞计数。观察到向U937细胞和THP-1细胞中同时加入HC-15抗体和Mab-ZAP造成的增殖抑制。根据这些结果，表明作为抗肿瘤药，HC-15抗体的内化活性对几种血液癌是有效的。
对于肥皂草毒蛋白标记的抗体诱导细胞死亡的分析
4-1.抗体的肥皂草毒蛋白标记
使用由毒素直接标记的HA-20抗体(HA-SAP)和由毒素直接标记的HC-15抗体(HC-SAP)研究由抗体的内化活性介导的细胞毒性。
将肥皂草毒蛋白标记纯化的HA-20抗体和纯化的HC-15抗体外包给Advanced Targeting Systems。这样获得由用平均3个肥皂草毒蛋白分子标记的HA-20和用平均2.4个肥皂草毒蛋白分子标记的HC-15组成的抗体(分别命名为HA-SAP和HC-SAP)。在对诱导癌细胞细胞死亡的能力的研究中使用这些抗体。
4-2.肥皂草毒蛋白标记的抗体的细胞毒性的分析
4-2-1.肥皂草毒蛋白标记的抗体对实体癌细胞株的细胞毒性的分析
在分析中使用以下癌细胞：ES-2、MCAS(卵巢癌)、Capan-2(胰癌，购自Japan Health Sciences Foundation)、BxPC-3、22Rv1(前列腺癌，购自ATCC)和HUVEC(人内皮细胞，购自Takara BioInc.)。在每种情况下使用由供应商提供的说明书标明的培养条件培养这些细胞。
如下分析细胞毒性。以1-5×10³细胞/孔的密度向96孔板中接种每种细胞株并过夜培养。第二天，加入HA-SAP、HC-SAP或对照抗体(肥皂草毒蛋白标记的小鼠IgG(IgG-SAP)，Advanced TargetingSystems)，以提供大约100nM-1 fM，并培养3-5天。使用WST-8测定活细胞计数。
根据图23a所示的结果，HC-SAP强烈地诱导卵巢癌细胞株ES-2和MCAS的细胞死亡。HC-SAP的活性如下：对于ES-2细胞EC₅₀＝0.09nM，对于MCAS细胞EC₅₀＝0.86nM。另一方面，显示对HUVEC(正常人内皮细胞)完全没有效应。
4-2-2.肥皂草毒蛋白标记的抗体显示的对血液癌细胞株的细胞毒性的分析
在含有10％FCS的RPMI1640(Invitrogen Corporation)中培养以下细胞株：RPMI8226(多发性骨髓瘤，购自ATCC)、HL-60(急性骨髓性白血病，购自JCRB)、SKM-1和THP-1(急性单核细胞性白血病，购自JCRB)和U937(单核细胞性白血病，购自JCRB)。
如下检查HA-SAP和HC-SAP对这些血液癌细胞株的细胞毒性。以1-5×10³细胞/孔的密度向96孔板中接种每种细胞株，接着加入大约100nM-1fM的HA-SAP或HC-SAP，并培养3-5天。然后使用WST-8测定活细胞计数。
根据图23b所示的结果，HC-SAP在U937、SKM-1和THP-1细胞中基本上诱导细胞死亡。HC-SAP的活性如下：对U937细胞EC₅₀＝0.33nM，对SKM-1细胞EC₅₀＝0.02nM，对THP-1细胞EC₅₀＝0.01nM。这些结果表明用(例如)毒素标记的针对HB-EGF的抗体对血液癌也是有效的。
DNA免疫
5-1.用于分泌型HB-EGF的表达载体的构建
如下构建用于分泌型HB-EGF的表达载体。为了扩增编码HB-EGF胞外区(氨基酸1-148)的片段，首先在下面条件下使用Pyrobest Taq聚合酶(Takara Bio Inc.)和使用HB-EGF表达载体pMCN_HB-EGF作为模板，进行PCR。
EGF-9：TCC GAA TTC CAC CAT GAA GCT GCT GCC GTCGGT G(SEQ ID NO：91)
EGF-10：TTT GCG GCC GCT AGA GGC TCA GCC CAT GACACC T(SEQ ID NO：92)
(94℃/30秒，65℃/30秒，72℃/30秒：25个循环)
用EcoRI和NotI消化产生的PCR产物。将产生的DNA片段插入用于动物细胞的pMCDN2表达载体中的EcoRI和NotI之间，从而构建用于分泌型HB-EGF的pMCDN_sHB-EGF表达载体。
5-2.DNA免疫
根据Bio-Rad Laboratories，Inc提供的说明书(#165-2431)所述，将50μg分泌型HB-EGF表达载体pMCDN_sHB-EGF包被在金粒子上。使用Tubing Prep Station(Bio-Rad Laboratories，Inc.)将以这种方式获得的结合有DNA的金粒子涂覆在导管内，并用管割刀将导管切割成合适的长度，作为免疫用DNA在4℃下储存。
然后进行DNA免疫。使用Helios基因枪(Bio-Rad Laboratories，Inc.)，通过轰击将DNA引入3只动物[(MRL/lpr，雄性，年龄：4周)(balb/c，雌性，年龄：6周)，购自Charles River Japan]的腹部。然后以3-4天的间隔通过同样的步骤给予总共11次免疫。对于最后一次免疫，将50μg HB-EGF_Fc悬浮于100μL PBS中，并注射到尾静脉内。3天后进行细胞融合。通过与1-3相同的步骤制备杂交瘤。
使用与2-4中所述相同的步骤，通过比较克隆的HB-EGF结合活性和中和活性，进行筛选候选抗体的方法。然后，通过2-4中所述的方法进行有限稀释、亚型确定和抗体纯化。通过DNA免疫最终获得显示强HB-EGF结合活性和中和活性的抗体HE-39。
对新型HB-EGF中和抗体(HE-39)的性质的分析
6-1.对HE-39结合活性型HB-EGF的能力的分析
为了将获得的HE-39结合活性型HB-EGF蛋白的能力与3种以前获得的抗体(HA-20、HB-20、HC-15)结合活性型HB-EGF蛋白的能力进行比较，进行下面的实验。HA-20、HB-20、HC-15或HE-39抗体在1μg/mL HB-EGF蛋白(R&D Systems，Inc.，259-HE)包被的ELISA板(NUNC)中以各种浓度反应，并与碱性磷酸酯酶(AP)标记的抗小鼠IgG(Zymed Laboratories，Inc.，#62-6622)反应1小时。通过加入1mg/mL底物(Sigma，S0942-50TAB)显色。用读板器测定OD₄₀₅，并根据用特定抗体获得的结合曲线计算达到50％结合的抗体浓度(ED₅₀)。结果，显示HE-39对活性型HB-EGF的结合活性具有大约0.016nM的ED₅₀值，因而表明HE-39具有比其它3种抗体强得多的结合活性(图24)。
表4.与HB-EGF的结合(ED₅₀，nmol/L)

  HA20  HB20  HC15  HE39  3.01  5.49  0.65  0.016
6-2.HE-39对proHB-EGF的结合活性的分析
为了比较HE-39对proHB-EGF的结合活性与3种以前获得的抗体(HA-20、HB-20、HC-15)对proHB-EGF的结合活性，进行下面的实验。
特定抗体(10μg/mL)在4℃下与表达HB-EGF的DG44细胞(HB-EGF_DG44)反应1小时，接着用FITC标记的抗小鼠IgG抗体(Beckman Coulter，PN IM0819)染色。随后通过FACS(Becton，Dickinson and Company)分析特定抗体与细胞表面HB-EGF的结合。
图25显示了根据FACS分析比较抗体HA-20、HB-20、HC-15和HE-39对在DG44细胞中过量表达的proHB-EGF的结合活性。灰色波形表示在缺乏第一抗体的情况下的染色图(对照)，而实线表示在存在特定抗体的情况下的染色图。横轴表示染色强度，纵轴表示细胞数。如图25所示，类似于HB-20和HC-15，HE-39抗体是一种识别细胞膜上的HB-EGF的抗体。
6-3.中和活性的分析
6-3-1.抑制HB-EGF与EGFR结合的能力
使用在3-4-1中所述的固相评价系统，比较HE-39抗体抑制HB-EGF与EGFR结合的能力与3种以前获得的抗体(HA-20、HB-20、HC-15)的抑制结合能力。向固定有EGFR-Fc的ELISA板上添加HB-EGF(50ng/mL)和系列稀释的抗体，并在室温下反应1小时。用TBS-T洗板，并通过3-4-1中所述的步骤检测结合EGFR的HB-EGF(图26)。
结果证明，HB-EGF与受体的结合尤其被HC-15和HE-39抗体强烈地抑制。
表5.对HB-EGF结合EGFR的抑制(EC₅₀，nmol/L)
  HA20  HB20  HC15  HE39  9.52  9.51  2.06  0.83
6-3-2.抑制EGFR_Ba/F3细胞生长的能力
然后分析HE-39抗体对EGFR_Ba/F3细胞的HB-EGF依赖性生长的中和活性，并与HA-20、HB-20和HC-15的中和活性进行比较。根据3-4-2中所述的方法，在HB-EGF(80ng/mL)的存在下，以2×10⁴细胞/孔的密度向96孔板中接种EGFR_Ba/F3细胞，并加入特定的纯化抗体。培养3天后，使用WST-8(细胞计数试剂盒-8)测定细胞计数，并构建生长曲线。根据获得的结果，计算处于50％的最大抑制效应的抗体浓度(EC₅₀值)。
根据结果，HE-39显示实质上好于HC-15(EC₅₀＝2.06nM)的生长抑制活性(EC₅₀＝0.83nM)，另外对EGFR_Ba/F3细胞还显示出最强的生长抑制效应(图27)。
表6HB-EGF依赖性生长的抑制(EC₅₀，nmol/L)
  HA20  HB20  HC15  HE39  9.52  9.51  2.06  0.83
HE-39抗体可变区的克隆
7.1可变区的克隆
根据3-1中所述的方法进行HE-39抗体可变区的克隆和氨基酸序列的分析。由于HE-39是IgG1，使用VL-k引物(SEQ ID NO：69)克隆轻链可变区，并使用VH-G1引物(SEQ ID NO：70)克隆重链可变区。
将在前述步骤中扩增的基因片段TA-克隆到pCRII-TOPO(Invitrogen TOPO TA-克隆试剂盒，#45-0640)中，之后确认每个插入片段的碱基序列。确认的可变链的序列如图28所示。
7-2.轻链可变区的确认
根据克隆可变区的结果，来源于HE-39杂交瘤的轻链可变区存在两个不同的基因(VL-1、VL-2)。这导致以下假设：HE-39杂交瘤没有被完全单克隆。因而再次通过有限稀释进行单克隆。向96孔板中接种HE-39以达到1个细胞/孔。培养大约10天后，使用表达HB-EGF的Ba/F3细胞，用FACS分析出现集落的孔的培养上清液。结果，如图29a所示，获得显示HB-EGF结合活性的3个单克隆抗体(HE39-1、HE39-5、HE39-14)。
然后，为了确定在这些单克隆杂交瘤中表达哪些轻链可变区(VL-1、VL-2)，进行下面的实验。
从每种杂交瘤(HE39、HE39-1、HE39-5、HE39-14)纯化RNA，并使用SuperScript III First Strand System(Invitrogen Corporation)合成cDNA。为了检查在各个杂交瘤中表达哪些轻链，用来源于每种杂交瘤的合成的cDNA作为模板，在下面的条件下，使用HE-39重链特异性的引物(HE39VH)和对于两种轻链类型(VL-1、VL-2)特异性的引物(HE39VL1，HE39VL2)，进行RT-PCR。
HE-39重链可变区特异性的引物
VH-G1：GGG CCA GTG GAT AGA CAG ATG(SEQ ID NO：70)
HE39VH：CTG GGT CTT TCT CTT CCT CCT GTC A(SEQ IDNO：93)
HE-39轻链可变区特异性的引物
VL-1
VL-k：GCT CAC TGG ATG GTG GGA AGA TG(SEQ ID NO：69)
HE39VL1：TGA GAT TGT GAT GAC CCA GAC TCC A(SEQ IDNO：94)
VL-2
VL-k：GCT CAC TGG ATG GTG GGA AGA TG(SEQ ID NO：69)
HE39VL2：TTC TCA CCC AGT CTC CAG CAA TCA(SEQ IDNO：95)
94℃/5秒，72℃/2分钟：5个循环
94℃/5秒，70℃/10秒，72℃/2分钟：5个循环
94℃/5秒，68℃/10秒，72℃/2分钟：27个循环
根据结果，确定如图29b所示，不仅在HE39中，而且在已通过另外的有限稀释单克隆的杂交瘤(HE39-1、HE39-5、HE39-14)中，表达两种类型的轻链(VL-1、VL-2)。这些结果表明，两种类型VL-1、VL-2存在于HE-39的轻链中。
HE-39抗体的内化活性的分析
8-1.对HE-39抗体的内化活性介导的细胞毒性的分析
也研究了通过DNA免疫获得的HE-39抗体的内化活性介导的细胞毒性的存在/不存在。
以2×10³细胞/孔的密度向96孔板中接种HB-EGF_DG44(过量表达HB-EGF的DG44细胞)。这些细胞与HA-20、HC-15或HE-39抗体(100ng/孔或1000ng/孔)和Mab-ZAP(100ng/孔)反应，培养4天，并使用WST-8测定活细胞计数。
对于加入抗HB-EGF抗体和Mab-ZAP的组，观察到诱导细胞死亡的能力。对于HC-15和HE-39，观察到特别强的诱导细胞死亡的能力(图30)。
对HE-39抗体的表位分析
9-1.HE-39抗体的结合结构域的分析
HB-EGF具有图31a所示的结构。成熟型HB-EGF由两个不同的结构域(即，肝素结合结构域和EGF样结构域)组成。首先构建如下所述的用于表达GST融合蛋白的大肠杆菌表达载体，其目标是确定这两个结构域中的哪一个是被HE-39抗体识别的结构域。
9-1-1.制备用于表位作图的GST融合蛋白表达载体
9-1-1-1.GST-HBEGF成熟表达载体的构建
如下制备用于GST蛋白质/成熟型HB-EGF融合蛋白的表达载体。为了扩增编码成熟型HB-EGF的片段，在下面条件下使用Pyrobest Taq聚合酶(Takara Bio Inc.)，进行以HB-EGF表达载体pMCN_HB-EGF为模板的PCR。
EGF 11：TTGGATCCGTCACTTTATCCTCCAAGCCACA(SEQID NO：96)
EGF 12：TTCTCGAGGAGGCTCAGCCCATGACACCT(SEQ IDNO：97)
(94℃/30秒，65℃/30秒，72℃/30秒：30个循环)
然后用BamHI和XhoI消化获得的PCR产物，并将其插入同样用BamHI和XhoI消化的大肠杆菌GST融合表达载体(pGEX-6P-1)的GST编码区的下游，以构建成熟型HB-EGF/GST融合蛋白表达载体(成熟的pGEX-HBEGF)。
9-1-1-2.GST-HBEGF HBD表达载体的构建
如下制备表达GST蛋白质/HBD(HB-EGF的肝素结合结构域)融合蛋白的载体。为了扩增编码肝素结合结构域的片段，首先在下面条件下使用Pyrobest Taq聚合酶(Takara Bio Inc.)进行以HB-EGF表达载体pMCN_HB-EGF为模板的PCR。
EGF 11：TTGGATCCGTCACTTTATCCTCCAAGCCACA(SEQID NO：96)
EGF 13：TTCTCGAGCCGAAGACATGGGTCCCTCTT(SEQ IDNO：98)
(94℃/30秒，65℃/30秒，72℃/30秒：30个循环)
然后用BamHI和XhoI消化获得的PCR产物，并将其插入同样用BamHI和XhoI消化的大肠杆菌GST融合表达载体(pGEX-6P-1)的GST编码区的下游，以构建HB-EGF肝素结合结构域/GST融合蛋白表达载体(pGEX-HBEGF_HBD)。
9-1-1-3.GST-HBEGF EGFD表达载体的构建
如下制备表达GST蛋白质/EGFD(HB-EGF的EGF样结构域)融合蛋白的载体。为了扩增编码EGF样结构域的片段，首先在下面条件下使用Pyrobest Taq聚合酶(Takara Bio Inc.)进行以HB-EGF表达载体pMCN_HB-EGF为模板的PCR。
EGF 14：TAGGATCCAAGAGGGACCCATGTCTTCGG(SEQ IDNO：99)
EGF 12：TTCTCGAGGAGGCTCAGCCCATGACACCT(SEQ IDNO：97)
(94℃/30秒，65℃/30秒，72℃/30秒：30个循环)
然后用BamHI和XhoI消化获得的PCR产物，并将其插入同样用BamHI和XhoI消化的大肠杆菌GST融合表达载体(pGEX-6P-1)的GST编码区的下游，以构建HB-EGF EGF样结构域/GST融合蛋白表达载体(pGEX-HBEGF_EGFD)。
9-1-2.各GST融合蛋白的表达的诱导
将如上所述构建的各种大肠杆菌表达载体转化到大肠杆菌BL21内。在LB培养基(各1mL)中培养大肠杆菌转化体，并在对数生长期加入IPTG(终浓度为1mM)以诱导蛋白质表达。4-5小时后回收大肠杆菌；通过在SDS样品缓冲液(0.5mL)中裂解制备裂解物；通过标准方法用5μL裂解物进行SDS-PAGE，然后印迹到PVDF膜上进行Western印迹分析。
9-1-3.成熟HB-EGF蛋白上的HE-39识别结构域的分析
使用如上所述制备的GST融合蛋白(其中，成熟HB-EGF蛋白的各个区域(肝素结合结构域、EGF样结构域)融合)，通过Western印迹法研究被HE-39抗体识别的成熟HB-EGF蛋白的区域。图31b所示的Western印迹分析结果证明，HE-39抗体识别成熟HB-EGF蛋白的EGF样结构域。
9-2.EGF结构域中的表位的分析
由于HE-39识别成熟HB-EGF蛋白的EGF样结构域，为了确定表位序列，如图32a所示，更细地分割EGF样结构域。
9-2-1.GST-EGFD5、GST-EGFD6和GST-EGFD7表达载体的构建
如下所述制备GST融合蛋白的大肠杆菌表达载体，该GST融合蛋白具有分为3个片段(EGFD5、EGFD6、EGFD7)的EGF结构域。
为了构建编码各区域(EGFD5、EGFD6、EGFD7)的DNA片段，首先为每个区域设计如下的两个低聚物。
用于EGFD5合成的低聚物
HEP9：
GAT CCA AGA GGG ACC CAT GTC TTC GGA AAT ACA AGGACT TCT GCA TCC ATG GAG AAT GCA AAT ATC(SEQ ID NO：100)
HEP10：
TCG AGA TAT TTG CAT TCT CCA TGG ATG CAG AAG TCCTTG TAT TTC CGA AGA CAT GGG TCC CTC TTG(SEQ ID NO：101)
用于EGFD6合成的低聚物
HEP 11：
GAT CCT GCA TCC ATG GAG AAT GCA AAT ATG TGA AGGAGC TCC GGG CTC CCT CCT GCA TCT GCC ACC CGC(SEQ IDNO：102)
HEP 12：
TCG AGC GGG TGG CAG ATG CAG GAG GGA GCC CGGAGC TCC TTC ACA TAT TTG CAT TCT CCA TGG ATG CAG(SEQID NO：103)
用于EGFD7合成的低聚物
HEP 13：
GAT CCG CTC CCT CCT GCA TCT GCC ACC CGG GTT ACCATG GAG AGA GGT GTC ATG GGC TGA GCC TCC(SEQ ID NO：104)
HEP 14：
TCG AGG AGG CTC AGC CCA TGA CAC CTC TCT CCA TGGTAA CCC GGG TGG CAG ATG CAG GAG GGA GCG(SEQ IDNO：105)
在每种情况下，组合两个低聚物并通过标准方法退火以制备双链DNA片段，并将其插入已用BamHI和XhoI消化的大肠杆菌GST融合表达载体(pGEX-6P-1)的GST编码区的下游，以产生各个构建体(pGEX-HBEGF_EGFD5、pGEX-HBEGF_EGFD6、pGEX-HBEGF_EGFD7)。
9-2-2.各GST融合蛋白的表达的诱导
将如上所述构建的各种大肠杆菌表达载体转化到大肠杆菌BL21内。在LB培养基(各1mL)中培养大肠杆菌转化体，并在对数生长期加入IPTG(终浓度为1mM)以诱导蛋白质表达。4-5小时后回收大肠杆菌；通过在SDS样品缓冲液(0.5mL)中裂解制备裂解物；通过标准方法用5μL裂解物进行SDS-PAGE，然后印迹于PVDF膜上进行Western印迹分析。
9-2-3.HE-39的表位作图
使用如上所述制备的GST融合蛋白(GST-EGFD5、GST-EGFD6、GST-EGFD7)，使用EGF样结构域的3个片段中的一个，通过Western印迹法研究HE-39抗体的识别序列。图32b所示的Western印迹分析结果证明，由于HE-39抗体结合GST-EGFD7，故HE-39抗体识别EGF样结构域中的序列[APSCICHPGYHGERCHGLSL]。
抗HB-EGF抗体介导的ADCC活性的分析
10-1.各抗体显示的对膜表达HB-EGF的结合活性的分析
经FACS分析，比较到目前为止获得的抗体对膜表达的HB-EGF的结合活性。特定抗体(10μg/mL)在4℃下与HB-EGF_Ba/F3细胞(过量表达HB-EGF的Ba/F3细胞)反应1小时，接着用FITC标记的抗小鼠IgG抗体(Beckman Coulter，PN IM0819)染色。通过FACS(Becton，Dickinson and Company)分析该特定抗体与细胞表面HB-EGF的结合。
图33a显示了通过FACS分析测定的各抗体对HB-EGF_Ba/F3的结合活性。纵轴上的G-平均值(几何平均值)是通过将细胞的抗体诱导的荧光强度转化为数值获得的值。分析结果表明HC-15是对细胞膜上的HB-EGF具有最强的结合活性的抗体，且HE-39、HE-48和HE-58也具有强结合活性。
10-2.抗HB-EGF抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的分析
使用铬释放法和已显示出对HB-EGF_Ba/F3细胞的结合活性的抗体(HB-10、HB-20、HB-22、HC-15、HE-39、HE-48、HE-58)分析对HB-EGF_Ba/F3细胞的ADCC活性。
向在96孔板中增殖的HB-EGF_Ba/F3细胞加入铬-51，并继续培养几小时。除去培养基；用培养基洗涤细胞；然后加入新鲜的培养基。加入抗体以达到10μg/mL的终浓度；也向每个孔中以相对于靶细胞大约5X或10X的量加入效应细胞(通过诱导在NK-92(ATCC、CRL-2407)中强制表达小鼠Fc-γ受体(NM_010188)而获得的重组细胞)；使培养板在37℃、5％CO₂孵箱中静置4小时。静置后，离心培养板，并从每个孔中回收恒定量的上清液；使用Wallac 1480γ计数器测定放射性；并确定特异的铬释放率(％)。根据在图33b的上图中显示的结果，在测试中使用的抗HB-EGF单克隆抗体中，HB-22、HC-15、HE-39、HE-48和HE-58特别诱导了非常强的ADCC活性。这些结果表明，针对HB-EGF的抗肿瘤抗体治疗非常有用。
使用下面的公式计算特异的铬释放率。
特异的铬释放率(％)＝(A-C)×100/(B-C)
其中：A是特定孔中的放射性；B是通过用1％终浓度的NonidetP-40进行细胞裂解释放到培养基中的放射性的平均值；C是只加入培养基的放射性的平均值。
10-3.抗HB-EGF抗体的补体依赖性细胞毒性(ADCC)的测定
通过离心分离(1000rpm，5分钟，4℃)回收HB-EGF_Ba/F3细胞；将细胞沉淀悬浮于大约200μL培养基和3.7MBq铬-51(编号CJS4，Amersham Pharmacia Biotech)中；并在37℃、5％CO₂孵箱中培养1小时。然后用培养基洗涤细胞3遍；随后用培养基调整细胞密度至1×10⁴/mL；并向96孔平底板的每孔中加入100μL。
用培养基稀释抗HB-EGF单克隆抗体(HB-10、HB-20、HB-22、HC-15、HE-39、HE-48、HE-58)和对照小鼠IgG2a抗体(目录号553453，BD Biosciences Pharmingen)，然后以50μL/孔的量加入。调整抗体至10μg/mL的终浓度。然后向每个板孔中加入幼兔补体(目录号CL3441，Cedarlane)以达到3％或10％的浓度，接着在37℃、5％CO₂孵箱中静置1.5小时。静置后，离心培养板(1000rpm，5分钟，4℃)；从每个孔中回收100μL上清液；并使用γ计数器(1480WIZARD3”，Wallac)测定回收的上清液中的放射性。
根据图33b的下图中显示的结果，在该测试中使用的抗HB-EGF单克隆抗体中，HB-20、HB-22、HC-15和HE-48显示CDC活性。另一方面，用作对照的小鼠IgG2a抗体在同样的浓度下不显示CDC活性。
工业实用性
本发明的抗体和包含本发明的抗体的药物组合物可用于治疗和诊断癌症。
序列表
<110>株式会社未来创药研究所(Forerunner Pharma Research Co.，Ltd.)
<120>抗HB-EGF抗体
<130>PCG-9018WO
<150>JP 2006-286824
<151>200610-20
<150>JP 2007-107207
<151>2007-04-16
<160>105
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>15
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>1
agctactgga tgcac                                             15
<210>2
<211>5
<212>PRT
<213>小鼠
<400>2
Ser Tyr Trp Met His
1               5
<210>3
<211>51
<212>DNA
<213>小鼠
<400>3
gagattaatc ctagcaacgg tcgtactaac tacaatgaga agttcaagag c    51
<210>4
<211>17
<212>PRT
<213>小鼠
<400>4
Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Ser
<210>5
<211>15
<212>DNA
<213>小鼠
<400>5
tccctctttgactac                                            15
<210>6
<211>5
<212>PRT
<213>小鼠
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Ser Leu Phe Asp Tyr
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<212>DNA
<213>小鼠
<400>7
agtgccagct caagtataag ttccaattac ttgcat                   36
<210>8
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<212>PRT
<213>小鼠
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Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Ser Asn Tyr Leu His
1               5                   10
<210>9
<211>21
<212>DNA
<213>小鼠
<400>9
aggacatcca atctggcttc t                                  21
<210>10
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<212>PRT
<213>小鼠
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Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1               5
<210>11
<211>27
<212>DNA
<213>小鼠
<400>11
cagcagggta gtagtatacc attcacg                            27
<210>12
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>12
Gln Gln Gly Ser Ser Ile Pro Phe Thr
1               5
<210>13
<211>15
<212>DNA
<213>小鼠
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ggctatggta taaac                                         15
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<212>PRT
<213>小鼠
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Gly Tyr Gly Ile Asn
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<212>DNA
<213>小鼠
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atgatctggg gtgatggaag cgcagactat aattcagctc tcaaatcc    48
<210>16
<211>16
<212>PRT
<213>小鼠
<400>16
Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Ala Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210>17
<211>30
<212>DNA
<213>小鼠
<400>17
ggggattact acggctacag gttttcttac                        30
<210>18
<211>10
<212>PRT
<213>小鼠
<400>18
Gly Asp Tyr Tyr Gly Tyr Arg Phe Ser Tyr
1               5                   10
<210>19
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<212>DNA
<213>小鼠
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aagtccagtc aaagtgtttt atacagttca aatcagaaga acttcttggc c    51
<210>20
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<212>PRT
<213>小鼠
<400>20
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Phe Leu
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Ala
<210>21
<211>21
<212>DNA
<213>小鼠
<400>21
tgggcatcca ctagggaatc t                                      21
<210>22
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
<400>22
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1               5
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<212>DNA
<213>小鼠
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catcaatacc tctcctcgta tacg                                   24
<210>24
<211>8
<212>PRT
<213>小鼠
<400>24
His Gln Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr
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<212>DNA
<213>小鼠
<400>25
ggctactaca tgcac                                             15
<210>26
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<212>PRT
<213>小鼠
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Gly Tyr Tyr Met His
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<212>DNA
<213>小鼠
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gagattaatc ctagaactgg tattactacc tacaaccaga agttcaaggc c    51
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<212>PRT
<213>小鼠
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Glu Ile Asn Pro Arg Thr Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Ala
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<211>27
<212>DNA
<213>小鼠
<400>29
gttggcagct cgggcccttt tacgtac                                         27
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<212>PRT
<213>小鼠
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Val Gly Ser Ser Gly Pro Phe Thr Tyr
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<212>DNA
<213>小鼠
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cgggcaagtc aggacattca tggttattta aac                                  33
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<212>PRT
<213>小鼠
<400>32
Arg Ala Ser Gln Asp Ile His Gly Tyr Leu Asn
1               5                   10
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<213>小鼠
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<213>小鼠
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Glu Thr Ser Asn Leu Asp Ser
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<213>小鼠
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ctacaatatg ctagttcgct cacg                                            24
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<212>PRT
<213>小鼠
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Leu Gln Tyr Ala Ser Ser Leu Thr
1               5
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<212>DNA
<213>小鼠
<400>37
atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgt ccactcccag     60
gtccaactgc agcagcctgg ggctgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaagctgtcc    120
tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagc tactggatgc actgggtgaa gcagaggcct    180
ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctagca acggtcgtac taactacaat    240
gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg    300
caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgtatg gtccctcttt    360
gactactggg gccaaggcac cactctcaca gtctcctca                           399
<210>38
<211>133
<212>PRT
<213>小鼠
<400>38
Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp
1               5                   10                  15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
        35                  40                  45
Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Val Trp Ser Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
        115                 120                 125
Leu Thr Val Ser Ser
    130
<210>39
<211>378
<212>DNA
<213>小鼠
<400>39
atgcagatta tcagcttgct gctaatcagt gtcacagtca tagtgtctaa tggagaaatt     60
gtgctcaccc agtctccaac caccatggct gcatctcccg gggagaagat cactatcacc    120
tgcagtgcca gctcaagtat aagttccaat tacttgcatt ggtatcagca gaagccagga    180
ttctccccta aactcttgat ttataggaca tccaatctgg cttctggagt cccagctcgc    240
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa ttggcaccat ggaggctgaa    300
gatgttgcca cttactactg ccagcagggt agtagtatac cattcacgtt cggctcgggg    360
acaaagttgg aaataaaa                                                  378
<210>40
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<212>PRT
<213>小鼠
<400>40
Met Gln Ile Ile Ser Leu Leu Leu Ile Ser Val Thr Val Ile Val Ser
1               5                   10                  15
Asn Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr Met Ala Ala Ser
            20                  25                  30
Pro Gly Glu Lys Ile Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser
        35                 40                 45
Ser Asn Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Phe Ser Pro Lys
    50                  55                  60
Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val pro Ala Arg
65                  70                  75                  80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Gly Thr
                85                  90                  95
Met Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Ser
            100                 105                 110
Ile Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
        115                 120                 125
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<212>DNA
<213>小鼠
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atggctgtcc tggcattact cttctgcctg gtaacattcc caagctgtat cctttcccag     60
gtgcagctga aggagtcagg acctggcctg gtggcgccct cacagagcct gtccatcaca    120
tgcaccgtct cagggttctc attaaccggc tatggtataa actgggttcg ccagcctcca    180
ggaaagggtc tggagtggct gggaatgatc tggggtgatg gaagcgcaga ctataattca    240
gctctcaaat ccagactgag catccgcaag gacaactcca agagccaagt tttcttagaa    300
atgaacagtc tgcaaactga tgacacagcc aggtactact gtgccagagg ggattactac    360
ggctacaggt tttcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a             411
<210>42
<211>137
<212>PRT
<213>小鼠
<400>42
Met Ala Val Leu Ala Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys
1               5                   10                  15
Ile Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
            20                  25                  30
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
        35                  40                  45
Thr Gly Tyr Gly Ile Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Leu Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ser Ala Asp Tyr Asn Ser
65                  70                  75                  80
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Arg Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
                85                  90                  95
Val Phe Leu Glu Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr
            100                 105                 110
Tyr Cys Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Tyr Arg Phe Ser Tyr Trp Gly
        115                 120                 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
    130                 135
<210>43
<211>396
<212>DNA
<213>小鼠
<400>43
atggaatcac agactcaggt cttcctctcc ctgctgctct gggtatctgg tacctttggg     60
aacattatgc tgacacagtc gccatcatct ctggctgtgt ctgcaggaga aaaggtcact    120
atgagctgta agtccagtca aagtgtttta tacagttcaa atcagaagaa cttcttggcc    180
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg    240
gaatctggtg tccctgatcg cttcgcaggc agtggatctg ggacagattt tactcttacc    300
atcagcagtg tacaaactga agacctggca gtttattact gtcatcaata cctctcctcg    360
tatacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa                              396
<210>44
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<212>PRT
<213>小鼠
<400>44
Met Glu Ser Gln Thr Gln Val Phe Leu Ser Leu Leu Leu Trp Val Ser
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Gly Thr Phe Gly Asn Ile Met Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala
            20                  25                  30
Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser
        35                  40                  45
Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln
    50                  55                  60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg
65                  70                  75                  80
Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ala Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
                85                  90                  95
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr
            100                 105                 110
Tyr Cys His Gln Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
        115                 120                 125
Leu Glu Ile Lys
    130
<210>45
<211>411
<212>DNA
<213>小鼠
<400>45
atgggatgga actggatctt tattttaatc ctgtcagtaa ctacaggtgt ccactctgag     60
gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gtgaagcctg gggcttcagt gaagatatcc    120
tgcaaggctt ctggttactc attcactggc tactacatgc actgggtgaa gcaaagtcct    180
gaaaagagac ttgagtggat tggagagatt aatcctagaa ctggtattac tacctacaac    240
cagaagttca aggccaaggc cacattgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg    300
cagctcaaga gcctgacatc tgaggactct gcagtctatt actgtgcaag agttggcagc    360
tcgggccctt ttacgtactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a             411
<210>46
<211>137
<212>PRT
<213>小鼠
<400>46
Met Gly Trp Asn Trp Ile Phe Ile Leu Ile Leu Ser Val Thr Thr Gly
1               5                   10                  15
Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys
            20                  25                  30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
        35                  40                  45
Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu
    50                  55                  60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Arg Thr Gly Ile Thr Thr Tyr Asn
65                  70                  75                  80
Gln Lys Phe Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
                85                  90                  95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
            100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Gly Ser Ser Gly Pro Phe Thr Tyr Trp Gly
        115                 120                 125
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
    130                 135
<210>47
<211>384
<212>DNA
<213>小鼠
<400>47
atggacatga gggctcctgc tcaggttttt ggcttcttgt tgctctggtt tccaggtgcc     60
agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccttat ctgcctctct gggagaaaga    120
gtcagtctca cttgccgggc aagtcaggac attcatggtt atttaaactt gtttcagcag    180
aaaccaggtg aaactattaa acacctgatc tatgaaacat ccaatttaga ttctggtgtc    240
ccgaaaaggt tcagtggcag taggtctggg tcagattatt ctctcattat cggcagcctt    300
gagtctgaag attttgcaga ctattactgt ctacaatatg ctagttcgct cacgttcggt    360
gctgggacca agctggagct gaaa                                           384
<210>48
<211>128
<212>PRT
<213>小鼠
<400>48
Met Asp Met Arg Ala Pro Ala Gln Val Phe Gly Phe Leu Leu Leu Trp
1               5                   10                  15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
            20                  25                  30
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser
        35                  40                  45
Gln Asp Ile His Gly Tyr Leu Asn Leu Phe Gln Gln Lys Pro Gly Glu
    50                  55                  60
Thr lle Lys His Leu Ile Tyr Glu Thr Ser Asn Leu Asp Ser Gly Val
65                  70                  75                  80
Pro Lys Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Ile
                85                  90                  95
Ile Gly Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln
            100                 105                 110
Tyr Ala Ser Ser Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
        115                 120                 125
<210>49
<211>627
<212>DNA
<213>智人(homo sapiens)
<400>49
atgaagctgc tgccgtcggt ggtgctgaag ctctttctgg ctgcagttct ctcggcactg   60
gtgactggcg agagcctgga gcggcttcgg agagggctag ctgctggaac cagcaacccg  120
gaccctccca ctgtatccac ggaccagctg ctacccctag gaggcggccg ggaccggaaa  180
gtccgtgact tgcaagaggc agatctggac cttttgagag tcactttatc ctccaagcca  240
caagcactgg ccacaccaaa caaggaggag cacgggaaaa gaaagaagaa aggcaagggg  300
ctagggaaga agagggaccc atgtcttcgg aaatacaagg acttctgcat ccatggagaa  360
tgcaaatatg tgaaggagct ccgggctccc tcctgcatct gccacccggg ttaccatgga  420
gagaggtgtc atgggctgag cctcccagtg gaaaatcgct tatataccta tgaccacaca  480
accatcctgg ccgtggtggc tgtggtgctg tcatctgtct gtctgctggt catcgtgggg  540
cttctcatgt ttaggtacca taggagagga ggttatgatg tggaaaatga agagaaagtg  600
aagttgggca tgactaattc ccactga                                      627
<210>50
<211>208
<212>PRT
<213>智人
<400>50
Met Lys Leu Leu Pro Ser Val Val Leu Lys Leu Phe Leu Ala Ala Val
1               5                   10                  15
Leu Ser Ala Leu Val Thr Gly Glu Ser Leu Glu Arg Leu Arg Arg Gly
            20                  25                  30
Leu Ala Ala Gly Thr Ser Asn Pro Asp Pro Pro Thr Val Ser Thr Asp
        35                  40                  45
Gln Leu Leu Pro Leu Gly Gly Gly Arg Asp Arg Lys Val Arg Asp Leu
    50                  55                  60
Gln Glu Ala Asp Leu Asp Leu Leu Arg Val Thr Leu Ser Ser Lys Pro
65                  70                  75                  80
Gln Ala Leu Ala Thr Pro Asn Lys Glu Glu His Gly Lys Arg Lys Lys
                85                  90                  95
Lys Gly Lys Gly Leu Gly Lys Lys Arg Asp Pro Cys Leu Arg Lys Tyr
            100                 105                 110
Lys Asp Phe Cys Ile His Gly Glu Cys Lys Tyr Val Lys Glu Leu Arg
        115                 120                 125
Ala Pro Ser Cys Ile Cys His Pro Gly Tyr His Gly Glu Arg Cys His
    130                 135                 140
Gly Leu Ser Leu Pro Val Glu Asn Arg Leu Tyr Thr Tyr Asp His Thr
145                 150                 155                 160
Thr Ile Leu Ala Val Val Ala Val Val Leu Ser Ser Val Cys Leu Leu
                165                 170                 175
Val Ile Val Gly Leu Leu Met Phe Arg Tyr His Arg Arg Gly Gly Tyr
            180                 185                 190
Asp Val Glu Asn Glu Glu Lys Val Lys Leu Gly Met Thr Asn Ser His
        195                 200                 205
<210>51
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>51
atgaagctgc tgccgtcggt g                                              21
<210>52
<211>22
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>52
tcagtgggaa ttagtcatgc cc                                             22
<210>53
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>53
taagtcgacc accatgaagc tgctgccgtc ggtg                                34
<210>54
<211>60
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>54
tttgcggccg ctcacttgtc atcgtcgtcc ttgtagtcgt gggaattagt catgcccaac    60
<210>55
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>55
aaagaattcc accatgaagc tgctgccgtc                                     30
<210>56
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>56
tatcggtccg cgaggttcga ggctcagccc atgacacctc                           40
<210>57
<211>38
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>57
cgattttcca ctgtgctgct cagcccatga cacctctc                             38
<210>58
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>58
tgggctgagc agcacagtgg aaaatcgctt atataccta                            39
<210>59
<211>3633
<212>DNA
<213>智人
<400>59
atgcgaccct ccgggacggc cggggcagcg ctcctggcgc tgctggctgc gctctgcccg     60
gcgagtcggg ctctggagga aaagaaagtt tgccaaggca cgagtaacaa gctcacgcag    120
ttgggcactt ttgaagatca ttttctcagc ctccagagga tgttcaataa ctgtgaggtg    180
gtccttggga atttggaaat tacctatgtg cagaggaatt atgatctttc cttcttaaag    240
accatccagg aggtggctgg ttatgtcctc attgccctca acacagtgga gcgaattcct    300
ttggaaaacc tgcagatcat cagaggaaat atgtactacg aaaattccta tgccttagca    360
gtcttatcta actatgatgc aaataaaacc ggactgaagg agctgcccat gagaaattta    420
caggaaatcc tgcatggcgc cgtgcggttc agcaacaacc ctgccctgtg caacgtggag    480
agcatccagt ggcgggacat agtcagcagt gactttctca gcaacatgtc gatggacttc    540
cagaaccacc tgggcagctg ccaaaagtgt gatccaagct gtcccaatgg gagctgctgg    600
ggtgcaggag aggagaactg ccagaaactg accaaaatca tctgtgccca gcagtgctcc    660
gggcgctgcc gtggcaagtc ccccagtgac tgctgccaca accagtgtgc tgcaggctgc    720
acaggccccc gggagagcga ctgcctggtc tgccgcaaat tccgagacga agccacgtgc    780
aaggacacct gccccccact catgctctac aaccccacca cgtaccagat ggatgtgaac    840
cccgagggca aatacagctt tggtgccacc tgcgtgaaga agtgtccccg taattatgtg    900
gtgacagatc acggctcgtg cgtccgagcc tgtggggccg acagctatga gatggaggaa    960
gacggcgtcc gcaagtgtaa gaagtgcgaa gggccttgcc gcaaagtgtg taacggaata   1020
ggtattggtg aatttaaaga ctcactctcc ataaatgcta cgaatattaa acacttcaaa   1080
aactgcacct ccatcagtgg cgatctccac atcctgccgg tggcatttag gggtgactcc   1140
ttcacacata ctcctcctct ggatccacag gaactggata ttctgaaaac cgtaaaggaa   1200
atcacagggt ttttgctgat tcaggcttgg cctgaaaaca ggacggacct ccatgccttt   1260
gagaacctag aaatcatacg cggcaggacc aagcaacatg gtcagttttc tcttgcagtc   1320
gtcagcctga acataacatc cttgggatta cgctccctca aggagataag tgatggagat   1380
gtgataattt caggaaacaa aaatttgtgc tatgcaaata caataaactg gaaaaaactg   1440
tttgggacct ccggtcagaa aaccaaaatt ataagcaaca gaggtgaaaa cagctgcaag   1500
gccacaggcc aggtctgcca tgccttgtgc tcccccgagg gctgctgggg cccggagccc   1560
agggactgcg tctcttgccg gaatgtcagc cgaggcaggg aatgcgtgga caagtgcaac   1620
cttctggagg gtgagccaag ggagtttgtg gagaactctg agtgcataca gtgccaccca   1680
gagtgcctgc ctcaggccat gaacatcacc tgcacaggac ggggaccaga caactgtatc   1740
cagtgtgccc actacattga cggcccccac tgcgtcaaga cctgcccggc aggagtcatg   1800
ggagaaaaca acaccctggt ctggaagtac gcagacgccg gccatgtgtg ccacctgtgc   1860
catccaaact gcacctacgg atgcactggg ccaggtcttg aaggctgtcc aacgaatggg   1920
cctaagatcc cgtccatcgc cactgggatg gtgggggccc tcctcttgct gctggtggtg   1980
gccctgggga tcggcctctt catgcgaagg cgccacatcg ttcggaagcg cacgctgcgg   2040
aggctgctgc aggagaggga gcttgtggag cctcttacac ccagtggaga agctcccaac   2100
caagctctct tgaggatctt gaaggaaact gaattcaaaa agatcaaagt gctgggctcc   2160
ggtgcgttcg gcacggtgta taagggactc tggatcccag aaggtgagaa agttaaaatt   2220
cccgtcgcta tcaaggaatt aagagaagca acatctccga aagccaacaa ggaaatcctc   2280
gatgaagcct acgtgatggc cagcgtggac aacccccacg tgtgccgcct gctgggcatc   2340
tgcctcacct ccaccgtgca gctcatcacg cagctcatgc ccttcggctg cctcctggac   2400
tatgtccggg aacacaaaga caatattggc tcccagtacc tgctcaactg gtgtgtgcag   2460
atcgcaaagg gcatgaacta cttggaggac cgtcgcttgg tgcaccgcga cctggcagcc   2520
aggaacgtac tggtgaaaac accgcagcat gtcaagatca cagattttgg gctggccaaa   2580
ctgctgggtg cggaagagaa agaataccat gcagaaggag gcaaagtgcc tatcaagtgg   2640
atggcattgg aatcaatttt acacagaatc tatacccacc agagtgatgt ctggagctac   2700
ggggtgaccg tttgggagtt gatgaccttt ggatccaagc catatgacgg aatccctgcc   2760
agcgagatct cctccatcct ggagaaagga gaacgcctcc ctcagccacc catatgtacc   2820
atcgatgtct acatgatcat ggtcaagtgc tggatgatag acgcagatag tcgcccaaag  2880
ttccgtgagt tgatcatcga attctccaaa atggcccgag acccccagcg ctaccttgtc  2940
attcaggggg atgaaagaat gcatttgcca agtcctacag actccaactt ctaccgtgcc  3000
ctgatggatg aagaagacat ggacgacgtg gtggatgccg acgagtacct catcccacag  3060
cagggcttct tcagcagccc ctccacgtca cggactcccc tcctgagctc tctgagtgca  3120
accagcaaca attccaccgt ggcttgcatt gatagaaatg ggctgcaaag ctgtcccatc  3180
aaggaagaca gcttcttgca gcgatacagc tcagacccca caggcgcctt gactgaggac  3240
agcatagacg acaccttcct cccagtgcct gaatacataa accagtccgt tcccaaaagg  3300
cccgctggct ctgtgcagaa tcctgtctat cacaatcagc ctctgaaccc cgcgcccagc  3360
agagacccac actaccagga cccccacagc actgcagtgg gcaaccccga gtatctcaac  3420
actgtccagc ccacctgtgt caacagcaca ttcgacagcc ctgcccactg ggcccagaaa  3480
ggcagccacc aaattagcct ggacaaccct gactaccagc aggacttctt tcccaaggaa  3540
gccaagccaa atggcatctt taagggctcc acagctgaaa atgcagaata cctaagggtc  3600
gcgccacaaa gcagtgaatt tattggagca tga                               3633
<210>60
<211>1210
<212>PRT
<213>智人
<400>60
Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln
            20                  25                  30
Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe
        35                  40                  45
Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn
    50                  55                  60
Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys
65                  70                  75                  80
Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val
                85                  90                  95
Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr
            100                 105                 110
Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn
        115                 120                 125
Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu
    130                 135                 140
His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu
145                 150                 155                 160
Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met
                165                 170                 175
Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro
            180                 185                 190
Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln
        195                 200                 205
Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg
    210                 215                 220
Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys
225                 230                 235                 240
Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp
                245                 250                 255
Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro
            260                 265                 270
Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly
        275                 280                 285
Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His
    290                 295                 300
Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu
305                 310                 315                 320
Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val
                325                 330                 335
Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn
            340                 345                 350
Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp
        355                 360                 365
Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr
    370                 375                 380
Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu
385                 390                 395                 400
Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp
                405                 410                 415
Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln
            420                 425                 430
His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu
        435                 440                 445
Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser
    450                 455                 460
Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu
465                 470                 475                 480
Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu
                485                 490                 495
Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro
            500                 505                 510
Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn
        515                 520                 525
Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly
    530                 535                 540
Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro
545                 550                 555                 560
Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro
                565                 570                 575
Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val
            580                 585                 590
Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp
        595                 600                 605
Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys
    610                 615                 620
Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly
625                 630                 635                 640
Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu
                645                 650                 655
Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His
            660                 665                 670
Ile Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu
        675                 680                 685
Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu
    690                 695                 700
Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys Ile Lys Val Leu Gly Ser
705                 710                 715                 720
Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Leu Trp Ile Pro Glu Gly Glu
                725                 730                 735
Lys Val Lys Ile Pro Val Ala Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser
            740                 745                 750
Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Ser
        755                 760                 765
Val Asp Asn Pro His Val Cys Arg Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser
    770                 775                 780
Thr Val Gln Leu Ile Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp
785                 790                 795                 800
Tyr Val Arg Glu His Lys Asp Asn Ile Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn
                805                 810                 815
Trp Cys Val Gln Ile Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg
            820                 825                 830
Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Val Lys Thr Pro
        835                 840                 845
Gln His Val Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Leu Gly Ala
    850                 855                 860
Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp
865                 870                 875                 880
Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu His Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp
                885                 890                 895
Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ser
            900                 905                 910
Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala Ser Glu Ile Ser Ser Ile Leu Glu
        915                 920                 925
Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr
    930                 935                 940
Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met Ile Asp Ala Asp Ser Arg Pro Lys
945                 950                 955                 960
Phe Arg Glu Leu Ile Ile Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro Gln
                965                 970                 975
Arg Tyr Leu Val Ile Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser Pro
            980                 985                 990
Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala  Leu Met Asp Glu Glu  Asp Met Asp
        995                 1000                 1005
Asp Val  Val Asp Ala Asp Glu  Tyr Leu Ile Pro Gln  Gln Gly Phe
    1010                 1015                 1020
Phe Ser  Ser Pro Ser Thr Ser  Arg Thr Pro Leu Leu  Ser Ser Leu
    1025                 1030                 1035
Ser Ala  Thr Ser Asn Asn Ser  Thr Val Ala Cys Ile  Asp Arg Asn
    1040                 1045                 1050
Gly Leu  Gln Ser Cys Pro Ile  Lys Glu Asp Ser Phe  Leu Gln Arg
    1055                 1060                 1065
Tyr Ser  Ser Asp Pro Thr Gly  Ala Leu Thr Glu Asp  Ser Ile Asp
    1070                 1075                 1080
Asp Thr  Phe Leu Pro Val Pro  Glu Tyr Ile Asn Gln  Ser Val Pro
    1085                 1090                 1095
Lys Arg  Pro Ala Gly Ser Val  Gln Asn Pro Val Tyr  His Asn Gln
    1100                 1105                 1110
Pro Leu  Asn Pro Ala Pro Ser  Arg Asp Pro His Tyr  Gln Asp Pro
    1115                 1120                 1125
His Ser  Thr Ala Val Gly Asn  Pro Glu Tyr Leu Asn  Thr Val Gln
    1130                 1135                 1140
Pro Thr  Cys Val Asn Ser Thr  Phe Asp Ser Pro Ala  His Trp Ala
    1145                 1150                 1155
Gln Lys  Gly Ser His Gln Ile  Ser Leu Asp Asn Pro  Asp Tyr Gln
    1160                 1165                 1170
Gln Asp  Phe Phe Pro Lys Glu  Ala Lys Pro Asn Gly  Ile Phe Lys
    1175                 1180                 1185
Gly Ser  Thr Ala Glu Asn Ala  Glu Tyr Leu Arg Val  Ala Pro Gln
    1190                 1195                 1200
Ser Ser  Glu Phe Ile Gly Ala
    1205                 1210
<210>61
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>61
atgcgaccct ccgggacggc                                                20
<210>62
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>62
cagtggcgat ggacgggatc t                                              21
<210>63
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>63
ttgcggccgc caccatgcga ccctccggga cggc                                34
<210>64
<211>61
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>64
accagatctc caggaaaatg tttaagtcag atggatcgga cgggatctta ggcccattcg    60
t                                                                    61
<210>65
<211>2514
<212>DNA
<213>小鼠
<400>65
atggtagggc tgggagcctg caccctgact ggagttaccc tgatcttctt gctactcccc    60
agaagtctgg agagctgtgg acacatcgag atttcacccc ctgttgtccg cct gggggac  120
cctgtcctgg cctcttgcac catcagccca aactgcagca aactggacca acaggcaaag   180
atcttatgga gactgcaaga tgagcccatc caacctgggg acagacagca tcatctgcct   240
gatgggaccc aagagtccct catcactctg cctcacttga actacaccca ggccttcctc   300
ttctgcttag tgccatggga agacagcgtc caactcctgg atcaagctga gcttcacgca   360
ggctatcccc ctgccagccc ctcaaaccta tcctgcctca tgcacctcac caccaacagc   420
ctggtctgcc agtgggagcc aggtcctgag acccacctgc ccaccagctt catcctaaag   480
agcttcagga gccgcgccga ctgtcagtac caaggggaca ccatcccgga ttgtgtggca     540
aagaagaggc agaacaactg ctccatcccc cgaaaaaact tgctcctgta ccagtatatg     600
gccatctggg tgcaagcaga gaatatgcta gggtccagcg agtccccaaa gctgtgcctc     660
gaccccatgg atgttgtgaa attggagcct cccatgctgc aggccctgga cattggccct     720
gatgtagtct ctcaccagcc tggctgcctg tggctgagct ggaagccatg gaagcccagt     780
gagtacatgg aacaggagtg tgaacttcgc taccagccac agctcaaagg agccaactgg     840
actctggtgt tccacctgcc ttccagcaag gaccagtttg agctctgcgg gctccatcag     900
gccccagtct acaccctaca gatgcgatgc attcgctcat ctctgcctgg attctggagc     960
ccctggagcc ccggcctgca gctgaggcct accatgaagg cccccaccat cagactggac    1020
acgtggtgtc agaagaagca actagatcca gggacagtga gtgtgcagct gttctggaag    1080
ccaacgcccc tgcaggaaga cagtggacag atccagggct acctgctgtc ctggaattcc    1140
ccagatcatc aagggcagga catacacctt tgcaacacca cgcagctcag ctgtatcttc    1200
ctcctgccct cagaggccca gaacgtgacc cttgtggcct acaacaaagc agggacctct    1260
tcacctacta cagtggtttt cctggagaac gaaggtccag ctgtgaccgg actccatgcc    1320
atggcccaag accttaacac catctgggta gactgggaag cccccagcct tctgcctcag    1380
ggctatctca ttgagtggga aatgagttct cccagctaca ataacagcta taagtcctgg    1440
atgatagaac ctaacgggaa catcactgga attctgttaa aggacaacat aaatcccttt    1500
cagctctaca gaattacagt ggctcccctg tacccaggca tcgtgggacc ccctgtaaat    1560
gtctacacct tcgctggaga gagagctcct cctcatgctc cagcgctgca tctaaagcat    1620
gttggcacaa cctgggcaca gctggagtgg gtacctgagg cccctaggct ggggatgata    1680
cccctcaccc actacaccat cttctgggcc gatgctgggg accactcctt ctccgtcacc    1740
ctaaacatct ccctccatga ctttgtcctg aagcacctgg agcccgccag tttgtatcat    1800
gtctacctca tggccaccag tcgagcaggg tccaccaata gtacaggcct taccctgagg    1860
accctagatc catctgactt aaacattttc ctgggcatac tttgcttagt actcttgtcc    1920
actacctgtg tagtgacctg gctctgctgc aaacgcagag gaaagacttc cttctggtca    1980
gatgtgccag acccagccca cagtagcctg agctcctggt tgcccaccat catgacagag    2040
gaaaccttcc agttacccag cttctgggac tccagcgtgc catcaatcac caagatcact    2100
gaactggagg aagacaagaa accgacccac tgggattccg aaagctctgg gaatggtagc    2160
cttccagccc tggttcaggc ctatgtgctc caaggagatc caagagaaat ttccaaccag    2220
tcccagcctc cctctcgcac tggtgaccag gtcctctatg gtcaggtgct tgagagcccc    2280
accagcccag gagtaatgca gtacattcgc tctgactcca ctcagcccct cttggggggc    2340
cccaccccta gccctaaatc ttatgaaaac atctggttcc attcaagacc ccaggagacc    2400
tttgtgcccc aacctccaaa ccaggaagat gactgtgtct ttgggcctcc atttgatttt    2460
cccctctttc aggggctcca ggtccatgga gttgaagaac aagggggttt ctag          2514
<210>66
<211>837
<212>PRT
<213>小鼠
<400>66
Met Val Gly Leu Gly Ala Cys Thr Leu Thr Gly Val Thr Leu Ile Phe
1               5                   10                  15
Leu Leu Leu Pro Arg Ser Leu Glu Ser Cys Gly His Ile Glu Ile Ser
            20                  25                  30
Pro Pro Val Val Arg Leu Gly Asp Pro Val Leu Ala Ser Cys Thr Ile
        35                  40                  45
Ser Pro Asn Cys Ser Lys Leu Asp Gln Gln Ala Lys Ile Leu Trp Arg
    50                  55                  60
Leu Gln Asp Glu Pro Ile Gln Pro Gly Asp Arg Gln His His Leu Pro
65                  70                  75                  80
Asp Gly Thr Gln Glu Ser LeuIle Thr Leu Pro Hi s Leu Asn Tyr Thr
                85                  90                  95
Gln Ala Phe Leu Phe Cys Leu Val Pro Trp Glu Asp Ser Val Gln Leu
            100                 105                 110
Leu Asp Gln Ala Glu Leu His Ala Gly Tyr Pro Pro Ala Ser Pro Ser
        115                 120                 125
Asn Leu Ser Cys Leu Met His Leu Thr Thr Asn Ser Leu Val Cys Gln
    130                 135                 140
Trp Glu Pro Gly Pro Glu Thr His Leu Pro Thr Ser Phe Ile Leu Lys
145                 150                 155                 160
Ser Phe Arg Ser Arg Ala Asp Cys Gln Tyr Gln Gly Asp Thr Ile Pro
                165                 170                 175
Asp Cys Val Ala Lys Lys Arg Gln Asn Asn Cys Ser Ile Pro Arg Lys
            180                 185                 190
Asn Leu Leu Leu Tyr Gln Tyr Met Ala Ile Trp Val Gln Ala Glu Asn
        195                 200                 205
Met Leu Gly Ser Ser Glu Ser Pro Lys Leu Cys Leu Asp Pro Met Asp
    210                 215                 220
Val Val Lys Leu Glu Pro Pro Met Leu Gln Ala Leu Asp Ile Gly Pro
225                 230                 235                 240
Asp Val Val Ser His Gln Pro Gly Cys Leu Trp Leu Ser Trp Lys Pro
                245                 250                 255
Trp Lys Pro Ser Glu Tyr Met Glu Gln Glu Cys Glu Leu Arg Tyr Gln
            260                 265                 270
Pro Gln Leu Lys Gly Ala Asn Trp Thr Leu Val Phe His Leu Pro Ser
        275                 280                 285
Ser Lys Asp Gln Phe Glu Leu Cys Gly Leu His Gln Ala Pro Val Tyr
    290                 295                 300
Thr Leu Gln Met Arg Cys Ile Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Trp Ser
305                 310                 315                 320
Pro Trp Ser Pro Gly Leu Gln Leu Arg Pro Thr Met Lys Ala Pro Thr
                325                 330                 335
Ile Arg Leu Asp Thr Trp Cys Gln Lys Lys Gln Leu Asp Pro Gly Thr
            340                 345                 350
Val Ser Val Gln Leu Phe Trp Lys Pro Thr Pro Leu Gln Glu Asp Ser
        355                 360                 365
Gly Gln Ile Gln Gly Tyr Leu Leu Ser Trp Asn Ser Pro Asp His Gln
    370                 375                 380
Gly Gln Asp Ile His Leu Cys Asn Thr Thr Gln Leu Ser Cys Ile Phe
385                 390                 395                 400
Leu Leu Pro Ser Glu Ala Gln Asn Val Thr Leu Val Ala Tyr Asn Lys
                405                 410                 415
Ala Gly Thr Ser Ser Pro Thr Thr Val Val Phe Leu Glu Asn Glu Gly
            420                 425                 430
Pro Ala Val Thr Gly Leu His Ala Met Ala Gln Asp Leu Asn Thr Ile
        435                 440                 445
Trp Val Asp Trp Glu Ala Pro Ser Leu Leu Pro Gln Gly Tyr Leu Ile
    450                 455                 460
Glu Trp Glu Met Ser Ser Pro Ser Tyr Asn Asn Ser Tyr Lys Ser Trp
465                 470                 475                 480
Met Ile Glu Pro Asn Gly Asn Ile Thr Gly Ile Leu Leu Lys Asp Asn
                485                 490                 495
Ile Asn Pro Phe Gln Leu Tyr Arg Ile Thr Val Ala Pro Leu Tyr Pro
            500                 505                 510
Gly Ile Val Gly Pro Pro Val Asn Val Tyr Thr Phe Ala Gly Glu Arg
        515                 520                 525
Ala Pro Pro His Ala Pro Ala Leu His Leu Lys His Val Gly Thr Thr
    530                 535                 540
Trp Ala Gln Leu Glu Trp Val Pro Glu Ala Pro Arg Leu Gly Met Ile
545                 550                 555                 560
Pro Leu Thr His Tyr Thr Ile Phe Trp Ala Asp Ala Gly Asp His Ser
                565                 570                 575
Phe Ser Val Thr Leu Asn Ile Ser Leu His Asp Phe Val Leu Lys His
            580                 585                 590
Leu Glu Pro Ala Ser Leu Tyr His Val Tyr Leu Met Ala Thr Ser Arg
        595                 600                 605
Ala Gly Ser Thr Asn Ser Thr Gly Leu Thr Leu Arg Thr Leu Asp Pro
    610                 615                 620
Ser Asp Leu Asn Ile Phe Leu Gly Ile Leu Cys Leu Val Leu Leu Ser
625                 630                 635                 640
Thr Thr Cys Val Val Thr Trp Leu Cys Cys Lys Arg Arg Gly Lys Thr
                645                 650                 655
Ser Phe Trp Ser Asp Val Pro Asp Pro Ala His Ser Ser Leu Ser Ser
            660                 665                 670
Trp Leu Pro Thr Ile Met Thr Glu Glu Thr Phe Gln Leu Pro Ser Phe
        675                 680                 685
Trp Asp Ser Ser Val Pro Ser Ile Thr Lys Ile Thr Glu Leu Glu Glu
    690                 695                 700
Asp Lys Lys Pro Thr His Trp Asp Ser Glu Ser Ser Gly Asn Gly Ser
705                 710                 715                 720
Leu Pro Ala Leu Val Gln Ala Tyr Val Leu Gln Gly Asp Pro Arg Glu
                725                 730                 735
Ile Ser Asn Gln Ser Gln Pro Pro Ser Arg Thr Gly Asp Gln Val Leu
            740                 745                 750
Tyr Gly Gln Val Leu Glu Ser Pro Thr Ser Pro Gly Val Met Gln Tyr
        755                 760                 765
Ile Arg Ser Asp Ser Thr Gln Pro Leu Leu Gly Gly Pro Thr Pro Ser
    770                 775                 780
Pro Lys Ser Tyr Glu Asn Ile Trp Phe His Ser Arg Pro Gln Glu Thr
785                 790                 795                 800
Phe Val Pro Gln Pro Pro Asn Gln Glu Asp Asp Cys Val Phe Gly Pro
                805                 810                 815
Pro Phe Asp Phe Pro Leu Phe Gln Gly Leu Gln Val His Gly Val Glu
            820                 825                 830
Glu Gln Gly Gly Phe
        835
<210>67
<211>2583
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>嵌合蛋白
<400>67
atgcgacctt ccgggacggc cggggcagcg ctcctggcgc tgctggctgc gctctgcccg     60
gcgagtcggg ctctggagga aaagaaagtt tgccaaggca cgagtaacaa gctcacgcag    120
ttgggcactt ttgaagatca ttttctcagc ctccagagga tgttcaataa ctgtgaggtg    180
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Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala
1               5                   10                  15
Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln
            20                  25                  30
Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe
        35                  40                  45
Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn
    50                  55                  60
Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys
65                  70                  75                  80
Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val
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Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr
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Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu
    130                 135                 140
His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu
145                 150                 155                 160
Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met
                165                 170                 175
Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro
            180                 185                 190
Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln
        195                 200                 205
Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg
    210                 215                 220
Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys
225                 230                 235                 240
Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp
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Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro
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Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val
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Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn
            340                 345                 350
Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp
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Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp
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Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln
            420                 425                 430
His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu
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Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser
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Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu
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Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu
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Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro
            500                 505                 510
Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn
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Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly
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Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro
545                 550                 555                 560
Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro
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Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val
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Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys
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Pro Lys Ile Pro Ser Asp Pro Ser Asp Leu Asn Ile Phe Leu Glu Ile
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<213>人工的
<220>
<223>嵌合蛋白
<400>75
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Gln Glu Ala Asp Leu Asp Leu Leu Arg Val Thr Leu Ser Ser Lys Pro
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Gln Ala Leu Ala Thr Pro Asn Lys Glu Glu His Gly Lys Arg Lys Lys
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Ala Pro Ser Cys Ile Cys His Pro Gly Tyr His Gly Glu Arg Cys His
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Gly Leu Ser Leu Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro
145                 150                 155                 160
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Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln
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1               5                   10
<210>83
<211>7
<212>PRT
<213>小鼠
<400>83
Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1               5
<210>84
<211>9
<212>PRT
<213>小鼠
<400>84
Gln Gln Tyr His Ser Asp Pro Phe Thr
1               5
<210>85
<211>444
<212>DNA
<213>小鼠
<400>85
atgtcctctc cacagacact gaacacactg actctaaaca tgggatggag ctgggtcttt     60
ctcttcctcc tgtcaggaac tgcaggtgtc cactctgagg tccagctgca acagtctgga    120
cctgagctga tgaagcctgg ggcttcagtg aagatgtcct gtaaggcttc tggatacatt    180
ttcactgact attacatgaa ctgggtgaag cagagtcatg gaaagagcct tgaatggatt    240
ggacgtgtta atcctaacaa tggtggaact agctacagcc agaagttcaa ggacaaggcc    300
acattgacag tagacaaatc cctcaacaca gcctacatgc aggtcaacag cctgacatct    360
gaggactctg cggtctatta ctgtgcaaga atctactatg gtggttcgga ctggggccaa    420
ggcaccactc tcacagtctc ctca                                           444
<210>86
<211>148
<212>PRT
<213>小鼠
<400>86
Met Ser Ser Pro Gln Thr Leu Asn Thr Leu Thr Leu Asn Met Gly Trp
1               5                   10                  15
Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly Val His Ser
            20                  25                  30
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
        35                  40                  45
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Tyr
    50                  55                  60
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
65                  70                  75                  80
Gly Arg Val Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Ser Gln Lys php
                85                  90                  95
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Leu Asn Thr Ala Tyr
            100                 105                 110
Met Gln Val Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
        115                 120                 125
Ala Arg Ile Tyr Tyr Gly Gly Ser Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
    130                 135                 140
Thr Val Ser Ser
145
<210>87
<211>396
<212>DNA
<213>小鼠
<400>87
atgatgagtc ctgtccagtt cctgtttctg ttaatgctct ggattcagga atccaacggt     60
gagattgtga tgacccagac tccactgtct ttgtcggtta ccattggaca accagcctct    120
atctcttgca agtcaagtca gagcctctta tatactactg gaaagacata tttgaattgg    180
ttacaacaga ggcctggcca ggctccaaaa cacctgatgt atcaggtgtc caaactggtc    240
cctggcatcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcagaaa cagattttac acttaaaatc    300
agcagagtgg aggctgaaga tttgggagtt tattactgct tgcaaggtac atattatcct    360
catacgttcg gatcggggac caagctggaa ataaaa                              396
<210>88
<211>132
<212>PRT
<213>小鼠
<400>88
Met Met Ser Pro Val Gln Phe Leu Phe Leu Leu Met Leu Trp Ile Gln
1               5                   10                  15
Glu Ser Asn Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser
            20                  25                  30
Val Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser
        35                  40                  45
Leu Leu Tyr Thr Thr Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg
    50                  55                  60
Pro Gly Gln Ala Pro Lys His Leu Met Tyr Gln Val Ser Lys Leu Val
65                  70                  75                  80
Pro Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe
                85                  90                  95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr
            100                 105                 110
Cys Leu Gln Gly Thr Tyr Tyr Pro His Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys
        115                 120                 125
Leu Glu Ile Lys
    130
<210>89
<211>390
<212>DNA
<213>小鼠
<400>89
atggattttc aagtgcagat tttcagcttc ttgctgatca gtgcctcagt cataatgacc    60
agaggacaaa atgttctcac ccagtctcca gcaatcatgt ctgcctctcc aggggagaag    120
gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt gtaagttcca tgtacttgca ctggtaccag    180
cagaagtcag gagcctcccc caaactctgg atttatggca catccaacct ggcttctgga    240
gtccctactc gcctcagtgg cagtgggtct gggacctctt actctctcac aatcagcagc    300
gtggaggctg aaaatgctgc cacttattac tgccagcagt atcatagtga cccattcacg    360
ttcggcacgg ggacaaaatt ggaaataaaa                                     390
<210>90
<211>130
<212>PRT
<213>小鼠
<400>90
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Ile Met Thr Arg Gly Gln Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile
            20                  25                  30
Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser
        35                  40                  45
Ser Ser Val Ser Ser Met Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly
    50                  55                  60
Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly
65                  70                  75                  80
Val Pro Thr Arg Leu Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu
                85                  90                  95
Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asn Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
            100                 105                 110
Gln Tyr His Ser Asp Pro Phe Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu
        115                 120                 125
Ile Lys
    130
<210>91
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>91
tccgaattcc accatgaagc tgctgccgtc ggtg    34
<210>92
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>92
tttgcggccg ctagaggctc agcccatgac acct    34
<210>93
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>93
ctgggtcttt ctcttcctcc tgtca              25
<210>94
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>94
tgagattgtg atgacccaga ctcca              25
<210>95
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>95
ttctcaccca gtctccagca atca               24
<210>96
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>96
ttggatccgt cactttatcc tccaagccac a                                   31
<210>97
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>97
ttctcgagga ggctcagccc atgacacct                                      29
<210>98
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>98
ttctcgagcc gaagacatgg gtccctctt                                      29
<210>99
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>99
taggatccaa gagggaccca tgtcttcgg                                      29
<210>100
<211>66
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>PCR引物
<400>100
gatccaagag ggacccatgt cttcggaaat acaaggactt ctgcatccat ggagaatgca    60
aatatc                                                               66
<210>101
<211>66
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>嵌合蛋白
<400>101
tcgagatatt tgcattctcc atggatgcag aagtccttgt atttccgaag acatgggtcc    60
ctcttg                                                               66
<210>102
<211>69
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>嵌合蛋白
<400>102
gatcctgcat ccatggagaa tgcaaatatg tgaaggagct ccgggctccc tcctgcatct    60
gccacccgc                                                            69
<210>103
<211>69
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>嵌合蛋白
<400>103
tcgagcgggt ggcagatgca ggagggagcc cggagctcct tcacatattt gcattctcca    60
tggatgcag                                                            69
<210>104
<211>66
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>嵌合蛋白
<400>104
gatccgctcc ctcctgcatc tgccacccgg gttaccatgg agagaggtgt catgggctga    60
gcctcc                                                               66
<210>105
<211>66
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>嵌合蛋白
<400>105
tcgaggaggc tcagcccatg acacctctct ccatggtaac ccgggtggca gatgcaggag    60
ggagcg                                                               66