钾离子通道阻滞化合物及其用途 【发明领域】
本发明涉及瞬时外向钾离子通道和其它钾离子通道的抑制剂。
【发明背景】
以下是对相关技术的描述，其中无论哪个都不会认为是权利要求的现有技术。
钾离子(K+)通道是跨膜蛋白，它能随着膜电位的变化，或者随着阳离子和/或配位体的激活而选择性地把K+移入或移出细胞。K+通道的主要作用是保持静息膜电位：另一个作用是使敏感细胞中动作电位复极。钾离子通道代表了不同类型的离子通道蛋白，并且现在已经阐明几种毒素主要是通过阻滞一种或多种特殊K+通道来起作用(如果不只是唯一的作用)(Rudy，＂Diversity and Ubiquityof K Channels＂，25Neuroscience 729，1988)。心脏细胞是以K+通道不同亚型的显著多样性为特征的。在一次动作电位过程中因膜的除极而能够打开好几种类型的K+通道，这些不同通道运载的离子流(currents)总和会引起膜的复极而达到静息电位。一旦膜除极，这些类型通道之一的瞬时外向K+通道能够产生快速(在1-10毫秒)启动的一股离子流(I10)，然后迅速(10-200毫秒)衰退(失活)。I10对心脏动作电位的最初复极起着最显著的作用，并且能被几种非特异性药用化合物如氨基吡啶类化合物和tedisamil，一种三类抗心律失常剂所阻滞(Dukes等，“Tedisamil Blocks the Transient and Delayed Rectifier K+ Currents in Mammal ian Cardiac and Glial Cells”254J.Pharmacd.Exp.Ther.560，1990)。阻滞I10导致心脏动作电位的延长。已从人心脏细胞中记录下了I10，如Escande等在“ Two Types ofTransient Outward Currents inAdult Human Atrial Cells”，252Am.J.Physiol H142，1987中所述。据说延长心脏动作电位(并且因此无刺激反应)是抑制再活动性心房和心室心律失常的一种机理(Lynch等，“Therapeutic Potential of ModulatingPotassium Currents in the Diseased Myocardium”6 FASEB J.2952，1992)。目前可得到的第III类抗心律失常剂，其中多数能够通过阻滞称作延缓型校正K+通道的一种单独的K+通道亚型起作用，它可以引起心脏动作电位的过度延长，这样会导致心室心律失常的出现，称作torsades de pointes(Sanguinetti，“Modulation of Potassium Channels by Antiarrhythmicand Antihypertensive Drugs”，19 Hypertension 228，1992)。
电压依赖性K+通道地打开也是中枢神经元非常短的动作电位特征过程中出现细胞膜复极的机理。在这种过程中，瞬时外向K+通道离子流(在神经元中称作I A)起着重要作用。树突毒素(dendrotoxin)，一种源于蛇类的毒素，选择性阻滞神经节神经元中迟缓型非失活K+离子流(Penner等，“Dendrotoxin：ASelective Blocker of a Non-inactivating PotassiumCurrent in Guinea-Pig Porsal Root Ganglion Neurones，407 Pfluqers Arch.365，1986)，并且在海马状突起的切片中也能阻滞瞬时外向K+离子流(IA)(Halliwell等，“CentralAction of Dendrotoxin：Selective Reduction of aTransient K Conductance in Hippocampus and Binding toLocalized Acceptors”，83Proc.Natl.Acad.sci.USA493，1986)。由树突毒素所引起的神经元中动作电位时间的延长会导致神经递质释放的增加(Harvey and Anderson，“Dendrotoxins：Snake Toxins That Block Potassium Channels andFacilitate Neurotransmitter Release”，31 Pharmac.Ther.33，1985)。有人已经提出在这个领域中的进一步研究可证实这将成为治疗认识性疾病如阿尔茨海默氏症的一种药理途径(Lavretskyand Jarvik，“A Group of Potassium-Channel Blockers-Acetylcholine Releasers：Nev Potentials for AlzheimerDisease？A Review”，12J.Clinical Psychopharm.110，1992)。发明概述
本发明一般涉及瞬时外向钾离子通道(例如，在心脏细胞和神经元中分别称作I10或IA的离子流)的新的特异性和有效的抑制剂或阻滞剂。本发明也涉及到从蜘蛛毒液中分离出的新多肽或其等同物，它们对一种或多种钾离子通道如瞬时外向钾离子通道有活性。
具体来说，提供了从蜘蛛疾行异足蛛和Olios fasciculatus的毒液中分离出的多肽毒素新活性的例子。这些肽(这里将其简称为化合物1、2和3)是电压依赖性瞬时外向K+通道的特异性有效的阻滞剂，它们阻滞心脏细胞的相应整细胞离子流(I10)。这些药剂本身，其片段或用一种配位体结合测定法(或其等同方法)应用这些毒素或其等同物发现的化合物，或其等同物，可用于治疗心律不齐，并且可用于治疗学习和记忆的障碍(如阿尔茨海默氏病)、帕金森氏症、多发性硬化症、精神分裂症、癫痫、中风和肌肉痉挛症。
一般来说，从蜘蛛疾行异足蛛和Olios fascicul atus的毒液中能够分离到本文所述和要求保护类型的有用的K+通道阻滞性多肽。也能分离到其它阻滞钾离子通道的具有相似或同源氨基酸(或其它化合物或单体)序列的多肽(或其等同物)。申请人相信本发明首次测出了源于蜘蛛毒液的毒素中这种K+通道阻滞活性的存在，由此表明对蜘蛛毒液中其它这类多肽的筛选是有用的和可生产的。本发明还涉及使用这些多肽来筛选作为活性剂可作用于共同位点(即，瞬时外向钾离子通道)的其他药剂的方法。
本申请人相信能选择性地阻滞中枢神经元中IA通道并引起神经递质释放增加的化学药剂可用于治疗阿尔茨海默氏病和其它神经疾病，相似地，本申请人也相信能选择性阻滞心脏细胞中I10通道的药剂可用于治疗心律失常。因此，能够把这些多肽和相关的化合物或药剂用于治疗心律失常，阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，多发性硬化病，精神分裂症，癫痫，中风和肌肉痉挛症。
所以，本发明第一方面阐述特异性有效的瞬时外向钾离子通道抑制剂、阻滞剂或拮抗剂。
术语“瞬时外向钾离子通道”是一个熟知的术语，该术语定义为不同种类细胞中特定亚型的钾离子通道，如，在心脏细胞和神经细胞中分别以上述注明的离子流I10和IA为特征的K+通道。
术语“抑制剂”是用来指减少由瞬时外向钾离子通道所产生的离子流的药剂。在本领域中，术语如“阻滞剂”和“拮抗剂”是与术语“抑制剂”互换使用的。
“特异性”是指对瞬时外向钾离子通道阻滞的半数最大值(IC50)为100nM或低于100nM，并且在至少高于瞬时外向K+通道IC50值10倍的浓度时对其它K+通道(如迟缓型校正K+通道，内向校正K+通道，乙酰胆碱激活的或ATP抑制的K+通道)，Na+或Ca2+通道均没有作用。
“有效”是指在抑制剂的浓度小于100nM，优选小于10nM和更优选小于1nM时能够抑制指定瞬时外向K+通道的50％。
在优选的实施方案中，这些药剂是多肽或源于蜘蛛毒液中的多肽。尽管本文提供了这种多肽的具体实例，但在本发明中这些实例不是限定性的，并且本领域普通技术人员应当意识到在各种蜘蛛毒液中能够容易鉴定出其它多肽，包括却不限于本文所述的多肽。此外，本领域普通技术人员应当意识到用标准方法能够合成等同的多肽。用常规的筛选方法能够很容易地鉴定出这些肽阻滞、抑制或拮抗选定的瞬时外向钾离子通道的特定活性部位。例如，能够合成或用各种肽酶从完整的多肽中生成特定肽片段，并目如下文所述在测定方法中测得这些片段具有抑制活性。在本发明中作为抑制剂具有活性的这些片段可用于各种筛选试验和治疗应用中。
此外，能够很容易地合成这种多肽的类似物或突变蛋白。这些合成包括对氨基酸序列中不影响原始多肽抑制或阻滞活性的区域进行修饰。在该抑制剂的许多保守区域中，可以取代氨基酸而不显著改变该抑制剂的活性，例如，使用较小的氨基酸如甘氨酸取代其它较小的氨基酸如缬氨酸，或者用带正电或负电荷的氨基酸取代相似电荷的氨基酸。
术语“衍生”简单地表示能够根据蜘蛛毒液中所鉴定的多肽通式结构合成化合物。用本领域所熟知的方法能进行这种衍生，上文一般性地提供了这种特定例子。术语“衍生”优选包括如上所述的类似物，突变蛋白和片段，它们具有如上文所述的多肽毒素的所需调节活性。
用蜘蛛疾行异足蛛和Olios fasciculatus的毒液中发现的多肽举例说明上述发明，按照本发明的三种特定多肽以及含有该多肽的级份包括疾行异足蛛肽化合物1(SEQ.ID.NO.1)，疾行异足蛛肽化合物2(SEQ.ID.NO.2)，和Ol ios fasciculatus肽化合物3(SEQ.ID.NO.3)。在一个实例中，本发明的多肽阻滞心脏和神经细胞中的瞬时外、向K+通道。本发明包括具有与疾行异足蛛肽化合物1和化合物2以及Olios fascicul atus肽化合物3的多肽基本上相同的氨基酸序列和基本上相同的K+离子流阻滞活性的多肽。
本发明第二方面阐述一种筛选瞬时外向钾离子通道活性剂的方法，它包括把一种瞬时外向钾离子通道与一种已知特异性瞬时外向钾离子通道抑制剂(如上述那些)和一种可能的瞬时外向钾离子通道活化剂相接触，然后测定可能的活化剂对已知抑制剂的结合的抑制作用。结合抑制作用表明是一种有用的瞬时外向钾离子通道活化剂。能够很容易地筛选出这类活化剂并测定其特异性。
“活性剂”是指增加(如果它作为一种激动剂)或者减少(如果它作为一种抑制剂)通过瞬时外向钾离子通道离子流的一种化合物。
本发明相关的一方面阐述一种从蜘蛛毒液中筛选一种有用的K+通道活化剂的方法，作为本文所述方法的举例说明。筛选该毒液来测定含有所需活性的级份。
“K+通道活性剂”是指增加或者抑制任何一种其它类型的K+通道(如迟缓型校正K+通道，内向校正K+通道Ca2+—激活或ATP—敏感型的K+通道)的化合物。
在优选的实施方案中，该筛选方法包括使用心脏或神经组织的瞬时外向钾离子通道。
本发明范围还包括一种鉴别能与瞬时外向钾离子通道结合的化合物的方法，所述化合物优选在与疾行异足蛛肽化合物1和化合物2，以及Olios fasciculatus肽化合物3结合的相同位点上结合。
本发明第三方面阐述一种治疗疾病或症状的方法，其中通过给生物体使用一种治疗有效量的一种特异性瞬时外向钾离子通道抑制剂或者一种源于蜘蛛毒液中的多肽(或其等同物)，调节瞬时外向钾离子通道的活性，来达到治疗有用的结果。被治疗的特殊疾病包括(但不限定)上述所列的那些。
“调节”是指降低瞬时K+通道的活性。例如，通过阻滞该通道的细孔，或者通过改变通道闸门的电压依赖性。
治疗包括的步骤是，首先用常规的临床方法诊断患有疾病或症状的患者(人或非人类)，然后给这类患者提供一种治疗有效的本发明组合物。
“治疗有效”是指能够使患者的所述疾病或状态的一种或多种症状缓解(到某种程度)的一种用量。此外，“治疗有效”还指能够使与该疾病或状态有关的或是该疾病或状态病因的生理或生化参数部分或者全部地恢复到正常的一种用量。通常该用量在大约1nmol/kg和1μmol/kg分子之间，这取决于它的EC50和患者的年龄，体重和疾病。
本发明另外一方面阐述一种药用组合物，它包括一种特异性瞬时外向钾离子通道抑制剂或蜘蛛毒液多肽(或其等同物)。
本发明还一方面阐述从一种蜘蛛毒液中可获得的一种多肽(或其类似物)，它是钾离子通道活性的一种抑制剂。本发明还提供这种多肽的独特片段。如上文所定义，这种类似物不是从毒液中所得到的多肽本身，而是通过分析一种已分离出的多肽(如本文举例说明的)所衍生的或者通过筛选其它毒液所获得的。
术语“独特片段”是指在本申请申请日已知序列中没有发现同样等同物的部分。用申请日时存在的一个解析多肽的数据库来测定等同物能够很容易地识别这些片段。
“药学上可接受的组合物”是指在一种药学上可接受的载体中含有一种治疗有效量的本发明的一种化合物，即，一种制剂，其中能够把该化合物加入其中溶解或者用别的方法使该化合物易于给药。药学可接受的载体例子包括水，生理盐水和生理缓冲盐水。这种药物组合物是以适当剂量来提供的。这些组合物一般是指由FDA或者非美国的相同机构所批准用于治疗一种特定疾病的那些组合物。
“疾病或状态”是指上述所列出的那些疾病和涉及心脏或神经细胞的相关疾病。
这种化合物用作杀虫剂也包括在本发明的范围内。申请人相信本文所述的化合物具有显著的杀虫作用，或许是通过阻滞与哺乳动物心肌的瞬时外向K+通道结构上相似的通道起作用。我们知道蜘蛛产生的毒液含有具有有效杀虫活性的多种毒素(Quistad，G.B，等“Insecticidal activity of Spider(Araneae)，centipede(Chilopoda)，scorpion(Scorpionidae)，and snake(Serpentes)venoms 85 Journal Economic Entomology 33，l992)。这些毒素在释放压力的作用下而放出，从而产生能够有效和迅速杀死或麻痹捕获昆虫的毒素(Jackson，H和P.N.R.Usherwood，“Spider toxins as tools for dissectingelements of excitary amino acid transmission”，11Trends in Neurosciences 278，1988)。
本发明的其它特征和优点在下列所述的优选实施方案和权利要求中将是显而易见的。
优选实施方案的描述
首先简要说明附图附图
图1是在用80％A/20％B平衡的、Vydac C18反相HPLC柱(10×250mm)上进行分离的疾行异足蛛毒液(120μl)的色谱分析图。在44分钟内用76％A/24％B到65％A/35％B的线性梯度洗脱(A＝0.1％TFA(含水)，B＝0.1％TFA(溶于CH3CN中))。注射该毒液5分钟后开始该梯度洗脱，并在39分钟时停止洗脱用3分钟时间将柱洗以50％B以洗脱最后的峰。在220nm处监测洗脱物的吸收度。以吸收峰底部的数值标记级份(#1—8和最后级份)。
图2是在阳离子交换柱上进行分离的肽化合物1和2的色谱分析图。(a图)对肽化合物1而言，用0～0.32M NaCl的50mM醋酸钠pH4.0的线性梯度在32分钟内展开该柱，然后用0.32～1M NaCl的50mM醋酸钠pH4.0的线性梯度在5分钟内展开该柱。(b图)对肽化合物2而言，用0-0.3M NaCl的50mM醋酸钠pH4.0的线性梯度在3分钟内展开该柱，然后用含0.3-1M NaCl的50mM醋酸钠pH4.0的线性梯度在35分钟内展开该柱。以1ml/分钟的流速洗脱，并在280nm处监测流出物。如色谱图所示收集级份。
图3是在Vydac C-18反相柱(300，10×250mm)上进行分离的Olios fasciculatus毒液(108ul)的色谱图。注射试样5分钟后，用20-45％乙腈/0.1％TFA线性梯度在75分钟内展开该柱。在50分钟时，用100％乙腈/0.1％TFA流过柱子7分钟。流速在3.0ml/分钟，并且监测在320nm处流出物。如色谱图所示收集级份。
图4是用阳离子交换色谱分析纯化的肽化合物3的色谱图。注射试样5分钟后，用0.25-lM NaCl的50mM醋酸钠缓冲液pH4.0的线性梯度在75分钟内展开该柱。以1ml/分钟流速洗脱并在280nm处监测流出物。如该色谱图所示收集级份。
以下详细描述发现和使用本发明有用的化合物治疗如心律失常和记忆、学习障碍的方法和实验。一种主要方法是用放射性配位体结合技术(或其等同技术)能够迅速筛选出化合物(合成的和天然产物)，来识别能修改被化合物1、化合物2或化合物3所结合的瞬时外向K+通道上的位点结合的那些化合物。用一种相似方法能够进行从蜘蛛毒液中筛选K+通道阻滞剂。此外，用这种技术也能很容易地筛选这种多肽的有用衍生物或类似物或突变蛋白质。
其他实验包括记录心脏和神经细胞中整个细胞离子流来确定那些能够作为瞬时外向钾离子流特异性活性药剂而与放射性标记的化合物1、化合物2或化合物3竞争性结合，并且对其它类型的通道没有显著作用的药剂。
本发明所述方法鉴别的药剂的理想特性包括：
1)特异地和有效地阻滞一种钾离子通道，如心脏或神经的瞬时外向K+通道。特异性阻滞是指该药剂在体内特定浓度时对其它离子通道或受体没有明显的作用，所说特定浓度是指以对心律失常或学习、记忆失调或者以上所列的其它疾病的治疗有效的剂量阻滞I10或IA时的体内浓度。
2)在治疗剂量时无明显副作用，包括过度延长心电图的QT间隔，心搏缓慢，高度兴奋性或疾病突然发作。蜘蛛毒液毒素的分离
以下是一种非限定的方法实例，由该方法可以分离本发明的抑制剂蜘蛛毒素。本领域的技术人员将会预想到用等同方法可以分离和识别具有本发明有用活性的其它多肽(或其等同物)。等同化合物是本文所指的类似物，突变蛋白和衍生物，并且是可用本文所述的方法来识别的具有对一种或多种K+通道有活性的类似物，突变蛋白和衍生物。本领域的技术人员将会预想到一旦识别和测序出一种有用的K+通道活性剂，就能够化学合成其全部或片段，并且如下所述，可以对该序列进行修饰。此外，这类片段或多肽本身可以用来筛选其活性与原多肽等同的其它活性剂。
按照对本领域技术人员所熟知的方法用电刺激分泌方法从蜘蛛疾行异足蛛和0lios fasciculatus中获得毒液。所用的方法优选应当保证全部毒液不被腹部反流液或血淋巴所污染。这种方法对本领域技术人员是熟知的。在—78℃左右以冷冻状态存放这样获得的全部毒液直到用于如下所述的精制。在各种预备和半预备柱如C-4和C-18 Vydac柱(Rainin Instrument Co.Inc.，Mack Road；Woburn，Massachusetts 01801)上用反相高效液相色谱法实现从全部毒液中精制组分。在220nm进行单色峰值测定。例如用一台Waters990二极管排列的测量仪(Millipore Corporation，WatersChromatography Division，34Maple Street，Milford，Massachusetts 01757)所测定收集的多色U V数据对级份进行进一步的分析。用已知方法如使用一台级份收集仪和一台ISCO2159峰值测定仪(ISCO，4700Superior，Lincoln，Nebraska，68504)收集柱中的级份。用适当大小的容器如无菌聚乙烯实验室器皿收集该级份。然后用冻干洗脱液，再冻干水份来完成对级份的浓缩。使用与最后精制级份时所用体系不同类型的柱子通过色谱分析方法测定所得到的级份的纯度。
肽的测序
按照已知方法能够对发明的多肽，如本文所识别的多肽进行测序。测定主结构的一般方法包括如下列步骤：1)将二硫键连接的半胱氨酸残基还原和进行S-吡啶化来提高底物对酶作用的敏感性；2)通过单一或多次步骤的酶解来控制该肽的裂解；3)用反相高效液相色谱层析法(HPLC)分离和纯化肽的片段；4)经N-末端测序和离子喷射质谱分析使肽片段特征化。
例如在溶液中进行该多肽半胱氨酸残基的S-吡啶乙基化研究，接着进行该多肽的氨基酸测序。如下所述能够完成S-吡啶乙基化的步骤。
把约1到10μg的多肽溶于或稀释在最多5μl的-种缓冲液中，这种缓冲液是混合1份含4mM EDTA pH8.5的三羟甲基氨基甲烷盐酸和3份8M盐酸胍制得的。加入2.5μl10％2-巯基乙醇水溶液并在暗处氩气中室温下把混合物保温两小时，保温之后，加入2μl 4-乙烯基吡啶(-20℃氩气中存放的新鲜试剂)，并把混合物在暗处氩气中室温下再保温两小时。然后除去混合物中的盐分，优选在一只较短的反相柱上用色谱法进行。最后按照已知方法对回收的烷基化多肽测序。
另一方面，如Kruft等，193Aral.Biochem.306(1991)所述在原位还原并S-吡啶乙基化后对该多肽测序。
目前，就来自疾行异足蛛毒液中的肽化合物1和化合物2和来自olios fasciculatus毒液中的肽化合物3而言，本文公开了特定的优点，使用不通过分离/纯化整个毒液的方法也能够获得其它肽。使用重组DNA技术通过克隆所述多肽或其部分的一种编码序列能够生产本发明的多肽。例如，按照本领域技术人员所熟知的方法使用已利用目前已知该多肽氨基酸序列信息的杂交探针来克隆整个多肽的编码序列。结合使用重组DNA技术和体外蛋白合成技术也能生产本发明的多肽。这种体外蛋白合成方法包括，但不限于，使用一台ABI430A固相肽合成仪(Applied Biosystems，Ins.，850LincolnCentre Drive，Foster City，California94404)应用本领域技术人员所熟知的常规Merrifield化学法或其它固相化学方法。等同的肽
众所周知，在多肽中能够进行特定氨基酸的取代而不影响或基本上不影响所说多肽的功能。这种可行性的取代在实际操作中因多肽的不同而有所不同。按照本领域技术人员熟知的方法对可允许的取代进行测定。因此，具有基本上相同的氨基酸序列和基本上相同的K+通道阻滞活性的所有多肽都应当属于本发明的范围之内。生物活性
这种多肽及其片段可用于治疗心律失常或记忆、学习失调如阿尔茨海默氏病以及上述其它疾病。当用于这类适应症时，把该多肽及其片段按照本领域公知的常规制剂方法如在Remington′sPharmaceutical Sciences(最新版，Mack Pnblishing Company，Easton，PA)中所公开的那些方法，制备成制剂。该制剂的性能将取决于给药途径和所需剂量。使用肽类药物常用的常规最优化技术能够实现对特定适应症的剂量最佳化。
一般来说，优选静脉内，肌肉内，皮下或腹膜内注射给药。对注射液来说，在液体基质如林格氏液，Hank溶液或其它形式的生理盐水中配制该肽或片段。制剂也包括冻干制剂，它能在给药时重新配制。把本发明活性化合物提供给受体的另一种方法包括透过粘膜或透皮给药，其中该制剂含有渗透促进剂，如洗涤剂，以及其它赋形剂。适当配制的口服给药也包括在本发明范围内。使用肽类化合物1，2和3进行筛选测定
此外，这种肽类及其生物活性片段可用于筛选试验以测定小分子或其它准药物抑制化合物1，2或3与心脏或神经瞬时外向钾离子通道结合的能力。本文以下描述了对竞争性结合的适当测定，其中使用了本发明的化合物1，2和3。在用于这种测定时，一般以放射性标记的形式提供多肽类化合物1，2或3(或一种活性片段)，并且评价所测化合物与放射性标记化合物竞争的能力。
以下实施例是用来详细说明而不是限定本发明的。
实施例1：疾行异足蛛的毒液级份
通过用A把75-120μl等份的粗制毒液稀释成1ml，并将稀释的部分上样到20％B平衡的一只Vydae C18柱上(10×250mm)，将约900μl的疾行异足蛛毒液进行分级分离。(A＝0.1％TFA(含水)；B＝0.1％TFA(溶于CH3CN))。3分钟后，用1分钟时间将梯度变为24％B并且在第5分钟时，开始用44分钟时间将线性梯度由24％变为35％B。流速为3.5ml/分钟，并在220nm测定流出液(图1)。收集到下列级份：级份1(在5和16分钟之间洗脱的峰)，级份2(在16和19分钟之间洗脱的峰)，级份3(在19和23.5分钟之间洗脱的峰)，级份4(在23.5和26.5分钟之间洗脱的峰)，级份5(在26.5和29.5分钟之间洗脱的峰)，级份6(在29.5和33分钟之间洗脱的峰)，级份7(在33和37分钟之间洗脱的峰)，级份8(在37和39分钟之间洗脱的峰)以及最后的级份(在39和46分钟之间洗脱的峰)。在39分钟时，大部分毒液组分已经洗脱后，用50％B过柱3分钟。当再没有峰值洗脱出时(～7分钟)，用4分钟时间把柱恢复到20％B并平衡柱子用于下一次色谱分离。合并且冻干从8次色谱分离流出的类似级份。如下面实施2和4中分另所述，级份6和7的主要峰与化合物1和2一致。
实施例2 Heteropoda肽化合物1
将疾行异足蛛粗制毒液(～50μl)上样至反相HPLC柱(Vydac，C-18300A，22×250nm)，并且在60分钟内使用从80％A和20％B到65％A和35％B双相线性梯度进行洗脱(A＝0.1％三氟醋酸(TFA)，B＝乙腈)，在220nm处测定，流速为15ml/分钟。收集所需要的43到44分钟的级份。用冷冻干燥法浓缩由各次运行中收集的组份。
用下列方法测定并确定肽化合物1的结构。使用Waters Pico-Tag系统对三份相同的1-10nmol样品进行PTC氨基酸分析。在一台脉冲-液相测序仪(ABI)上对天然和还原的/吡啶乙基化肽进行N-末端测序。从一台SCI-EXAPI III离子喷射质谱仪上得到质谱分析。
按照Kruft等，193 Anal.Biochem.306(1991)的方法原位生产适合于N-末端测序的化合物1的吡啶乙基化衍生物。
同时获得的这些数据证实了肽化合物1的结构如下所示。SEo.ID.No.1：Asp Asp Cys Gly Lys Leu Phe Ser Gly Cys Asp Thr Ash Ala1 5 10Asp Cys Cys Glu Gly Tyr Val Cys Arg Leu Trp Cys Lys Leu15 20 25Asp Trp 3030个残基，6个半胱氨酸，3个二硫键。计算的质量＝3412.86(酰胺)。测得的质量＝3412.70(离子喷射质谱)。估算的p1＝3.76。
实施例3：Heteropoda肽化合物1
在一只HEMA-IEC BIO SB柱(10μm，4.6×150cm；Alltech Associates，Deerfield，IL 60015)上用离子交换色谱分离法进一步纯化肽化合物1。把从反相层析法得到的含有肽化合物1的冻干物溶于3ml50mM醋酸钠(pH4.0)，并且如下用三等分进行层析分离。把1ml样品上样在用50mM醋酸钢(pH4.0)平衡的HEMA-IEC BIO SB柱子上。5分钟后，在32分钟内用0-0.32M NaCl的50mM醋酸钠溶液(pH4.0)的线性梯度展开该柱，接着在5分钟内用0.32-1M NaCl的50mM醋酸钠溶液(pH4.0)的线性梯度展开该柱(图2a)。10分钟后，在5分钟内把柱恢复到起始条件，并且平衡该柱以用于下一步的色谱分析。以1ml/分钟洗脱，并在280nm监测洗出液。如色谱图上所示收集级份。把另外2ml粗制化合物1如上所述进行色谱分离并合并三次色谱分离中相似的级份。
在一只Vydac C-18反相柱(10×250mm，300)上使在26.5和29分钟之间从离子交换柱上洗脱出的主要吸收峰脱盐，把合并的级份(～10ml)装载到用20％乙腈/0.1％TFA平衡的反相柱上。10分钟后，在30分钟内用20-35％的乙腈/0.1％TFA的线性梯度以3.5ml/分钟的流速展开该柱，并在220nm处监测洗出液。把35.5和38分钟之间洗脱出的级份冷冻干燥，得到641μg的纯化肽化合物1。测得该肽质量为3412.72(电子喷射离子化质谱法)。
实施例4Heteropoda肽化合物2
把疾行异足蛛粗制毒液(～50μl)上样至一只反相HPLC柱(Vydac，C-18，300A，22×250mm)上，并在60分钟内使用由80％A和20％B到65％A和35％B的双相线性梯度进行洗脱(A＝0.1三氟醋酸(TFA)，B二乙腈)，在220nm测定，流速为15ml/分钟。在46到48.5分钟之间收集所要的级份。用冷冻干燥法浓缩从各次运行中收集的级份。
把源于50μl粗制毒液的上述级份的物质上样至一只反相HPLC柱(Vydac，C-18，300A，22×250mm)上，并使用75％A和25％B+(A＝0.1％TFA，B＝乙腈)等效洗脱程序进行洗脱，在220nm处测定，并以3.5ml/分钟的流速进行操作。在55到68分钟之间收集所需的级份。用冷冻干燥法浓缩从各次运行中收集的级份。
用下列方法测定并确定肽化合物2的结构。用Waters Pico-Tag系统对三份相同的1-10nmol样品进行PTC氨基酸分析。用一台脉冲-液相测序仪(ABI)对天然和还原的/吡啶乙基化肽进行N-末端测序，从一台SCI-EXAPI III离子喷射质谱仪上得到质谱分析。
按照Kruft等，193Anal Biochem 306(1991)的方法原位生产适合N-末端测序的化合物的吡啶乙基化衍生物。
同时获得的这些数据证实了如下所示的肽化合物2的结构。SEQ.ID.No.2：Glu Cys Gly Thr Leu phe ser Gly Cys Ser Thr His Ala Asp1 5 10Cys Cys Giu Gly Phe Ile Cys Lys Leu Trp Cys Arg Tyr Glu15 20 25Arg Thr Trp 30 31个残基，6个半胱氨酸，3个二硫键。计算的质量＝3599.05(酰胺)测得的质量＝3599.38(离子喷射质谱)估算的pl＝5.41。
实施例5：Heteropoda肽化合物2
在一只HEMA-IEC BI0 SB柱(10μm，4.6×150cm)上用阳离子交换层析法纯化肽化合物2。把从最初反相层析得到的含有肽化合物2的冻干物溶解在3ml50mM醋酸钠(pH4.0)中，并如下对三等份进行色谱分析。把1ml样品上样至在用50mM醋酸钠(pH4.0)平衡的HEMA-IEC BIO SB柱上。5分钟后，在3分钟内用0-0.3M NaCl的50mM醋酸钠溶液(pH4.0)的线性梯度展开该柱子，接着在35分钟内用0.3-1M NaCl的50mM醋酸钠溶液(pH4.0)线性梯度展开该柱(图2b)。5分钟后，在10分钟内把该柱恢复到起始条件并进行平衡以用于下一步层析。以1ml/分钟流速洗脱，并在280nm监测洗出液。如色谱上所示收集级份。如上所述把其它两毫升粗制化合物2进行层析。并且合并来自三次层析的相同级份。
在一只Vydac c-18反相柱(10×250mm，300)上分两部分脱去在30和34分钟之间从阳离子交换柱上洗脱的主要吸收峰的盐分。把该柱在25％乙腈/0.1％TFA中平衡，并用起始溶剂洗脱10分钟接着在20分钟内用25-35％乙腈/0.1％TFA线性梯度以3.5ml/分钟的流速洗脱。在220nm处监测洗出液，并且在26.5到29分钟以单峰形式洗脱出肽化合物2。然后把从阳离子交换柱中得到的其它洗出液脱去盐分，并且合并相同的级份。冷冻干燥这些流出液得到1.88mg纯化的肽化合物2。测得这种肽的质量为3599.52(电子喷射离子化质谱法)。
实施例6：Olios fasciculatus毒液的分级分离
用1.5ml的20％乙腈/0.1％TFA稀释大约108μl的Oliosfasci culatus的毒液并将样品上样至用相同缓冲液平衡过的一只VydacC-18柱(300，10×250mm)将全部毒液进行分级分离。注射样品5分钟后，在75分钟内用20-45％乙腈/0.1％TFA的线性梯度展开该柱(图3)。在50分钟时，大多数毒液成分洗脱下来后，用7分钟时间将柱子洗以100％乙腈/0.1％TFA。流速为3.0ml/分钟，并且在220nm监测洗出液。如色谱图上所示收集级份。冷冻干燥在40和42分钟之间洗脱出的含有肽化合物3的级份(#21)，并把残余物溶于2ml 50nM醋酸钠，0.25M NaCl溶液(pH4.0)中。
实施例7：Olios fasciculatus化合物3
在一只HEMA-IEC BIO SB柱(10μm，4.6×150cm，来自Alltech Associates，Deerfield，IL60015)上用阳离子交换层析法进一步纯化肽化合物3。把从反相层析中得到的含肽化合物3的溶液(1.5ml)装载在用相同缓冲液平衡过的HEMA-IEC BIO SB柱上。5分钟后，在75分钟内用0.25-1M NaCl的50mM醋酸钠缓冲液(pH4.0)的线性梯度展开该柱(图4)。以1ml/分钟流速洗脱，并在280nm处监测洗出液。如该色谱图上所示收集级份。
在一只Vydac C-18反相柱(10×250mm，300)上把在27和32分钟之间从阳离子交换柱上洗脱下来的主要峰值的物质(级份#4)脱盐。把级份(～4.5ml)装载在用0.1％TFA平衡过的反相柱上。3分钟后，在3分钟内用0-15％异丙醇/0.1％TFA的线性梯度展开该柱，接着在5分钟内用15-30％异丙醇/0.1％TFA的线性梯度展开该柱。以1.0ml/分钟流速洗脱，并在220nm处监测洗出液。冷冻干燥在43和45分钟之间洗脱出的级份得到70μg纯化的肽化合物3。测得该肽的质量为3786.64(电子喷射离子化质谱法)。
得到了还原、衍生的肽化合物3的N-末端序列分析。序列如下
SEQ.ID.No.3：
Asp Asp Cys Ala Gly Trp Met Glu Ser Cys Ser Ser Lys
1 5 10
Pro Cys Cys Ala Gly Arg Lys Cys Phe Ser Glu Trp Tyr
15 20 25
Cys Lys Leu Val Val Asp Gln Asn
3034个残基，6个半胱氨酸，3个二硫键。测得质量＝3786.64(离子喷射质谱) 对氨基酸33和34的鉴别可信度较低。实施例8：疾行异足蛛和Olils fasCiculatus肽级份和化合物1，2和3的K+通道阻滞活性
用下列方法证实本发明的肽级份和化合物1，2和3阻滞瞬时外向K+通道的能力。
按照前面所述的方法(Kamp等，“Voltage-and Use-dependent Modulation of Cardiac Calcium Channels bythe Dihydropyridine(+)-202-791”，64 Circ.Res.3381989)分离鼠心室的心肌细胞。该方法包括用含有胶原酶和蛋白酶的溶液逆行灌注到一个切下的鼠心脏来酶解整个心脏从而分离适用于标准电位差施加试验的单个心脏肌细胞。用其他所详细描述(Hamill等，“Improved Patch Clamp Techniqnes for High-resolutionCurrent Recording from Cells and Cell-Free MembranePatches”，391 Pflugers Arch.85，1981)的施加电位差技术从分离的肌细胞记录全部细胞的离子流。把细胞放入一个0.5ml记录室中，并用下列组合物的缓冲液浸泡，这种组合物为(以mM计)：NaCl 132：MgCl2，1.2: CaCl2，1.8；KCl，4；HEPES，10；葡萄糖，10：pH为7.4。在记录K+离子流的大多数试验中，去除CaCl2而向该溶液中加1mM Co2+来阻滞Ca2+离子流。用商业上可买到的片夹放大器(Axon Instruments Axopatch ID)给该肌细胞施加一个电位差，并用个人计算机收集和分析数据。给细胞施加-60mV的电压。使用的测试电压(500毫秒间隔)范围是-40至+30mV。利用这些技术能够记录这些细胞中的几种K+离子流，包括内向校正K+离子流；迅速激活、非失活的迟缓型校正K+离子流；和电压依赖性的瞬时外向K+离子流(I10)。分别把实施例1中所述制得的毒液级份1-8和最后级份的干级份残余物溶于1ml水中。然后用3ml的缓冲液稀释10μl的每个样品来测试心脏K+离子流的作用。在这些条件下，肽级份2-9以一种电压依赖性的方式阻滞I10。在-10mV的试验电位时完全阻滞，在+30mV试验电位时阻滞降低到对照值的30到70％。如上述实施例3和5中所述分离并纯化级份6(化合物1)和级份7(化合物2)的主要肽。化合物1以电压依赖性方式阻滞I10，在较小的除极试验电位时有较大的阻滞出现。通过测定抑制50％的I10所需的浓度(IC50)和在三种不同的试验电位时这种离子流的最大阻滞的方法来定量表示这种阻滞。在-10mV，+20mV和+50mV试验电位时I10的最大阻滞分别是100％，79％和69％，阻滞I10的IC50在-10mV为16nM，在+20mV为35nM以及在+50mV为138nM(n＝4-6)。与阻滞I10一样，在90％复极时测得，化合物1(30nM)延长了34±5％所分离的鼠心室肌细胞的动作电位时间。选择性地延长动作电位时间是第三类抗心律失常药的活性(VaughanWilliams，“Delayed ventricular repolarization as anantiarrhythmic principle”，6 Eur.Heart J.145，1985)。测定化合物1或2对其它心脏离子流的作用来评价其特异性。如使用标准全细胞电位施加技术所测试的，在0.2-1.0μm浓度时化合物1或化合物2不影响下列心脏的离子流：——鼠心室肌细胞中超速迟缓型校正K+离子流(Ikur)——豚鼠心室肌细胞中缓慢迟缓型校正K+离子流(Iks)——鼠和豚鼠心室肌细胞中内向校正K+离子流(Iki)——鼠心室肌细胞的钠离子流(INa)——鼠和豚鼠心室肌细胞中L型Ca2+离子流(Ica-L)
在一个分离的人心室肌细胞中，化合物1(0.2μM)也阻滞I10但不阻滞Ikw，类似于在鼠心室肌细胞中的发现。
化合物3也有相似活性，在试验电位＜0mV在1μM时完全阻滞I10，同时对迟缓型校正或内向校正K+离子流没有影响。一旦失去了毒素，化合物1和化合物2(1μM)的作用基本上相反。
还测试了化合物1或2对由分离的非心脏细胞所记录的许多其他K+通道的活性。在0.2-1.0μM，化合物1或2对下列无作用：——鼠中枢细胞(浦肯野氏神经元，小脑粒细胞，海马锥体细胞，交
感神经神经节细胞)，GH3垂体细胞或兔破骨细胞的迅速迟缓
型校正K+离子流(Ik)——鼠小脑粒细胞或交感神经的神经节细胞的瞬时外向电流(In)——在Xenopus oocytes中所表达的一种克隆通道。
因此表明化合物1和2对心脏肌细胞中的一种类型的通道(一种电压激活的瞬时外向K+离子流)是非常具有特异性唯一报道的抑制(神经细胞中)瞬时外向K+离子流的其它毒素是树突毒素(Halinell等“Central action of dendrotoxin：Selective veduction of a transient K conductance in hippocampus and binding to localized acceptors”83 Proc.Natl.Acad.Sci.USA493，1986)。但是，我们已证明树突毒素(2μM)对鼠心脏I10没有作用。所以，化合物1，2和3是首次描述能特异性阻滞心脏I10的毒素。
实施例9：化合物1和2的神经作用
用本发明化合物1和2对海马切片的电生理作用来证实它影响中枢神经活性的能力。
用断头术处死雄性Sprague-Dawley鼠(100-2009)。从颅内取出大脑，马上放入冷的(4-6℃)充氧的(95％O2/5％CO2)人造脑脊髓液(aCSF)中，这种人造脑脊髓液是由NaCl，126；KCl，2.5，NaH2PO4，1.24；MgSO4，1.3；CaCl2，2.4；NaHCO3，26；葡萄糖11(单位mM)所组成，如前面(Mueller等，“Arylamine spider toxins antagonize NMDA receptor-mediated synaptic transmission in rat hippocampalslices”，9synapse244，1991)所述制备海马切片。室温下把切片保存在有充氧的aCSF的200ml容器中。在1小时的恢复期后，把一个切片转移到小容量(～300μl)的记录室中。在该切片上放置较轻的铂来增加记录的稳定性。用aCSF覆盖该切片，并以一种过冷系统保持。新鲜充氧的aCSF流速为2ml/分钟。保持该切片浸泡在该流动的aCSF中，以使药物进入该切片的电位问题降到最低。对细胞外的电位记录时，把记录室的温度保持在33℃。在肉眼观察下把双极同轴刺激电极放在靠近CA1-CA2边缘的辐射层下。为引发突触反应，每30秒向各切片释放3-50V的50微秒的单向脉冲同时测量该反应，直到从特定记录位置上得到电位的最大幅度为止。然后设置电压来引发半数最大反应。用充有0～9％NaCl的2-3MW玻璃微电极进行记录，该电极也是在肉限观察下放置的。记录来源于CA1锥体细胞层(总体峰)或辐射层(场的兴奋性突触后电位(EPSP)和输入冲动排(AV))的突触反应，并将其数字化，输入一种以IBMPC机为基础的数据采集和存贮系统中。用磷酸盐缓冲液(PBS：NaCl，140mM；KCl，2.5mM；KH2PO4，1.5mM；Na2HPO4，8.1mM；pH7.4)以所需最终浓度的100-1000倍配制毒素，然后转入储备注射器中，以便通过稀释和混合达到所需的最终浓度。将全部药物和毒素过冷30分钟后使用，此时反应幅度一般已经平衡。把全部波型数据化并存盘。计算用药前5分钟期间(对照，用药前)和用药后5分钟期间(用药后25-30分钟)的细胞外所记录反应幅度平均值。
化合物1在总体峰的幅度上出现一个持续的增长，这种增长在用新鲜的aCSF冲洗化合物1期间没有恢复原状。对500nM化合物1的平均反应是增长35±9％(平均值±S.E.M.，n＝5个切片)在这些切片的两个切片中，同时记录的场兴奋性突触后电位的帽度以16％的平均值增长，而输入冲动排没有变化。
使用纯化的化合物2可得到相似结果，当以1μM的最后浓度使用化合物2时，它能在总体峰的幅度上产生25±7％(平均值±S.E.M.，n＝9个切片)的增长。在这些切片的两个切片中，同时记录的场兴奋性突触后电位的幅度以12％平均值增长，而输入冲动排没有变化。
综上所述，这些结果证实化合物1和2能够长时间增加Schaffer侧突的-CA1锥体细胞突触上的突触传递。这些数据不能区分突触前和突触后的作用部位，也不能清楚地表明作用的机理。在突触传递上的这种增长可能是因为对电压敏感性钾离子通道的阻滞所致。
当静脉注射(i.v.)或当通过脑室内注射给药(i.c.v)时，许多K+通道阻滞剂能够引起癫痫发作。例如，当以0.008μg/g通过脑室内注射时，相当于大约0.24μg只鼠，树突毒素能引起鼠抽搐和死亡(Schweitz，H.等，＂Purification andpharmacological Characterization of peptide toxins fromthe black mamba(Dendroaspis polylepis)venom＂，28Toxicon 847，1990)。比较起来，给有听原性癫痫发作倾向的鼠用1μg(n＝3)或2μg(n＝1)的化合物2通过脑室内注射时，化合物2不会引起抽搐或癫痫发作。以10，15或24μg(n＝1每次剂量)剂量静脉注射化合物2后，它能引起鼠瞬时共济失调，但没有观察到抽搐。
实施例10：其它K+通道阻滞毒素
化合物1、2和3是指从蜘蛛毒液中分离出来的能够阻滞特异性K+通道的首次报道的毒素例子。在不是疾行异足蛛和Oliosfasciculatus种的蜘蛛毒液中也含有结构上不相关的毒素(肽类和非肽类)，这些毒素能有效地阻滞哺乳动物细胞中的I10或者其它类型的K+通道。
现在已经知道从脊柱动物和非脊动物毒液中分离的几种其它毒素的特性。例如，从蜜蜂Apis mellifera毒液中已分离出两种毒素能够阻滞K+通道。蜜蜂神经毒素能够阻滞低电导Ca2+激活的K+通道，而MCD(肥大细胞脱粒)肽能阻滞非失活迟缓型校正K+通道(Strong，“Potassium Channel Toxins”，46Pharmac.Ther.137，1990)。从蝎子和蛇产生的毒液中已分离出了其它K+通道的特异性阻滞毒素。例如，Leiurus quinquestriatus蝎子的毒液中含有至少两种毒素，charybdotoxin和leiurotoxin，它们分别能阻滞高电导和低电导Ca2+激活性K+通道(Strong，“potassiumChannel Toxins”，46Pharm.Ther.127，1990)。现在已经从窄头眼镜蛇的毒液中分离出了能够阻滞神经元的非失活迟缓型校正K+通道的毒素(Harvey和Anderson，“Dendrotoxins：SnakeToxins That Block Potassium Channels and FacilitateNeurotransmitter Release”，31Pharmac.Ther.33，1985)。来自绿色窄头眼镜蛇(Dendroaspis angusticeps)的树突毒素和来自黑色窄头眼镜蛇(D.Polylepis)的毒素1都具有与β-金环蛇毒素明显的序列同源现象，其中β-金环蛇毒素是从Bungarusmulticinctus的毒液中分离出来的也能够阻滞相同类型K+通道的一种抑制性突触前神经毒素(Moczydlowski等，“An EmergingPharmacology of Peptide Toxins Targeted Against PotassiumChannels”，105J.Membrane Biol95，1988)。据报道以上所指的毒素具有除阻滞非失活迟缓型校正K+通道之外的作用。例如，β-金环蛇毒素也具有磷脂酶A2活性(Moczydlowski等)，而树突毒素也能阻滞海马神经元的钠离子流和一种缓慢失活的瞬时K+离子流(Li和McArdle“Dendrotoxin Inhibits Sodium andTransient Potassium Cuments in Murine HippocampalNeurons”，64.Biophys.J.A198，1993)。
上述毒素已经用于定义正常细胞的生理学和疾病组织细胞中的特异性K+通道的作用。但是已经发现对几种K+通道还没有发现较高特异性和有效的调节剂。对于发现这类新的通道配合体来说，蜘蛛毒液是一种可以发掘的资源。
通过使用全细胞电压施压记录技术测定整个毒液，由标准HPLC方法分离的毒液级份，和分离的毒素对分离的哺乳动物心脏和神经细胞K+离子流的作用来检测蜘蛛毒液中K+通道特异性毒素的存在。
实施例11：筛洗能存神经组织中瞬时外向K+通道部位与化合物
1/化合物2 /化合物3结合的化合物的方法
用本领域中已知的方法(乳过氧化物酶，Bolton-Hunter，氯胺T等)用125I标记化合物1，2或3或相关肽。使用下述方法测定作用于化合物1/化合物2/化合物3结合部位的候选化合物，通过测定其取代用125I标记的[125I]化合物1，[125I]化合物2，或[125I]化合物3或相关肽的特异性结合的能力来评价所述候选化合物。
把下列测试法作为一种高生产率的测试方法，来筛选产品库(如，天然产物库和主要制药公司申请的化合物)从而识别在I10通道上的化合物1/化合物2/化合物3结合部位具有活性的新的一类化合物。然后用这类新化合物作为以神经I10通道上化合物1/化合物2/化合物3结合部位为目标的药物开发项目的化学主结构。用这种测试法识别的化合物给学习和记忆失调如阿尔茨海默氏病和上述所列的其它疾病提供了一种新的治疗途径。如果在定量试验中使用了一种肽，确保该肽保留着它的生物活性是很重要的。就阻滞心脏I10而言，碘化的(125I)化合物1、化合物2和化合物3保留着它们的正常活性。例如，125I-化合物1以一种电压依赖性方式阻滞鼠心室肌细胞的I10，估计IC50在-10mV为25nM，在+20mV为70nM，并且在+50mV为150nM。
按照Williams等(“Effects of Polyamines on theBinding of[3H]MK-801 to the NNDA Receptor：Pharmacological Evidence for the Existence of aPolyamine Recognition Site”36Molec.Pharmacol.575，1989)的方法制备鼠脑膜，如下：把重量为100-200g的雄性Sprague-Dawley小鼠(Simonsen Laboratories)用断头术处死。用一台玻璃/Teflon匀浆机在含5mMK-EDTA的300ml0.32M蔗糖溶液(pH7.0)中把20只小鼠大脑(去掉小脑和脑干)匀浆。在1000xg把匀浆离心分离10分钟，去掉上清液，再在30,000xg离心分离30分钟。把所得到的沉淀物悬浮于250ml 5mM K-EDTA(pH7.0)，并在冰上搅拌15分钟。然后在30,000xg离心分离30分钟。把该沉淀物悬浮于90ml 5mM K-EDTA(pH7.0)，并把15-ml等分试样在0.9M和1.2M蔗糖溶液(各10ml)的不连续蔗糖梯度中分层。在95,000xg把该梯度溶液离心分离90分钟，收集在0.9M/1.2M蔗糖溶液界面的突触浆膜(SPM)。用500ml5mM K-EDTA(pH7.0)的悬浮液冲洗该膜，并在32℃保温30分钟，再在100,000xg离心分离30分钟。重复三次该冲洗步骤，包括30分钟的保温，将最后的沉淀物再悬浮于60ml 5mMK-EDTA(pH7.0)中，并在-80℃以等分试样存放。为进行与[125I]化合物1，2或3的结合试验，把突触浆膜(SPMs)融化，在32℃温育30分钟，冲洗一次，然后以100,000xg离心分离30分钟。把SPMs再悬浮于缓冲液A中(20mM K-HEPES，1mM K-EDTA，(pH7.0)。向该反应混合物中加入[125I]化合物1，2或3。在聚丙烯试管中进行结合试验。最后温育体积为200μl。在100μm非放射活性的化合物1，2或3存在下测定非特异性结合。把三份相同样品在32℃温育2小时。加入10ml冰冷的缓冲液A结束试验，然后用玻璃纤维滤纸过滤(Schl eicher&Schuell No.30)。用另外10ml缓冲液A冲洗滤纸，并用γ计数仪测定125I的放射活性。
为了证实上述测试，也进行了下列试验。
(a)把200μl含100nM[125I]化合物1、2或3的缓冲液A通过该玻璃纤维滤纸来测定与该滤纸非特异性结合的[125I]化合物1、2或3的量。用另外10ml缓冲液A冲洗该滤纸，并用闪烁计数法测定与该滤纸结合的放射活性。如果出现大量的非特异性结合的[125I]化合物1，2或3，则用未标识的化合物1，2或3提前冲洗该滤纸来限制这种结合。如果不出现较高非特异性结合，则用离心法而不是过滤法结束该试验，用闪烁计数法测定沉淀物中放射活性的量。
(b)将SPMs再悬浮于缓冲液A，作出一条饱和曲线。测试缓冲液含有75μg的蛋白质。使用[125I]化合物1，2或3的9个浓度，范围从10nM到100μM(半数对数单位)。由数据作一条饱和曲线，并用Scatchard分析法(Scatchard，“The Attractionsof Proteins for Small Molecules and Ions”，51Ann.N.Y.Aead.Sci.660，1949)测定近似KD值和Bmax。用Hill曲线的制图(Hill，“A New Mathematical Treatmentof Changesof Ionic Concentrations in Musele and Nerve Under theAction of Electric Currents，With a Theory to TheirMode of Excitation”40 J.Physiol.190，1910)测定[125I]化合物1，2或3的结合协同性。
(c)把SPMs悬浮于缓冲液A来测定结合对蛋白(受体)浓度的依赖性。这种试验缓冲液(200μl)含有与其KD值相等浓度的[125I]化合物1，2或3和可增长浓度的蛋白。[125I]化合物1、2或3的特异性结合应当与蛋白(受体)的含量呈线性关系。
(d)把SPMs悬浮于缓冲液A中来测定配合体-受体结合的时间过程。该试验用的缓冲液(300μl)含有与其KD值相等浓度的[125I]化合物1，2或3和100μg蛋白。在不同时间长度于32℃温育三份相同的样品；测定达到平衡的时间，并且在所有随后进行的试验中通常用到这个时间点。
(e)用竞争性试验能够分析结合部位的药理。在这种试验中，保持[125I]化合物1，2或3的浓度和蛋白量不变，同时改变试验(竞争)药物的浓度。这种试验能够测定竞争药物的IC50和近似KD(Cheng和Prusoff，“Relationship Between theInhibition Constant(K1)and the Concentration ofInhibitor Which Causes 50 Percent Inhibition(IC50)ofan Enzymatic Reaction”，22J.Biochem.Pharmacol.3099，1973)。用Hill曲线分析法确定该竞争药物的结合协同性。
[125I]化合物1，2或3的特异性结合是指能与I10通道上的一个新部位结合。按照这样，与化合物1，2或3相关的肽应当以竞争性方式竞争[125I]化合物1，2或3的结合，并且在这种试验中它们的功效应当与在阻滞I10(如，在分离出的神经或心脏细胞中对I10的抑制)的功能性试验中它们的抑制功效有关。相反，在I10通道上的其它部位具有活性的化合物应当不能以竞争性方式替换[125I]化合物1，2或3的结合。相反地，可能会出现对[125I]化合物1，2或3结合的复杂变构调节，这表明是非竞争性的相互作用。
(f)在[125I]化合物1，2或3的结合达到平衡(见上述(d))后测定它们的结合，并向反应混合物中加入较多过量的无放射活性的竞争性药物来进行评估解离动态的研究。然后在不同时间间隔测定[125I]化合物1，2或3的结合。用这种测试方法，测出[125I]化合物1，2或3结合的结合和解离比(Titeler，“Multiple Dopamine Receptors：Receptor Binding Studiesin Dopamine Pharmacology”，Marcel Dekker，Inc.，NewYork，1983)。另外的试验包括改变反应温度(20℃到37℃)来搞研究这些参数对温度的依赖性。
实施例12：能够结合至心脏组织的瞬时外向K+通道上化合物1/化合物2/化合物3结合部位的化合物的筛选方法
通过本领域中已知方法(乳过氧化物酶，Bolton-Hunter氯胺T等)用125I标记化合物1，化合物2，化合物3和相关的肽。用以下所述的技术测定作用于化合物1/化合物2/化合物3结合部位的候选化合物替换[125I]化合物1，[125I]化合物2，[125I]化合物3或用125I标记的相关肽的特异性结合的能力来评估它们。
把下列测试法当作一种高生产率的试验方法使用来筛选产品库(如，天然产物库和多数制药公司申请的化合物)，从而识别在心脏I10通道上化合物1/化合物2/化合物3结合部分具有活性的新的一类化合物。然后用这类新化合物作为以心脏I10通道上化合物1/化合物2/化合物3的结合部位为目标的药物开发项目的化学主结构。用这种测试法识别出的化合物给治疗再活动性室上和心室的心律失常提供了一条新的治疗途径。
按照Doyle等的方法(“Saxitoxin binding and“Fast”SodiumChannel Inhibition in Sheep Heart Plasma Membrane”249Am.J.Physiol H328，1985)。以及Jones和Besch的方法(“Isolation of Canine Cardiac Sarcolemmal Vesicles”，5Methods in Pharmacology 1，1984)，如Kamp和Miller改良的方法(“Voltage-dependent Nitrendipine Binding toCardiac Sarcolemmal Vesicles”，32Mol.Pharmacol.278，1987)制备心脏肌纤维膜泡囊。在0-4℃下制备新鲜的牛或其它合适哺乳动物心脏组织的心脏肌纤维膜泡囊。把心脏切成1cm3的小块，并用一台绞肉机制成糊状。在4倍肉糊体积的0.75M胆碱氯中(用30mMN-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)-15mMTris缓冲到pH7.4)把该肉糊匀浆。用一种Tekmar T185轴在300ml聚丙烯离心管中进行两次30秒的匀化搅拌。这种和所有其它的缓冲液都包括蛋白酶抑制剂：0.2mM苯基甲磺酰氟，1mM EGTA，和1mM二硫苏糖醇(dithiothreitol)。在一台Sorvall离心机的GSA转子中以27,000xg把所得到的匀浆离心20分钟。除去上清液并把沉淀物再悬浮于10mM HEPES-5mM Tris(pH7.4)中，并如上述再进行离心。把这次离心沉淀物再悬浮于10mM HEPES-Tris中，并用Tekmar的T185轴以5档设置进行三次匀化各30秒。在GSA转子中以14,000xg把匀浆离心20分钟。然后在GSA转子中以27,500xg把上清液离心70分钟。
在初步离心后，该膜悬浮于50％蔗糖，150mM KCl，100mMTris Cl和5mM焦磷酸钠中。把这些泡囊填充到四步不连续梯度的底部其它步骤的浓度为30％，21.5％和9.5％蔗糖。在一台Beckman50.2Ti转子中以193,000xg把这个梯度溶液离心1.5小时。在9.5％-21.5％蔗糖溶液界面的薄膜富集在表面肌纤维膜上。收集这种薄膜并将其释释到含150mM KCl，0.8mM NgSO4和10mM Tris HCl的缓冲液(pH＝7.4@22℃)中，然后在193.000×g离心35分钟。把所得到的沉淀物再悬浮于填料缓冲液，并再离心一次。把最后的沉淀物再悬浮于填料缓冲液到最终蛋白浓度为2mg蛋白/ml，液氮冷冻并在-70℃存贮到使用。
用150mM KCl填充膜泡囊(20-40μg蛋白)并稀释50倍制成1ml含150mM KCl的结合缓冲液。把该泡囊在37℃预保温5分钟，然后在没浓度的[125I]化合物1，2或3(1nM-1μm)存在下再次温育达到平衡条件所需的时间(由最初试验测得准确的时间)。加入4ml冰冷的结合缓冲液来终止结合反应，然后在Whatman GF/C滤纸上迅速过滤，随后用另外三份4ml的冰冷的结合缓冲液冲洗。用常规的γ计数技术测定与该滤纸结合的放射活性。[125I]化合物1，2或3的特异性结合定义为用总结合减去在1-10μm冷的化合物1，2或3存在下测得的结合。
用实施例8的(a)-(f)图中所略述的方法证实上述试验。
实施例13：重组受体结合试验
下面是迅速筛选本发明有用化合物的试验例。在这个试验中，用一般方法从合适的生物体如入可获得编码I10通道结合部位(受体)的cDNA或基因克隆。已克隆出了这类受体，并且在现有技术中是公知的。在一种适当表达载体中表达该克隆的分离片段来生产从该受体中能获得的最小多肽，这种多肽保留了结合化合物1，2或3的能力。用这种方法能够识别出含有新的化合物1/化合物2/化合物3受体的多肽。使用表达I10通道的稳定转染的哺乳动物细胞系(如，HEK293细胞)能使这种试验变得容易。
另一方面，化合物1/化合物2/化合物3受体能够与化学改性的化合物1，2或3以这样一种方法进行化学反应，即修饰与选择的化合物接触(或相邻)的化合物1/化合物2/化合物3肽受体的氨基酸残基，并由此可得到识别。如上所述，使用标准表达载体能够重组表达化合物1/化合物2/化合物3受体的片段，该片段含有经测定能与化合物1，2或3结合且足以能够与所说分子结合的那些氨基酸。
用标准化学方法能把具有所需结合特性的重组多肽与一种固相支持物相结合。然后把这种固相或亲和性基质与化合物1，2或3接触来证实这些化合物能与该柱子相结合，并且测定出从这些固相上除去该化合物的条件。然后用大数据库中的化合物重复这种步骤来测定能与该亲和性基质结合的那些化合物，然后用与化合物1，2或3的相似方式将其释放。尽管如此，也可以使用其他的结合和释放条件以获得能够在不同于化合物1/化合物2/化合物3肽结合所用的条件(如，尤其是在病理状态下能够更好模拟生理状态的条件)下结合的化合物。因此能够从存在于液体基质或提取物中的非常大量的化合物中筛选出确实能够结合的那些化合物。
一旦鉴别出能与上述化合物1/化合物2/化合物3结合多肽结合的化合物，即可用上述各种试验容易地测定那些化合物，确定它们或其简单的衍生物是否是可用于治疗心脏和神经疾病的有用化合物。
在另外一种方法中，可以将天然化合物1，2或3受体与一种柱或其它固相支持物结合。然后能够鉴别出不被在该受体其它部位结合的试剂所竞争的那些化合物。这类化合物定义了该受体上新的结合部位。被其它已知化合物所竞争的化合物能够与已知部位结合，或者与已知部位重迭的新部位结合。不管怎样，这类药物在结构上不同于已知化合物。因此，可以用来定义可用作治疗剂的新化学类别的兴奋剂或拮抗剂。制剂和给药
如本文所证实的，本发明有用的化合物可用于治疗神经性疾病或失调。尽管这些化合物常用于治疗人类患者，但它们也可用来治疗其它脊椎动物如其它灵长类动物，农用动物如猪，牛和家禽，以及体育用动物和玩赏用动物如马、狗和描的类似或相同疾病。
在治疗和/或诊断使用中，把本发明化合物配制成不同给药方式的制剂，这些给药方式包括全身和外科或局部给药。在Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，EastonPA中一般可以找到制剂技术和剂型。
对全身用药来说，优选口服用药。另一方面，也可以使用注射，如肌内，静脉内，腹膜内和皮下注射。对注射液来说，把本发明化合物用液体溶液，优选生理上可接受的缓冲液如Hank氏溶液或林格氏溶液配成制剂。另一方面，也可以把本发明的化合物用一种或多种赋形剂(如，聚乙二醇)配成制剂，这种赋形剂一般是以USP标准所规定的安全性可接受的。此外，可以把该化合物配成固体形式，并且在使用前迅速再溶解或悬浮。也包括冻干形式。
用透过粘膜或透过皮肤的方法也能全身给药，或者口服该化合物给药。对透过粘膜或透过皮肤给药来说，在该制剂中使用适合渗透该障碍的渗透剂。这些渗透剂在现有技术中一般都是已知的。例如，对透过粘膜给药来说，这种渗透剂包括胆汁盐和梭链孢酸衍生物。此外，使用洗涤剂可有利于渗透。透过粘膜给药可以通过部鼻部喷雾给药，例如，或者使用栓剂给药。对口服给药来说，把该化合物配成常规的口服剂型如胶囊剂、片剂和保健药剂。
对局部给药来说，如现有技术中所公知的，可把本发明化合物配成油剂，油膏剂、凝胶剂或霜剂。
用一般方法能够测定出本发明不同化合物的必须给药量。治疗用量一般是对于每公斤所治疗动物体重，剂量为1到50mg。
其它实施方案包括在下列权利要求中。
“序列表”(1)一般资料： (i)申请人： Michael.C.Sangui netti Alan Mueller (ii)发明名称： 钾离子通道阻滞化合物及其用途 (iii)序列数： 3 (iv)通信地址：
(A)住址： Lyon&Lyon
(B)街道： 6l1 West Sixth Street
(C)城市： Los Angeles
(D)州： California
(E)国家： 美国
(F)邮编： 90017 (v)计算机可读形式：
(A)介质类型： 3.5寸盘，1.44Mb容量
(B)计算机： IBM兼容机
(C)操作系统： IBM MS-DOS(5.0版)
(D)软件： WordPerfeet(5.1版) (vi)当前申请数据：
(A)申请号：
(B)申请日：
(C)分类： (vii)在先申请数据：
全部在先申请，包括下列所述申请：1
(A)申请号：08/033,388
(B)申请：03/18/93 (viii)律师/代理人资料：
(A)姓名： WARBURG，RICHARD J.
(B)登记号： 32,327
(C)参考/案号：206/093 (ix)通讯资料：
(A)电话： (213)489-1600
(B)传真： (213)955-0440
(C)电传： 67-3510(2)SEQ ID NO：1的资料： (i)序列特征：
(A)长度：30
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单股
(D)拓扑结构：线性 (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Asp Asp Cys Gly Lys Leu Phe Ser Gly Cys Asp Thr Asn Ala1 5 10Asp Cys Cys Glu Gly Tyr Val Cys Arg Ler Trp Cys Lys Leu15 20 25 Asp Trp 30(2)SEQ ID NO：2的资料： (i)序列特征：
(A)长度：31
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单股
(D)拓扑结构：线性 (xi)序列描述：SEQ ID NO：2： Glu Cys Gly Thr Leu Phe Ser Gly Cys Ser Thr His Ala Asp 1 5 10 Cys Cys Glu Gly Phe Ile Cys Lys Leu Trp Cys Arg Tyr Glu 15 20 25 Arg Thr Trp 30(3)SEQ ID NO：3的资料： (i)序列特征：
(A)长度：34
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单股
(D)拓扑结构：线性 (xi)序列描述：SEQ ID NO：3： Asp Asp Cys Ala Gly Trp Met Glu Ser Cys Ser Ser Lys Pro 1 5 10 Cys Cys Ala Gly Arg Lys Cys Phe Ser Glu Trp Tyr Cys Lys 15 20 25 Leu Val Val Asp Gln Asn 30