膜内在蛋白质的抽提 技术领域
本发明涉及采用不同去污剂切向流过渗滤法，从细菌或含有重组载体的细菌宿主细胞中抽提革兰阴性菌膜内在蛋白质的方法。
背景技术
革兰阴性菌有内膜和外膜。这些膜中所含的蛋白质总体上称为膜内在蛋白质。可从革兰阴性菌中抽提获得相对少量的天然膜内在蛋白质。重组表达技术能使细菌增加表达这些蛋白质。
小规模批量纯化这些天然的或重组的膜内在蛋白质涉及一利用离心从细菌细胞裂解液中抽提蛋白质的抽提步骤，接着采用常规的技术进行下游纯化。
然而，离心不适用于大规模地抽提这些蛋白质，因为离心是个麻烦的过程。需要一种大规模的抽提方法，以获得足够用于经济生产的大量蛋白质。
因而，需要一种避免使用离心从而更适用于大规模生产的抽提天然或重组革兰阴性菌膜内在蛋白质的方法。两种这样的蛋白质是流感嗜血杆菌的脂化的外膜蛋白质P4和P6。
发明概述
因而，本发明的一个目的是发展一种避免使用离心并且更适用于大规模生产的抽提天然或重组革兰阴性菌膜内在蛋白质的方法。
本发明的另一目的是发展一种选择性地溶解革兰阴性菌的内膜和外膜蛋白质的方法。
本发明地又一目的是发展从大肠杆菌抽提脂化形式的重组流感嗜血杆菌外膜蛋白质P4和P6的方法。
通过采用不同去污剂切向流渗滤且避免离心的方法实现本发明下述这些和其它目的。还可采用这些方法连续抽提所需的蛋白质。
对于采用不同去污剂切向流渗滤，分别从细菌或含有重组载体的细菌宿主细胞中抽提得到天然的或重组表达的革兰阴性菌内膜蛋白质的方法，它包括：
(a)裂解发酵培养液中的细菌或含有重组载体的细菌宿主细胞；
(b)用不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(a)得到的裂解发酵培养液，其中，所述缓冲液通过渗透去除了胞内和胞外性污染物，并用螯合剂防止蛋白质水解；
(c)用去污剂和不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(b)得到的裂解产物，其中，所述去污剂溶解并取出内膜蛋白质，并使用二价阳离子稳定外膜蛋白质，防止它们溶解；和
(d)收集(c)步取得的内膜蛋白质。
对于采用不同去污剂切向流渗滤，分别从细菌或含有重组载体的细菌宿主细胞中抽提得到天然的或重组表达的革兰阴性菌外膜蛋白质的方法，它包括：
(a)裂解发酵培养液中的细菌或含有重组载体的细菌宿主细胞；
(b)用不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(a)得到的裂解发酵培养液，其中，所述缓冲液通过渗透去除了胞内和胞外性污染物，使用螯合剂防止蛋白质水解；
(c)用去污剂和不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(b)得到的裂解产物，其中，所述去污剂溶解并去除内膜蛋白质，并使用二价阳离子稳定外膜蛋白质，从而防止它们溶解；
(d)用(c)步的缓冲液渗滤从(c)得到的裂解产物，并且用不含去污剂的(c)步的二价阳离子，以降低(c)步的去污剂浓度；
(e)用不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(d)得到的裂解产物，并用螯合剂和去污剂溶解和取出外膜蛋白质；
(f)收集(e)步取得的外膜蛋白质。
如果需要，在上述步骤之后，可进一步进行以下抽提步骤：
(g)使用(e)步中除去污剂以外的其余试剂渗滤从(e)得到的裂解产物，以减少去污剂的浓度；
(h)用(e)步试剂渗滤从(g)得到的裂解产物；和
(i)收集(h)步取得的外膜蛋白质。
对于采用不同去污剂切向流渗滤，从细菌宿主细胞中抽提出流感嗜血杆菌脂化重组外膜蛋白质P4(脂化rP4)的方法，它包括：
(a)裂解发酵培养液中的细菌宿主细胞；
(b)用不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(a)得到的裂解发酵培养液，其中，所述缓冲液通过渗透去除了胞内和胞外性污染物，并用螯合剂以防止蛋白质水解；
(c)用去污剂和不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(b)得到的裂解产物，其中，所述去污剂溶解并去除内膜蛋白质，并使用二价阳离子稳定外膜蛋白质，从而防止它们的溶解；
(d)用(c)步的缓冲液渗滤从(c)得到的裂解产物，并且使用不含去污剂的(c)步的二价阳离子，以降低(c)带来的去污剂浓度；
(e)用不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(d)得到的裂解产物，用螯合剂和去污剂溶解外膜蛋白质；
(f)用不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(e)得到的裂解产物，使用螯合剂和去污剂抽提和取出脂化rP4；和
(g)收集(f)步取得的脂化rP4。
如果需要，在上述步骤之后，可进一步进行以下抽提步骤；
(h)使用(f)步除去污剂外的其余试剂渗滤从(f)得到的裂解产物，以减少去污剂的浓度；
(i)用(f)步试剂渗滤从(h)得到的裂解产物以抽提和取出脂化rP4；和
(j)收集(i)步取得的脂化rP4。
如果还需要，在上述步骤之后，还可进一步进行以下抽提步骤：
(k)使用(f)步除去污剂外的其余试剂渗滤从(j)得到的裂解产物，以减少去污剂的浓度；
(l)用(f)步的试剂渗滤从(k)得到的裂解产物以抽提和取出脂化rP4；和
(m)收集(l)步取得的脂化rP4。
如果还需要，还可进一步进行脂化rP4抽提的循环。
对于采用不同去污剂切向流渗滤，从细菌宿主细胞中抽提得到流感嗜血杆菌脂化重组外膜蛋白质P6(脂化rP6)的方法，它包括：
(a)裂解发酵培养液中的细菌宿主细胞；
(b)用不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(a)得到的裂解发酵培养液，其中，所述缓冲液通过渗透去除了胞内和胞外性污染物，并使用螯合剂防止蛋白质水解；
(c)用去污剂和不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(b)得到的裂解产物，其中，所述去污剂溶解并去除内膜蛋白质，并使用二价阳离子稳定外膜蛋白质，从而防止它们的溶解；
(d)用不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(c)得到的裂解产物，使用螯合剂螯合二价阳离子并防止蛋白质水解，使用去污剂溶解和去除除脂化rP6外的外膜蛋白质；
(e)用不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(d)得到的裂解产物，用螯合剂防止蛋白质水解、用去污剂去除其他外膜蛋白质以及用盐破坏膜/外膜蛋白质复合体；
(f)用(e)步试剂(除了去污剂和盐外)渗滤从(e)得到的裂解产物，以减少去污剂的浓度；
(g)用去污剂和不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(f)得到的裂解产物，其中，所述去污剂溶解和去除结合于细胞外膜的其他蛋白质，用螯合剂防止蛋白质水解；
(h)用(g)步缓冲液和(g)步螯合剂渗滤从(g)得到的裂解产物，以减少从(g)带来的去污剂的浓度；
(i)用磷酸盐化合物和去污剂渗滤从(h)得到的裂解产物，以溶解和去除结合于细胞外膜的其他蛋白质；
(j)用磷酸盐化合物渗滤从(i)得到的裂解产物，以降低(i)带来的去污剂浓度；
(k)加热(j)步的裂解产物，以从膜中取出脂化rP6，同时用磷酸盐化合物和去污剂渗滤该裂解产物以溶解、抽提和取出脂化rP6；
(l)收集(k)步取得的脂化rP6。
如果需要，可修改抽提脂化rP6的方法，在进行(k)步之前浓缩(j)步得到的裂解产物。
附图的简短说明
图1描述了抽提脂化rP4期间取自渗透液流的样品的SDS-PAGE分析，如下面的实施例1所述。泳道：泳道1是Pharmacia低分子量标记物；2是0.1μg脂化rP4标准品；3是0.3μg脂化rP4标准品；4是1μg脂化rP4标准品；5是用裂解缓冲液(10mM Hepes，1mM EDTA)进行渗滤的渗透液；6是用TritonTMX-100进行渗滤的渗透液；7是用TrisTM缓冲液进行渗滤的渗透液；8是用ZwittergentTM3-12缓冲液进行1x渗滤的渗透液；9是用ZwittergentTM 3-12缓冲液进行10x渗滤的渗透液。
图2描述了在脂化rP4的抽提过程中4个试验的渗透流量，如下面的实施例2所述。流量以升/平方米膜面积/小时(1mh)计。
图3描述了脂化rP6抽提法第一部分期间取自渗透流液的样品的SDS-PAGE分析，如下面的实施例3所述。泳道：1是标记物12标准品；2是用裂解缓冲液进行渗滤的渗透液；3是用TritonTM X-100进行渗滤的渗透液；4是用TrisTM缓冲液进行渗滤的渗透液；5是用ZwittergentTM 3-14进行渗滤的渗透液；6是用ZwittergentTM 3-14/0.5M NaCl进行渗滤的渗透液；7是用TrisTM缓冲液进行渗滤的渗透液；8是用Sarcosyl进行渗滤的渗透液。
图4描述了脂化rP6抽提法第二部分期间取自渗透流液样品的SDS-PAGE分析，如下面的实施例3所述。泳道：1是标记物12标准品；2是用TrisTM缓冲液进行渗滤的渗透液；3是在室温用ZwittergentTM 3-12进行渗滤的渗透液；4是用TrisTM缓冲液进行渗滤的渗透液；5是浓缩步骤的渗透液；6是在55℃用ZwittergentTM 3-12进行渗滤的渗透液；7是在55℃用TrisTM缓冲液进行渗滤的渗透液；8是在55℃用ZwittergentTM 3-12进行渗滤的渗透液。
发明的详细描述
本发明抽提膜内在蛋白质的方法较其它方法有几个优点。首先，本发明将澄清和抽提合并在一项操作中。仅采用一步渗滤过程将产物从细胞中抽提出来并与细胞碎片分离。其它的方法通常需要一步抽提操作和第二步澄清操作。第二个优点是膜蛋白质以半纯化状态被抽提出来，这简化了下游的加工步骤。最后，本发明方法非常容易放大规模，因为所要求的仅仅是膜的表面积随着细胞的数量成比例地增加。
在开始本发明抽提方法之前，先采用常规的方法在同源或异源细菌宿主细胞中表达从革兰阴性菌的膜内在蛋白质，或者先分离得到天然的细菌。将发酵培养液通过匀浆器使其裂解，开始抽提过程。在本发明的一个较佳实施例中，匀浆器是一种微流化器(microfluidizer)。
然后采用切向流动渗滤技术裂解的发酵培养液进行不同去污剂抽提。在这个方法中，使用包含确定的截留值或孔径大小的渗透膜的切向流动系统，按特定的顺序加入缓冲液渗滤裂解的细胞。选择缓冲液的使用顺序以首先溶解内膜蛋白质，然后溶解外膜蛋白质。渗滤期间，小于此膜的分子量截留值的较小溶解蛋白质随着渗透液穿过了膜，而较大的分子和不溶的蛋白质则被保留。
然后改变缓冲液，并加入去污剂以溶解和抽提外膜蛋白质。控制缓冲液和去污剂的加入顺序，以选择性方式抽提所需的外膜蛋白质。然后采用常规方法如离子交换层析纯化抽提得到的蛋白质。
因此，本发明的抽提方法可选择性溶解革兰阴性菌的内膜和外膜蛋白质。溶解的蛋白质随着渗透液通过超滤膜，而不溶的蛋白质则被膜所保留。
可使用本发明方法从任何合适的革兰阴性菌中抽提天然的膜内在蛋白质，这些细菌包括但不限于流感嗜血杆菌(如P4和P6蛋白)、卡他性莫拉菌(Moraxellacatarrhalis，例如UspA1和UspA2蛋白)和B群奈瑟脑膜炎球菌。
采用本发明方法抽提得到的重组膜内在蛋白质可在任何含有一重组载体的合适的细菌宿主细胞中表达，这种表达进而又使该细胞中含有编码所需重组膜内在蛋白质的核苷酸序列。这些细菌宿主细胞的例子包括但不限于大肠杆菌、沙门菌、志贺菌和枯草杆菌(B.subtilis)。
不能用该膜抽提具有大的接近膜截留值的单体、多体或凝聚体大小的天然或重组蛋白质。然而，在大肠杆菌中以包涵体形式表达的革兰阴性菌蛋白质(如淋球菌蛋白或脑膜炎球菌蛋白)也可采用本方法抽提。包涵体比膜的截留值大因而被膜保留，而其它蛋白质则被抽提。然后加入尿素或类似的变性剂溶解该包涵体。然后采用常规方法抽提、复性和纯化所需的蛋白质。
本发明的抽提方法是以在大肠杆菌宿主细胞中表达的流感嗜血杆菌P4和P6蛋白的重组形式为例进行描述的。
流感嗜血杆菌的P4蛋白(也称为e蛋白)的分子量大约为30KD，在美国专利5601831中有所描述，本文纳入该文作为参考。天然形式的P4蛋白是脂化的。为了重组表达脂化的P4蛋白，从细菌获得P4基因，并将其插入适当的表达载体中。在下面的实施例1和2中使用了表达载体pBAD18-Cm〔L.-M.Guzman等人，J.Bacteriol.，177，4121-4130(1995)〕。这个载体含有一阿拉伯糖诱导型启动子和其它适当的控制元件。然后将该表达载体插入合适的细菌宿主细胞中。在下面的实施例1和2中，宿主细胞是大肠杆菌BLR菌株(Novagen，Madison，WT)。如果使用诱导型启动子，则加入了诱导物，引起宿主细胞表达所需的蛋白质。在下面的实施例1和2中，诱导物是L-阿拉伯糖。
流感嗜血杆菌的P6蛋白(也称为PBOMP-1和PAL)的分子量大约为15KD，在美国专利5110908中有所描述。P4蛋白的天然形式是脂化的。然而，先前试图重组表达脂化的rP4结果是产生低水平的表达。待授权的共同享有的美国临时专利申请号60/141067描述了一种产生脂化rP6的表达系统。为了重组表达脂化的rP6蛋白，从细菌中获得P6基因，并将其插入适当的表达载体中。在下面的实施例3和4中再次使用表达载体pBAD18-CM。将这个表达载体插入合适的细菌宿主细胞中，在下面的实施例3和4中，该宿主细胞还是大肠杆菌BLR菌株。如果使用诱导型启动子，则加入诱导物以引起宿主细胞表达所需的蛋白质。在下面的实施例3和4中，诱导物是L-阿拉伯糖。
在本发明的一个较佳实施例中，渗滤膜购自Millipore(Bedford，MA)。该膜由再生纤维素制成，截留值为1000KD，表面积为0.002m2/克湿重细胞。
任何可溶解蛋白质的去污剂可用于此抽提方法中，包括但不限于ZwittergentTM化合物(如ZwittergentTM 3-12和ZwittergentTM 3-14)、非离子性TritonTM化合物(如TritonTM X-100)、十二烷基肌氨酸钠、葡糖苷(如辛基葡糖苷、壬基葡糖苷或十二烷基麦芽苷、胆酸、脱氧胆酸或十二烷基麦芽苷)。在较佳实施例中，对于本文所述的具体步骤，去污剂是ZwittergentTM 3-12、TritonTM X-100和十二烷基肌氨酸钠。
可使用各种化合物作为抽提过程中的缓冲液，只要该化合物不被渗滤膜保留即可。这些缓冲液包括但不限于Hepes、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、TrisTM、磷酸钠和硼酸钠。在较佳实施例中，对于本文所述的具体步骤，缓冲液是Hepes、TrisTM和磷酸钠。
在一些抽提步骤中使用了螯合剂，以防止蛋白质水解和/或螯合二价阳离子。较佳的螯合剂是EDTA。二价阳离子在一些抽提步骤中使用到，以稳定或溶解外膜蛋白质。二价阳离子包括金属离子如Mg2+和Ca2+，Mg2+最佳。氯化钠是抽提脂化rP6的盐破坏步骤中优选的盐。
可修改抽提过程使其包括至少一个使用具有不同截留分子量的渗滤膜的操作，这样首先使裂解产物通过较大截留分子量的膜，任何再通过较小截留分子量的膜。这样的膜渗透顺序使得能在同一轮渗滤的不同阶段(裂解产物)分别纯化两种或多种膜内在蛋白质。
对于采用不同去污剂切向流渗滤，分别从细菌或含有重组载体的细菌宿主细胞中抽提得到天然的或重组表达的革兰阴性菌内膜蛋白质的方法，它包括：
(a)裂解发酵培养液中的细菌或含有重组载体的细菌宿主细胞；
(b)用不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(a)得到的裂解发酵培养液，其中，所述缓冲液通过渗透去除了胞内和胞外性污染物，并用螯合剂防止蛋白质水解；
(c)用去污剂和不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(b)得到的裂解产物，其中，所述去污剂溶解并取出内膜蛋白质，并使用二价阳离子稳定外膜蛋白质，防止它们溶解；和
(d)收集(c)步取得的内膜蛋白质。
对于采用不同去污剂切向流渗滤，分别从细菌或含有重组载体的细菌宿主细胞中抽提得到天然的或重组表达的革兰阴性菌外膜蛋白质的方法，它包括：
(a)裂解发酵培养液中的细菌或含有重组载体的细菌宿主细胞；
(b)用不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(a)得到的裂解发酵培养液，其中，所述缓冲液通过渗透去除了胞内和胞外性污染物，用螯合剂防止蛋白质水解；
(c)用去污剂和不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(b)得到的裂解产物，其中，所述去污剂溶解并去除内膜蛋白质，并使用二价阳离子稳定外膜蛋白质，从而防止它们的溶解；
(d)用(c)步的缓冲液渗滤从(c)得到的裂解产物，并且使用不含去污剂的(c)步的二价阳离子，以降低(c)步的去污剂浓度；
(e)用不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(d)得到的裂解产物，并用螯合剂和去污剂溶解和取出外膜蛋白质；
(f)收集(e)步取得的外膜蛋白质。
如果需要，在上述步骤之后，可进一步进行以下抽提步骤：
(g)使用(e)步中除去去污剂以外的其余试剂渗滤从(e)得到的裂解产物，以减少去污剂的浓度；
(h)用(e)步试剂渗滤从(g)得到的裂解产物；和
(i)收集(h)步取得的外膜蛋白质。
对于采用不同去污剂切向流渗滤，从细菌宿主细胞中抽提出流感嗜血杆菌脂化重组外膜蛋白质P4(脂化rP4)的方法，它包括：
(a)裂解发酵培养液中的细菌宿主细胞；
(b)用不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(a)得到的裂解发酵培养液，其中，所述缓冲液通过渗透去除了胞内和胞外性污染物，并用螯合剂防止蛋白质水解；
(c)用去污剂和不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(b)得到的裂解产物，其中，所述去污剂溶解并去除内膜蛋白质，并使用二价阳离子稳定外膜蛋白质，从而防止它们的溶解；
(d)用(c)步的缓冲液渗滤从(c)得到的裂解产物，并且用不含去污剂的(c)步得到的二价阳离子，以降低(c)带来的去污剂浓度；
(e)用不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(d)得到的裂解产物，用螯合剂和去污剂溶解外膜蛋白质；
(f)用不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(e)得到的裂解产物，使用螯合剂和去污剂抽提和取出脂化rP4；和
(g)收集(f)步取得的脂化rP4。
如果需要，在上述步骤之后，可进一步进行以下抽提步骤：
(h)使用(f)步除去污剂外的其余试剂渗滤从(f)得到的裂解产物，以减少去污剂的浓度；
(i)用(f)步试剂渗滤从(h)得到的裂解产物以抽提和取出脂化rP4；和
(j)收集(i)步取得的脂化rP4。
如果还需要，在上述步骤之后，还可进一步进行以下抽提步骤：
(k)使用(f)步除去污剂外的其余试剂渗滤从(j)得到的裂解产物，以减少去污剂的浓度；
(l)用(f)步的试剂渗滤从(k)得到的裂解产物以抽提和取出脂化rP4；和
(m)收集(l)步取得的脂化rP4。
如果还需要，还可进一步进行脂化rP4抽提的循环。
对于采用不同去污剂切向流渗滤，从细菌宿主细胞中抽提得到流感嗜血杆菌脂化重组外膜蛋白质P6(脂化rP6)的方法，它包括：
(a)裂解发酵培养液中的细菌宿主细胞；
(b)用不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(a)得到的裂解发酵培养液，其中，所述缓冲液通过渗透去除了胞内和胞外性污染物，并使用螯合剂防止蛋白质水解；
(c)用去污剂和不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(b)得到的裂解产物，其中，所述去污剂溶解并去除内膜蛋白质，并使用二价阳离子稳定外膜蛋白质，从而防止它们的溶解；
(d)用不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(c)得到的裂解产物，使用螯合剂螯合二价阳离子并防止蛋白质水解，使用去污剂以溶解和去除除了脂化rP6外的外膜蛋白质；
(e)用不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(d)得到的裂解产物，用螯合剂防止蛋白质水解、用去污剂去除其他外膜蛋白质以及用盐破坏膜/外膜蛋白质复合体；
(f)用(e)步试剂(除了去污剂和盐外)渗滤从(e)得到的裂解产物，以减少去污剂的浓度；
(g)用去污剂和不被渗滤膜保留的缓冲液渗滤从(f)得到的裂解产物，其中，所述去污剂溶解和去除结合于细胞外膜的其他蛋白质，用螯合剂防止蛋白质水解；
(h)用(g)步缓冲液和(g)步螯合剂渗滤从(g)得到的裂解产物，以减少从(g)带来的去污剂的浓度；
(i)用磷酸盐化合物和去污剂渗滤从(h)得到的裂解产物，以溶解和去除结合于细胞外膜的其他蛋白质；
(j)用磷酸盐化合物渗滤从(i)得到的裂解产物，以降低(i)带来的去污剂浓度；
(k)加热(j)步的裂解产物，以从膜中取出脂化rP6，同时用磷酸盐化合物和去污剂渗滤该裂解产物以溶解、抽提和取出脂化rP6；
(l)收集(k)步取得的脂化rP6。
如果需要，可修改抽提脂化rP6的方法，在进行(k)步之前浓缩(j)步得到的裂解产物。
为了更好地理解本发明，给出了下列实施例。这些实施例仅仅是阐述性的，而不是限制本发明的范围。
实施例
实施例1
不同去污剂膜抽提脂化rP4
从细菌细胞(如大肠杆菌细胞)中抽提脂化的rP4的整个过程涉及显微流化作用(microfluidization)或细胞裂胞和膜不同去污剂抽提。收集发酵培养液，加入5mMEDTA，以抑制可能的金属蛋白酶引起的蛋白质降解。然后将该培养液稀释至低于5％(w/v)的细胞湿重浓度，用高压微流化器(Microfluidics，Newton，MA)裂解。使用包括表面积为0.002m2/g湿重细胞的1000KD再生纤维素Millipore膜的切向流动系统，按特定的顺序加入缓冲液渗滤裂解的细胞。选择缓冲液加入的顺序，以首先溶解内膜蛋白质，接着溶解包括rP4的外膜蛋白质。渗滤期间，小于膜的截留分子量的适当大小的溶解蛋白质通过了膜，而较大的分子和不溶的蛋白质则被保留。渗滤步骤的顺序如下：
(1)用10mM Hepes/1mM EDTA/pH8.0、体积是滞留物体积3倍的溶液渗滤裂解的发酵培养液，以通过渗透去除胞内和胞外性污染物。
(2)用10mM Hepes/1mM MgCl2/1％TritonTM X-100、pH8溶液渗滤该裂解产物5次，溶解和取出膜内在蛋白质。Mg2+离子稳定了外膜，因此，外膜蛋白质在TritonTMX-100中是不溶的。
(3)用10mM/Hepes/1mM MgCl2/pH8溶液渗滤裂解产物3次，以减少TritonTMX-100的浓度。
(4)用50mM TrisTM/5mM EDTA/1％ZwittergentTM 3-12/pH8溶液渗滤裂解产物3次，以溶解外膜蛋白质，包括脂化的rP4，然后开始从外膜抽提和收集脂化的rP4。
(5)用50mM TrisTM/5mM EDTA/pH8溶液渗滤裂解产物3次。此步不使用ZwittergentTM 3-12，因为ZwittergentTM化合物不像较小的化合物(如氯化钠)那样容易地通过截留分子量为1000KD的膜；此步起着降低膜中ZwittergentTM浓度的作用，否则步骤(4)的ZwittergentTM浓度会减少下面的步骤(6)和(8)通过膜的流速。
(6)用50mM TrisTM/5mM EDTA/1％ZwittergentTM 3-12/pH8溶液渗滤裂解产物2次，以继续从外膜抽提和收集脂化的rP4。
(7)用50mM TrisTM/5mM EDTA/pH8溶液渗滤裂解产物2次，以继续降低ZwittergentTM浓度。
(8)用50mM TrisTM/5mM EDTA/1％ZwittergentTM 3-12/pH8溶液渗滤裂解产物2次，以继续从外膜抽提和收集脂化的rP4。
(9)用50mM TrisTM/5mM EDTA/pH8溶液渗滤裂解产物2次，以再次减少ZwittergentTM的浓度。
在渗滤步骤中，跨膜压力维持在大约5psi，流量维持在150升/m2膜面积/小时(lmh)。渗滤过程在室温中进行。渗透流量的范围为30-40lmh，这对于该抽提方法的实际应用和大规模生产应是足够高的。
抽提期间，在不同点采集用于分析的样品，通过SDS-PAGE评估不同渗滤步骤对蛋白质抽提的影响。加入酒精沉淀样品，离心，然后以SDS样品制备缓冲液中重新溶解至原始体积的20％。这种制备样品的方法浓缩了样品并减少样品的TritonTM或ZwittergentTM 3-12浓度。这两种物质会干扰SDS与样品的结合，并降低对凝胶条带的分辨。将10μl各样品加样到Novex(Encinitas，CA)10％丙烯酰胺凝胶上，然后在125V电压下电泳60-90分钟。
图1显示了抽提脂化的rP4期间取自渗透液的样品的典型SDS-PAGE分析。脂化的rP4在这些凝胶上以大约30KD的分子量运行。该凝胶显示了渗滤期间一些污染蛋白质被裂解缓冲液(泳道5)和含有TritonTM X-100的缓冲液(泳道6)去除。在这些渗滤步骤中损失的脂化rP4很少。在使用ZwittergentTM 3-12的渗滤步骤中，脂化的rP4以部分纯化的状态被抽提(泳道8)。在最后的ZwittergentTM 3-12渗滤步骤中，渗透液中存在非常少的脂化的rP4(泳道9)。这表明大多数溶解的脂化rP4已通过渗透被回收。其它试验显示，抽提完成后在滞留物中不溶的脂化rP4非常少(数据未给出)。通过Western分析发现ZwittergentTM 3-12抽提的30KD条带是脂化的rP4(数据未给出)。
实施例2
脂化rP4的另一种抽提法
本实施例给了由脂化rP4的其他四种抽提方法得到的数据。在各个操作中，首先将5mM EDTA加到重组大肠杆菌发酵培养液中，以抑制可能的金属蛋白酶引起的蛋白质降解。然后将该发酵培养液的湿细胞浓度调整到10％，通过Microfluidics微流化器裂解。然后将此细胞裂解液分成含有500g细胞的等量份，-70℃冷冻。
将500克等份的裂解大肠杆菌发酵培养液移出-70℃，放到温度不超过40℃的水浴中解冻。然后将该细胞裂解液稀释到5％的细胞湿重。然后如实施例1所述采用切向流动渗滤法将此5％细胞裂解液进行不同去污剂抽提。仅在步骤(4)中有轻微的差别，在该步骤中，渗滤了2次而不是3次。
将抽提期间不同点采得的样品作SDS-PAGE分析，得到了与图1所示可比较的结果(数据未给出)。计算出4轮中各轮回收的脂化rP4的量。在抽提之前和之后通过SDS-PAGE凝胶电泳然后使用光密度计扫描测定细胞裂解液中的脂化rP4的百分比。这个数据表明，抽提前后细胞裂解液中脂化rP4蛋白质平均减少了78％(以克计)。这个数据还表明，抽提合并物中脂化rP4蛋白质的总回收与细胞裂解液的比是18％。
其结果列在表1中：
表1 样品 体积 (L) 蛋白质 (mg/ml) 总蛋白 质(g) ％LrP4 LrP4 (g/L) LrP4 (g) LrP4 减少％ LrP4回 收％ N21001细胞裂解液 10 20.00 200.00 13.70 2.74 27.40 N21002细胞裂解液 10 10.80 108.00 12.10 1.31 13.07 N21003细胞裂解液 10 12.20 112.00 11.90 1.33 13.33 N21004细胞裂解液 10 7.80 78.00 12.60 0.98 9.83 N21001抽提的细胞裂解液 10 2.60 26.00 14.80 0.38 3.85 85.96％14.04％ N21002抽提的细胞裂解液 10 1.30 13.00 12.40 0.16 1.61 87.66％12.34％ N21003抽提的细胞裂解液 10 1.20 12.00 13.40 0.16 1.61 87.94％12.06％ N21004抽提的细胞裂解液 10 3.40 34.00 14.30 0.49 4.86 50.53％49.47％ N21001抽提合并物 120 0.06 7.20 56.30 0.03 4.0514.79％ N21002抽提合并物 120 0.06 6.60 42.30 0.02 2.7921.36％ N21003抽提合并物 120 0.03 3.12 73.60 0.02 2.3017.23％ N21004抽提合并物 120 0.05 6.24 29.90 0.02 1.8718.98％
图2阐述了此渗滤方法的再现性。监测了抽提过程中4次运行的渗透液流量。整个过程中流动速率相似，证明该抽提方法是可控制的和可再现的。
为了纯化抽提得到的脂化rP4，将含有脂化rP4的细胞裂解液通过由DEAESepharoseTM Fast Flow柱和SP SepharoseTM Fast Flow柱(Pharmacia&Upjohn，Piscataway，NJ)组成的串联离子交换柱。用另外的平衡缓冲液洗涤层析柱，然后从流程(process stream)中移去DEAE柱。然后用20柱体积的平衡缓冲液洗涤SP柱，随后用NaCl梯度洗脱，得到纯化的脂化rP4 30K蛋白质。用浓度为20mM的NaCl洗脱脂化rP4蛋白质的纯化凝集形式(形式I)。用浓度为140mM的NaCl洗脱脂化rP4蛋白质的凝集和非凝集形式的混合物(形式II)。
然后将形式II的脂化rP4 30K蛋白质进行受控制的缓慢冷却处理，使其转变为更凝聚的形式I状态。可分别纯化两种纯化形式，然后保存，或者可分别纯化然后合并。转变方法如下：
(1)获得脂化rP4形式II的无菌过滤等份；
(2)慢慢冷冻至-6℃。
实施例3
不同去污剂膜抽提脂化rP6
抽提脂化rP6的方法与抽提脂化rP4的方法类似。但是，渗滤过程需要更多步骤，因为脂化rP6与肽聚糖紧密结合在一起。用10mM EDTA处理表达脂化rP6的大肠杆菌细胞发酵培养液，然后在进行均质化之前先将其稀释成细胞湿重/体积为10％以下。然后用高压微流化器裂解细胞，在室温下使用跨线流通膜过滤装置按顺序用缓冲液进行渗滤。测定了允许有效质量的溶解蛋白质的转运通过膜的最小膜面积大约是0.002m2/g细胞湿重。尺寸小于此膜1000KD截留分子量的溶解蛋白质与渗透液一起通过了膜，而较大的分子和不溶解蛋白质则被保留。渗滤的步骤如下：
(1)以体积为滞留物3倍的10mM Hepes/1mM EDTA/pH8.0(裂解缓冲液)渗滤裂解的发酵培养液，以通过渗透去除胞内和胞外性污染物。
(2)用10mM Hepes/1mM MgCl2/0.2％TritonTM X-100溶液渗滤裂解产物2次，以溶解和取出内膜蛋白质。Mg2+离子稳定了外膜，因此，外膜蛋白质不溶解在TritonTM X-100中。
(3)用50mM TrisTM/5 mM EDTA/0.2％ZwittergentTM 3-14溶液渗滤裂解产物3次，以溶解和去除其它的外膜蛋白质(但不包括rP6)。EDTA螯合步骤(2)中的Mg2+离子，并防止蛋白质水解。
(4)用50mM TrisTM/5mM EDTA/0.5M NaCl/0.2％ZwittergentTM 3-14渗滤裂解产物3次，以溶解和去除其他蛋白质。此步骤的缓冲液中加入NaCl，以破坏膜蛋白质和膜之间的离子性相互作用。进行这一步是因为脂化rP6是肽聚糖结合脂蛋白，盐起着去除膜/外膜蛋白复合体中的膜结合蛋白质(不包括脂化的rP6)的作用(脂化的rP4不这样结合，因而在抽提rP4时不进行这一步骤)。继续以滞留物3倍体积的50mM TrisTM/5mM EDTA渗滤，以降低滞留物中ZwittergentTM的浓度。
(5)用50mM TrisTM/5mM EDTA/0.2％十二烷基肌氨酸钠渗滤裂解产物3次，去除其他膜结合蛋白质(但不包括脂化的rP6)，然后用50mM TrisTM/5mM EDTA渗滤3次，减少滞留物中十二烷基肌氨酸钠的浓度。
(6)用10mM磷酸钠/0.2％ZwittergentTM 3-12渗滤裂解产物3次，去除其他膜结合蛋白质(但不包括脂化的rP6)，然后用10mM磷酸钠渗滤3次，减少滞留物中ZwittergentTM 3-12的浓度。
(7)将裂解产物浓缩到其原体积的20％，然后55℃用10mM磷酸钠/0.2％ZwittergentTM 3-12渗滤3次，溶解脂化的rP6，通过渗透收集该蛋白质。渗滤之前进行浓缩，以增加渗透液中脂化rP6的浓度。55℃继续用体积为其余滞留物3倍的10mM磷酸钠渗滤，减少滞留物中ZwittergentTM 3-12的浓度。进行这个加热步骤是因为〔如上述步骤(4)〕脂化的rP6是一种肽聚糖结合脂蛋白，加热可从膜/膜蛋白复合体中取出脂化的rP6(脂化的rP4不这样结合，因而在抽提rP4时不进行这一步骤)。最后，55℃用滞留物3倍体积的10mM磷酸钠结束渗滤。
渗滤期间，跨膜压力维持在大约10psi，流量维持在大约120-180lmh。所有的渗滤过程在室温中进行，除了最后的55℃抽提步骤外，因为该步骤在较高温度进行可溶解脂化的rP6。渗透液流量范围为30-50lmh，这对于该抽提方法的实际应用和大规模生产应是足够高的。
抽提期间，采取自不同的点的样品作SDS-PAGE分析，以评估不同渗滤步骤对蛋白质抽提的效果。如实施例1所述制备样品和进行凝胶电泳。
图3和4显示了脂化rP6抽提期间取自渗透液样品的典型SDS-PAGE分析。脂化的rP6以大约15KD在这些凝胶上运行。该凝胶显示了渗滤期间一些污染蛋白质被裂解缓冲液(图3，泳道2)和含有不同去污剂的缓冲液(图3，泳道5和6；图4，泳道3)所去除。在这些渗滤步骤中脂化的rP6的损失很少。在最后55℃ZwittergentTM 3-12渗滤期间，脂化的rP6以部分纯化的状态被抽提得到(图4，泳道6)。在第二次55℃ ZwittergentTM 3-12渗滤步骤结束时，渗透液中的脂化rP6非常少(图4，泳道8)。这表明大多数溶解的脂化rP6已通过渗透被回收。其它实验也显示渗滤过程完成后滞留物中残留的不溶解的脂化rP6非常少(数据未给出)。Westem分析显示，ZwittergentTM 3-12/55℃抽提物的15KD条带是脂化的rP6(数据未给出)。
重复上述方法，以从另一大肠杆菌发酵培养液中抽提脂化的rP6。SDS-PAGE分析得到与图3和4类似的结果(数据未给出)，且Western分析也显示ZwittergentTM3-12/55℃抽提物的15KD条带是脂化的rP6(数据未给出)。
实施例4
脂化rP6的另外抽提法
这个实施例所给的数据得自脂化的rP6的3次另外抽提步骤。在各步骤中，使用实施例3中所述的方法从重组大肠杆菌发酵培养液中抽提得到脂化的rP6。
其结果列在表2中：
表2 样品(15ml) 体积(L)蛋白质(mg/ml) 总蛋白质(g) 纯度(％) 总LrP6(g)N4-1002裂解的发酵培养液 5 18.70 93.50 10.70％ 10.00N4-1002 55C抽提合并物 20 0.17 3.43 34.20％ 1.17N4-1003裂解的发酵培养液 5 14.74 73.71 2.30％ 1.70N4-1003 55C抽提合并物 20 0.73 14.52 19.50％ 2.83N4-1004裂解的发酵培养液 5 14.74 73.71 7.20％ 5.31N4-1004 55C抽提合并物 20 0.08 1.66 26.00％ 0.43