蘘荷抗肿瘤活性组分的提取方法及其应用.pdf

本发明提供一种蘘荷抗肿瘤活性组分的提取方法，它包括以下步骤：取烘干的蘘荷根茎为原料，切成0.5-1cm小段后加入8-10倍超纯水浸泡12-24小时；边搅拌边加入8倍70％乙醇溶液，使充分混匀，回流提取1.5小时，然后过滤；取过滤的滤渣，边搅拌边加入8倍70％乙醇溶液使充分混匀，回流提取1-1.5小时，过滤，重复一次；将全部过滤所得滤液合并，浓缩干燥滤液，得浸膏；浸膏过HPD400大孔树脂，水洗至无醇味，接着过HPD400色谱柱，分别以30％、60％、95％乙醇洗脱，依次得到洗脱组分A、洗脱组分B、洗脱组分C，浓缩干燥洗脱组分C，该洗脱组分C可应用于制备抗肿瘤药物中。

1.  一种蘘荷抗肿瘤活性组分的提取方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取烘干的蘘荷根茎为原料，切成0.5-1cm小段后，加入超纯水进行浸泡12-24小时，其中超纯水的加入量为蘘荷根茎质量的8-10倍；
(2)边搅拌边加入70％乙醇溶液，使充分混匀，乙醇溶液的加入量为蘘荷根茎质量的8倍，然后进行回流提取1.5小时，提取完后进行过滤；
(3)取步骤(2)中过滤的滤渣，边搅拌边加入70％乙醇溶液使充分混匀，乙醇溶液的加入量为滤渣质量的8倍，然后进行回流提取1.5小时，提取完后进行过滤；
(4)取步骤(3)中过滤的滤渣，边搅拌边加入70％乙醇溶液使充分混匀，乙醇溶液的加入量为滤渣质量的8倍，然后进行回流提取1小时，提取完后进行过滤；
(5)将步骤(2)、(3)、(4)过滤所得的滤液进行合并，浓缩干燥滤液，得浸膏；
(6)将得到的浸膏过HPD400大孔树脂，然后水洗至无醇味，接着浸膏过HPD400色谱柱，分别以30％、60％、95％乙醇洗脱，依次得到洗脱组分A、洗脱组分B、洗脱组分C，浓缩干燥洗脱组分C，即为本发明目的抗肿瘤活性组分。

2.  利用权利要求1所述的蘘荷抗肿瘤活性组分的提取方法得到的抗肿瘤活性组分在制备抗肿瘤药物中的应用。

蘘荷抗肿瘤活性组分的提取方法及其应用
技术领域
本发明涉及中医药制品加工技术领域，具体涉及一种从蘘荷中提取抗肿瘤活性组分的方法，以及该提取到的蘘荷在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
癌症一直是危害人类健康的难以治愈的病症之一，很多化学治疗、手术治疗、放射线治疗肿瘤的方法对人体自身也存在着很多危害，寻求一个具有好的疗效同时对人体的毒害作用小的药物是我们医药学者的目标。中医学早于二千多年前对癌症已有所认识，中医疗法则有其独特的理论逻辑和思维方式，多种中药可有效地抑制肿瘤细胞，并配合放化疗调节机体免疫、诱导肿瘤细胞分化和凋亡、预防癌转移复发及抑制癌前病变等作用机制达到防止癌症发生的目的，具有良好的应用前景。特别是有关中药诱导肿瘤细胞凋亡和分化的研究，现已成为中药防治恶性肿瘤的一个新动向。
蘘荷(Zingiber mioga)，姜科姜属，多年生草本植物，俗称野姜、茗荷、阳藿等。其嫩芽、花轴和嫩茎味芳香微甘，可凉拌或炒食，也可制作酱菜，是营养价值很高的珍稀蔬菜。蘘荷嫩茎具有特殊气味，其挥发油中除具有特殊气味的挥发性组分外，还鉴定出许多药用成分，如烷烃醇类、酮类、醛类、环氧化合物及醚类、冰片、烯烃、脂肪酸、酯类化合物等多种化合物。
目前，对于襄荷根茎提取物的研究中，还未见其抗癌功效的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术的不足，提供一种蘘荷抗肿瘤活性组分的提取方法，该方法操作简单、过程可控、重复性好，提取得到的种蘘荷抗肿瘤活性组分被证明具有抗肿瘤活性。
本发明所采用的技术方案为：
一种蘘荷抗肿瘤活性组分的提取方法，它包括以下步骤：
(1)取烘干的蘘荷根茎为原料，切成0.5-1cm小段后，加入超纯水进行浸泡12-24小时，其中超纯水的加入量为蘘荷根茎质量的8-10倍；
(2)边搅拌边加入70％乙醇溶液，使充分混匀，乙醇溶液的加入量为蘘荷根茎质量的8倍，然后进行回流提取1.5小时，提取完后进行过滤；
(3)取步骤(2)中过滤的滤渣，边搅拌边加入70％乙醇溶液使充分混匀，乙醇溶液的加入量为滤渣质量的8倍，然后进行回流提取1.5小时，提取完后进行过滤；
(4)取步骤(3)中过滤的滤渣，边搅拌边加入70％乙醇溶液使充分混匀，乙醇溶液的加入量为滤渣质量的8倍，然后进行回流提取1小时，提取完后进行过滤；
(5)将步骤(2)、(3)、(4)过滤所得的滤液进行合并，浓缩干燥滤液，得浸膏；
(6)将得到的浸膏过HPD400大孔树脂，然后水洗至无醇味，接着浸膏过HPD400色谱柱，分别以30％、60％、95％乙醇洗脱，依次得到洗脱组分A、洗脱组分B、洗脱组分C，浓缩干燥洗脱组分C，即为本发明目的抗肿瘤活性组分。
本发明还进一步提供上述从蘘荷提取到的抗肿瘤活性组分在制备抗肿瘤药物中的应用。该活性组分作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂。
与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：
1、本发明先使用超纯水对蘘荷根茎进行浸泡，以软化蘘荷根茎坚硬的细胞壁，然后采用多次回流提取的方法、加上搅拌过程中乙醇浓度的缓慢渐变，使尽可能地多提取到有效组分，并通过工艺参数的精确控制，使回流提取过程稳定可控、重复性好，最后过HPD400色谱柱，通过大量对比试验最终确定30％、60％、95％三个乙醇洗脱梯度，使得得到的目的组分中其抗肿瘤活性成分含量高，使尽可能地提高有效成分的提取率；
2、本方法采用回流提取加色谱分离的方法，成功提取到体内和体外抗肿瘤实验均呈阳性的活性组分，本方法总的来说操作简单、过程可控，可实施化程度高，有利于后期工业化推广；
3、本发明提取得到的活性组分原料来源于天然，副作用小或没有，可进一步开发出药效更好、不良反应更小更少的抗癌剂，用于癌症的治疗，具有明显的社会效益和经济效益；
4、本发明拓展了抗肿瘤药物或保健食品的原料来源，扩大了蘘荷的应用范围，使蘘荷成为抗肿瘤药物的有效组分原料，显著提高了蘘荷的附加值。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术 语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
实施例1：蘘荷抗肿瘤活性组分的提取
1、原料、材料：
蘘荷根茎采自浙江湖州莫干山。
2、试剂：
超纯水由密立博纯水仪生产；95％乙醇购自天津市北方天医化学试剂厂。
3、仪器设备：
HPD400(43cm×3.5cm)色谱柱购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司；电子调温电热套购自天津市泰斯特仪器有限公司；旋转蒸发仪购自上海亚容生化仪器厂。
4、提取方法包括以下步骤：
(1)取烘干的蘘荷根茎为原料，切成0.5-1cm小段后，加入超纯水进行浸泡18小时，其中超纯水的加入量为蘘荷根茎质量的8倍；
(2)边搅拌边加入70％乙醇溶液，使充分混匀，乙醇溶液的加入量为蘘荷根茎质量的8倍，然后进行回流提取1.5小时，提取完后进行过滤；
(3)取步骤(2)中过滤的滤渣，边搅拌边加入70％乙醇溶液使充分混匀，乙醇溶液的加入量为滤渣质量的8倍，然后进行回流提取1.5小时，提取完后进行过滤；
(4)取步骤(3)中过滤的滤渣，边搅拌边加入70％乙醇溶液使充分混匀，乙醇溶液的加入量为滤渣质量的8倍，然后进行回流提取1小时，提取完后进行过滤；
(5)将步骤(2)、(3)、(4)过滤所得的滤液进行合并，减压回收溶剂，浓缩干燥滤液，得浸膏；
(6)将得到的浸膏过HPD400大孔树脂，然后水洗至无醇味，收集水洗液，接着浸膏过HPD400(43cm×3.5cm)色谱柱，分别以30％、60％、95％乙醇洗脱，依次得到洗脱组分A、洗脱组分B、洗脱组分C，减压回收乙醇，浓缩干燥各洗脱组分。
实施例2：药理实验-体外实验
1、实验材料
人肝癌细胞HepG2、人纤维肉瘤细胞HT-1080、人结肠癌细胞HCT116、人黑色素瘤细胞A375-S2、人组织细胞淋巴瘤细胞U-937、人慢性髓原白血病细胞K562、人原髓细胞白血病细胞HL60购于American Type Culture Collection(ATCC，Rockville，MD，USA)。细胞接种在含10％胎牛血清、2％谷氨酰胺的RPMI-1640培养液中，在37℃，5 ％CO₂培养箱中培养。
2、操作步骤：
2.1贴壁细胞
选用对数生长期的贴壁肿瘤细胞，用胰酶消化后，用含10％小牛血清的RPMI l640培养基配成5×10⁴/ml的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔100l，37℃，5％CO₂培养24h。
实验组更换新的含不同浓度(0.1、1、10、20、50、100ug/mL)被测样品(洗脱组分C)的培养液，对照组则更换含等体积溶剂的纯培养液，每组设3个平行孔，37℃，5％CO₂培养48h。弃去上清液，用PBS小心洗2次，每孔加入100μL新鲜配制的含0.5mg/ml MTT的培养基，37℃继续培养4h。小心弃去上清，并加入150μL DMSO，用微型振荡器混匀10min后，用酶标仪在492nm处测定光密度值。
2.2悬浮细胞
选用对数生长期的细胞，用含10％小牛血清的RPMIl640培养基配成2×10⁵/ml的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔50μL，37℃，5％CO₂培养24h。实验组加入含不同浓度(同上)被测样品(洗脱组分C)的培养液50μL，对照组则加入含等体积溶剂的纯培养液，每组设3个平行孔，37℃，5％CO₂培养48h，每孔加入10l新鲜配制的含5mg/ml MTT的培养基，37℃继续培养4h。用三联液(SDS 10g，10M HCl0.1mL，异丁醇5mL，用蒸馏水稀释至100mL)100μL溶解结晶，37℃孵育12h。用酶标仪在492nm处测定光密度值。
3、按下式计算药物对肿瘤细胞生长的抑制率
肿瘤细胞生长抑制率(％)
＝[A₄₉₂(阴性对照)－A₄₉₂(加药组)]/A₄₉₂(阴性对照)×100％，
从中求出样品的半数抑制浓度(IC₅₀)。
4、实验结果如表1所示
表1 蘘荷95％醇层提取物对7种肿瘤细胞株的抑制作用

体外实验结果表明，95％醇层提取物可以抑制多种肿瘤细胞株的增殖，说明该提取物在体外有抑制癌细胞增长作用。其他提取物(水洗液、洗脱组分A、洗脱组分B)则 没有表现出抑制癌细胞增长作用。
实施例3：药理实验-体内实验
选接种8d健康状况良好的S180瘤源小鼠，腹部皮肤消毒后，注射器抽取腹水，离心后弃上清，无菌生理盐水稀释至细胞浓度为1×10¹⁰L^-1，于每只小鼠右侧腋皮下接种0.2mL以形成实体瘤。次日将小鼠随机分为5组，每组10只，分别为模型对照组(生理盐水)、阳性对照组(环磷酰胺)、水洗液组(2g/kg)、洗脱组分A组(2g/kg)、洗脱组分B组(2g/kg)、洗脱组分C组(2g/kg)，连续给药8d，末次给药24h后颈椎脱臼处死小鼠，称体重，剥取瘤块、脾脏和胸腺并称重。按照下列公式计算抑瘤率、脾指数和胸腺指数。
抑瘤率％＝(1-模型对照组平均瘤重/实验组平均瘤重)×100％
脾(胸腺)指数＝[脾(胸腺)重量(mg)/体重(g)]×100％
结果如表2所示：
表2 蘘荷各提取组分对小鼠S180肿瘤的抑制作用

注：^*P<0.05，**P<0.01，与模型组相比
结果表明，蘘荷醇提物95％醇层可以显著降低瘤重，肿瘤抑制率可以达到41.88％，而且没有环磷酰胺的抑制胸腺指数的副作用。提示蘘荷醇提物抗癌作用的有效部位可能在95％醇层中。
接下来我们将对95％醇层进行成份、纯度等进一步鉴定，以期望于能获得高纯度的活性单体。本项研究的目的就是在总结临床经验和初步试验证明蘘荷提取物有抗癌作用的基础上，力争为临床奉献一个既抗癌又低毒有效的新型中药制剂。为了保障我们的科研成果，也为鼓励我们进一步深入研究，我们特先申请此专利，希望获批。
本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合中药制品 加工的普通市售产品。
以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。