肿瘤凋亡诱导配体基因、基因表达蛋白及其制备方法 技术领域：本发明涉及医药生物技术领域，是肿瘤凋亡诱导配体基因、基因表达蛋白及其制备方法。
背景技术：肿瘤是威胁人类健康的重大疾病之一。采用基因重组技术获得特异性杀伤肿瘤的重组蛋白进行肿瘤生物治疗是当今肿瘤治疗研究中的一个热点领域。1996年Pitti，RM等发现了肿瘤凋亡诱导配体(Tumor related apoptosis inducingligand)基因，这个基因所编码的完整蛋白即肿瘤凋亡诱导配体蛋白(简称Trail)，是一种由281个氨基酸组成的II型膜蛋白，它还可以通过剪切形成两种可溶性胞外段部分，一种由N端第109位到第281位氨基酸组成的蛋白(简称Trail109)；另外一种由N端第114位到第281位氨基酸组成的蛋白(简称Trail114)。Trail、Trail109和Trail114都可以有效地诱导肿瘤细胞凋亡，尤其对于血液、淋巴系统恶性肿瘤及肺癌等都有特异性的杀伤作用，而对于正常人体细胞无杀伤作用。但目前的研究仍存在如下问题：(一)Trail的表达局限于真核表达系统，其表达量低，无法形成规模产品；(二)两种可溶性胞外段Trail109和Trail114没有相应的表达系统，使其生产和功能的发挥受到限制；(三)虽然有人报道了中国人群的Trail基因的部分cDNA序列，但至今未见有关中国人群的Trail基因的全长cDNA序列的报道。
发明内容：本发明克隆了中国人的Trail全长cDNA，与已报道的欧美人群序列进行比较，发现5’端第598位碱基由C变成G，使其编码的N端第200位氨基酸由苏氨酸变为丙氨酸，从而证实此cDNA序列为中国人群所特有。本发明利用这一Trail全长cDNA，建立了Trail高效的原核表达系统。用克隆的Trail全长cDNA，分别克隆可溶性胞外段Trail109和Trail114的cDNA，并分别建立Trail109和Trail114原核表达系统。在此基础上制备Trail、Trail109和Trail114蛋白，经过对杀伤肿瘤细胞地活性分析，证明它们都具有较强的杀伤肿瘤细胞的作用。
肿瘤凋亡诱导配体基因的克隆、基因表达系统及其肿瘤凋亡诱导配体蛋白的制备，具体包括如下步骤：一、分别制备肿瘤凋亡诱导配体基因cDNA
1.由外周血淋巴细胞总RNA通过RT-PCR反转录并扩增得到Trail全长cDNA，见核苷酸序列表1。
2.设计并合成引物，通过PCR扩增从Trail全长cDNA得到Trail109 cDNA，见核苷酸序列表2。
3.设计并合成引物，通过PCR扩增从Trail全长cDNA得到Trail114 cDNA，见核苷酸序列表3。二、分别构建上述cDNA的原核表达载体
1.构建Trail全长cDNA原核表达载体。
2.构建Trail109cDNA原核表达载体。
3.构建Trail114 cDNA原核表达载体。三、分别用上述cDNA的原核表达载体转化大肠杆菌，构建各工程菌株四、分别制备肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail、Trail109和Trail114
1.诱导各工程菌株表达肿瘤凋亡诱导配体蛋白；
2.纯化各肿瘤凋亡诱导配体蛋白。
扩增Trail全长cDNA的基本材料是健康中国人外周血淋巴细胞中抽取的总RNA，原核表达载体为pET-11a(Novagen公司)，所使用的转化宿主细菌株为大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen公司)。
本发明用RT-PCR方法反转录扩增Trail全长cDNA，以之为模板，用相应引物从5’端第325位到第843位碱基通过PCR扩增得到Trail109cDNA，从5’端第340位到第843位碱基通过PCR扩增得到Trail114cDNA。扩增过程中所用的各引物均有酶切位点，用各相应酶，分别酶切各cDNA和与之相应的表达载体，cDNA和表达载体的酶切片段通过连接、转化和鉴定，就可得到表达Trail的原核表达载体pET-Trail、表达Trail109的原核表达载体pET-Trail109、表达Trail114的原核表达载体pET-Trail114。分别将各构建好的原核表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达Trail的原核表达菌株pET-BL21-Trail、表达Trail109的原核表达菌株pET-BL21-Trail109、表达Trail114的原核表达菌株pET-BL21-Trail114。通过蛋白表达诱导物IPTG诱导，利用工程菌表达蛋白并经离子交换法纯化后，分别得肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail、Trail109和Trail114，其氨基酸序列见表4、表5、表6。
本发明具有如下优点和积极效果：
本发明得到的Trail cDNA是中国人群中所特有的，为该基因在特定人群和非特全长cDNA相配合，覆盖了表达肿瘤凋亡诱导配体蛋白的功能区域。本发明所使用的原核表达载体能高效表达重组蛋白，为选择相应的工程菌奠定了基础。尤其是pET-BL21-Trail菌株、pET-BL21-Trail109菌株和pET-BL21-Trail114菌株都能够高效的表达重组蛋白，成为良好的工程菌。所表达的各产物有良好的活性，从而可为人肿瘤的治疗提供有效的制剂。
附图说明：
图1.Trail cDNA、Trail109cDNA和Trail114cDNA的长度及所处相对位置示意图；
图2.制备肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail、Trail109和Trail114的流程图；
图3.Trail全长cDNA的原核表达载体pET-Trail的构建图；
图4.Trail109 cDNA原核表达载体pET-Trail109的构建图；
图5.Trail114 cDNA原核表达载体pET-Trail114的构建图。
具体实施方式：
现结合附图和实施例，对本发明作进一步详细叙述。
实施例1：制备肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail
一、制备Trail全长cDNA(见图2)
1.总RNA反转录制备外周血cDNA
按常规用人外周血总RNA，以MMLV反转录酶和寡聚核苷酸，42℃ 1小时将人外周血总RNA反转录得cDNA(详见《分子克隆》第396页)。
2.设计并合成引物
设计两套引物：引物1、引物2和引物3、引物4，其中在引物3和引物4中分别加入NdeI和BamHI酶切位点GATATG和GGATCC。
引物1：5’GGC TGC CTG GCT GAC TTA CAG CA3’
引物2：5’CAT CCT GAA AAC TGA ATA GTC ACT 3’
引物3：5’ATT TCT CAT ATG GTG AGA GAA AGA CC3’
引物4：5’CTC GAG GGA TCC TTA GCC AAC TAA AAA GGC C3’
3.PCR扩增Trail全长cDNA
采用槽式PCR方法，以引物1和引物2对外周血cDNA进行第一次扩增。
外周血cDNA(50ng/ul) 1ul
20mM dNTP 1ul
引物1(50uM) 0.5ul
引物2(50uM) 0.5ul
10X缓冲液 5ul
pfu DNA聚合酶(5U/ul) 1ul
去离子水 41ul先以94℃30秒，37℃30秒，72℃5分钟反应8个循环，再以94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃5分钟反应22个循环，反应结束后72℃延伸10分钟，扩增物经1％琼脂糖凝胶电泳后，回收800～900bp间的条带，得到第一次扩增的PCR产物，。
以引物3和引物4对第一次获得的PCR产物作第二次PCR扩增。
第一次扩增产物(0.5ug/ul) 1ul
20mM dNTP 1ul
引物3(50uM) 0.5ul
引物4(50uM) 0.5ul
10X缓冲液 5ul
pfu DNA聚合酶(5U/ul) 1ul
去离子水 41ul先以94℃ 30秒，37℃ 30秒，72℃ 5分钟反应8个循环，再以94℃ 30秒，55℃30秒，72℃ 5分钟反应22个循环，反应结束后72℃延伸10分钟，获得Trail全长cDNA，共843bp，进行DNA测序，结果见核苷酸序列表1，该序列中的黑体字GATATG和GGATCC是NdeI和BamHI酶切位点。
二、Trail全长cDNA原核表达载体pET-Trail的构建(见图3)
以NdeI和BamH同时酶切Trail cDNA和pET-11a原核表达载体，分别经1％琼脂糖凝胶电泳，回收相应酶切片段，两种酶切片段在16℃下用T4 DNA连接酶连接8小时，将连接产物转化大肠杆菌DH5a，挑取转化后的菌落，扩增并抽取质粒，酶切鉴定和DNA测序后，得到表达Trail的原核表达载体pET-Trail(构建过程详见《分子克隆》第1～48页)。连接体系：NdeI和BamHI酶切后Trail cDNA(100ng/ul) 3ul
NdeI和BamHI酶切后pET-11a(100ng/ul) 1ul
10X T4 DNA连接酶缓冲液 1ul
T4 DNA连接酶(5U/ul) 1ul
去离子水 4ul
三、表达Trail的工程菌株pET-BL21-Trail的构建
按常规将得到的pET-Trail原核表达载体以CaCl2法转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆菌落扩增后，得到Trail的表达菌株pET-BL21-Trail。(详见《分子克隆》第48～66页)。
四、制备肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail
挑取单个克隆的pET-BL21-Trail菌落，接种到500ml的LB培养基中，37℃以200转/分钟摇动至细菌浓度达到O.D.为0.5～0.6，加入蛋白表达诱导物IPTG500mM，使其终浓度达到1mM/L，诱导5～6小时，以8000转/分钟离心10分钟，弃上清，可收获细菌约3克。以20ml 50mM Tris.Cl pH7.9缓冲液重悬细菌，加入1mg/ml溶菌酶和1ug/ml DNaseI消化30分钟，13000转/分钟离心10分钟，收获细菌裂解后产生的含目的蛋白的包含体约1克。以8M/L的尿素溶解包含体，13000转/分钟离心10分钟，将上清转移到新的管中，弃细菌碎片组成的沉淀。用1升50mM Tris.Cl pH10.0缓冲液对上清进行透析，约48小时，其间换液2～3次。将透析好的上清加样于DEAE-spharose Fast Ftow离子交换层析柱，在pH10.0的条件下细菌中大多数杂蛋白都结合在层析柱上，而滤下的80％都是表达的肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail，反复过柱2次后，得到纯度达90％以上的Trail约0.6克。从3克细菌中可得到0.6克肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail，因此从细菌总蛋白中得率约为20％。Trail的氨基酸序列见表4。实施例2：制备肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail109
一、Trail109 cDNA的克隆(见图1)
1.设计并合成引物
以Trail全长cDNA为模板，设计覆盖Trail109 cDNA的引物5和引物6，并在其中分别加入NdeI和BamHI酶切位点GAT ATG和CAT ATG。
引物5：5’GAA AAG CAT ATG AAT ATT TCT CCC CT3’
引物6：5’CTC GAG CAT ATG TTA GCC AAC TAA AAA GGC C3’
2.扩增Trail109 cDNA以引物5和引物6和Trail全长cDNA模板，通过PCR进行扩增。
Trail全长cDNA(50ng/ul) 1ul
20mM dNTP 1ul
引物5(50uM) 0.5ul
引物6(50uM) 0.5ul
10X缓冲液 5ul
pfu DNA聚合酶(5U/ul) 1ul
去离子水 41ul先以94℃30秒，37℃30秒，72℃5分钟反应8个循环，再以94℃30秒，55℃30秒，72℃5分钟反应22个循环，反应结束后72℃延伸10分钟，得到Trail109 cDNA，并进行DNA测序，结果见核苷酸序列表2，该序列中的黑体字GATATG和GGATCC是NdeI和BamHI酶切位点。
二、Trail109原核表达载体pET-Trail109的构建(见图4)
以NdeI和BamH同时酶切Trail109cDNA和pET-11a原核表达载体，分别经1％琼脂糖电泳，回收相应酶切片段，再用T4 DNA连接酶在16℃下对两种酶切片段连接8小时，将连接产物转化大肠杆菌DH5a，挑取转化后的菌落，扩增并抽取质粒，酶切鉴定和DNA测序后，得到表达Trail109原核表达载体pET-Trail109。连接体系：NdeI和BamHI酶切后Trail109 cDNA(100ng/ul) 3ul
NdeI和BamHI酶切后pET-11a(100ng/ul) 1ul
10X T4 DNA连接酶缓冲液 1ul
T4 DNA连接酶(5U/ul) 1ul
去离子水 4ul
三、表达Trail109的工程菌株pET-BL21-Trail109的构建
按常规以pET-Trail109转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单菌落后扩增，得到表达Trail109的菌株pET-BL21-Trail109。
四、制备肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail109
细菌的扩增、收获及包含体的收获、溶解方法同实施例1。由于Trail109的等电点与Trail的不同，所以在进行透析和离子交换时使用pH11.0的缓冲液，其操作过程同实施例1。得到纯度达90％以上的Trail109。从3克细菌中可得到0.8克Trail109，因此从细菌总蛋白中得率约为27％。其相应氨基酸序列见表5。实施例3：制备肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail114
一、Trail114 cDNA的克隆(见图1)
1.设计并合成引物
以Trail全长cDNA为模板，设计覆盖Trail114 cDNA的引物7和引物8，在其中分别加入NdeI和BamH酶切位点CAT ATG和GGA TCC。
引物7：5’ATT TCT CAT ATG GTG AGA GAA AGA CC3’
引物8：5’CTC GAG GGA TCC TTA GCC AAC TAA AAA GGC C3’
2.扩增Trail114 cDNA以引物7和引物8和Trail全长cDNA模板，通过PCR进行扩增。
Trail全长cDNA(50ng/ul) 1ul
20mM dNTP 1ul
引物5(50uM) 0.5ul
引物6(50uM) 0.5ul
10X缓冲液 5ul
pfu DNA聚合酶(5U/ul) 1ul
去离子水 41ul先以94℃30秒，37℃30秒，72℃5分钟反应8个循环，再以94℃30秒，55℃30秒，72℃5分钟反应22个循环，反应结束后72℃延伸10分钟，得到Trail114 cDNA，并进行DNA测序，结果见核苷酸序列表3，该序列中的黑体字GATATG和GGATCC是NdeI和BamHI酶切位点。
二、Trail114原核表达载体pET-Trail114的构建(见图5)
以NdeI和BamH同时酶切Trail114cDNA和pET-11a原核表达载体，分别经1％琼脂糖凝胶电泳，回收相应酶切片段，再用T4 DNA连接酶在16℃下对两种酶切片段连接8小时，将连接产物转化大肠杆菌DH5a，挑取转化后的菌落，扩增并抽取质粒，酶切鉴定和DNA测序后，得到表达Trail114原核表达载体pET-Trail114。连接体系：NdeI和BamHI酶切后Trail114 cDNA(100ng/ul) 3ul
NdeI和BamHI酶切后pET-11a(100ng/ul) 1ul
10X T4 DNA连接酶缓冲液 1ul
T4 DNA连接酶(5U/ul) 1ul
去离子水 4ul
三、表达Trail114工程菌株pET-BL21-Trail114的构建
以pET-Trail114转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单菌落后扩增，得到表达Trail114的菌株pET-BL21-Trail114。
四、制备肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail114
细菌的扩增、收获及包含体的收获、溶解方法同实施例1。由于Trail114的等电点与Trail和Trail109的都不同，所以在进行透析和离子交换时使用pH12.0的缓冲液，其操作过程同实施例1。得到纯度达90％以上的Trail114。从3克细菌中可得到0.9克肿瘤凋亡诱导配体蛋白Trail114，因此从细菌总蛋白中得率约为30％。其相应氨基酸序列见表6。Trail、Trail109和Trail114杀伤肿瘤细胞的活性分析：
将Trail、Trail109和Trail114分别加入培养的肿瘤细胞株Hela(宫颈癌)、Jurkat(白血病)和正常人胚肾细胞293细胞中，24小时后通过流式细胞仪检测其诱导肿瘤细胞凋亡情况，发现各组的诱导凋亡率相似，其中对杀伤Hela细胞各组均约20％，对Jurkat细胞各组均约80％，而对正常对照组293细胞则无杀伤作用。
表1：Trail cDNA核苷酸序列CATATGGCTATGATGGAGGTCCAGGGGGGACCCAGCCTGGGACAGACCTGCGTGCTGATCGTGATCTTCACAGTGCTCCTGCAGTCTCTCTGTGTGGCTGTAACTTACGTGTACTTTACCAACGAGCTGAAGCAGATGCAGGACAAGTACTCCAAAAGTGGCATTGCTTGTTTCTTAAAAGAAGATGACAGTTATTGGGACCCCAATGACGAAGAGAGTATGAACAGCCCCTGCTGGCAAGTCAAGTGGCAACTCCGTCAGCTCGTTAGAAAGATGATTTTGAGAACCTCTGAGGAAACCATTTCTACAGTTCAAGAAAAGCAACAAAATATTTCTCCCCTAGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGAGTAGCAGCTCACATAACTGGGACCAGAGGAAGAAGCAACACATTGTCTTCTCCAAACTCCAAGAATGAAAAGGCTCTGGGCCGCAAAATAAACTCCTGGGAATCATCAAGGAGTGGGCATTCATTCCTGAGCAACTTGCACTTGAGGAATGGTGAACTGGTCATCCATGAAAAAGGGTTTTACTACATCTATTCCCAAACATACTTTCGATTTCAGGAGGAAATAAAAGAAAACGCAAAGAACGACAAACAAATGGTCCAATATATTTACAAATACACAAGTTATCTTGACCCTATATTGTTGATGAAAAGTGCTAGAAATAGTTGTTGGTCTAAAGATGCAGAATATGGACTCTATTCCATCTATCAAGGGGGAATATTTGAGCTTAAGGAAAATGACAGAATTTTTGTTTCTGTAACAAATGAGCACTTGATAGACATGGACCATGAAGCCAGTTTTTTCGGGGCCTTTTTAGTTGGCTAAGGATCC
表2：Trail109 cDNA核苷酸序列CATATGAATATTTCTCCCCTAGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGAGTAGCAGCTCACATAACTGGGACCAGAGGAAGAAGCAACACATTGTCTTCTCCAAACTCCAAGAATGAAAAGGCTCTGGGCCGCAAAATAAACTCCTGGGAATCATCAAGGAGTGGGCATTCATTCCTGAGCAACTTGCACTTGAGGAATGGTGAACTGGTCATCCATGAAAAAGGGTTTTACTACATCTATTCCCAAACATACTTTCGATTTCAGGAGGAAATAAAAGAAAACGCAAAGAACGACAAACAAATGGTCCAATATATTTACAAATACACAAGTTATCTTGACCCTATATTGTTGATGAAAAGTGCTAGAAATAGTTGTTGGTCTAAAGATGCAGAATATGGACTCTATTCCATCTATCAAGGGGGAATATTTGAGCTTAAGGAAAATGACAGAATTTTTGTTTCTGTAACAAATGAGCACTTGATAGACATGGACCATGAAGCCAGTTTTTTCGGGGCCTTTTTAGTTGGCTAAGGATCC
表3：Trail114 cDNA核苷酸序列CATATGGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGAGTAGCAGCTCACATAACTGGGACCAGAGGAAGAAGCAACACATTGTCTTCTCCAAACTCCAAGAATGAAAAGGCTCTGGGCCGCAAAATAAACTCCTGGGAATCATCAAGGAGTGGGCATTCATTCCTGAGCAACTTGCACTTGAGGAATGGTGAACTGGTCATCCATGAAAAAGGGTTTTACTACATCTATTCCCAAACATACTTTCGATTTCAGGAGGAAATAAAAGAAAACGCAAAGAACGACAAACAAATGGTCCAATATATTTACAAATACACAAGTTATCTTGACCCTATATTGTTGATGAAAAGTGCTAGAAATAGTTGTTGGTCTAAAGATGCAGAATATGGACTCTATTCCATCTATCAAGGGGGAATATTTGAGCTTAAGGAAAATGACAGAATTTTTGTTTCTGTAACAAATGAGCACTTGATAGACATGGACCATGAAGCCAGTTTTTTCGGGGCCTTTTTAGTTGGCTAAGGATCC
表4：Trail氨基酸序列MAMMEVQGGPSLGQTCVLIVIFTVLLQSLCVAVTYVYFTNELKQMQDKYSKSGIACFLKEDDSYWDPNDEESMNSPCWQVKWQLRQLVRKMILRTSEETISTVQEKQQNISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENAKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG
表5：Trail109氨基酸序列NISPLVRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENAKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG
表6：Trail114氨基酸序列VRERGPQRVAAHITGTRGRSNTLSSPNSKNEKALGRKINSWESSRSGHSFLSNLHLRNGELVIHEKGFYYIYSQTYFRFQEEIKENAKNDKQMVQYIYKYTSYPDPILLMKSARNSCWSKDAEYGLYSIYQGGIFELKENDRIFVSVTNEHLIDMDHEASFFGAFLVG