生产D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸的方法 本发明涉及一种生产D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸的方法。更具体地讲，本发明涉及用一种新型转化体生产D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸的方法，该转化体具有编码一种酶的基因，该酶能通过不对称裂解水解作用将5-取代乙内酰脲转化成相应的D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸(以下将所述酶称作乙内酰脲酶)。
旋光D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸可被转化成相应的D-α-氨基酸，而旋光D-α-氨基酸是重要的制药用中间化合物。具体地讲，工业用化合物包括用作生产半合成青霉素和半合成头孢菌素的中间化合物的D-苯基甘氨酸和D-(P-羟苯基)甘氨酸。
为了生产D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸，已知采用能通过不对称裂解水解作用将5-取代乙内酰脲转化成相应的D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸的微生物酶促反应的方法，所述方法披露于JP-A 53-91189、JP-A 53-44690、JP-A 53-69884、JP-A53-133688等中。
此外，由嗜热微生物获得了一种与乙内酰脲酶有关的基因(所述酶是一种能将5-取代的乙内酰脲转化成相应的D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸的酶)并将该基因插入中温微生物中以产生具有乙内酰脲酶活性的转化型微生物。另外，在WO 94/00577中，乙内酰脲酶基因片段是从属于农杆菌属(Agrobacterium)的微生物中提取，并将其导入大肠杆菌(E.Coli)或农杆菌属地一种微生物中，以表达这种酶的活性。
上述利用微生物酶促反应的方法具有以下缺陷：已知为所述酶的来源的微生物的酶产量不足，而且，培养基昂贵。
另外，就JP-A 62-87089中所披露的转化型微生物而言，其酶促活性仅比具有乙内酰脲酶活性的孢子形成嗜热微生物高几倍，而且酶的产量仍然不足。
此外，现有技术中尚没有用上述转化型微生物对5-取代乙内酰脲进行不对称裂解水解以便产生和积累相应的D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸的先例。
本发明就是为了解决上述问题，而且涉及创造一种具有极高的酶产量的微生物，还涉及用由此所获得的酶源有效地生产D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸。
JP-A 62-87089和WO 94/00577披露了通过重组DNA技术获得乙内酰脲酶生产微生物的方法。不过，用于提供乙内酰脲酶基因的来源微生物完全不同于在本发明中被用于获得乙内酰脲酶基因的微生物。另外，所述乙内酰脲酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列明显不同于本发明的有关序列
本发明提供了一种用于生产D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸的方法，该方法包括在一种含水介质中使5-取代乙内酰脲与乙内酰脲酶反应，该乙内酰脲酶是由一种转化体产生，而转化体又是通过用含有源自芽胞杆菌KNK245(FERMBP-4863)、农杆菌KNK712(FERM BP-1900)或假单胞菌KNK003A(FERM BP-3181)的乙内酰脲酶编码基因的一种DNA片段和一种载体DNA的重组DNA转化一种宿主微生物，如属于埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属、黄杆菌属、芽胞杆菌属、沙雷菌属(Serratia)、农杆菌属、棒状杆菌属或短杆菌属(Brevibacterium)的微生物而获得的。
迄今为止，现有技术中尚未见具有极高乙内酰脲酶生产能力的转化体，如在本发明中所得到的转化体，而且，通过利用该转化体的酶的反应能够极为有效和经济地生产D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸。
随后，将结合附图对本发明做详细说明。
图1是质粒pAH1043的限制酶图。
图2是质粒pTH102的限制酶图。
图3是质粒pTH103的限制酶图。
图4是质粒pTH104的限制酶图。
图5是质粒pPHD301的限制酶图。
图6是质粒pTHB301的限制酶图。
可以从芽胞杆菌KNK245、农杆菌KNK712或假单胞菌KNK003A获得带有用于本发明的基因的DNA片段。
农杆菌KNK712和假单胞菌KNK003A已由本发明人保藏于NIBH(National Institute of Bioscience and Human Technology)，A-gency of Industrial Science&Technology，Ministry of internationalTrade&Industry，保藏编号分别为FERM BP-1900和FERM BP-3181，这些菌株详细披露于Wo 92/10579中。芽胞杆菌KNK245是由本发明人新发现的菌株，并于1994年11月2日提交NIBH保藏，保藏编号为FERM BP-4863。
芽胞杆菌KNK245的微生物学特征如下：
芽胞杆菌 KNK245
形状 棒状，丝状
大小 0.5-0.8×3-10(μm)
革兰氏染色 +
孢子 +
游动性 -
生长温度 37-60℃
生长pH 5.0-8.9
生长于5％NaCl中 -
生长于7％NaCl中 -
生长于0.02％叠氮化物中 -
生长于0.001％溶菌酶中 -
硝酸还原 -
淀粉水解 +
酪蛋白分解 +
酪氨酸分解 -
过氧化氢酶 -
氧化酶 +
吲哚产生 -
鼠李糖 -
萄萄糖 +
果糖 +
棉子糖 -
蔗糖 +
麦芽糖 +
乳糖 -
为了从所述菌株中获取乙内酰脲酶基因，通常采用以下方法。
首先，从一种微生物细胞中提取基因组DNA，然后用合适的限制酶，如Sau3AI等对该DNA进行部分水解。将所得到的片段连接到载体DNA上，以得到具有各种基因组DNA片段的重组DNA分子作为基因文库(见JP-A 58-126789和US 4,237,224)。
然后，从该基因文库中选择带有所需基因的重组体。例如，可以通过检测表达蛋白的酶促活性进行选择，或通过分析蛋白的N-末端序列，合成相应的DNA探针并通过菌落杂交等检测目的基因的存在。另外，可以采用DNA引物通过菌落杂交或聚合酶链式反应(PCR)方法获得所需要的基因，所述DNA引物是合成的已知乙内酰脲酶碱基序列的合适部分。一旦得到目的基因，即分析其核苷酸序列。另外，对一种乙内酰脲酶生产微生物和一种含有该酶基因的重组体进行培养。纯化所得到的酶，并测定所得蛋白的分子量。同时，用一台气相蛋白测序仪或类似装置测其N-末端部分的氨基酸序列。
接着，通过比较所述DNA核苷酸序列和N-末端氨基酸序列，确定编码乙内酰脲酶蛋白的核苷酸序列部分翻译成蛋白的起始位点，而且，通过考虑其与该蛋白分子量的关系证实，该酶蛋白是由所述基因上从该起始位点至终止密码子的部分编码，从而证实了所述目的基因(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Chapter 4和13)。因此，从农杆菌KNK712和芽胞杆菌KNK245中获得了序列1、2和3的DNA片段。众所周知，编码由此获得的酶的基因和/或目的基因(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Chapter 4和13)。因此，从芽胞杆菌KNK245、农杆菌KNK712和假单胞菌KNK003A中获得了序列1、2和3的DNA片段。众所周知，编码由此获得的酶的基因和/或带有该基因的DNA片段与具有编码相应于上述基因和/或DNA片段的氨基酸序列的另一种核苷酸序列的DNA片段相同，因为一个氨基酸通常相应于若干个碱基密码子。
可用于本发明的载体包括质粒、噬菌体或其衍生物，它们源于微生物，并能够在属于埃希氏菌属、假单胞菌属、黄杆菌属、芽胞杆菌属、沙雷菌属、棒状杆菌属或短杆菌属的细菌细胞中自主生长。
例如，可以采用披露于“Guidelines on Recombinant DNA Experi-ments，-Commentation，Q and A-”(The life Science Section of theResearch Development Office in the Science and Technology Agency，Ed.，revised Sept.16，1987)的第25至27页和第36至38页上的宿主-载体系统。另外，可将重组DNA用于提高待生产的酶的量的目的，该重组DNA具有一个与一种载体的适当位置连接的翻译起始位点，对该载体作过修饰，使其具有强结构启动子。用一种限制酶对该片段的两端进行切割，以形成与合适载体的重组体。通过直接转化属于埃希氏菌、假单胞菌、黄杆菌、芽胞杆菌、沙雷杆菌、农杆菌、棒状杆菌或短杆菌属的微生物可以产生乙内酰脲酶生产重组微生物。
无须直接转化上述属的微生物也可获得乙内酰脲酶生产重组微生物；即，一旦用其它微生物，如大肠杆菌将目的基因克隆到宿主载体系统中，此后便产生了具有合适载体的重组DNA。
以下文献所披露的内容可广泛用于生产重组体：授予S.N.Cohen等的美国专利US4,237,244说明书；Idenshi-SousaJikken-hou(Experimental Method of Gene Manipulation)”[Ed.，Yasuyuki TAKAGI，Kohdan-sha Scientific(1980)]；Method in En-zymology，68，Recombinant DNA[Ed.，Ray Mv，Academic Press(1979)]，JP-A58126789说明书等。
克隆目的基因，并除去其不必要的DNA。可以用其翻译起始位点与一个载体上的合适位置连接的重组DNA转化上述宿主细胞，以便提高待生产的酶产量，对所述载体作过修饰，使其具有强结构启动子。
在常规营养培养基中培养转化体，以表达导入的重组DNA。当来自基因DNA或载体DNA的一个性状被赋予重组DNA之后，可根据具体性状将一种合适的成分加入培养基中。
为了将由此所得的转化体作为酶的生产源，可以用常规培养基培养这种转化体。如果必要，还可以进行一种处理，以便诱导酶的产生，如添加乙内酰脲化合物、尿嘧啶、异丙基-1-硫基一3-D-半乳糖苷(IPTG)等，并提高温度。通常，用于培养转化体的培养基可以是含有碳源、氮源和无机离子的培养基。在很多场合，通过进一步添加有机微量养分，如维生素、氨基酸等可以获得理想的结果。通常，可将诸如葡萄糖和蔗糖之类的碳水化合物、诸如乙酸之类的有机酸、和醇等用作碳源。作为氮源，可以采用氨气、氨水、铵盐等。作为无机离子，可以采用磷酸根离子、镁离子、钾离子、铁离子、锰离子、钴离子、镍离子、铜离子、铝离子、钼离子等。
如果在需氧条件下培养1～10天，同时，分别将pH和温度调整至4-8和25-60℃的合适范围，可以获得理想结果。
由转化体所产生的酶促活性可以如下形式表现，如转化体的培养液、其微生物细胞、自该微生物细胞中提取的酶、固定化微生物细胞等。
作为微生物细胞，可以采用任何培养液，在结束培养液的培养之后，从培养液中分离微生物细胞，洗涤微生物细胞，然后即可使用。作为处理过的微生物细胞，可以采用冻干的微生物细胞、丙酮干燥的微生物细胞、与甲苯或洗涤剂接触的微生物细胞、溶菌酶处理过的微生物细胞、超声处理过的微生物细胞、机械研磨的微生物细胞等。另外，可以使用获自上述处理过的微生物细胞、固定化微生物细胞、不可溶化处理的微生物细胞的具有乙内酰脲酶活性的酶提取物，固定在用于固定化的支持物(如阴离子交换树脂)上的酶蛋白。固定化的方法可以参考JP-A63-185382等的说明书。
作为固定化用的支持物，适用的有酚醛阴离子交换树脂，如Duolite A568或DS17186(Rohm&Haas Co.：注册商标)；以及含有各种胺、铵盐、或二羟乙基胺类官能团类的各种阴离子交换树脂，例如聚苯乙烯树脂，如Amberlite IRA935、IRA945、IRA901(Rohm&haas Co.：注册商标)、Lewatit OC1037(Bayer A.G.：注册商标)和Diaion EX-05(Mitsubishi Chemical Industries，Ltd.：注册商标)。其它支持物，如DEAE-纤维素也可以采用。
另外，为了获得更强、更稳定的酶吸收，通常采用交联剂，交联剂的优选例子为戊二醛。所使用的酶不仅可以是纯化酶，而且可以是具有不同纯化度的酶，如部分纯化的酶、解离的微生物细胞的悬浮液和无细胞提取液。固定化酶的制备可以按常规方法进行，例如，将酶吸附在一种支持物上，随后进行交联处理。
对用作本发明酶促反应的底物的5-取代乙内酰脲无特殊限制，可以是通常用于此类反应的任何化合物。其例子包括由以下通式(1)所代表的化合物：
式(1)化合物的取代基的选择范围很宽。为了提供工业用制品，如药物的中间化合物，优选的R为苯基、由羟基取代的苯基、烷基、取代烷基、芳烷基或噻吩基。对于由羟基取代的苯基来说，羟基数可以为一个或几个，而且可以位于邻-、间-和对-位中的任一位置上，其典型例子为对羟苯基。烷基是1-4个碳原子的基团，相应的D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸是D-N-氨基甲酰基-丙氨酸、D-N-氨基甲酰基缬氨酸、D-N-氨基甲酰基亮氨酸、D-N-氨基甲酰基异亮氨酸等。所述取代烷基为用羟基、烷基硫基、羧基、氨基、苯基、羟基取代的苯基、酰胺基等取代的1-4个碳原子的烷基，其相应的D-N-氨基甲酰基氨基酸为D-N-氨基甲酰基-丝氨酸、D-N-氨基甲酰基苏氨酸、D-N-氨基甲酰基蛋氨酸、D-N-氨基甲酰基半胱氨酸、D-N-氨基甲酰基天冬酰胺、D-N-氨基甲酰基谷氨酰胺、D-N-氨基甲酰基酪氨酸、D-N-氨基甲酰基-色氨酸、D-N-氨基甲酰基天冬氨酸、D-N-氨基甲酰基谷氨酸、D-N-氨基甲酰基组氨酸、D-N-氨基甲酰基赖氨酸、D-N-氨基甲酰基精氨酸、D-N-氨基甲酰基瓜氨酸等。芳烷基是具有7-8个碳原子的基团，例如苄基或苯乙基，相应的D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸为D-N-氨基甲酰基-苯丙氨酸等。
作为含水介质，可以使用含有水、缓冲液或有机溶剂，如乙醇的介质。另外，必要时还可向该含水介质中加入微生物生长所需的营养物、抗氧化剂、洗涤剂、辅酶、羟胺、金属等。
当在水溶性介质中培养上述微生物的微生物细胞时，让该微生物细胞接触一种特定的5-取代乙内酰脲的情况下，采用一种不仅含有5-取代乙内酰脲，而且含有微生物生长所需的营养物，如碳源、氮源和无机离子源的含水介质。如果再向其中加入诸如维生素和氨基酸之类的有机微量营养物，在多数情况下会取得理想效果。作为碳源，通常采用诸如葡萄糖、蔗糖之类的碳水化合物，诸如乙酸之类的有机酸；醇等。作为氮源，可以采用氨气、氨水、铵盐等。作为无机离子，可以采用磷酸根离子、镁离子、钾离子、铁离子、锰离子、钴离子、镍离子、铜离子、铝离子、钼离子等。
培养是在有氧条件下进行，同时，分别将pH和温度调至4-8和25～60℃的适当范围内。如果培养进行1～10天，能高效地将5-取代的乙内酰脲仅转化为D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸。
另一方面，当让上述微生物的培养液原样与培养的微生物细胞、处理过的微生物细胞、酶提取物、固定化微生物细胞、不可溶化的微生物细胞或固定的酶蛋白在含有溶解的或悬浮的5-取代乙内酰脲的含水介质中反应时，可将反应混合物静置一段时间或搅拌，同时维持10-80℃的适当温度和pH4-9.5的适当pH值。因此，如果将反应进行5-100小时，由乙内酰脲酶进行底物的D-特异性水解反应，而且底物发生化学外消旋，所有D-，DL-或L-5-取代乙内酰脲转化成相应的D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸，从而在所述含水介质中积累大量的氨基酸。另外，可以随着反应的进行，以单独部分加入5-取代乙内酰脲。
可以分离所产生的D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸，并通过常规分离方法提纯。
通过采用按上述方法获得的分离并纯化的D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸或由乙内酰脲酶反应所获得的反应混合物可很容易地获得D-α-氨基酸，通过化学作用或具有脱甲氨酰酶活性的酶促作用将D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸转化成相应的D-α-氨基酸。
下面的实施例将对本发明作进一步的详细说明。
例1
从土壤中分离具有乙内酰脲酶活性的微生物
将0.5g土壤样品悬浮于2ml生理盐水中之后，静置该悬浮液，然后将1滴上清液涂在一种分离琼脂板培养基(1.0％肉膏，1.0％胨，1.0％酵母提取物，0.3％氯化钠，2.0％琼脂；pH7.5)上。将其在50℃下培养2天，并将所得菌落转移到添加了0.1％尿嘧啶和20ppm氯化锰的同一分离平板培养基上，并在50℃下再培养1天。将所获得的微生物细胞悬浮于100μl反应底物溶液[DL-(对羟苯基)乙内酰脲30mM，亚硫酸钠0.1％，碳酸缓冲液50mM]中，并让其在50℃下反应2小时。然后，将反应混合物点滴在TLC板上，用展开溶剂丁醇∶乙酸∶水(4∶1∶1)展开，接着用在浓盐酸中配制的10％对二甲氨基苯甲醛溶液显色，检测黄色斑点，以便选择能产生N-氨基甲酰基-对羟苯基甘氨酸的微生物菌株。这样，从2740个菌落中分离得到具有高乙内酰脲酶活性的芽胞杆菌KNK245(FERM BP-4863)。
例2
得自芽胞杆菌KNK245的乙内酰脲酶的N-末端氨基酸测序
将一整环的芽胞杆菌KNK245接种到盛于500ml体积的Sak-aguchi烧瓶中的100ml接种培养基(1.0％肉膏、1.0％胨、0.5％酵母提取物；pH7.5)里，并在55℃下培养19小时。然后将2％的该培养物接种到盛于2L Sakaguchi烧瓶中的500ml主培养基(1.0％肉膏，1.0％胨，0.5％尿嘧啶，20ppm氯化锰四水合物；pH7.5)里，并在55℃下培养19小时。通过离心从由此获得的9升培养液中收集微生物细胞。将其悬浮于含有20mM硫酸锰的0.2M Tris-HCl(pH8.0)中，超声波破碎并离心，以获得无细胞提取物。然后，通过硫酸铵沉淀分级分离、DEAE-Sepharose和苯基-Sepharose将该提取物纯化32倍。此外，用硫酸铵获得乙内酰脲酶结晶。将该结晶溶于水中，并用A470A Model Gas Phase Protein Sequencer(由AppliedBiosystems生产)进行分析。结果发现，该乙内酰脲酶的N-末端的氨基酸序列为：
1 5 10
Met-Lys-Lys-Ile-Ile-Lys-Asn-Gly-Thr-Ile-Val-Thr-
例3
获得带有源于农杆菌KNK712(FERM BP-1900)的编码乙内酰脲酶基因的质粒
通过以下方法进行的研究业已发现，乙内酰脲酶基因位于克隆于质粒pADH101中的DNA片段上，该质粒披露于WO 92/10579中。用常规方法由pAHD101转化大肠杆菌JM109，接种到含有100mg/l氨苄青霉素的50ml的L-液(10g/l胨，5g/l酵母提取物、5g/l氯化钠；pH7.0)里，并在37℃培养16小时。然后，收集50ml培养液，除去上清液，将微生物细胞悬浮于50ml底物溶液(0.5％5-(对羟苯基)乙内酰脲，0.05％Triton x-100，0.05M磷酸缓冲液；pH8.7)里，在37℃下，在氮气流中反应3小时。将反应混合物点滴到TLC板上，展开，并用在氢氯酸中配制的对二甲氨基苯甲醛显色，以便检测与真实样品相符合的D-N-氨基甲酰基-(对羟苯基)甘氨酸斑点。关于前者，我们证实pAHD101转化体能表达编码乙内酰脲酶的基因。
将通过用Sac I和Sal I裂解质粒pAHD101缩短插入的片段而获得的2.1kbp片段连接到用Sac I和Sal I裂解的pUC18片段上，以获得质粒pAH1043(见图1)。
另外，用DNA测序试剂盒(由Applied Biosystems生产)对乙内酰脲酶基因进行核苷酸测序。结果示于序列1中。
用质粒pAH1043转化大肠杆菌HB101，以便获得大肠杆菌HB101 pAH1043(FERM BP-4865)转化体。
例4
制备芽胞杆菌KNK245基因组DNA与载体DNA的重组DNA
将芽胞杆菌KNK245(FERMBP-4863)放在2升培养液(10g/l肉膏、10g/l胨、5g/l酵母提取物；pH7.5)中，在45℃下培养24小时，收集微生物细胞。从按照Marmur方法获得的微生物细胞中提取基因组DNA。将10单位BamH I加入1μg基因组DNA中，并让其在37℃下反应16小时。
另一方面，用BamH I对质粒pUC19进行彻底裂解，并用T4DNA连接酶将其连接到上述所得到的基因组DNA片段上，以便得到各种重组质粒的混合物。
例5
获得源于芽胞杆菌KNK245的乙内酰脲酶基因
根据源于例3的农杆菌KNK712(FERM BP-1900)和披露于JP-A 62-87089中的Lu1220菌株的乙内酰脲酶基因的核苷酸序列，合成两种引物，引物1和引物2(见表1)，各种引物具有上述核苷酸序列互补链的序列，并且从1155bp间断核苷酸序列起取向相反。用两种引物进行聚合酶链式反应(PCR)，引物是以在例4中制备的源于芽胞杆菌KNK245的基因组DNA为模板合成的，以获得约1.2kbp的片段。用DNA测序试剂盒(由Applied Biosystems生产)对所述片段进行核苷酸测序。结果发现，它对已知的乙内酰脲酶基因有很高的互补度，而且发现所获得的PCR片段是乙内酰脲酶基因的一部分。然后，合成两个引物，引物3和引物4(表1)，其具有相应于该片段互补链的反向取向的序列。
另外，合成具有例4的重组DNA上的载体部分序列的引物5(表1)，通过采用上文合成的引物和后一种引物，并以例4的重组DNA为模板进行PCR，以获得分别含有乙内酰脲酶基因的前半部分和后半部分的两类DNA片段。对所得到的DNA片段进行核苷酸测序。根据由例2中乙内酰脲酶蛋白的N-末端氨基酸序列预计的核苷酸序列，确定翻译密码子。与上述确定的核苷酸序列一起确定编码乙内酰脲酶的基因的整个核苷酸序列。
结果示于序列2中。
然后，根据由此获得的核苷酸序列，合成具有乙内酰脲酶基因起始密码子和Nde I限制位点的序列的引物6(表1)和具有乙内酰脲酶基因上的Pst I限制位点的序列的引物7(表1)，并以例4的基因组DNA为模板进行PCR，以获得1.2kb的片段1。然后合成在上述Pst I限制位点上具有反向序列的引物8(表1)和具有相应于终止密码子的下游的序列和Hind III限制位点的引物9(表1)，并以例4的基因组DNA为模板进行PCR，以便获得0.25kb的片段2。用NdeI和Pst I对片段1进行限制性酶切，用Pst I和Hind III对片段2进行限制性酶切，并用Nde I和Hind III对pUCNT进行限制性酶切，pUCNT是披露于WO94/03613中的pUC19的改进载体质粒。用T4DNA连接酶将上述限制片段连接在一起，以便获得含有乙内酰脲酶基因的质粒pTH102(见图2)。
Table 1
引物1
引物2
引物3
5′-TAACATCCTTTTGCATCAACCACTTC-3′
引物4
5′-AAAAAAGGAAGAATCACGTTAAA-3′
引物5
5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′
引物6
5′-TACGAGCATATGAAAAAGATCATTAAGAACGG
AAC-3′
引物7
5′-GTGTGTTTCTGCAGAAATTACCCGTTC-3′
引物8
5′-TAATTTCTGCAGAAACACACCATAT-3′
引物9
5′-GCTGAAAGCTTCGAAATAAGCCATTTTCGAGC
AG-3′
引物10
5′-TAATTTCTGCAGAAACACACCACATGGCCGT
CG-3′
引物11
5′-CGAGCAAGCTTCTACTAAATGGTTAATTTCTC
AT-3′
引物12
5′-GGAAGCTTTCATTAAATGGTTAATTTCTCATC
TTGTT-3′
引物13
5′-TACGAGGGATCCTATAAATTCCAACAAGTGC
TATA-3′
例6
制备用于表达芽胞杆菌KNK245乙内酰脲酶基因的重组DNA
按照与获得例5的片段2相同的方法进行PCR，以便得到0.25kb的片段3，所不同的是，不采用用于产生片段2的、具有Pst I限制位点的引物，而是采用合成的引物10(表1)代替具有终止密码子序列的引物，其中，靠近Pst I限制位点的Nde I限制位点上的一个核苷酸被取代，以阻止Nde I的裂解作用，并采用合成的引物11(表1)，基中，在终止密码子下游的核苷酸数目进一步减少。然后，按照获得例5中pTH102相同的方法由片段1和3和pUCNT(见图3)获得质粒pTH103.
此外，以与获得pTH103相同的方法获得pTH104，所不同的是，不采用具有终止密码子下游序列的引物11，而采用引物12(表1)。
由pTH104转化的大肠杆菌HB101被命名为大肠杆菌HB101pTH104。该菌株已于1994年11月2日保藏于NIBH，保藏编号为FERM BP-4864。
例7
获得含有源于假单胞菌KNK003A(FERM BP-3181)的乙内酰脲酶编码基因的质粒
按照例3所述方法发现，乙内酰脲酶基因位于WO92/10579中所披露的质粒pPHD301上。
用pPHD301转化大肠杆菌HB101，以获得大肠杆菌HB101pPHD301(FERM BP-4866)。pPHD301的限制酶图如图5所示。
按照与例3相同的方法对乙内酰脲酶基因进行核苷酸测序。结果如序列3所示。
例8
用所获得的转化体将5-(对羟苯基)乙内酰脲转化成D-N-氨基甲酰基-(对羟苯基)甘氨酸。
将在例6中得到的转化体大肠杆菌HB101pTH104接种到含有100μg/ml氨苄青霉素和400ppm氯化锰四水合物的50ml 2YT培养液(16g/l多胨(polypeptone)，10g/l酵母提取物，5g/l氯化钠；pH 7.0)里，并在37℃培养24小时。以50ml上述培养液中收集微生物细胞，并悬浮于0.05M的碳酸缓冲液(pH8.7)中，定容至50ml。以0.05％的终浓度加入Triton x-100。向该溶液中添加1.5g 5-(对羟苯基)乙内酰脲，在40℃温度下，在氮气流中反应3小时，同时搅拌，用6N NaOH将pH调至8.7。反应结束后，对反应混合物进行离心，取上清液，用在浓氢氯酸配制的10％对二甲氨基苄醛溶液显色，对其中的D-N-氨基甲酰基-(对羟苯基)甘氨酸进行比色测定。结果，以97.5％的转化率获得了D-N-氨基甲酰基-(对羟苯基)甘氨酸。
用氢氯酸将反应混合物的pH调至5。离心以后，浓缩上清液，用浓氢氯酸调至pH2，并于4℃下保存。滤除沉淀的结晶，并从水-乙醇中再结晶，以获得970mg D-N-氨基甲酰基-(对羟苯基)甘氨酸，m.p.176-177℃，[α]D20＝-177.0°(C＝0.5，5％乙醇)。
例9
制备固定化乙内酰脲酶
从1升按例7所述方法获得的大肠杆菌HB101 pTH104培养液中收集微生物细胞，悬浮于1mM硫酸锰水溶液中，定容至60ml，将pH调至8.5，并通过超声波破碎。向由此获得的酶溶液中加入20g阴离子交换树脂Duolite A-568，平衡至pH8.5，并在15℃下搅拌该混合物20小时，以吸附所述酶。向该混合物中加入戊二醛，使其终浓度为0.1％，搅拌混合物1小时，以便进行交联反应。然后收集树脂并洗涤，以获得20g固定化乙内酰脲酶。
例10
用固定化酶将5-(对羟苯基)乙内酰脲转化成D-氨基甲酰基-(对羟苯基)甘氨酸
将5g在例9中获得的固定化乙内酰脲酶加至温度为40℃的100ml 1mM硫酸锰水溶液中，该溶液中用氮气起泡。向该溶液中加3g 5-(对羟苯基)乙内酰脲，在40℃下，在搅拌条件下反应3小时，同时用氮气起泡。反应结束后，静置反应混合物，并吸取收集反应混合物。按照与例8相同的方法纯化上述氨基甲酰基氨基酸制品，获得2.2g D-N-氨基甲酰基-(对羟苯基)甘氨酸。
例11
在枯草杆菌(Bacillus subtilis)中表达芽胞杆菌KNK245乙内酰脲酶基因
按照与例5相同的方法进行PCR，以芽胞杆菌KNK245基因组DNA为模板，并采用引物12和13(表1)，以便获得1.7kb的片段。用BamH I和Hind III裂解该片段，并将其连接到以类似方法裂解过的质粒pHY300PLK(Takara Shuzo)上，获得质粒pTHB301。其限制酶图如图6所示。
通过电击法(用Shimadzu公司的GTE-10型，10KV/cm，2ms)将质粒pTHB 301导入枯草杆菌ISW 1214(可从Takara Shuzo获得)、枯草杆菌YS-11(IAM12019)或枯草杆菌3115(IAM12020)，并在添加了0.02g/l氯化镁四水合物的例4的培养基中、在37℃下培养20小时。通过收集微生物细胞并通过超声波将其破碎，以制备无细胞提取物。结果，各种乙内酰脲酶的活性比在相同条件下培养芽胞杆菌KNK245所获得的活性高大约2.2倍。
例12
在嗜热生物中表达芽胞杆菌KNK245乙内酰脲酶基因
用J.Bacteriol，149，824(1982)中披露的原生质体法，由在例11中制备的质粒pTH301转化嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus Stearother-mophilus)IFO12550，并以与例11相同的方法培养，以制备无细胞提取物。乙内酰脲酶的活性比在相同条件下制备的芽胞杆菌KNK245的乙内酰脲酶的活性高大约3.6倍。
如上所述，按照本发明可以创造一种具有极高的乙内酰脲酶活性的微生物，以其为酶源可以有效生产D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸。
微生物保藏
已按照布达佩斯条约分别将有关微生物保藏在下述保藏机构。农杆菌KNK712，保藏日：1988年5月31日，保藏号为FERM BP-1900；假单胞菌KNK003A，保藏日：1990年12月1日，保藏编号为FERM BP-3181；芽胞杆菌KNK245，保藏日：1994年11月2日，保藏编号为FERM BP-4863；大肠杆菌HB101 pAH1043，保藏日：1994年11月2日，保藏编号为FERM BP-4865；大肠杆菌HB101pTH104，保藏日：1994年11月2日，保藏编号为FERM BP-4864；大肠杆菌HB101 pPHD301，保藏日：1994年11月2日，保藏编号为FERM BP-4866。
保藏机构名称：National Institute of Bioscience andHuman-Technology(以前的Fermentation Research Institute)，Agency of Industrial Science&Technology，Ministry of InternationalTrade&Industry.
地址：1-3，Higashi 1 Chome Tsukuba-shi Ibaraki-ken 305，日本。
【序列表】
序列1
序列长度：2105
序列类型：核酸
序列：
10 20 30 40 50 60
GTCGACTTCAACTCGTTCCGCCTCGAACGAGAGCGCTCTGCACAGAATCGTCTTCGCTAG
70 80 90 100 110 120
GCCGCCGTTCCGCTTGACAGCTTCAAAACACCATGCAAACTTGTATAAAGAATTACATTC
130 140 150 160 170 180
CATATACGGAACAAACTCTTCAATCCTGAGAGCGACATCATGGACATCATTATCAAAAAC
MetAspIleIleIleLysAsn
190 200 210 220 230 240
GGAACCATCGTGACCGCGGATGGCATTTCTCGCGCCGATCTCGGGATCAAGGATGGCAAG
GlyThrIleValThrAlaAspGlyIleSerArgAlaAspLeuGlyIleLysAspGlyLys
250 260 270 280 290 300
ATCACCCAGATCGGCGGCGCGCTCGGCCCAGCGGAGCGGACGATCGACGCGGCCGGCCGC
IleThrGlnIleGlyGlyAlaLeuGlyProAlaGluArgThrIleAspAlaAlaGlyArg
310 320 330 340 350 360
TACGTCTTTCCGGGCGGCATAGACGTTCACACGCATGTCGAAACGGTCAGCTTCAACACG
TyrValPheProGlyGlyIleAspValHisThrHisValGluThrValSerPheAsnThr
370 380 390 400 410 420
CAGTCGGCCGACACGTTCGCAACAGCGACGGTCGCGGCCGCCTGTGGCGGAACGACAACC
GlnSerAlaAspThrPheAlaThrAlaThrValAlaAlaAlaCysGlyGlyThrThrThr
430 440 450 460 470 480
ATCGTCGATTTCTGTCAGCAGGATCGCGGCCACAGCCTGGCGGAACCCGTCCCCAAGTGG
IleValAspPheCysGlnGlnAspArgGlyHisSerLeuAlaGluProValProLysTrp
490 500 510 520 530 540
GACGGTATGGCCGGCGGCAAGTCGGCGATCGATTACGGCTACCACATCATCGTGCTCGAC
AspGlyMetAlaGlyGlyLysSerAlaIleAspTyrGlyTyrHisIleIleValLeuAsp
550 560 570 580 590 600
CCGACCGACAGCGTGATTGAGGAGCTGGAGGTGCTTCCCGATCTTGGCATTACCTCCTTC
ProThrAspSerValIleGluGluLeuGluValLeuProAspLeuGlyIleThrSerPhe
610 620 630 640 650 660
AAGGTCTTCATGGCCTATCGCGGCATGAACATGATCGACGACCTGACGCTGCTGAAGACG
LysValPheMetAlaTyrArgGlyMetAsnMetIleAspAspValThrLeuLeuLysThr
670 680 690 700 710 720
CTCGACAAGGCGGTCAAGACCGGATCGCTCGTCATGGTGCACGCGGAAAACGGCGACGCC
LeuAspLysAlaValLysThrGlySerLeuValMetValHisAlaGluAsnGlyAspAla
730 740 750 760 770 780
GCCGACTATCTGCGCGACAAGTTCGTGGCCGAGGGCAAAACCGCGCCGATCTACCACGCG
AlaAspTyrLeuArgAspLysPheValAlaGluGlyLysThrAlaProIleTyrHisAla
790 800 810 820 830 840
CTCAGCCGCCCGCCCCGGGTCGAAGCCGAGGCAACCGCGCGGGCCCTCGCCCTGGCCGAA
LeuSerArgProProArgValGluAlaGluAlaThrAlaArgAlaLeuAlaLeuAlaGlu
850 860 870 880 890 900
ATCGTCAACGCCCCGATCTACATAGTCCATGTGACCTGCGAGGAGTCCCTTGAGGAGGTG
IleValAsnAlaProIleTyrIleValHisValThrCysGluGluSerLeuGluGluVal
910 920 930 940 950 960
ATGCGCGCAAAATCGCGAGGCGTCCGCGCTCTGGCGGAAACCTGCACGCATTACCTTTAC
MetArgAlaLysSerArgGlyValArgAlaLeuAlaGluThrCysThrHisTyrLeuTyr
970 980 990 1000 1010 1020
CTCACCAAGGAAGACCTGGAGCGGCCGGATTTCGAAGGTGCGAAATACGTTTTCACACCG
LeuThrLysGluAspLeuGluArgProAspPheGluGlyAlaLysTyrValPheThrPro
1030 1040 1050 1060 1070 1080
CCGGCCCGCGCGAAGAAAGACCATGACGTTCTCTGGAACGCACTCAGAAACGGTGTGTTC
ProAlaArgAlaLysLysAspHisAspValLeuTrpAsnAlaLeuArgAsnGlyValPhe
1090 1100 1110 1120 1130 1140
GAAACGGTTTCCTCCGACCATTGCTCCTGGCTCTTCAAGGGGCACAAGGACCGGGGCCGG
GluThrValSerSerAspHisCysSerTrpLeuPheLysGlyHisLysAspArgGlyArg
1150 1160 1170 1180 1190 1200
AACGACTTTCGCGCCATCCCGAACGGCGCGCCGGGCGTCGAGGAACGGTTGATGATGGTC
AsnAspPheArgAlaIleProAsnGlyAlaProGlyValGluGluArgLeuMetMetVal
1210 1220 1230 1240 1250 1260
TATCAGGGCGTCAACGAAGGCCGGATTTCCCTTACCCAGTTCGTGGAACTGGTCGCCACG
TyrGlnGlyValAsnGluGlyArgIleSerLeuThrGlnPheValGluLeuValAlaThr
1270 1280 1290 1300 1310 1320
CGCCCGGCCAAGGTCTTCGGAATGTTTCCGCAAAAGGGGACGATCGCGGTCGGTTCGGAC
ArgProAlaLysValPheGlyMetPheProGlnLysGlyThrIleAlaValGlySerAsp
1330 1340 1350 1360 1370 1380
GCCGACATCGTCCTTTGGGACCCCGAGGCCGAAATGGTGATCGAACAGACCGCCATGCAC
AlaAspIleValLeuTrpAspProGluAlaGluMetValIleGluGlnThrAlaMetHis
1390 1400 1410 1420 1430 1440
AACGCCATGGATTACTCCTCCTACGAGGGACACAAGGTCAAGGGCGTGCCGAAGACGGTG
AsnAlaMetAspTyrSerSerTyrGluGlyHisLysValLysGlyValProLysThrVal
1450 1460 1470 1480 1490 1500
CTCCTGCGTGGCAAGGTTATCGTCGACGAAGGTTCCTATGTCGGCGAACCGACGGACGGG
LeuLeuArgGlyLysValIleValAspGluGlySerTyrValGlyGluProThrAspGly
1510 1520 1530 1540 1550 1560
AAATTCCTGAAACGTCGCAAATACAAGCAGTAAACCGGCATTCTACGAGAACGATGATGA
LysPheLeuLysArgArgLysTyrLysGln***
1570 1580 1590 1600 1610 1620
CAATACACACTTCGACAAGTGTCGTCGCGCCTGACGGCGACAGCGTTGCAAGCGGCTTCG
1630 1640 1650 1660 1670 1680
ACAGGCGTTACGGCGCACCGACATTCAATCAGATACCATCGGGCGAACGGCTGGTGTCGG
1690 1700 1710 1720 1730 1740
ACTGCATCGCGCTGATGCTGAAGCACCGTTCCGTCAGACGCTACACGGGGGAACCTCTCC
1750 1760 1770 1780 1790 1800
CCCCAGGCACGCTGGAAATGCTGATGGCGGCGGGTCAGTCGGCTGCGACATCCTCCAACA
1810 1820 1830 1840 1850 1860
TGCAGACCGTGTCGGTCATCGCGGTGACGGACCCCGAGAAAAAGACCCGTCTCGCGAAGA
1870 1880 1890 1900 1910 1920
CATGCGCCGGGCAGGACTTCATCGCCAACGCTCCTGTGCTCCTGTGTTTCGTGACGGATC
1930 1940 1950 1960 1970 1980
TTGCGCGCCCCGCCAGGGTCGCCTCCACGATTGGCGCCGATCTTTTCGCGTTGCCGATGA
1990 2000 2010 2020 2030 2040
TCGACACCTTTCTGGCGTCCATCAGCGATTGTTCCATCTTCGCGCAAAACCTTGTTCTCG
2050 2060 2070 2080 2090 2100
CCGCGGAATCGCTCGGCATGGGCACCTGCTATGTCGGGAGCCTGCGCAACCGGCCTGATC
CCGGG
序列2
序列长度：1776
序列类型：核酸
序列：
10 20 30 40 50 60
ATTAACNCGGACGTCTGTATAAATTCCAACAAGTGCTATATCGCCTGTGAAGATGCTTCC
70 80 90 100 110 120
CACCAATGCATTGACCGCGTAGCGGATGAAAACGGTAAAGAGTATTTAAAAGTACGCGAA
130 140 150 160 170 180
GACGATTGTGTAGGCTGTAATTTATGTTCCATTGTATGTCCTGTGGACGGTGCCATTGAC
190 200 210 220 230 240
ATGGTTGAACTTCCTAATGAGCTTCCGCCGATGACGTGGAATGAACCCCAAGCANCCTAG
250 260 270 280 290 300
GCGCACTAGCAGCTGTAATATTGACGTAAAATAAAAAAACAGCCAAAGAG((GGAATGCC
310 320 330 340 350 360
AAGTGAAAAAGATCATTAAGAACGGAACGATTGTCACAGCAACCGATACGTATGAAGCCG
MetLysLysIleIleLysAsnGlyThrIleValThrAlaThrAspThrTyrGluAlaAsp
370 380 390 400 410 420
ATTTGTTGATTGAAGACGGGAAAATTGCAATGATTGGCAGAAATTTTGACGAAAATGAAG
LeuLeuIleGluAspGlyLysIleAlaMetIleGlyArgAsnPheAspGluAsnGluAla
430 440 450 460 470 480
CGGAAGTGGTTGATGCAAAAGGATGTTACGTGTTTCCGGGCGGCATTGATCCGCACACGC
GluValValAspAlaLysGlyCysTyrValPheProGlyGlyIleAspProHisThrHis
490 500 510 520 530 540
ATTTAGATATGCCGTTTGGAGGCACGGTGACAAAAGACGATTTCGAATCGGGAACGATCG
LeuAspMetProPheGlyGlyThrValThrLysAspAspPheGluSerGlyThrIleAla
550 560 570 580 590 600
CAGCCGCTTTTGGCGGAACGACAACGATTATCGATTTTTGTTTAACAAATAAAGGCGAGT
AlaAlaPheGlyGlyThrThrThrIleIleAspPheCysLeuThrAsnLysGlyGluSer
610 620 630 640 650 660
CATTGAAAAAAGCGATTGAAACTTGGCATAACAAAGCAAAAGGAAAAGCGGTTATCGATT
LeuLysLysAlaIleGluThrTrpHisAsnLysAlaLysGlyLysAlaValIleAspTyr
670 680 690 700 710 720
ATGGATTCCATTTAATGATTGCTGAAATGAACGAAGATGTGTTGGAAGAATTGCCGAAAA
GlyPheHisLeuMetIleAlaGluMetAsnGluAspValLeuGluGluLeuProLysIle
730 740 750 760 770 780
TCATTGAAGAAGAAGGCATTACATCGTTTAAAGTGTTCATGGCGTATAAAAATGTTTTCC
IleGluGluGluGlyIleThrSerPheLysValPheMetAlaTyrLysAsnValPheGln
790 800 810 820 830 840
AAGCGGACGACGGCACTTTATACCGAACCTTGCTTGCGGCGAAAGAACTGGGTGCACTCG
AlaAspAspGlyThrLeuTyrArgThrLeuLeuAlaAlaLysGluLeuGlyAlaLeuVal
850 860 870 880 890 900
TAATGGTTCATGCCGAAAACGGTGACGTCATCGATTATTTAACGAAAAAAGCGATCGCTG
MetValHisAlaGluAsnGlyAspValIleAspTyrLeuThrLysLysAlaIleAlaAsp
910 920 930 940 950 960
ATGGTAATACTGATCCGATTTACCATGCACTCACAAGACCTCCGGAAGTGGAAGGTGAGG
GlyAsnThrAspProIleTyrHisAlaLeuThrArgProProGluValGluGlyGluAla
970 980 990 1000 1010 1020
CGACAGGACGTGCATGTCAATTAACAGGTCTTGCTGGTTCTCAACTTTATGTTGTTCATG
ThrGlyArgAlaCysGlnLeuThrGlyLeuAlaGlySerGlnLeuTyrValValHisVal
1030 1040 1050 1060 1070 1080
TTTCCTGCGCTCAAGCTGTTGAAAAAATTGCGGAAGCCCGTAACAAAGGGTTGGACGTAT
SerCysAlaGlnAlaValGluLysIleAlaGluAlaArgAsnLysGlyLeuAspValTrp
1090 1100 1110 1120 1130 1140
GGGGAGAAACGTGTCCGCAATATTTAGTTCTCGACCAATCTTACTTAGAAAAACCTGACT
GlyGluThrCysProGlnTyrLeuValLeuAspGlnSerTyrLeuGluLysProAspPhe
1150 1160 1170 1180 1190 1200
TTGAAGGAGCAAAATACGTCTGGTCTCCTCCGCTCCGAGAAAAATGGCATCAAGATGTGT
GluGlyAlaLysTyrValTrpSerProProLeuArgGluLysTrpHisGlnAspValLeu
1210 1220 1230 1240 1250 1260
TATGGAACGCTTTGAAAAACGGACAGCTCCAAACTTTAGGTTCTGACCAATGTTCCTTTG
TrpAsnAlaLeuLysAsnGlyGlnLeuGlnThrLeuGlySerAspGlnCysSerPheAsp
1270 1280 1290 1300 1310 1320
ACTTTAAAGGACAAAAAGAACTTGGCAGAGGTGATTTCACGAAAATCCCGAACGGCGGAC
PheLysGlyGlnLysGluLeuGlyArgGlyAspPheThrLysIleProAsnGlyGlyPro
1330 1340 1350 1360 1370 1380
CAATGATTGAGGATCGAGTAAGCATTCTTTTTAGTGAAGGAGTAAAGAAAGGAAGAATTT
MetIleGluAspArgValSerIleLeuPheSerGluGlyValLysLysGlyArgIleSer
1390 1400 1410 1420 1430 1440
CATTAAATCAATTTGTTGACATTATGTCAACGAGAATTGCTAAATTGTTTGGATTATTCC
LeuAsnGlnPheValAspIleMetSerThrArgIleAlaLysLeuPheGlyLeuPhePro
1450 1460 1470 1480 1490 1500
CGAAAAAAGGTACTATCGCTGTTGGATCTGACGCAGATTTAGTTATTTTCGATCCAAATA
LysLysGlyThrIleAlaValGlySerAspAlaAspLeuValIlePheAspProAsnIle
1510 1520 1530 1540 1550 1560
TTGAACGGGTAATTTCTGCAGAAACACACCATATGGCCGTCGATTACAATGCATTTGAAG
GluArgValIleSerAlaGluThrHisHisMetAlaValAspTyrAsnAlaPheGluGly
1570 1580 1590 1600 1610 1620
GAATGAAAGTGACGGGAGAACCAGTGTCCGTTCTTTCAAGAGGCGAATTCGTCATTCGTG
MetLysValThrGlyGluProValSerValLeuSerArgGlyGluPheValIleArgAsp
1630 1640 1650 1660 1670 1680
ACAAAACATTTGTCGGTAAGCCAGGATACGGCCAATATTTAAAACGGGCAAAATACGGAA
LysThrPheValGlyLysProGlyTyrGlyGlnTyrLeuLysArgAlaLysTyrGlyLys
1690 1700 1710 1720 1730 1740
AACATGCAGTTTCTAAACAAGATGAGAAATTAACCATTTAGTAGAAAGCTGCTCGAAAAT
HisAlaValSerLysGlnAspGluLysLeuThrIle***
1750 1760 1770
GGCTTATTTCGGTTAAATCAGCGGAACAACTCCCGC
序列3
序列长度：1569
序列类型：核酸
序列
10 20 30 40 50 60
TCGGAACCTGAAAACGAAATATCCCGCCGGACGGTGGGAAGGTGAAAGGAGGAGTCTCCA