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1、10申请公布号CN104177477A43申请公布日20141203CN104177477A21申请号201410438939622申请日20140828C07K7/06200601C07K1/34200601C07K1/20200601C07K1/16200601C12P21/06200601A23L1/305200601A61K8/64200601A61Q19/0820060171申请人滨州万嘉生物科技有限公司地址256600山东省滨州市北外环路335号72发明人罗永康徐萍王智刘鹏74专利代理机构北京修典盛世知识产权代理事务所特殊普通合伙11424代理人胡长远54发明名称一种鱼肉抗氧化活性。
2、肽及其制备方法57摘要本发明公开了属于水产食品加工领域的一种鱼肉抗氧化活性肽，其氨基酸序列为ASNTRPASPASPMET。该肽可以人工合成，也可以鱼肉为原料制备。其制备包括将鱼肉制成鱼肉浆液，然后用碱性蛋白酶进行酶解，离心，取上清液；利用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜对上清液超滤，SEPHADEXG25凝胶分离，收集第2个洗脱峰；再用高效液相色谱纯化；最后浓缩、冷冻干燥。本发明鱼肉抗氧化活性肽的抗氧化功能好，其清除DPPH自由基能力可达90以上；其次，本发明是以天然产物为原料、经过食品级碱性蛋白酶酶解获得的产物，安全，无毒，本发明制备方法简单，有效地解决了目前抗氧化多肽难以实现产业化生产的问题。
3、。51INTCL权利要求书2页说明书5页序列表1页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书5页序列表1页附图1页10申请公布号CN104177477ACN104177477A1/2页21一种鱼肉抗氧化活性肽，其特征在于所述的鱼肉抗氧化活性肽的氨基酸序列为ASNTRPASPASPMET。2按照权利要求1所述的鱼肉抗氧化活性肽，其特征在于所述的鱼肉抗氧化活性肽的分子量为679DA。3权利要求1所述的鱼肉抗氧化活性肽，其特征在于按照如下方法制备1、洗净鱼肉，用打浆机将鱼肉打成浆，得鱼肉浆；然后向鱼肉浆中加入1030倍鱼肉重量的水，在8090下保持1520MIN，再。
4、用分散均质机在1000013000RPM下匀浆13MIN，得鱼肉浆液；2、用1MOL/L的NAOH或HCL调节步骤1所得的鱼肉浆液的PH为7080，并调节鱼肉浆液的温度为5060；然后按照碱性蛋白酶与鱼肉质量比为150200的比例加入碱性蛋白酶，搅拌，在5060下酶解0530H，再在95100下保温35MIN，冷却至室温；接着在40006000G下离心1015MIN，收集上清液；3、利用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜对步骤2所得的上清液进行超滤，收集滤液；再经过SEPHADEXG25凝胶分离，洗脱液为去离子水，流速为08ML/MIN，洗脱峰在280NM下进行检测，收集第2个洗脱峰；再用RPHPL。
5、C反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以590乙腈溶液作为洗脱液，流速为15ML/MIN，得到含抗氧化活性肽的溶液；4、将步骤3所得的含抗氧化活性肽的溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼肉抗氧化活性肽。4按照权利要求3所述的鱼肉抗氧化活性肽，其特征在于所述的鱼是指鲢鱼、草鱼或鳕鱼。5按照权利要求3所述的鱼肉抗氧化活性肽，其特征在于其步骤2中所述的碱性蛋白酶是指ALCALASE24L。6按照权利要求3所述的鱼肉抗氧化活性肽，其特征在于其步骤3中所述的590乙腈溶液是指05MIN乙腈溶液为5，540MIN乙腈溶液从5到40，4050MIN乙腈溶液从40到90。7权利要求1所述的鱼肉抗氧。
6、化活性肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤1、洗净鱼肉，用打浆机将鱼肉打成浆，得鱼肉浆；然后向鱼肉浆中加入1030倍鱼肉重量的水，在8090下水浴1520MIN，再用分散均质机在1000013000RPM下匀浆13MIN，得鱼肉浆液；2、用1MOL/L的NAOH或HCL调节步骤1所得的鱼肉浆液的PH为7080，并调节鱼肉浆液的温度为5060；然后按照碱性蛋白酶与鱼肉质量比为150200的比例加入碱性蛋白酶，搅拌，在5060下酶解0530H，再在95100下保温35MIN，冷却至室温；接着在40006000G下离心1015MIN，收集上清液；3、利用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜对步骤2所得的上清。
7、液进行超滤，收集滤液；再经过SEPHADEXG25凝胶分离，洗脱液为去离子水，流速为08ML/MIN，洗脱峰在280NM下进行检测，收集第2个洗脱峰；再用RPHPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以590乙腈溶液作为洗脱液，流速为15ML/MIN，得到含抗氧化活性肽的溶液；权利要求书CN104177477A2/2页34、将步骤3得到的含抗氧化活性肽的溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼肉抗氧化活性肽。8按照权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述的鱼是指鲢鱼、草鱼或鳕鱼。9按照权利要求7所述的制备方法，其特征在于其步骤2中所述的碱性蛋白酶是指ALCALASE24L。10权利要。
8、求1所述的鱼肉抗氧化活性肽作为添加剂在食品或化妆品上的应用。权利要求书CN104177477A1/5页4一种鱼肉抗氧化活性肽及其制备方法技术领域0001本发明属于水产食品加工领域，具体涉及一种以鱼肉为原料生产的鱼肉抗氧化活性肽，以及该鱼肉抗氧化活性肽的制备方法。背景技术0002蛋白质经过水解得到多肽，使得蛋白质的结构被改变，疏水区的活性官能基团暴露，随着肽键的裂解，游离氨基酸增加，从而可以提供质子或电子源，保持较高的氧化还原电位，使其具有清除活性自由基的能力，清除过氧化亚硝酸盐能力和抑制脂质过氧化作用的发生，从而抗氧化肽的抗氧化活性得以提高。氧化对需氧生物特别是脊椎动物和人类是一个重要的代谢过。
9、程，但是它却导致了自由基的形成。活性氧自由基ROS被认为能引起氧化应激。在食品体系中，脂类或蛋白质可能会受到ROS的攻击经历氧化过程，从而导致食品产生不愉快味道，颜色发暗或不良质地，同时也可能产生潜在的毒性终产物。抗氧化多肽的应用能防止食品成分由于捐献电子给活性氧自由基以及中和活性氧自由基的负面作用而变质。抗氧化肽在医学、化妆品、生物、食品领域有广泛的应用价值。0003有关抗氧化肽的国内外专利情况，国外专利方面如1欧洲专利EP1188767A1公开了一种来源于酪蛋白的抗氧化肽；2美国专利US8232243B2公开了含有色氨酸和酪氨酸的肽作为抗氧化的方法，这种抗氧化剂可以用于治疗和预防氧化过程带。
10、来的疾病和综合症。国内方面已有从酪蛋白、蛙类、马面鲀鱼头蛋白等中提取制备抗氧化肽的相关专利。如1专利CN103275180A公开了一种马面鲀鱼头蛋白抗氧化肽，该抗氧化肽的氨基酸序列为LEUSERHISGLYPROTYRLSHGPY；2专利CN103103242A公开了一种以蓝圆鲹鱼肉蛋白为原料制备的抗氧化活性肽，其氨基酸序列分别为HISASPHISPROVALCYS组氨酸天冬氨酸组氨酸脯氨酸缬氨酸半胱氨酸和HISGLULYSVALCYS组氨酸谷氨酸赖氨酸缬氨酸半胱氨酸；3专利CN103431158A公开了一种鸭肉蛋白源抗氧化肽。0004经检索，没有发现以鱼肉为原料，利用碱性蛋白酶制备氨基酸序列。
11、为ASNTRPASPASPMET的抗氧化肽的报道。发明内容0005本发明目的在于提供一种以鱼肉为原料制备的鱼肉抗氧化活性肽，该抗氧化活性肽具有较好的清除自由基作用。0006本发明另一目的在于提供上述鱼肉抗氧化活性肽的制备方法。0007本发明第三目的在于提供上述鱼肉抗氧化活性肽的用途。0008实现本发明的技术方案如下0009本发明一种鱼肉抗氧化活性肽，其所述的鱼肉抗氧化活性肽的氨基酸序列为ASNTRPASPASPMETSEQIDNO1。0010上述鱼肉抗氧化活性肽，所述的鱼肉抗氧化活性肽的分子量为679DA。说明书CN104177477A2/5页50011上述鱼肉抗氧化活性肽可以人工合成，也可以。
12、鱼肉为原料利用碱性蛋白酶制备。0012上述鱼肉抗氧化活性肽，按照如下方法制备00131、洗净鱼肉，用打浆机将鱼肉打成浆，得鱼肉浆；然后向鱼肉浆中加入1030倍鱼肉重量的水，在8090下保持1520MIN，再用分散均质机在1000013000RPM下匀浆13MIN，得鱼肉浆液；00142、用1MOL/L的NAOH或HCL调节步骤1所得的鱼肉浆液的PH为7080，并调节鱼肉浆液的温度为5060；然后按照碱性蛋白酶与鱼肉质量比为150200的比例加入碱性蛋白酶，搅拌，在5060下酶解0530H，再在95100下保温35MIN，冷却至室温；接着在40006000G下离心1015MIN，收集上清液；00。
13、153、利用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜对步骤2所得的上清液进行超滤，收集滤液；再经过SEPHADEXG25凝胶分离，洗脱液为去离子水，流速为08ML/MIN，洗脱峰在280NM下进行检测，收集第2个洗脱峰；再用RPHPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以590乙腈溶液体积比作为洗脱液，流速为15ML/MIN，得到含抗氧化活性肽的溶液；00164、将步骤3得到的含抗氧化活性肽的溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼肉抗氧化活性肽。0017上述鱼肉抗氧化活性肽中所述的鱼是指鲢鱼、草鱼或鳕鱼等。0018上述鱼肉抗氧化活性肽步骤2中所述的碱性蛋白酶是指ALCALASE24L。0019。
14、上述制备方法步骤3中所述的装SEPHADEXG25柱的规格为长100CM，直径26CM。0020上述鱼肉抗氧化活性肽步骤3中所述的590乙腈溶液是指05MIN乙腈溶液为5体积比，540MIN乙腈溶液从5到40体积比，4050MIN乙腈溶液从40到90体积比。0021上述鱼肉抗氧化活性肽步骤4中所述的鱼肉抗氧化活性肽中氨基酸序列为ASNTRPASPASPMETNWDDM的肽的含量大于80。0022上述鱼肉抗氧化活性肽的制备方法，包括如下步骤00231、洗净鱼肉，用打浆机将鱼肉打成浆，得鱼肉浆；然后向鱼肉浆中加入1030倍鱼肉重量的水，在8090下水浴1520MIN，再用分散均质机在1000013。
15、000RPM下匀浆13MIN，得鱼肉浆液；00242、用1MOL/L的NAOH或HCL调节步骤1所得的鱼肉浆液的PH为7080，并调节鱼肉浆液的温度为5060；然后按照碱性蛋白酶与鱼肉质量比为150200的比例加入碱性蛋白酶，搅拌，在5060下酶解0530H，再在95100下保温35MIN，冷却至室温；接着在40006000G下离心1015MIN，收集上清液；00253、利用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜对步骤2所得的上清液进行超滤，收集滤液；再经过SEPHADEXG25凝胶分离，洗脱液为去离子水，流速为08ML/MIN，洗脱峰在280NM下进行检测，收集第2个洗脱峰；再用RPHPLC反相高效液。
16、相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以590乙腈溶液体积比作为洗脱液，流速为15ML/MIN，得到含抗氧化活性肽的溶液；00264、将步骤3得到的含抗氧化活性肽的溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼肉抗说明书CN104177477A3/5页6氧化活性肽。0027上述制备方法中所述的鱼是指鲢鱼、草鱼或鳕鱼等。0028上述制备方法步骤2中所述的碱性蛋白酶是指ALCALASE24L。0029上述制备方法步骤3中所述的装SEPHADEXG25柱的规格为长100CM，直径26CM。0030上述制备方法步骤3中所述的590乙腈溶液是指05MIN乙腈溶液为5体积比，540MIN乙腈溶液从5到40体积比，4。
17、050MIN乙腈溶液从40到90体积比。0031上述鱼肉抗氧化活性肽作为添加剂在食品或化妆品上的应用。0032本发明具有的优点和有益效果1、本发明鱼肉抗氧化活性肽ASNTRPASPASPMET具有很好的抗氧化功能，其清除DPPH自由基能力可达90以上；2、本发明鱼肉抗氧化活性肽是以天然产物为原料、经过食品级碱性蛋白酶酶解获得的产物，将其作为食品、化妆品等添加剂安全，无毒；3、本发明鱼肉抗氧化活性肽制备方法简单，易实现产业化生产，有效地解决了目前抗氧化多肽难以实现产业化生产的问题。4、本发明开发的抗氧化肽，能广泛应用于功能食品。附图说明0033图1本发明鲢鱼鱼肉蛋白酶解产物超滤后组分SPP分子量。
18、3000的SEPHADEXG25凝胶过滤层析图谱；其中组分1是指分子量相对较大的肽，组分2是指分子量相对较小的肽。具体实施方式0034实施例1鲢鱼鱼肉抗氧化活性肽的制备0035按照如下方法进行00361、将鲢鱼鱼肉100克洗净，用打浆机将鱼肉打成浆,得鱼肉浆；然后向鱼肉浆中加入20倍鱼肉重量的水200克，在90中水浴20MIN，再用分散均质机在12000RPM下匀浆2MIN，得到鱼肉浆液300克。00372、用1MOL/L的NAOH或HCL调节步骤1鱼肉浆液的PH为80，温度调节为50，然后按照碱性蛋白酶与鱼肉质量比为1100的比例加入碱性蛋白酶ALCALASE24LNOVOZYMES1克，在。
19、50下酶解2小时，然后在95下保温3MIN，冷却至室温；再在5000G条件下离心15MIN，收集上清液。00383、利用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜对步骤2所得的上清液进行超滤，收集滤液，再经过SEPHADEXG25长100CM，直径26CM凝胶色谱分离，洗脱液为去离子水，流速为08ML/MIN，洗脱峰在280NM下进行测量，收集第2个洗脱峰见图1；再用RPHPLC反相高效液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是以590乙腈溶液体积比作为洗脱液，流速为1ML/MIN，得到高纯度的抗氧化活性肽溶液；00394、将步骤3得到的抗氧化活性肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼肉抗氧化活性肽。0040。
20、通过LCMS/MS对所得的鱼肉抗氧化活性肽的主要成分进行测定，该鱼肉抗氧化说明书CN104177477A4/5页7活性肽的氨基酸序列为ASNTRPASPASPMET，其分子量为679DA，该肽的含量为81。0041实施例2鲢鱼鱼肉抗氧化活性肽的制备0042按照如下方法进行00431、将鲢鱼鱼肉300克洗净，用打浆机将鱼肉打成浆，得鱼肉浆；然后向鱼肉浆中加入20倍鱼肉重量的水600克，在85中水浴20MIN，再用分散均质机在12000RPM下匀浆2MIN，得到鱼肉浆液900克。00442、用1MOL/L的NAOH或HCL调节步骤1鱼肉浆液的PH为70，温度调节为55，然后按照碱性蛋白酶与鱼肉质量。
21、比为1150加入碱性蛋白酶ALCALASE24L2克，在55下酶解1小时，然后在95下保温4MIN，冷却至室温；再在5000G条件下离心15MIN，收集上清液。00453、利用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜对步骤2所得的上清液进行超滤，收集滤液；再经过SEPHADEXG25长100CM，直径26CM凝胶色谱分离，洗脱液为去离子水，流速为08ML/MIN，洗脱峰在280NM下进行检测，收集第2个洗脱峰；再用RPHPLC反相高校液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是为590乙腈溶液体积比作为洗脱液，流速为1ML/MIN，得到高纯度的抗氧化活性肽溶液；00464将步骤3得到的抗氧化活性肽溶液通。
22、过浓缩、冷冻干燥，得鱼肉抗氧化活性肽。0047通过LCMS/MS对所得的鱼肉抗氧化活性肽的主要成分进行测定，该鱼肉抗氧化活性肽的氨基酸序列为ASNTRPASPASPMET，其分子量为679DA，该肽的含量为806。0048实施例3鲢鱼鱼肉抗氧化活性肽的制备0049按照如下方法进行00501、将鱼肉1000克洗净，用打浆机将鱼肉打成浆，得鱼肉浆；然后向鱼肉浆中加入20倍鱼肉重量的水2000克，在90中水浴15MIN，用分散均质机在12000RPM匀浆2MIN，得到鱼肉浆液3000克。00512、用1MOL/L的NAOH或HCL来调节调节步骤1鱼肉浆液的PH为80，温度调节为57，然后按照碱性蛋白。
23、酶与鱼肉质量比为1200加入碱性蛋白酶ALCALASE24L5克，在57下酶解2小时，然后在95下保温5MIN，冷却至室温；再在5000G条件下离心15MIN，收集上清液。00523、利用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜对步骤2所得的上清液进行超滤，收集滤液；再经过SEPHADEXG25长100CM，直径26CM凝胶色谱分离，洗脱液为去离子水，流速为08ML/MIN，洗脱峰在280NM下进行测量，收集第2个洗脱峰；再用RPHPLC反相高校液相色谱进行1次分离，反相HPLC的分离条件是为590乙腈溶液体积比作为洗脱液，流速为1ML/MIN，得到高纯度的抗氧化活性肽溶液。00534将步骤3得到的抗氧化。
24、活性肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到鱼肉抗氧化活性肽。0054通过LCMS/MS对所得的鱼肉抗氧化活性肽的主要成分进行测定，该鱼肉抗氧化活性肽的氨基酸序列为ASNTRPASPASPMET，其分子量为679DA，该肽的含量为809，。0055实施例4本发明鱼肉抗氧化活性肽的抗氧化活性的测定试验0056试验样品实施例1、实施例2、实施例3制备的鱼肉抗氧化活性肽；说明书CN104177477A5/5页80057人工合成肽ASNTRPASPASPMET委托GENSCRIPT生物公司合成0058试验方法00591清除DPPH自由基能力测定取20G/ML的抗氧化活性肽15ML，加入995乙醇15ML和002。
25、DPPH乙醇溶液0675ML混合，振荡混匀，室温下避光水浴30MIN，然后在517NM下检测体系吸光值。吸光值越低，体系的清除DPPH自由基能力越强。空白对照即是将样品溶液15ML换成去离子水15ML。0060DPPH自由基清除能力空白吸光值样品吸光值/空白吸光值10000612还原力测定取20G/ML的抗氧化活性肽1ML，加入02M磷酸缓冲液PH6625ML和1质量分数的铁氰化钾溶液25ML，混匀，然后在50水浴加热20MIN。取出迅速冷却，加入10质量分数三氯乙酸TCA溶液25ML，混合均匀，然后在3000G下离心10MIN。取上清液25ML，加入去离子水25ML和1质量分数三氯化铁溶液0。
26、5ML，充分混匀，在室温下反应10MIN，用700NM波长测定吸光度。还原力即可用700NM波长处吸光值表示。00623氧化自由基吸收能力ORAC测定不同浓度的抗氧化活性肽溶液20L与75MM磷酸盐缓冲液80LPH74及200NM的荧光试剂50L充分混合，然后在37温育15MIN，再加入80MM的AAPH溶液50L。用酶标仪每分钟读取荧光值共进行100MIN。荧光的激发波长和发射波长分别是485NM和538NM。用磷酸缓冲溶液代替样品作为空白。以TROLOX作为标准对照，使用的浓度为0，2，4，8，12，16M，绘制荧光淬灭曲线，并计算荧光淬灭曲线下的积分面积AUC。AUC的计算公式如下00630064其中F0是0MIN时荧光值，FI是第IMIN时的荧光值。0065ORAC值用样品曲线的斜率与TROLOX曲线的斜率之比，ORAC值得单位表示为MTROLOX/MG肽。0066结果见表1在20G/ML的条件下，本发明鱼肉抗氧化活性肽的清除DPPH自由基能力达到90以上，还原力达到087以上，其ORAC为16以上。说明本发明鱼肉抗氧化活性肽具有较好的抗氧化能力，是理想的抗氧化肽。0067表1本发明鱼肉抗氧化活性肽的抗氧化活性试验结果0068说明书CN104177477A1/1页90001序列表CN104177477A1/1页10图1说明书附图CN104177477A10。