淫羊藿苷PLGA纳米粒子及制备方法及用途
技术领域
本发明属于中药制药技术领域，特别是涉及一种淫羊藿苷PLGA纳米粒子及制备方法。
背景技术
淫羊藿苷是从中药淫羊藿中提取的有效活性成分，是一种黄酮苷类化合物，具有抗肿瘤，促进骨形成，抗骨质疏松，调节机体免疫等药理学活性。淫羊藿苷为水不溶性药物，能微溶于乙醇，乙酸乙酯,不溶于醚、苯、氯仿。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是生物相容性可降解高分子聚合物，常用于包载药物，以保护药物活性、缓慢释放药物延长药物作用时间，对于难溶性药物，可以提高其分散性。
PLGA包载药物的纳米粒制备常采用溶剂挥发法，将药物和PLGA溶于沸点较低的二氯甲烷等有机溶剂，通过挥发除去溶剂,但淫羊藿苷既不溶于水，也不溶于醚、苯、氯仿等易挥发性有机溶剂，故现有的溶剂挥发法不适用于制备淫羊藿苷PLGA纳米粒。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种纳米粒子粒径分布均匀，90％以上在100‐300nm之间的淫羊藿苷PLGA纳米粒子。
本发明的第二个目的是提供一种简便易行的淫羊藿苷PLGA纳米粒子的制备方法。
本发明的第二个目的是提供一种淫羊藿苷PLGA纳米粒子的用途。
本发明的技术方案概述如下：
淫羊藿苷PLGA纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
(1)以二甲基甲酰胺为溶剂配制浓度为0.005-0.02g/ml的淫羊藿苷溶液为溶液1；以二甲基甲酰胺为溶剂配制浓度为0.01-0.08g/ml的PLGA溶液为溶液2；
(2)在冰浴和超声下，按体积比为1-2:3的比例，将溶液1滴加入溶液2中得溶液3；
(3)在冰浴和超声下，按体积比为1:4-10的比例将溶液3滴加入浓度为10g/L-30g/L的PVA水溶液中,形成PLGA淫羊藿苷O/W乳剂；
(4)将PLGA淫羊藿苷O/W乳剂置于透析袋中，放入装有水的容器中，在转速20-50rpm透析6-10h；
(5)将透析袋中的液体在4℃离心，收集固化的纳米粒，冷冻干燥即得淫羊藿苷PLGA纳米粒子，所述PLGA为聚乳酸-羟基乙酸共聚物的缩写，所述PVA为聚乙烯醇的缩写。
超声的条件优选为：频率为20HZ,振幅为20％-35％。
离心的转速优选为20,000rpm，离心的时间为30min。
上述方法制备的淫羊藿苷PLGA纳米粒子。
上述淫羊藿苷PLGA纳米粒子在制备促进软骨细胞增殖药物的应用。
本发明的优点：
本方法使用的载药材料PLGA生物相容性好，颗粒小，均匀，溶解性好。本方法制得的淫羊藿苷PLGA纳米粒相比未包封的药物，在水中的分散性能显著提高，并缓慢释放淫羊藿 苷以延长作用时间。本发明中的制备方法使用的材料简单，方法易操作，重复性好。制备的纳米粒子粒径分布均匀，粒径在在100‐300nm之间。
附图说明
图1本发明的淫羊藿苷PLGA纳米粒子扫描电镜图。
图2本发明的淫羊藿苷PLGA纳米粒子的粒径图。
图3本发明的淫羊藿苷PLGA纳米粒子的Zeta电位图。
图4本发明的淫羊藿苷PLGA纳米粒子的体外累计释放曲线。
图5本发明的淫羊藿苷PLGA纳米粒子对软骨细胞增殖影响的实验。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
淫羊藿苷购于中国药品生物制品检定所，批号：110737-200415
实施例1
淫羊藿苷PLGA纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
(1)以二甲基甲酰胺为溶剂配制浓度为0.01g/ml的淫羊藿苷溶液为溶液1；以二甲基甲酰胺为溶剂配制浓度为0.05g/ml的PLGA溶液为溶液2；PLGA分子量为7600-11500Da；
(2)在冰浴和超声下，按体积比为1.5:3的比例，将溶液1滴加入溶液2中得溶液3；所述超声频率为20HZ,振幅为30％，超声时间10min,每超声30S间隔5S；
(3)在冰浴和超声下，按体积比为1:6的比例将溶液3滴加入浓度为10g/L的PVA水溶液中,形成PLGA淫羊藿苷O/W乳剂；PVA的分子量为30000-70000Da，所述超声频率20HZ,振幅为30％，超声时间15min，每超声30S间隔5S；
(4)将PLGA淫羊藿苷O/W乳剂置于透析袋[MD34(8000-14000D)]中，放入装有水的容器中，在转速30rpm磁力搅拌，透析8h；
(5)将透析袋中的液体在4℃，20,000rpm下超速离心30min,收集固化的纳米粒，用蒸馏水洗涤，在4℃，20,000rpm下超速离心30min,收集固化的纳米粒，冷冻干燥即得淫羊藿苷PLGA纳米粒子。所述PLGA为聚乳酸-羟基乙酸共聚物的缩写，所述PVA为聚乙烯醇的缩写。
实施例2
淫羊藿苷PLGA纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
(1)以二甲基甲酰胺为溶剂配制浓度为0.005g/ml的淫羊藿苷溶液为溶液1；以二甲基甲酰胺为溶剂配制浓度为0.01g/ml的PLGA溶液为溶液2；PLGA分子量为7600-11500Da；
(2)在冰浴和超声下，按体积比为1:3的比例，将溶液1滴加入溶液2中得溶液3；所述超声频率为20HZ,振幅为20％，超声时间15min,每超声30S间隔5S；
(3)在冰浴和超声下，按体积比为1:4的比例将溶液3滴加入浓度为15g/L的PVA水溶液中,形成PLGA淫羊藿苷O/W乳剂；PVA的分子量为30000-70000Da，所述超声频率20HZ,振幅为20％，超声时间15min，每超声30S间隔5S；
(4)将PLGA淫羊藿苷O/W乳剂置于透析袋[MD34(8000-14000D)]中，放入装有水的容器中，在转速20rpm磁力搅拌，透析10h；
(5)将透析袋中的液体在4℃，20,000rpm下超速离心30min,收集固化的纳米粒，用蒸馏水洗涤，在4℃，20,000rpm下超速离心30min,收集固化的纳米粒，冷冻干燥即得淫羊藿苷PLGA纳米粒子。
实施例3
淫羊藿苷PLGA纳米粒子的制备方法，包括如下步骤：
(1)以二甲基甲酰胺为溶剂配制浓度为0.02g/ml的淫羊藿苷溶液为溶液1；以二甲基甲酰胺为溶剂配制浓度为0.08g/ml的PLGA溶液为溶液2；PLGA分子量为7600-11500Da；
(2)在冰浴和超声下，按体积比为2:3的比例，将溶液1滴加入溶液2中得溶液3；所述超声频率为20HZ,振幅为35％，超声时间8min,每超声30S间隔5S；
(3)在冰浴和超声下，按体积比为1:10的比例将溶液3滴加入浓度为30g/L的PVA水溶液中,形成PLGA淫羊藿苷O/W乳剂；PVA的分子量为30000-70000Da所述超声频率20HZ,振幅为35％，超声时间10min，每超声30S间隔5S；
(4)将PLGA淫羊藿苷O/W乳剂置于透析袋[MD34(8000-14000D)]中，放入装有水的容器中，在转速50rpm磁力搅拌，透析6h；
(5)将透析袋中的液体在4℃，20,000rpm下超速离心30min,收集固化的纳米粒，用蒸馏水洗涤，在4℃，20,000rpm下超速离心30min,收集固化的纳米粒，冷冻干燥即得淫羊藿苷PLGA纳米粒子。
实施例4
淫羊藿苷PLGA纳米粒子体外表征：
(1)粒度分布：取实施例1制备的淫羊藿苷PLGA纳米粒子少许溶于水中，吸取1ml样品溶液，注入到纳米粒度和Zeta电位分析仪的石英测量池和毛细管小池中，测定样品的粒径和Zeta电位，见图1、2和图3。
(2)稳定性测试：将实施例1制备的淫羊藿苷PLGA纳米粒子少许溶于水中，分别于0天，7天，14天，30天取样，测定样品的粒径，多分散体系和Zeta电位,考察纳米粒的长期稳定性，见表1。
表1
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(3)缓释测定
用pH＝7.4的磷酸缓冲盐溶液(PBS)作为缓释介质，准确称取实施例1制备的淫羊藿苷PLGA纳米粒子10mg，分散在4mLPBS中，置于双向扩散池的一侧，另一侧加入4mlPBS。在100rpm震荡速度，37℃条件下进行纳米粒的体外释放速度测定，分别在2、4、8、24、48、72、120、168、216、264、336和408h，取单纯加PBS一侧的样4mL，同时补充4mL新鲜PBS。用高效 液相色谱检测释放液中游离淫羊藿苷浓度，计算不同时间点药物累积释放百分比，绘制累积释放曲线，见图4。
检测结果所示实施例1制备的淫羊藿苷PLGA纳米粒子粒较均一，得到的纳米粒的平均粒径在180nm左右，且在水中有较好的均一性稳定性，在pH＝7.4的PBS缓冲液中均具有一定的缓释能力。
实验证明，实施例2和实施例3制备的淫羊藿苷PLGA纳米粒子的粒较均一，得到的纳米粒的平均粒径和水中稳定性与实施例1的结果相似，在pH＝7.4的PBS缓冲液中均具有一定的缓释能力。
实施例5
细胞增殖实验
从兔关节软骨里提取软骨细胞，培养至第四代，按1*104接种于96孔板，待贴壁后吸出原培养基，分别加入含有空载纳米粒的培养基，含有淫羊藿苷(0.05％DMSO助溶)的培养基及实施例1制备的淫羊藿苷PLGA纳米粒子的培养基各200ul/孔。(培养基为DMEM培养基,含有10％FBS和1％双抗)
空载纳米粒组，淫羊藿苷组及淫羊藿苷PLGA纳米粒子组每组分别设三种终浓度，其中淫羊藿苷组和淫羊藿苷PLGA纳米粒子组根据含淫羊藿苷药量分别设10-4M，10-5M,10-6M三组，空载纳米粒的三组质量分别对应淫羊藿苷PLGA纳米粒子组的质量。对照组不加药，阴性空白组为培养基。置于37℃，5％CO2的培养箱中培养1，2，3，5，7，9d,MTT法测定细胞生长曲线。
检测结果如图5所示，本发明所示的空载纳米粒对细胞相容性较好，无毒性作用。本发明所示的三组不同浓度淫羊藿苷PLGA纳米粒子(在图中简称载药纳米)在9d，促进软骨细胞增殖率明显高于同浓度的淫羊藿苷组，且无细胞抑制作用。
实验证明，实施例2和实施例3制备的淫羊藿苷PLGA纳米粒子促进软骨细胞增殖率与实施例1相似。