基于白蛋白为载体材料的载姜黄素肝靶向纳米粒的制备.pdf

本发明公开了一种基于白蛋白为载体材料载姜黄素的肝靶向纳米粒的制备方法，属于医药领域。具体的说是通过共价结合制备了一种肝靶向纳米粒——甘草次酸修饰姜黄素白蛋白纳米粒。该载药纳米粒包括姜黄素、白蛋白和甘草次酸。该肝靶向纳米粒主要是由甘草次酸通过共价结合到载药白蛋白纳米粒表面构成。本发明制备的肝靶向纳米粒具有缓释的效果，可通过甘草次酸介导姜黄素白蛋白纳米粒靶向到肝细胞，降低药物的毒副作用，提高药物的疗效，制备工艺简单且生产成本低，具有广泛的应用前景。

1.  一种肝靶向的纳米粒——甘草次酸修饰姜黄素白蛋白纳米粒，其特征在于：该载药纳米粒包括姜黄素、白蛋白和甘草次酸。该肝靶向纳米粒主要是由甘草次酸的羧基与二环己基碳二亚胺(DCC)，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应制得甘草次酸活性酯，再与白蛋白表面的氨基反应得到。

2.  根据权利要求1所述，其特征在于：甘草次酸修饰姜黄素白蛋白纳米粒各组分配比关系如下：姜黄素和白蛋白的质量比为1∶1～40。

3.  根据权利要求1所述，其特征在于：白蛋白载体材料可以是人血清白蛋白，牛血清白蛋白，卵清蛋白或其他种类的白蛋白。

4.  根据权利要求1所述甘草次酸修饰姜黄素白蛋白纳米粒，其特征在于：所述肝靶向纳米粒的粒径50nm～500nm，载药量为5％～50％。

5.  根据权利要求1所述的一种甘草次酸修饰姜黄素白蛋白纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)：制备甘草次酸活性酯。
步骤(2)：采用去溶剂法制备载姜黄素白蛋白纳米粒。
步骤(3)：将步骤(1)中制备的甘草次酸活性酯溶于0.5mL的DMSO中以0.5-1mL/min的滴加到3.5mL步骤(2)中制备的姜黄素白蛋白纳米粒中，室温避光搅拌1h，再采用凝胶过滤法去除未反应完的原料和副产物，得到甘草次酸修饰姜黄素白蛋白纳米粒。

基于白蛋白为载体材料的载姜黄素肝靶向纳米粒的制备
【技术领域】
本发明属于医药领域，具体涉及一种基于白蛋白为载体材料载姜黄素的肝靶向纳米粒的制备方法
【背景技术】
原发性肝癌是我国常见的严重威胁着人类健康的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈上升趋势，所带来的经济负担及对社会发展的危害日益凸显。化疗仍然是目前临床上治疗肝癌的主要手段，但由于常规化疗药物不能选择性的运输到病灶部位而产生严重的毒副作用。随着肝靶向给药系统研究的不断发展，国内外对甘草中的有效成分甘草酸、甘草次酸的研究给予了广泛的关注，尤其是对甘草次酸的共价修饰和构效关系之间的研究。Negishi等已经证实肝细胞膜上存在大量甘草次酸特异性结位点，且该结合位点具有高度特异性和饱和性。近年来国内学者也对肝细胞膜上的甘草次酸特异结合位点进行了大量研究，甘草次酸作为肝靶向配体表现出一定的潜力，通过甘草次酸介导有望增加药物在肝脏分布，提高药物的肝靶向性，提高肝脏相关疾病的治疗效果。
基于白蛋白的纳米给药系统在医药领域引起了广泛的关注，主要是由于其具有低免疫原性，可生物降解和良好的生物相容性。目前中国专利CN103054810A公开了一种高包封率姜黄素白蛋白纳米药物组合物。中国专利CN102336802A公开了甘草次酸修饰脂质、肝靶向脂质体、胶束及复合物和制法。中国专利CN102512369A公开了甘草次酸固体脂质纳米粒及其制备方法。中国专利CN101254308公开了甘草次酸-聚乙二醇/壳聚糖肝靶向复合给药系统及制备方法。经过专利及文献查询，具有主动靶向给药系统的技术——甘草次酸修饰姜黄素白蛋白纳米粒未见报道。
【发明内容】
本发明所要解决的关键问题是制备一种具有肝靶向的纳米粒——甘草次酸修饰姜黄素白蛋白纳米粒，提供一种具有缓释作用，选择性地作用于肝细胞，减少药物毒副作用的主动肝靶向纳米给药系统的制备方法。
本发明的技术方案如下：
步骤1：将甘草次酸溶于20mL无水二甲基亚砜中，加入0.5mL的三乙胺，在搅拌的条件下分别加入0.94g N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)和0.52g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温避光搅拌24h，得到淡黄色的混悬液。过滤，除去反应中的副产物二环己基脲，再搅拌条件下加入无水乙醚以析出固体并真空干燥，得到淡黄色固体粉末。
步骤2：称取0.0095～0.0104g白蛋白粉末溶于1.0mL的超纯水中，另称取0.0035-0.0044g姜黄素6.0mL的无水乙醇，将药物的乙醇溶液以0.1～5.0mL/min的速度滴加到白蛋白水溶液中，加入50.0μL 0.5％戊二醛，搅拌固化4h，于35.0℃旋转蒸发除去乙醇，即得载药白蛋白纳米粒混悬液。
步骤3：将步骤(1)中制备的甘草次酸活性酯溶于0.5mL的DMSO中以0.5-1.0mL/min的滴加到3.5mL步骤(2)中制备的姜黄素白蛋白纳米粒中，室温避光搅拌1h。
附图说明：
图1甘草次酸修饰姜黄素白蛋白纳米粒的粒径分布图
图2甘草次酸修饰姜黄素白蛋白纳米粒的外观图
图3甘草次酸修饰姜黄素白蛋白纳米粒透射电镜
图4体外释放图
图5不同制剂作用24h的体外细胞毒性试验
具体实施方式：
以下通过实施例对本发明进一步详细说明：
实施例：
1.甘草次酸活性酯的制备
(a)称取1.0g甘草次酸于50mL圆底烧瓶中，向其中加入20.0mL无水二甲基亚砜中，在加入0.5mL的三乙胺，磁力搅拌溶解。
(b)在搅拌的条件下分别加入0.94g N，N’-二环己基碳二亚胺(DCC)和0.52g的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温避光搅拌24h，得到淡黄色的混悬液。过滤，除去反应中的副产物二环己基脲，再搅拌条件下加入无水乙醚以析出固体并真空干燥24h，得到淡黄色固体粉末。
2.姜黄素白蛋白纳米粒的制备
称取0.0095～0.0104g白蛋白粉末溶于1mL的超纯水中，另称取0.0035-0.0044g姜黄素于6mL的无水乙醇，将药物的乙醇溶液以0.1～5mL/min的速度滴加到白蛋白水溶液中，加入50.0μL 0.5％戊二醛，磁力搅拌固化4h，与35.0℃旋转蒸发除去乙醇，即得载药白蛋白纳米粒混悬液。
3.甘草次酸修饰姜黄素白蛋白纳米粒的制备：
将(1)中制备的甘草次酸活性酯溶于0.5mL的DMSO中，以0.5-1.0mL/min的滴加到3.5mL(2)中制备的姜黄素白蛋白纳米粒中，室温避光搅拌1h。采用凝胶色谱柱法(Sephadex G-50柱)分离甘草次酸修饰姜黄素白蛋白纳米粒和未偶联的甘草次酸。所得纳米粒的粒径分布，见图1；外观图，见图2；透射电镜照片，见图3。
4.体外释放行为的考察
本发明采用透析袋法，甘草次酸修饰姜黄素白蛋白纳米粒在PBS(pH7.4)中释药的特性，见图4。结果表明，甘草次酸修饰姜黄素白蛋白纳米粒的药物释放具有一定的缓释性。
5.MTT法检测甘草次酸修饰的姜黄素白蛋白纳米粒对人肝癌HepG2细胞的抑制作用
取对数期生长的HepG2细胞，弃去培养液，用0.25％胰蛋白酶消化1-2min，再用含血清的培养液终止消化，于1000rpm离心5min，弃去上清液，加入新鲜含血清的培养液，制成单细胞悬液，调整细胞密度至5×10³个/mL，轻轻吹匀后接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养24h后，分别加入含不同浓度的姜黄素原料药，姜黄素白蛋白纳米粒以及甘草次酸修饰姜黄素白蛋白纳米粒的培养液，每孔100μL，使药物终浓度分别为27.15，81.44，135.73μmol/L，其中以加细胞悬液，不加含药物的培养液为对照组，以不加细胞悬液，不加含药物的培养液为空白组。每组6个复孔，继续置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养24h，再每孔加入5mg/mL MTT液20μL于培养箱中继续培养4h，经滤纸吸去上清液，每孔加入150μL DMSO，振摇10min，待蓝紫色的甲瓒充分溶解混匀，用酶标仪于570nm处检测每孔的OD值。计算每组细胞存活率，见图5。结果表明，与姜黄素混悬液和姜黄素白蛋白纳米粒相比，甘草次酸修饰姜黄素白蛋白纳米粒作用的HepG2细胞存活率显著下降，并且具有浓度依赖性。说明白蛋白纳米粒表面修饰甘草次酸之后，在甘草次酸介导作用下，能更有效的将药物递送于人肝癌HepG2细胞内。