一种含有米力农化合物的药物组合物.pdf

一种含有米力农化合物的药物组合物
技术领域
本发明属于西药制剂技术领域，具体地说，涉及一种含有米力农化合物的药物组合物。
背景技术
米力农(Milirinone)的化学名是1，6-二氧-2-甲基-6-氧-(3，4'-双吡啶)-5-甲腈，其结构式如下，是吡啶联吡啶酮类化合物，在氨力农的基础上其中一个吡啶环上增加了甲基和氰基，是磷酸二酯酶抑制剂，为氨力农的同类药物，作用机理与氨力农相同，但其作用较氨力农强10～30倍，副作用少，耐受性较好。主要在肝代谢失活，80％以原形从尿中排出。

米力农有正性肌力作用和血管扩张作用。其正性肌力作用主要是通过抑制磷酸二酯酶抑制细胞内cAMP水解，提高cAMP水平，继而激活蛋白激酶，使更多钙通道开放，细胞内钙增加，心肌收缩力加强，心排血量增加，而与肾上腺素受体或心肌细胞中的Na⁺、K⁺-ATP酶无关，因而不增加耗氧量。在血管中，米力农直接作用于小动脉，使血管平滑肌细胞钙离子外流增加，引起血管松弛扩张，但对平均动脉压和心率无明显影响。米力农的心血管效应与剂量有关，小剂量时主要表现为正性肌力作用，当达到稳态的最大正性肌力效应的剂量时，其扩张血管作用随着剂量的增加加强。
另外，米力农能改善休克患者的血流动力学及全身的氧供、氧耗，尤其对急性心肌梗死诱发的心源性休克有一定疗效，但对休克症状严重的患者却无能为力。
蛋氨酸是构成人体的必需氨基酸之一，但其不能在体内自身生成，所以必须由外部获得。性心肌梗死往往伴随着心肌损伤，而蛋氨酸则具有心肌保护作用。
体内氧自由基造成的膜脂质过度氧化是导致机体多种损害的原因。脂质过氧化物会损害初级和次级溶酶体膜，使溶酶体内含有的作为水解的酸性磷酸酶释放出来，对细胞和线粒体膜等重要的细胞器造成损害，蛋氨酸能通过多种途径抗击这些损害。蛋氨酸是含硫必需氨基酸，为含硫α-氨基酸之一，通过使内源性磷脂合成增加，从而稳定了溶酶体膜，减 少了酸性磷酸酶的释放，保护了心肌细胞线粒体免受损害。
目前米力农基本以注射剂剂型应用于患者。米力农由赛诺菲-安万特公司研发，于1989年在欧洲和美国上市，其注射液处方为米力农、乳酸、葡萄糖和注射用水。
CN1679566A公开了一种米力农注射液及其制备方法，采用了乳酸作为助溶剂和pH调节剂。
CN101152180A公开了一种米力农注射液及其制备方法，其特征是它还含有醋酸、磷酸或硫酸中的一种，且调节注射液的pH值范围在2.8～3.5之间。
CN1739512A公开了一种高浓度米力农注射用冻干粉针剂及其制备方法。该冻干粉针剂含有以下组分：(a)2-10重量份米力农；(b)药学上可接受的酸性物质，酸性物质与米力农的重量比为0.25：1至1：0.25，并且所述的酸性物质选自：L-天冬氨酸、酒石酸、柠檬酸、谷氨酸、或其组合；(c)15-100重量份药学可接受的载体。所述的冻干粉针剂溶于水，可形成米力农浓度为2-10mg/ml的注射剂，从而可减小注射用药体积，并且稳定性更好，方便临床用药与药品的贮存和运输。
CN103655562A公开了一种新的治疗充血性心力衰竭的米力农药物组合物及其制备方法。该米力农注射液由米力农、盐酸半胱氨酸、依地酸钙钠、注射用水组成，本发明所提供的药物组合物具有稳定性高，制备工艺简单，临床使用方便，易于产业化实施。
CN1686126A公开了一种米力农冻干制剂，用于解决目前的米力农冻干制剂性质不稳定、在自然光照或强光照射下变色的技术问题。本发明的米力农冻干制剂，含有活性成分的米力农或其药物上可接受的盐和0.2％w/v至25％w/v的甘氨酸。本发明的有益效果是，由于在米力农的冻干制剂中加入适合浓度的甘氨酸，可防止冻干粉在自然光或强光下变色现象的发生，保证制剂良好的溶解度和稳定性，便于运输、贮存和使用。
“米力农注射液中有关物质研究”【张庆森，等.米力农注射液中有关物质研究[J]，中国药科大学学报，2014，45(6)：695-697】通过酸碱破坏性试验表明，米力农产生主要降解产物杂质A和杂质B，杂质A和杂质B的结构式如下。

同时“HPLC法测定米力农注射液有关物质”【张桂芳，等.HPLC法测定米力农注射液中有关物质[J]，药物分析杂质，2014，34(3)：457—460】通过对抽自全国10个省市的不 同批号(批号为100509、101002、101102、101208、110305、101207)的米力农注射液样品进行检验后发现各批号的米力农样品中均含有杂质A、杂质B以及其它杂质。有些批号中杂质A的含量是较多的。见下表1：
表1、不同批号样品的有关物质含量(％)

批号杂质A杂质B其他杂质1005090.0810.0120.1011010020.0750.0100.0831011020.0750.0070.0911012070.0570.0090.0831012080.0460.0070.0351103050.0430.0040.033
可见，现有技术的米力农注射液稳定性较差，容易发生降解，有关物质明显增加，杂质A和杂质B尤为明显。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种性质稳定、不易发生降解的含有米力农化合物的药物组合物，采用该组合物制得的米力农注射液性质稳定、不易发生降解、杂质A含量低，且在一定条件下存放一定时间杂质A、杂质B和其他杂质的含量无明显变化的米力农注射液。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种含有米力农化合物的药物组合物，其中，所述的药物组合物含有米力农、葡萄糖、蛋氨酸和乳酸。
其中，所述的蛋氨酸与米力农的质量之比为0.02～10:1，优选0.2～1.2:1，更优选0.5:1。
现有技术的米力农注射液稳定性较差，容易发生降解，结构确定的杂质A的含量较高。本发明人通过大量的试验，当组合物中含量一定量的蛋氨酸后可以明显地降低注射液中杂质A的含量。本发明人进一步通过蛋氨酸用量筛选试验，得出本发明中所述的蛋氨酸与米力农的质量之比为0.02～10:1，优选0.2～1.2:1，更优选0.5:1。
具体地说，所述的药物组合物包括如下组分：

优选，所述的药物组合物包括如下组分：

更优选，所述的药物组合物包括如下组分：

本发明所述的药物组合物可制备成药学上可接受的各种剂型。
所述的剂型为水针剂或冻干粉针剂，优选水针剂。
所述的水针剂为将本发明所述的药物组合物与注射用水制成水针剂。
其中，所述的注射用水的用量为10000重量份。
现有技术的米力农注射液稳定性较差，容易发生降解，有关物质明显增加，杂质A和杂质B尤为明显。本发明在进行了大量的试验后，惊喜地发现通过在处方中增加一定量的蛋氨酸后增加了注射液的稳定性，降低了降解反应的发生，且在一定条件下存放一定时间杂质A、杂质B和其他杂质的含量均无明显变化。
同时，通过试验发现，本发明所提供的米力农水针剂在治疗急、慢性顽固型充血性心力衰竭时，能够更有效地保护心肌。
本发明还提供上述水针剂的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：
1)称取处方量的20﹪注射用水加入到配料罐中，然后将已称好的处方量的无水葡萄糖和蛋氨酸加入到配料罐中搅拌使其完全溶解，得溶液A；
2)向溶液A中加入0.1％W/V的针用活性炭，搅拌吸附15分钟，再经过5μm钛棒和0.45μm过滤器脱炭，得溶液B；
3)向溶液B中再加入处方量的米力农，充分搅拌使溶解后，补加注射用水至全量，搅拌使混合均匀，得药液；
4)用乳酸调节药液pH值，使其控制在3.4～3.8，再经过滤除菌后高压灭菌，得所述的水针剂。
本发明的水针剂含有米力农、葡萄糖、蛋氨酸、乳酸和注射用水，使用乳酸调节pH值至3.0～3.8之间，能够保证配置和存储过程的pH值稳定。葡萄糖的作用是作为渗透压调节剂，用于调节注射液的渗透压至285～310mOsmol/kg。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明所提供的含有米力农化合物的药物组合物性质稳定，不易发生降解，采用该组合物制得的米力农水针剂性质稳定、不易发生降解、在一定条件下存放一定时间杂质A、杂质B和其他杂质的含量无明显变化；
(2)本发明所提供的米力农水针剂在治疗急、慢性顽固型充血性心力衰竭时，能够更有效地保护心肌。
附图说明
图1为对照组大鼠心肌组织的HE染色图片；
图2为假手术组大鼠心肌组织的HE染色图片；
图3为模型组大鼠心肌组织的HE染色图片；
图4为对比例组大鼠心肌组织的HE染色图片；
图5为实施例1组大鼠心肌组织的HE染色图片；
图6为实施例2组大鼠心肌组织的HE染色图片；
图7为实施例3组大鼠心肌组织的HE染色图片。
具体实施方式
以下为本发明的具体实施方式，所述的实施例是为了进一步描述本发明，而不是限制本发明。
对比例、不含蛋氨酸的米力农注射液
处方：

制备方法：
1)称取2升注射用水加入到配料罐中，然后再把已称好的无水葡萄糖470g加入到配料罐中搅拌使其完全溶解，得溶液A；
2)向溶液A中加入0.1％(W/V)的针用活性炭，搅拌吸附15分钟，再经过5μm钛棒和0.45μm过滤器脱炭，得溶液B；
3)向溶液B中再加入处方量的米力农，充分搅拌使溶解后，补加注射用水至全量，搅拌使混合均匀，得药液；
4)用乳酸调节药液pH值，使其控制在3.4～3.8；取样，中间体检测合格后，用真空 泵将药液打入灌封间；将药液经二级0.2μm过滤器除菌过滤到已灭菌贮液罐中，灌装，121℃灭菌30分钟，得所述的注射液。
实施例1、本发明的米力农水针剂
处方：

制备方法：
1)称取2升注射用水加入到配料罐中，然后再把已称好的无水葡萄糖470g、蛋氨酸1g加入到配料罐中搅拌使其完全溶解，得溶液A；
2)向溶液A中加入0.1％(W/V)的针用活性炭，搅拌吸附15分钟，再经过5μm钛棒和0.45μm过滤器脱炭，得溶液B；
3)向溶液B中再加入处方量的米力农，充分搅拌使溶解后，补加注射用水至全量，搅拌使混合均匀，得药液；
4)用乳酸调节药液pH值，使其控制在3.4～3.8；取样，中间体检测合格后，用真空泵将药液打入灌封间；将药液经二级0.2μm过滤器除菌过滤到已灭菌贮液罐中，灌装，121℃灭菌30分钟，得所述的米力农水针剂。
实施例2、本发明的米力农水针剂
处方：

制备方法：同实施例1。
实施例3、本发明的米力农水针剂
处方：

制备方法：同实施例1。
实施例4、本发明的米力农水针剂
处方：

制备方法：同实施例1。
实施例5、本发明的米力农水针剂
处方：

制备方法：同实施例1。
实施例6、本发明的米力农水针剂
处方：


制备方法：同实施例1。
实施例7、本发明的米力农水针剂
处方：

制备方法：同实施例1。
实施例8、本发明的米力农冻干粉针剂
处方：

制备方法：
1)称取2升注射用水加入到配料罐中，然后再把已称好的无水葡萄糖470g、蛋氨酸1g加入到配料罐中搅拌使其完全溶解，得溶液A；
2)向溶液A中加入0.1％(W/V)的针用活性炭，搅拌吸附15分钟，再经过5μm钛棒和0.45μm过滤器脱炭，得溶液B；
3)向溶液B中再加入处方量的米力农，充分搅拌使溶解后，补加注射用水至全量，搅拌使混合均匀，得药液；
4)用乳酸调节药液pH值，使其控制在3.4～3.8；取样，中间体检测合格后，用真空泵将药液打入灌封间，灌装，冷冻干燥，得所述的米力农冻干粉针剂。
试验例1、不同蛋氨酸用量对米力农注射液中杂质A的影响
本试验例考察了不同蛋氨酸用量对米力农注射液中杂质A的影响。
处方：

制备方法：同实施例1。
将制得的米力农水针剂按照“HPLC法测定米力农注射液有关物质”【张桂芳，等.HPLC法测定米力农注射液中有关物质[J]，药物分析杂质，2014，34(3)：457—460】中的方法测定各样品中杂质A的含量。结果见表2：
表2、不同蛋氨酸用量对各样品中杂质A的含量影响
蛋氨酸用量(g)杂质A(％)00.0850.20.0250.50.02310.02120.01550.007100.011120.014150.020200.022400.023600.024800.0251000.0271050.0811100.082
从上述实验结果可以看出，不同蛋氨酸用量对各样品中杂质A的含量具有一定的影响， 当样品中不含蛋氨酸时，杂质A的含量较高，随着蛋氨酸用量的增加，杂质A的含量呈现降低的趋势，而当蛋氨酸的用量为5g(即蛋氨酸与米力农的质量比为0.5:1)时，所得米力农水针剂样品中杂质A的含量最小，随后随着蛋氨酸用量的增加，其米力农水针剂样品中杂质A的含量出现增加的趋势。当蛋氨酸的用量增加到105g时，样品中杂质A的含量和未加蛋氨酸的相当。因此，本发明人确定本发明中蛋氨酸与米力农的质量之比为0.02～10:1，优选0.2～1.2：1，更优选0.5:1。
试验例2、米力农注射液中有关物质的含量测定
本试验例对对比例和本发明实施例的米力农注射液中有关物质的含量进行了测定。
试验方法：将各样品置放于相对湿度为75％、温度为40℃的环境中，分别于第0月、1月、2月、3月时取样，按照“HPLC法测定米力农注射液有关物质”【张桂芳，等.HPLC法测定米力农注射液中有关物质[J]，药物分析杂质，2014，34(3)：457—460】中的方法测定各样品中有关物质的含量。结果见表3：
表3、米力农注射液中的有关物质含量(％)

从上述试验结果可以看出，与对比例的米力农注射液相比，本发明的米力农注射液中 杂质A、杂质B及其它杂质的含量明显降低，且长时间放置杂质A、杂质B及其它杂质的含量增加不明显，几乎无变化。
对本发明其它实施例的米力农制剂也进行了上述试验，其获得的结果相似。
试验例3、米力农组合物对大鼠脓毒症模型的影响
心肌损伤是脓毒症病死率显著增加的重要原因，约占30％～80％。米力农因其正性肌力及扩张血管的作用广泛用于治疗临床各类病因所导致的急慢性心衰，实验中采用复制脓毒症模型，观察脓毒症大鼠血清心肌肌钙蛋白I(cTnI)，心肌同工酶CK-MB、E-选择素(E-selecting)的改变及米力农组合物对脓毒症大鼠早期血管内皮细胞及心肌细胞的保护作用。
1、试验动物分组及脓毒症模型制备
试验动物：日龄70～90d的雄性Wistar健康大鼠70只，体重300±100g，随机抽取分组，每组10只，共7组。
制模方法：大鼠实验前禁食12小时，自由饮水。10％水合氯醛腹腔注射麻醉，固定，沿中下腹正中线切口2cm，暴露腹腔脏器，探查并将盲肠提出，7号丝线距盲肠根部1.5cm，血管弓内结扎盲肠，采用盲肠结扎穿孔术(CLP)复制脓毒症模型；正常对照组不做处理。
分组情况：A组(正常对照组)；B组(假手术组)；C组(模型组)；D(对比例组)；E组(模型组实施例1)；F组(模型组实施例2)；G组(模型组实施例3)。
2、给药方法
假手术组及脓毒症模型组于制模后经尾静脉注射4ml生理盐水，12h后重复给药。A组(正常对照组，未制模老鼠不给药)；B组(假手术组，生理盐水给药)；C组(按照模型组，制模老鼠不给药)；D组(制模老鼠，对比例处方给药)；E组(按照模型组实施例1处方给药)；F组(按照模型组实施例2处方给药)；G组(按照模型组实施例3处方给药)。
3、检测指标及方法
制模后24h经腹部主动脉采血3ml，离心后取上清液液氮中保存(-70℃)。取血后处死大鼠，取左心室心尖部心肌组织分别用多聚甲醛水溶液和戊二醛固定，液氮中保存。采用同相夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测TNF-α(试剂盒由上海信然生物技术有限公司)；用放射免疫法测定ET-1(试剂盒购自上海研域化学试剂有限公司)；一氧化氮化学性质活泼，在体内代谢成NO₃^—，利用硝酸还原酶特异性将NO₃^—转化为NO₂^—，通过显示深浅测定其浓度的高低(化学检测试剂盒由南京生物技术有限公司)；大鼠血清选择素检测采用双抗体夹心酶标免疫分析法(试剂盒USCNLIFE武汉华美生物工程有限公司)；采用ELISA法测定血清CK-MB及cTnI浓度(试剂盒美国雅培公司)。
正常对照组与假手术组血清检测CK-MB、cTnI、NO、ET-1、E-选择素水平较正常对照 组及假手术组均明显升高(均P<0.01)；米力农组合物对比例、实施例1、2、3组均在血清检测CK-MB、cTnI、NO、ET-1、E-选择素浓度和模型组比较，发现对比例组、实施例1组在24小时无明显差异(均P>0.01)，米力农组合物实施例2、3组在24小时结果具有统计学上的差异(均P<0.01)。
表4、大鼠血清CK-MB的水平比较(mg/ml)
分组6h12h24h对照组247.59±17.64247.59±17.64247.59±17.64假手术组366.85±23.09381.54±20.96390.22±21.81模型组1609.33±462.35*1436.27±359.65*1127.46±347.28*对比例组1496.54±511.241123.47±329.47*777.45±96.74*实施例1组1334.66±497.25984.95±87.56*742.54±67.58*实施例2组1128.70±54.27*^△789.60±49.55*^△585.47±52.15*^△实施例3组1131.25±62.54*^△742.22±51.27*^△570.14±50.27*^△
与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，△P<0.01。
表5、大鼠血清cTnI的水平比较(ng/ml)
分组6h12h24h对照组0.316±0.0190.316±0.0190.316±0.019假手术组1.895±0.0242.052±0.0282.093±0.024模型组12.672±0.817*11.279±0.633*10.735±0.684*对比例组10.358±0.7765.373±0.673*5.094±0.612*实施例1组7.485±0.6255.713±0.405*4.854±0.358*实施例2组5.912±0.399*^△4.830±0.342*^△4.329±0.303*^△实施例3组6.147±0.412*^△4.861±0.327*^△4.294±0.287*^△
与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，△P<0.01。
表6、大鼠血清NO的水平比较(μg/ml)
分组6h12h24h对照组65.32±2.6965.32±2.6965.32±2.69假手术组72.63±2.5479.60±3.7282.16±2.82模型组146.02±8.72*135.94±7.89*130.67±7.31*对比例组105.48±8.80*93.27±7.56*88.61±7.17*实施例1组95.42±8.13*83.61±7.14*78.52±7.00*实施例2组76.34±6.39^△70.91±5.78^△67.05±5.96^△实施例3组78.61±6.49^△71.28±5.85^△69.70±5.24^△
与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，△P<0.01。
表7、大鼠血清ET-1的水平比较(pg/ml)
分组6h12h24h对照组57.52±1.8757.52±1.8757.52±1.87假手术组52.47±1.7459.86±1.6362.34±2.00模型组160.21±6.93*155.64±5.79*153.08±5.83*对比例组127.24±6.80*114.27±5.43*93.61±5.68*实施例1组112.76±5.22*104.87±4.94*94.31±4.30*实施例2组98.48±6.72*^△91.91±6.39*^△85.05±5.83*^△实施例3组96.31±6.40*^△90.28±6.22*^△84.42±5.64*^△
与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，△P<0.01。
表8、大鼠血清E-选择数的水平比较(ng/ml)
分组6h12h24h对照组0.064±0.0190.064±0.0190.064±0.019假手术组0.289±0.0160.316±0.0190.328±0.020模型组6.410±0.772*6.123±0.742*5.892±0.613*对比例组5.082±0.703*4.441±0.639*3.120±0.645*实施例1组4.763±0.730*3.308±0.692*3.074±0.668*实施例2组3.274±0.584*^△2.807±0.562*^△2.615±0.523*^△实施例3组3.318±0.613*^△2.803±0.590*^△2.422±0.604*^△
与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，△P<0.01。
正常组及假手术组心肌组织TNF-α、ET-1、NO水平差异无统计学意义。模型组心肌组织TNF-α、ET-1、NO水平较正常对照组及假手术组明显升高(P<0.01)，米力农组合物对比例组、实施例1、2、3组心肌组织均在TNF-α、ET-1、NO和模型组比较，发现对比例、实施例1组在24小时无明显差异(均P>0.01)，米力农组合物实施例2、3组在24小时结果具有统计学上的差异(均P<0.01)。
表9、大鼠心肌匀浆TNF-α的水平比较(pg/g)
分组6h12h24h对照组267.58±43.21267.58±43.21267.58±43.21假手术组319.40±58.79348.14±62.73356.72±66.91模型组1343.53±124.32*1120.71±103.60*1032.64±89.67*对比例组1089.69±118.03*956.00±97.32*863.42±82.03*实施例1组1009.47±100.74*942.95±87.43*772.61±70.29*实施例2组884.21±72.33*^△625.49±57.06*^△529.84±48.52*^△实施例3组865.72±69.40*^△594.01±56.32*^△503.93±47.04*^△
与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，△P<0.01。
表10、大鼠心肌匀浆NO的水平比较(μg/g)
分组6h12h24h对照组31.47±1.3631.47±1.3631.47±1.36假手术组34.19±1.5435.67±1.7337.28±1.79模型组132.62±11.09*125.41±9.51*116.03±8.14*对比例组106.23±10.03*94.70±9.32*92.65±7.49*实施例1组108.30±7.70*94.16±7.43*89.71±6.57*实施例2组87.39±6.44*^△75.03±5.76*^△69.50±5.37*^△实施例3组85.72±6.78*^△72.82±6.04*^△63.06±5.48*^△
与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，△P<0.01。
表11、大鼠心肌匀浆ET-1的水平比较(ng/g)
分组6h12h24h对照组1.68±0.121.68±0.121.68±0.12假手术组1.79±0.121.88±0.151.94±0.l8模型组21.47±0.59*19.14±0.54*17.27±0.47*对比例组19.23±0.66*18.72±0.52*16.85±0.58*实施例1组19.03±0.57*17.67±0.53*15.71±0.52*实施例2组13.60±0.50*^△11.12±0.42*^△9.82±0.39*^△实施例3组13.69±0.48*^△12.99±0.41*^△9.53±0.37*^△
与对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，△P<0.01。
从上述试验结果可以看出，对比例组、实施例1、2、3组均具有心肌保护作用，而处方中加入了蛋氨酸的实施例1、2、3组则加强了这种保护作用。
制模后24小时后，取血后处死大鼠，取左心室心尖部心肌组织分别用多聚甲醛水溶液和戊二醛固定，苏木精-伊红(HE)染色光镜观察醋酸铀-枸盐酸铅双染行电镜观察心肌组织病理学改变。正常对照组和假手术组大鼠心肌细胞排列整齐，核居中，无明显肿胀、变性、坏死、心肌横纹清晰，未见心肌纤维断裂，炎症细胞浸润。24小时的模型组可见心肌细胞肿胀、空泡变性、炎症细胞浸润明显，核膜破裂和细胞核肿胀明显。米力农对比例组心肌病变较模型组无明显减轻；实施例1、2、3组一次较模型组心肌病变减轻，心肌肿胀逐步变轻，肌丝结构排列开始变得规则，线粒体的肿胀到实施例3组相比模型组几乎无明显差异，但四个组中均出现不同程度的线粒体空泡化。图1至图7为各组大鼠心肌组织的HE染色图片。
对本发明其它实施例的米力农制剂也进行了上述试验，其获得的结果相似。