一种抗疲劳铁肽的制备方法
技术领域
本发明涉及一种抗疲劳铁肽的制备方法。
背景技术
疲劳是机体复杂的生理生化变化过程，也是目前存在的一个普遍性的社会问题，现代社会激烈竞争给人们带来的巨大生存压力，以及现代人生活作息越来越不规律都会极易让人产生疲劳感。因此，研发抗疲劳产品具有重大意义。
海洋类蛋白水解物的研究可追溯到20世纪40年代。Kristinsson等研究了从鲑幽门提取得到的混合酶和四种商品酶制剂对大西洋鳕鱼肌肉蛋白质的酶解[Kristinsson H G,Rasco B A.Fish protein hydrolysates:production,biochemical,and functional properties[J].CRC Crit Rev Food Sci Nutr,2000,40:43-81]；Liaset等研究了几种商品蛋白酶制剂对生产鱼片产生的碎肉的酶法水解与利用[Liaset B,Lied E,Espe M.Enzymatic hydrolysis of by-products from the fish-filleting industry:chemical characterisation and nutritional evaluation[J].J Sci Food Agric,2000,80:581-589.]。20世纪80年代末水解物的生物活性方面研究逐渐兴起，如邓尚贵等则采用复合酶水解法对青鳞鱼蛋白水解物的抗贫血活性进行研究[Deng S G,Peng Z Y,Chen F et al,2004.Amino acids composition and anti-anaemia action of hydrolyzed offal protein from Harengμla zunasi Bleeker.Food Chemistry,87(1):97—102.]；施佳慧等以鲐鲅鱼为原料，发现其水解产物对小鼠有一定的抗疲劳效果[施佳慧,朱加进,陈文聪等.鲐鲅鱼水解产物抗疲劳作用效果研究[J].中国食品学报,2010,10(6):77～79.]；方富永等利用三酶水解工艺酶解长牡蛎肉，研究其酶解肽对昆明种小鼠的抗疲劳作用[方永富,苗艳丽,劳秋燕等.长牡蛎肉三酶水解工艺优化及水解物抗疲劳试验[J].中国药学杂志,2011,46(8):579～584.]。
现代生物代谢研究发现，蛋白经消化酶水解后，并不都是被水解成氨基酸形式被吸收，更多则是以肽的形式吸收，水解肽-金属配合物是由可溶性金属离子同多肽按一定摩尔比结合而成的有机元素螯合物，具有稳定性高、吸收快、适口性好、生物效价高的特点。因此，有效利用鱼糜酶解产物进行亚铁螯合修饰，制备具有抗疲劳及抗贫血的功能性食品，可为实现海洋资源的综合利用、提高其附加值开辟新的途径，为开发海洋类 蛋白抗疲劳产品提供理论依据。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种抗疲劳铁肽的制备方法，以海洋鱼糜作为原料，将鱼糜酶解产物进行亚铁螯合修饰，具有操作简单、成本低的特点，制得的抗疲劳铁肽具有天然、无毒、无污染、高效抗疲劳等优点。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种抗疲劳铁肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)取一定量鱼糜按1:9～11的料液比溶于去离子水中，用搅拌机打成匀浆，并将混合浆液pH调至6～7，在40～50℃下保温8～12min；
2)根据鱼糜质量，按19000～21000IU/g比例加入木瓜蛋白酶，搅拌均匀，控制pH在6～7之间，在40～50℃下持续酶解6～10h，然后灭酶，冷却至室温后用滤纸以及微孔滤膜过滤，得到酶解液；
3)调节酶解液pH为6.5～7.5，按照鱼糜质量的0.09～0.11％加入抗坏血酸，放入28～32℃恒温水浴震荡锅静置10～15min，按浓度为0.9～1.1mol/L的FeCl2溶液与酶解液1:40～60的体积比加入FeCl2溶液，震荡20～40min后真空浓缩，冷冻干燥，得到所需的粉状多肽亚铁螯合物Fe-FPH。
作为优选，所述步骤1)的鱼糜采用带鱼鱼糜。
作为改进，所述步骤1)的pH调节是采用0.9～1.1mol/L HCl溶液和0.9～1.1mol/L NaOH溶液进行调节的。
作为优选，所述步骤2)的木瓜蛋白酶的酶活力20000IU/g。
作为改进，所述步骤2)的酶解过程中pH值的控制是每隔1～2h用0.9～1.1mol/L HCl溶液和0.9～1.1mol/L NaOH溶液进行调节。
再改进，所述步骤2)的灭酶是在酶解完成后将酶解液在85～95℃、10～20min进行钝化灭酶。
再改进，所述步骤2)的微孔滤膜过滤分别采用0.45mm、0.22mm的微孔滤膜进行二次过滤。
进一步改进，所述步骤3)的真空浓缩的温度为40-50℃，时间3.5-4h，冷冻干燥的温度为-40～-50℃，时间为18-20h。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明以带鱼鱼糜为原料，通过蛋白酶酶解、 亚铁螯合修饰得到多肽亚铁螯合物，具有操作方便、分离提取率高，成本低的特点，制得的多肽亚铁螯合物经实验证明本发明可有效增加了贫血大鼠全血、肌肉中SOD活力和肝脏中GSH-Px活力，显著降低全血、肝脏和肌肉中MDA含量以及血乳酸含量，具有显著的抗疲劳效果，而且属于天然提取物，具有天然、无毒、无污染的特点，使用安全可靠，同时本发明也为开发海洋类蛋白抗疲劳产品提供理论依据。
附图说明
图1是本发明制备的Fe-FPH的热变性温度；
图2是本发明制备的Fe-FPH的红外光谱图；
图3是带鱼多肽的红外光谱图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
一种抗疲劳铁肽的制备方法，具体步骤如下：
一、材料及处理
带鱼鱼糜，由浙江兴业有限公司提供。用锯子将冷冻鱼糜分装成100～200g/袋，置于-20℃冰箱中保存，使用前一晚放至4℃冷藏室中缓慢解冻。
二、试剂
木瓜蛋白酶(papain，酶活力20000IU/g)，购自上海金穗生物科技有限公司；氯化亚铁(食品级)、抗坏血酸、氢氧化钠等分析纯试剂，均购自国药集团药业股份有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒，丙二醛(MDA)检测试剂盒，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)检测试剂盒，乳酸检测试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所。
三、仪器与设备
PHS-3C PH计，上海兰科仪器有限公司；HWS-12电热恒温水浴锅，上海齐欣科学仪器有限公司；SHAB恒温水浴振荡器，常州国华有限公司；FD-1000冷冻干燥机，日本；N-1000旋转蒸发仪，日本EYELA；Spectra Plus 384全波长酶标仪，美国MD；KX-21全自动血细胞分析仪,日本SYSMEX；DSC 200F3差式量热扫描仪，NETZSCH；AA-6200型原子吸收分光光度计，日本岛津；傅立叶红外光谱仪，美国Nicolet。
四、Fe-FPH的制备
取一定量的过夜缓慢解冻好的鱼糜，料液比按1:10溶于去离子水中，用搅拌机打成匀浆，以1mol/L HCl溶液和1mol/L NaOH溶液将混合浆液pH调至6.5，45℃下保温10min。根据鱼糜质量，按20000IU/g比例加入木瓜蛋白酶，搅拌均匀，在45℃下持续 酶解8h。酶解过程中每隔2h用1mol/L HCl溶液和1mol/L NaOH溶液控制pH在6.5左右。酶解完成后，酶解液90℃、15min进行钝化灭酶，冷却至室温，用滤纸以及0.45μm、0.22μm的微孔滤膜过滤，使得酶解液澄清透亮，放入4℃冰箱备用。
采用FeCl2为亚铁盐，配置成1mol/L溶液。调节酶解液pH为7，按照鱼糜质量的0.1％加入抗坏血酸，放入30℃恒温水浴震荡锅静置10～15min，再按1(FeCl2溶液):50(酶解液)(V：V)把FeCl2溶液加入到酶解液中，震荡30min后真空浓缩，真空浓缩的温度为40-50℃，时间3.5-4h，冷冻干燥得到粉状Fe-FPH，冷冻干燥的温度为-40～-50℃，时间为18-20h。
下面通过实验对本发明制备的Fe-FPH的铁含量、溶解度等进行测定，并进行抗疲劳性能试验：
一、Fe-FPH铁含量的测定采用火焰原子吸收法，样品测定重复3次。
二、Fe-FPH在不同pH条件下的溶解度通常用氮溶解指数(NSI)来评价[杨国燕,陈栋梁,刘莉等.菜籽分离蛋白及菜籽蛋白肽的功能特性研究[J].食品科学,2007,28(01):76～78.]。在室温下，取0.2gFe-FPH粉末，溶于5mL不同PH(3、4、5、6、7、8、9)的水溶液中，搅拌至充分溶解。溶液pH用1mol/L HCl和NaOH预先调节好。在12000r/min、4℃条件下离心15min。取上清液1mL，稀释5倍，用双缩脲方法测上清液的蛋白含量，凯式定氮法测定样品总氮。
氮溶解指数(NSI)％＝(上清液含氮量/样品总氮)×100
三、Fe-FPH差示扫描量热仪(DSC)测定
精确称取试样5～10mg置于银质坩埚内，盖上锅盖，用密封压机密封。依次用镊子取下炉盖和两个内盖，用镊子将盛放样品的坩埚放在右侧热流传感器的中心位置，空白坩埚放在左侧热流传感器的中心位置，再依次盖上两个盖子。设置升温速率为10℃/min，终止温度为120℃，液氮为冷却介质。
四、Fe-FPH红外光谱扫描
取Fe-FPH粉末2mg，放入玛瑙研钵中，放入干燥的光谱纯KBr200mg，混合研磨均匀(在红外灯下进行)，使其粒度在2.5μm以下，装入压片模具，抽气加压，压力约为60MPa，维持3～5min，卸掉压力则可得一透明KBr样品片，利用红外分光光度计进行定性分析，得到光谱。
五、动物抗疲劳实验
1、动物分组
新生刚断奶Wistar大鼠20只，雌雄各半，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。 平均分为两组，A组为空白对照组，B组为试验组，每组雌雄各半。两组均喂养缺铁饲料和去离子水，造模时间为2个月。当大鼠Hb含量达到中度贫血(Hb<90g/L)时即为贫血造模成功。
2、疲劳造模及给药
造模成功后，A组每天进行30min游泳训练，B组每天Fe-FPH 40mg/(100g×bw)灌胃3小时后进行30min游泳训练(灌胃剂量根据Fe-FPH铁含量以及正常大鼠每日铁摄入量2.4mg/(100g×bw)计算[马娟.不同剂量铁补充对缺铁性贫血大鼠的疗效及副作用观察[D].第二军医大学,2013.]。干粉先用蒸馏水溶解、浓缩后灌胃)，两组均继续喂养缺铁饲料和去离子水。
3、大鼠力竭游泳时间测定
A、B组连续游泳20d后，第21d进行力竭性游泳。将大鼠放入水温(25±1)℃、深35cm的水槽内，待大鼠头部没入水面以下6s不再上浮为力竭终点，记录游泳时间。
4、生化指标检测
力竭大鼠休息30min后，断头取血，肝素抗凝，取大鼠后肢肌肉和肝脏，冰生理盐水浴下制备匀浆，根据试剂盒说明，测定全血、肝组织、肌组织SOD活力和MDA含量，肝组织GSH-Px活力和血乳酸指数。
5、数据处理采用t检验判定显著性。实验结果均以各组均数±标准差表示。
六、实验结果与讨论
1、Fe-FPH溶解度
由表1可知，Fe-FPH在pH5时溶解度最高，达到69.91％，之后随着pH值越大，溶解度越低。pH 8、9时，其溶解度已降至60％以下，而在pH3～6，溶解性均为60％以上，说明碱性条件下的溶解度比酸性条件来得低，这可能跟物质本身的等电点有关。
表1 Fe-FPH在不同pH条件下的溶解性
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2、Fe-FPH热变性温度
差式扫描量热仪(DSC)通过测量样品与对照区域的热流，来提供热迁移方面的信息。热变性曲线的最大迁移点(吸热峰)即样品的热变性温度[张虹,卓素珍,戴志远.鮟鱇鱼皮中胶原蛋白的提取及性质研究[J].中国食品学报,9(6):34～40.]。由图1可知，Fe-FPH的热变性温度为62.4℃，属于蛋白质类物质正常变性温度范围。大鼠体温(36.5±0.5)℃，因此Fe-FPH进入大鼠体内时其空间结构不会发生变化，能保持原有药性。
3、Fe-FPH结构分析
图2是用溴化钾压片法测定Fe-FPH在波数400～4000cm-1范围的红外光谱图，而多肽的红外光谱作为对照。由图可知，整个波数范围内主要出现4个波峰。多肽红外光谱中，属于的酰胺A谱带位于3407.11cm-1处，主要由NH的伸缩振动所致；1649.93cm-1处的吸收峰属于酰胺I带，由C＝O伸缩振动引起；1401.04cm-1属于多肽氨基酸残基的侧链基团；1048.54cm-1属于铵盐NH4+的特征吸收峰。结合Fe2+后发现，氨基的伸缩吸收峰由3407.11cm-1往高波段移到3423.16cm-1处；酰胺I带则向低波段方向发生移动，变成1646.02cm-1，且吸收峰变强；铵盐NH4+的特征吸收峰基本不变但峰变强。酰胺A向高波数方向移动，酰胺I带向低波数方向移动，铵盐NH4+的特征吸收峰增强，充分说明多肽的氨基和羧基应该都参与了与Fe2+的配位。
4、Fe-FPH对贫血大鼠力竭游泳时间的影响
运动耐力的提高是抗疲劳能力加强最直接、最客观的指标[何来英,严卫星,楼密密等.保健食品抗疲劳作用试验方法研究[J].中国食品卫生杂志,1997,9(4):1～6.]。力竭游泳时间的长、短可以反映动物运动疲劳的程度。由表2可知，A、B组雄性大鼠力竭游泳时间具有极显著差异(P<0.01)，A、B组雌性大鼠相比差异明显(P<0.05)，A、B组所有大鼠比较差异显著(P<0.05)。从表中数据看出，灌胃Fe-FPH的B组贫血大鼠力竭游泳时间比A组明显延长。
表2 贫血大鼠力竭游泳时间
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注：与A组比，*P<0.05,**P<0.01，下同
5、Fe-FPH对贫血大鼠SOD活力的影响
SOD是抗自由基损伤的一个重要的抗氧化酶，当体内SOD较多时，它能通过催化自由基的歧化反应而有效的清除自由基，减轻自由基对细胞的损害，延缓疲劳的产生和/或加速疲劳的恢复。
由表3可知，B组大鼠肝脏中SOD活性与A组大鼠比差异明显(P<0.05)，B组大鼠肌肉中SOD活性相比A组差异极显著(P<0.01)，B组大鼠全血中SOD活性高于A组，但无统计学意义(P>0.05)。除B组大鼠肝脏中SOD活力无增强或增强较弱外，全血和肌肉中，Fe-FPH均对SOD的活性有一定增强作用。
表3 Fe-FPH对贫血大鼠全血、肝脏和肌肉中SOD活力的影响
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6、Fe-FPH对贫血大鼠MDA含量的影响
MDA是体内脂质过氧化代谢产物，一般都将其作为评定自由基生成及其对膜脂质双层破坏结果的指标。即当体内MDA含量过多时，表明机体的脂质过氧化程度较高，产生的自由基较多，容易破坏细胞结构和功能，使ATP生成减少，导致疲劳。
由表4可知，B组大鼠的肝脏和肌肉中MDA含量较A组大鼠均有非常明显的降低作用(P<0.01)，B组大鼠全血中MDA含量相比A组虽有降低趋势，但两组差异不明显(P>0.05)。
表4 Fe-FPH对贫血大鼠全血、肝脏和肌肉中MDA含量的影响
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7、Fe-FPH对贫血大鼠GSH-Px活力的影响
GSH-Px是体内存在的一种清除自由基、抑制自由基反应，防止膜脂质过氧化，保护细胞膜结构和功能完整性的酶，能延缓或阻止疲劳的产生[游丽君.泥鳅蛋白抗氧化肽的分离纯化及抗疲劳、抗癌功效研究[D].华南理工大学,2010.]。由表5可知，B组大鼠肝脏中GSH-Px活力比A组大鼠明显升高(P<0.05)。
表5 Fe-FPH对贫血大鼠肝脏中GSH-Px活力的影响
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8、Fe-FPH对贫血大鼠乳酸含量的影响
机体剧烈运动时产生大量乳酸，乳酸进入血液，使血乳酸浓度显著增加，氢离子浓度升高，代谢失调，引起疲劳。由表6可知，两组大鼠血液中乳酸含量差异极显著(P<0.01)，B组明显低于A组。
表6 Fe-FPH对贫血大鼠血乳酸含量的影响
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七、总结
(1)Fe-FPH含铁量为60180mg/kg；在pH5时溶解度最高，达到69.91％，随着pH 值的升高，溶解度逐渐降低，并且在酸性条件下的溶解度较碱性条件来得高；Fe-FPH的热变性温度为62.4℃，保证了Fe-FPH进入大鼠体内其药性不发生改变；对Fe-FPH的结构分析，酰胺A向高波数方向移动，酰胺I带向低波数方向移动，表明带鱼多肽的氨基和羧基与Fe2+的结合有关。
(2)动物实验中，Fe-FPH能明显延长贫血大鼠的力竭游泳时间；显著增加贫血大鼠肌肉中SOD活性，对全血中SOD有增强趋势，但差异性不显著，对肝脏中SOD活性增强较弱；明显降低了贫血大鼠肝脏、肌肉中MDA含量，对全血中MDA含量有降低作用，但无统计学意义；对肝脏中GSH-Px活力有显著增强作用；对血乳酸降低作用极明显。综上说明Fe-FPH对贫血大鼠具有一定的抗疲劳功效。