本发明涉及预防和/或治疗β-链球菌型扁桃体炎的药物制剂。 扁桃体炎，即扁桃体的一种炎症，是一种涉及面很广的健康问题。估计在瑞典每年有300，000左右的人患急性扁桃体炎，其中大约有30-50%的病例是由β-链球菌引起的。通常治疗扁桃体炎使用青霉素，例如苯氧甲基青霉素。但是约有10-25%的病例进行这种治疗无效。结果病人患再发性扁桃体炎。在日托幼儿园、在学校甚至在家庭里，凡是人群彼此密切接触而出现一些感染机会的地方，扁桃腺炎就特别流行。结果导致反复性的药物治疗。看医生以及青霉素治疗，这不仅是一个严重的健康问题，而且也是一个经济问题。
在不考虑病人免疫防御方面的局部缺乏和全身性免疫缺乏的情况下，治疗无效高发生率的原因被认为是取决于感染部位抗菌素活性的不足。后者包括的因素如病人对药物的适当性、青霉素的具体剂量、给药次数以及对药物地受到削弱的吸收。此外还提到了由于β-内酰胺酶产生菌使青霉素失活而造成感染灶处青霉素浓度的不足，与治疗β-链球菌扁桃体炎无效有关的其他因素是正常菌丛的干扰。从而提高了对链球菌感染的易感性和A组β-链球菌的青霉素耐受性。
已知在咽喉菌丛的细菌之中，细菌干扰对扁桃体炎起着重要的作用。现已证明一些链球菌的菌株、特别是一些α-链球菌能抑制产生普通感染的β-链球菌的生长。受上述复发性感染的人在他们的正常咽喉菌丛中经常缺乏起抑制作用的α-链球菌，而具有α-链球菌的人很少患扁桃体炎。
Sanders等人（Sanders，C.，Nelsen，G.，Sanders，E.：Bacterialinterference，Ⅱ.Epidemiological determinants of the antagonistic activity of the normal throat flora against group Astreptococci.Infection and Imminity 1977，16：599-603）已证明一些绿色链球菌的菌株抑制A组链球菌（GAS）的生长。Sanders还证明了在感染的儿童中通常出现的抗GAS的α-链球菌的抑制效果。
α-链球菌抗β-链球菌感染在咽喉中保护的作用也已为Grahn和Holm（Grahn，E.，Holm，S.E.：Bacterial interference in the throat flora during a streptococcal tonsillitis outbreak in an apartment house area.Zentralblatt für Bakteriologie Mikrobiologie and Hygiene A 1983，256：72-79）和Roos等人（Roos，K.，Grahn，E.，Holm，S.E.：Evaluations of betalactamase activity and microbial interference in treatment failures of acute streptococcal tonsilittis.Scandinavian Journal of Infections Diseases 1986，18：313-19）证明。他们还说明了缺乏起干扰作用的α-链球菌是使链球菌型扁桃体炎治疗经常无效的一个重要原因。
此外，Beck（Interference by a α-hemolytic streptococcus of β-hemolytic pathogenic streptococci，Inflammation，3：463-465，1979）发现了一个对GAS具有高抑制能力的绿色链球菌（streptococcus viridans）的菌株，并且他还建议将该菌株“植入”患复发性链球菌扁桃体炎的人体。以前Sprunt等人（Sprunt K.，Leidy G.，Redman W.：Abnormal colonisation of neonates in an ICU：Conversion to normal colonisation by pharyngeal implantation of alpha-hemolytic streptococcus strain 215.Pediatr Res14：308-313，1980），也提出过类似的报告，他将α-链球菌菌株植入担心有感染危险的22个孩子的鼻咽中，这种植入在16个孩子中证明是成功的，并且引起7个孩子的正常菌落发生变化，使得被植入的菌株是植入后4-18天要被发现的唯一的α-链球菌菌株。
正常菌落中的细菌以不同方式抑制侵入的细菌，其他的一些因素是如对一重要生长因子竞争、PH变异、废物积累、过氧化物、细菌毒素以及酶的形成以及还有称为细菌素的物质的产生。已知细菌素与抗生素非常相似，然而差别在于具有非常显著的选择作用和不干扰非常重要的厌氧细菌菌落。α-链球菌对β-链球菌的抑制作用已被证明在很大程度上取决于存在由α-链球菌产生的细菌素。所以需要一种在预防和治疗β-链球菌型扁桃体炎中有效的药物制剂。
本发明的一方面是提供一种预防和/或治疗β-链球菌型扁桃体炎的药物制剂，该制剂的特征在于含有至少一种活的微生物菌株、所述菌株选自寄存号为NCIB 40104，NCIB 40105和NCIB 40106的血链球菌（streptococcus sanguis）Ⅱ菌株、寄存号为NCIB40107的轻型链球菌（Streptococcus mitis）菌株以及与这些寄存的菌株的抑制β-链球菌能力基本相同的链球菌菌株。并置于能使这些微生物保持存活的药用介质中。
本发明另一方面是上述制剂被用于预防和/或治疗扁桃体炎、很可能是在青霉素治疗期后。根据后面的权利要求，本发明的其它特征是很明显的。
本发明第三个方面是提供一种制造上述制剂的方法。
已经发现本发明药物制剂在预防和治疗β-链球菌型扁桃体炎中特别有效。在下文将要描述的实验中，一个最佳实施例的本发明制剂内同时存在四种不同的α-链球菌的菌株，发现它能将瑞典三个地方分离出来的β-链球菌的95-98%消灭掉。所述微生物菌株不同数目的组合也有效果，但是不如目前当所有四种菌株都存在时获得的最好效果。特别的是菌株NCIB40104单独来看是非常有效的，而剩余3种菌株各自的效果都不如NCIB40104。
药用介质最好是由NaCl、脱脂牛奶或NutramigenR（1981，3，13日的商标注册，注册号175，669，权利人是Mead Johnson &公司，Evansville，Ind.USA）组成的。但也可以使用其他能使微生物保持存活的药用介质。在本发明的一个实施方案中，使用了用于给出具有中性PH的等渗组合物的生理盐水缓冲溶液。
制剂中的每一种微生物在所述介质内的浓度为104-1010CFU/ml），（菌落形成单位/ml）最好为105-109CFU/ml。
对于这四种微生物菌株，其中有三种属于血链球菌属Ⅱ（下文称α89a，α502和α505），第四种为轻型链球菌属（下文称为α7213），它在大多数人的正常咽喉菌丛中都能发现。菌株α89a与NCIB40104对应，菌株α502，α505和α7213则分别与NCIB40105、NCIB40106，和NCIB40107对应。
按下列程序分离本发明制剂内的上述4种菌株。由每200人左右分离出五种具有不同菌落表观的α-链球菌菌株、总计约1000种菌株。采用下列方式用这些菌株进行体外抗不同类型的β-链菌球试验。
首先在TY-肉汤内培养所有的α-链球菌，洗涤并稀释至500nm（Viatron）时光密度为0.3，相应浓度为104-105CFU/ml。将这些菌株的微滴（含在有10-100CFU）采用Steer氏针形复制器（见Steers E.，Foltz E.L.，Graves B.S.，Riden J.：An inocula replicating apparatus for routine testing of bacterial susceptibility to antibiotics，Antibiot Chemother 9：307-311 1959）转移到血琼脂平板上（每皿25个菌株），并使其干燥10-15分钟。用于本次实验中的琼脂平皿是由具有5%灭菌去纤维蛋白的马血的BBL Colombia Agar Base（Div.Becton Dickinson & Co.，Cockeysville，MD21030，USA）作成的，其PH为7.49-7.57。
将β-链球菌不同的菌株迅速地涂在每一株α链球菌邻近，将该平板置于5%CO2中于37℃培养。为了消灭过氧化物的产生，一些平板是在厌氧条件下培养的。然后通过研究琼脂平板上能观察到的特殊的生长抑制图型来记录α菌株对β链球菌的抑制作用。
就对β-链球菌干扰而论，以不同的组合形式进一步研究了最好的起抑制作用的菌株，并选择出四种最有效的菌株，这四种菌株即α89a，α502，α505和α7213。然后分别在含0.2%葡萄糖的TY肉汤内于37℃下培养过夜。然后洗涤并悬浮于盐水中。四种选择出来的菌株再对来自Umea，Uppsala和Gothenburg的100种不同的β链球菌进行检验。这些菌株分别80%、92%和89%被抑制。
本发明制剂中的这四种微生物菌株可以悬浮于药用的介质中。冷冻至-20℃，或冷冻干燥，以使保藏，向病人投药使用喷雾器最为合适，借助于喷雾器，可将融化的、液体制剂向口中和/或鼻内投药。
用于本发明一个实施方案的喷雾器，可含有109CFU/mlα链球菌的5ml生理盐水悬浮液。每次喷雾的剂量107CFU，相当于约0.01ml。
本发明制剂中的这些微生物菌株于1989.2.3寄存于国家工业与海运细菌收集公司（NCIMB）Torry研究站，邮政信箱31，135Abbey Road，Aberdeen AB9 8DG，英国，寄存号为NCIB40104，NCIB40105，NCIB40106和NCIB40107。按照API 20系统（API系统-LaBalme les Grottes-38390Montalieu-Vercieu，France）对所述生物体菌株进行说明或分类。说明表和说的结果示于下页。
对链球菌菌株干扰所获结果
试验 α89a α502 α505 α7213
VP - - - -
HIP - - - -
ESC - - - -
PYRA - - - -
αGAL + + + -
βGUR - - - -
βGAL - - - -
PAL + + + +
LAP + + + +
ADH + + + +
RIB - - - -
ARA - - - -
MAN - - - -
SOR - - - -
LAC + + + +
TRE （+） - - +
INU - - - -
RAF + + + -
AMD + + + +
GLYG - - - -
溶血 - - - -全部具有α溶血（绿溶血）。
血链球菌Ⅱ 血链球菌Ⅱ 血链球菌Ⅱ 轻链球菌
实验
下述实验目的是通过使用本发明的含有四种α链球菌菌株，能抑制病人GAS的制剂再移植到患复发性扁桃体炎的病人身上，并分析这种新菌落抗复发GAS扁桃体炎的保护能力。
在1986年的最后三个半月中，家庭A（双亲和三个孩子）经受了25次急性扁桃体炎。重复培养咽喉样品显示出所有家庭成员都存在β链球菌GAS T型12。交替给他们施用苯氧甲基青霉素（每日按12.5mg/kg体重两次，10天）和红霉素（每日按20mg/kg体重两次，10天），然而只出现暂时性的好转。
1986年的最后3个月中，家庭B（双亲和两孩子）经历11次急性扁桃体炎（GAS-T型12）。情况如同家庭A，所有家庭成员都用苯氧甲基青霉素和红霉素治疗。从家庭B分离出的一些β链球对红霉素有耐药性[MIC（最低抑制浓度）大于8mg/l]。两个家庭发生的链球菌扁桃体炎的情况列于表1。
由两个家庭全部的9名病人分离出的α链球菌都缺乏对他们自身GAS的生长抑制能力。用于证明对GAS的生长抑制，即细菌干扰的方法已为Grahn等人（Grahn，E.，Holm，S.E.，Roos，K.，Ekedahl C：由扁桃体表面分离出的α溶血链球菌对β溶血链球菌、釀脓链球菌的干扰-方法学的研究，Zentralblatt für Bakteriologie Mikrobiologie und Hygiene A 1983，254：459-468）所说明。
1987年2月两个家庭的所有成员都用本发明的制剂治疗，将以这4种α链球菌中的每一种在药用介质中大约107CFU/ml的量的制剂通过鼻子喷入9个人的咽上部，并通过咀喷入咽扁桃体炎区域。该方法每天重复一次共四次，然后一星期一次共一个月，再以后一个月一次两/三个月，从开始治疗起的8个月中，通过反复培养咽喉样品病人得以控制。在用本发明制剂选择出来的α链球菌开始重新移植时，所有九个病人都缺乏抗自身GAS的起干扰作用的α链球菌，家庭A中的所有成员在治疗前都是GAS的携带者，而另一家庭B设有一个成员是GAS的携带者，无论家庭A或家庭B没有一个表现出任何感染的临床征兆，治疗后期的4个月只有一个病人仍然是原始GAS菌株的携带者，而且此人同样缺乏起抑制作用的α链球菌。在所有其余的病人中，都发现了植入的α链球菌剧烈地生长。该生长通过对不同的GAS菌株典型的生长抑制图型及其生化反应所证实。如由表2所见，该表表明引入了对GAS起抑制作用的α链球菌以后治疗的频率和微生物结果。家庭B的孩子们在日托幼儿院里接触GAS因而是所述细菌的携带者，但是他们并没有感染。同一家庭的双亲在同一时期内甚至不是带菌者。
表3表明了在重新移植α链球菌前后链球菌扁桃体炎的发生情况。在重新移植对GAS起抑制作用的α链球菌后和在随后的八个月当中。两个家庭没有一个人表现出链球菌扁桃体炎的临床征兆。确实一些家庭成员在这个时期是GAS的带菌者，但没有一个人患扁桃体炎。
如本实验证实的那样，本发明制剂可以非常成功地用于链球菌扁桃体炎的预防和治疗中。在需要对扁桃体炎进行强有力和有效的治疗时，在最佳剂量的青霉素疗程终结时使用所述制剂。
表1
链球菌扁桃体炎的发生情况，M代表男性，F代表女性。
性别 年龄
家庭A M 30 ＊ ＊ ＊ ＊
F 27 ＊ ＊ ＊ ＊＊＊ ＊
M 7 ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊
M 4 ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊
F 1 ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ ＊
家庭B M 36 ＊
F 33 ＊ ＊ ＊ ＊ ＊
M 4 ＊
F 1 ＊ ＊ ＊ ＊
六月 七月 a八月t 九月十月 十一 十二 一月1986
月 月
表2
在施用本发明的含有对GAS起抑制作用的α链球菌制剂后的微生物结果的影响，+表示GAS存在。
性别/年龄
家庭A M 30 +++ + - - - - - -
F 27 +++ - - - - + - -
M 7 +-- - - - - - - -
M 4 ++- - - - - - - -
F 1 +++ - - - - - - -
家庭B M 36 --- - - - - - -
F 33 --- - - - - - -
M 4 --- + + + - + +
F 1 --- + + + + - -
2月 3月 4月 5月……9月
1987
表3
在重新移植本发明的含有α-链球菌的制剂之前和以后的β-链球菌型扁桃体炎的发病情况