一种T2毒素的酵母菌发酵去除方法.pdf

本发明公开了属于生物化学技术领域的一种T-2毒素的酵母菌发酵去除方法。该方法首先通过酵母菌菌种的活化和培养，制成酵母菌培养液，然后向含有T-2毒素的污染粮食中喷洒酵母菌培养液，常温发酵3-6天，将被污染粮食取出，晒干。本发明的方法可以有效的去除被污染粮食或饲料中的T-2毒素，操作方法简单，去除率高，可应用于粮食或饲料中T-2毒素的脱毒，以使其达到国家标准。

1.  一种T-2毒素的酵母菌发酵去除方法，其特征在于，按照如下步骤进行：
(1)酵母菌菌种的活化和培养，制成酵母菌培养液，培养液中活菌数含量为1×10⁸-1×10⁹CFU/mL；
(2)向含有T-2毒素的污染粮食中喷洒酵母菌培养液，喷洒量为污染粮食质量的1％；
(3)常温发酵3-6天，将被污染粮食取出，晒干。

2.  根据权利要求1所述一种T-2毒素的酵母菌发酵去除方法，其特征在于，所述酵母菌菌种为食品发酵级菌种Saccharomyces cerevisiae 1221。

3.  根据权利要求2所述一种T-2毒素的酵母菌发酵去除方法，其特征在于，所述粮食为小麦、大麦、玉米、高粱、稻谷。

4.  根据权利要求1所述一种T-2毒素的酵母菌发酵去除方法，其特征在于，所述酵母菌培养液的制备方法为：将保存的酵母菌菌株接种于YPD平板，于30℃培养箱中有氧培养48h，挑起单菌落接入YPD液体培养基中，于30℃培养箱中150r/min有氧振荡培养48h，再按1％接种量接种于YPD液体培养基中，30℃培养箱中150r/min有氧振荡培养30-60h，在到达稳定生长期时，活菌数为1×10⁸-1×10⁹CFU/mL时，取出培养液。

5.  根据权利要求1所述一种T-2毒素的酵母菌发酵去除方法，其特征在于，所述常温发酵温度为20℃-30℃。

一种T-2毒素的酵母菌发酵去除方法
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种T-2毒素的酵母菌发酵去除方法。
背景技术
T-2毒素属于真菌毒素，是毒性最强的单端孢霉烯族毒素，是由产毒真菌在适宜的环境条件下产生的有毒代谢产物，经常污染食品(特别是粮食制品)和饲料，对人类和动物具有多种毒害作用，国内外对粮谷、食品和饲料中的T-2毒素制定了严格的限量标准。
酵母菌可以去除某些真菌毒素，最早研究酵母菌去除真菌毒素是Ciegler等(1966)、Mann等(1977)，他们研究了酵母菌对黄曲霉毒素脱毒作用。Scott等(1995)、Torres等(2001)报道了啤酒和蒸馏酒生产中黄曲霉毒素、赭曲霉毒素A的消长规律。Scott等(1996)报道含有酵母菌细胞壁的酒糟能将黄曲霉毒素吸附。上述酿酒酵母使家禽动物具有抗黄曲霉毒素的能力(Devegowda等，1998；Stanley等，1993)。Santin等(2003)报道了酵母菌细胞壁作为家禽动物的饲料添加剂，能降低黄曲霉毒素的毒效应。到目前为止，研究最多是利用酵母菌对黄曲霉毒素进行脱毒，但尚没有没有报道酵母菌对T-2毒素具有去除作用，更没有摸索其可以工业化应用的条件。
发明内容
本发明的目的在于提供一种T-2毒素的酵母菌发酵去除方法。
一种T-2毒素的酵母菌发酵去除方法，按照如下步骤进行：
(1)酵母菌菌种的活化和培养，制成酵母菌培养液，培养液中活菌数含量为1×10⁸-1×10⁹CFU/mL；
(2)向含有T-2毒素的污染粮食中喷洒酵母菌培养液，喷洒量为污染粮食质量的1％；
(3)常温发酵3-6天，将被污染粮食取出，晒干。
所述酵母菌菌种为食品发酵级菌种Saccharomyces cerevisiae 1221。
所述粮食为小麦、大麦、玉米、高粱、稻谷。
所述酵母菌培养液的制备方法为：将保存的食品级酵母菌菌株接种于YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose medium，YPD)平板，于30℃培养箱中有氧培养48h，挑起单菌落接入YPD液体培养基中，于30℃培养箱中150r/min有氧振荡培养48h，再按1％接种量接种于YPD液体培养基中，30℃培养箱中150r/min有氧振荡培养30-60h，在到达稳定生长期时，活菌数为1×10⁸-1×10⁹CFU/mL时，取出培养液。
所述常温发酵温度为20℃-30℃。
本发明的有益效果：本发明的方法可以有效的去除被污染粮食和饲料中的T-2毒素，操作方法简单，去除率高，可应用于粮食和饲料中T-2毒素的脱毒，以使其达到国家标准。
附图说明
图1为酵母菌的生长曲线。
图2为T-2毒素的多反应监测(MRM)色谱图截图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1酵母菌发酵对T-2毒素去除作用实验
酵母菌培养基YPD培养基，购于德国SERVA Electrophoresis GmbH公司，称取50g于1000mL超纯水中，用玻璃棒搅拌至完全溶解，分装至三角瓶，121℃高压灭菌20min，制成YPD液体培养基，4℃保存。灭菌前在其中添加1.5％的琼脂，灭菌后倒平板，制成YPD平板，4℃保存。
毒素标准储备液制备：精确称取购于美国Sigma-Aldrich公司的T-2毒素标准品5.0mg于5mL容量瓶中，用乙腈溶解、定容，制成1.0mg/mL T-2毒素准储备液，于-20℃条件下避光保存，使用前拿出置于室温条件下30min，每次使用不超过1h，每月更新。
毒素标准工作液制备：将T-2毒素标准储备液用5％甲醇水溶液(初始流动相)、YPD液体培养基、PBS缓冲液稀释、定容，制成100.0μg/mL、10.0μg/mL、1.0μg/mL、0.1μg/mL、0.01μg/mL的毒素标准工作液、YPD液体培养基基质标准工作液、PBS缓冲液基质标准工作液，于4℃条件下避光保存，使用前拿出置于室温条件下30min，每次使用不超过2h，每10天更新。
酵母菌菌株为食品发酵常用的食品级酵母菌菌株Saccharomyces cerevisiae 1221。
酵母菌菌种的活化：将保存的酵母菌菌株接种于YPD平板，于30℃培养箱中有氧培养48h，挑起单菌落接入YPD液体培养基中，于30℃培养箱中有氧振荡培养(振荡频率150r/min)48h，再按1％接种量接种于YPD液体培养基中，30℃培养箱中有氧振荡培养(振荡频率150r/min)48h，置于冰箱4℃保存。将活化后的酵母菌培养液按1％接种量接种于100mL YPD液体培养基中，30℃有氧振荡培养(振荡频率150r/min)，于0h、6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h和48h取出，在波长680nm处，测定培养液吸光度值(OD值)，测定时以 未接种YPD液体培养基为空白对照。以时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制酵母菌生长曲线(如图1所示)。根据酵母菌生长曲线，在到达稳定生长期时，取出培养液稀释后，用YPD平板计数。活菌数大约为10⁸CFU/mL。
酵母菌发酵对T-2毒素的去除作用实验：将活化后的酵母菌发酵液按1％接种量接种到添加T-2浓度为1.0μg/mL的YPD培养基中，30℃有氧振荡(振荡频率150r/min)培养，0h、24h、48h、72h、96h分别取出测定T-2毒素。通过高效液相色谱-串联质谱法对T-2毒素的去除效果进行测定。
所述高效液相色谱-串联质谱法的色谱条件：采用日本Shimadzu UFLC LC-20AD高效液相色谱系统，其中LC分离柱为日本Shimadzu Shim-peak UP-ODS(150mm×4.6mm i.d.，3.0μm p.s)，LC保护柱为日本Shimadzu Shim-peak GPRC-ODS(8mm×1.5mm i.d.，5.0μm p.s.)。流动相：A(水，含5mmol/L醋酸铵和0.2％甲酸)；B(甲醇)。梯度洗脱：0～2min，5％B；2～5min，5％～95％B；5～10.5min，95％B；10.5～11min，95％～5％B。流速：0.3mL/min。柱温：40℃。进样量：30μL。
所述高效液相色谱-串联质谱法的质谱条件：采用美国Applied Biosystems Sciex API 4000 triple quadrupole instrument equipped with Ion Source Turbo Spray串联质谱系统，其中扫描方式：正离子模式扫描(Positive)。检测模式：多反应检测(MRM)。气帘气压力(CUR)：40psi(氮气)。离子源气体1(GAS1)：60psi(氮气)。离子源气体2(GAS2)：60psi(氮气)。离子源温度(TEM)：650℃。界面加热器(IHE)：ON。电喷雾电压(IS)：5500.00V。碰撞气压力(CAD)：10psi(氮气)。条件如表1所示。
表1 T-2毒素的跃迁监测及电喷雾离子源条件

所述高效液相色谱-串联质谱法测定T-2毒素含量具体方法为：将30μL浓度为1.0μg/mL的T-2毒素标准工作液注射到HPLC-MS/MS中，分析得到T-2毒素的二级质谱图(second-order mass spectrum)。根据得到的T-2毒素二级质谱图，选择相应最强的离子作为定量离子和定性离子。根据所选择的定量离子和定性离子，进行多反应检测(MRM)，得到的T-2毒素色谱图(图2)。将含有不同浓度毒素的YPD基质标准工作液及待测溶液离心(14000×g，10min，＜10℃)，上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液收集到HPLC进样瓶中，于冰箱4℃条件下保存，最后用HPLC-MS/MS分析。以各基质标准工作液中被测组分峰面积为纵坐标，以各基质标准工作液中被测组分添加浓度为横坐标，绘制基质标准工作曲线，用基质标准工作曲线对待测溶液中毒素进行定量。
检测的结果显示：Saccharomyces cerevisiae 1221发酵24h时T-2毒素浓度变化显著，48h时T-2毒素去除率为40％。
实施例2
一种T-2毒素的酵母菌发酵去除方法，按照如下步骤进行：
(1)酵母菌菌种的活化和培养，制成酵母菌培养液，培养液中活菌数含量为5×10⁸CFU/mL；
所述酵母菌培养液的制备方法为：将保存的食品级酵母菌菌株Saccharomyces cerevisiae 1221接种于YPD平板，于30℃培养箱中有氧培养48h， 挑起单菌落接入YPD液体培养基中，于30℃培养箱中有氧振荡培养(振荡频率为150r/min)48h，再按1％接种量接种于YPD液体培养基中，30℃培养箱中有氧振荡培养(振荡频率为150r/min)30-60h，在到达稳定生长期时，活菌数为5×10⁸CFU/mL时，取出培养液。
(2)向含有T-2毒素的小麦中喷洒酵母菌培养液，喷洒量为小麦质量的1％；
(3)常温发酵6天，将被污染小麦取出，晒干。
采用本发明的方法发酵3天时T-2毒素浓度变化显著，6天后T-2毒素去除率为35％。
实施例3
一种T-2毒素的酵母菌发酵去除方法，按照如下步骤进行：
(1)酵母菌菌种的活化和培养，制成酵母菌培养液，培养液中活菌数含量为4×10⁸CFU/mL；
所述酵母菌培养液的制备方法为：将保存的食品级酵母菌菌株Saccharomyces cerevisiae 1221接种于YPD平板，于30℃培养箱中有氧培养48h，挑起单菌落接入YPD液体培养基中，于30℃培养箱中有氧振荡培养(振荡频率为150r/min)48h，再按1％接种量接种于YPD液体培养基中，30℃培养箱中有氧振荡培养(振荡频率为150r/min)30-60h，在到达稳定生长期时，活菌数为4×10⁸CFU/mL时，取出培养液。
(2)向含有T-2毒素的大麦中喷洒酵母菌培养液，喷洒量为大麦质量的1％；
(3)常温发酵6天，将被污染大麦取出，晒干。
采用本发明的方法发酵3天时T-2毒素浓度变化显著，6天后T-2毒素去除率为33％。
实施例4
一种T-2毒素的酵母菌发酵去除方法，按照如下步骤进行：
(1)酵母菌菌种的活化和培养，制成酵母菌培养液，培养液中活菌数含量为6×10⁸CFU/mL；
所述酵母菌培养液的制备方法为：将保存的食品级酵母菌菌株Saccharomyces cerevisiae 1221接种于YPD平板，于30℃培养箱中有氧培养48h，挑起单菌落接入YPD液体培养基中，于30℃培养箱中有氧振荡培养(振荡频率为150r/min)48h，再按1％接种量接种于YPD液体培养基中，30℃培养箱中有氧振荡培养(振荡频率为150r/min)30-60h，在到达稳定生长期时，活菌数为6×10⁸CFU/mL时，取出培养液。
(2)向含有T-2毒素的玉米中喷洒酵母菌培养液，喷洒量为玉米质量的1％；
(3)常温发酵6天，将被污染玉米取出，晒干。
采用本发明的方法发酵3天时T-2毒素浓度变化显著，6天后T-2毒素去除率为30％。
实施例5
一种T-2毒素的酵母菌发酵去除方法，按照如下步骤进行：
(1)酵母菌菌种的活化和培养，制成酵母菌培养液，培养液中活菌数含量 为5×10⁸CFU/mL；
所述酵母菌培养液的制备方法为：将保存的食品级酵母菌菌株Saccharomyces cerevisiae 1221接种于YPD平板，于30℃培养箱中有氧培养48h，挑起单菌落接入YPD液体培养基中，于30℃培养箱中有氧振荡培养(振荡频率为150r/min)48h，再按1％接种量接种于YPD液体培养基中，30℃培养箱中有氧振荡培养(振荡频率为150r/min)30-60h，在到达稳定生长期时，活菌数为5×10⁸CFU/mL时，取出培养液。
(2)向含有T-2毒素的高粱中喷洒酵母菌培养液，喷洒量为高粱质量的1％；
(3)常温发酵6天，将被污染高粱取出，晒干。
采用本发明的方法发酵3天时T-2毒素浓度变化显著，6天后T-2毒素去除率为34％。
实施例6
一种T-2毒素的酵母菌发酵去除方法，按照如下步骤进行：
(1)酵母菌菌种的活化和培养，制成酵母菌培养液，培养液中活菌数含量为5×10⁸CFU/mL；
所述酵母菌培养液的制备方法为：将保存的食品级酵母菌菌株Saccharomyces cerevisiae 1221接种于YPD平板，于30℃培养箱中有氧培养48h，挑起单菌落接入YPD液体培养基中，于30℃培养箱中有氧振荡培养(振荡频率为150r/min)48h，再按1％接种量接种于YPD液体培养基中，30℃培养箱中有氧振荡培养(振荡频率为150r/min)30-60h，在到达稳定生长期时，活菌数为5×10⁸CFU/mL 时，取出培养液。
(2)向含有T-2毒素的稻谷中喷洒酵母菌培养液，喷洒量为稻谷质量的1％；
(3)常温发酵6天，将被污染稻谷取出，晒干。
采用本发明的方法发酵3天时T-2毒素浓度变化显著，6天后T-2毒素去除率为32％。