本发明涉及百日咳毒素B寡聚体亚基的重组表达，以及亚基在体外结合以形成能够用于疫苗中的非反应原性多聚体组分，以引发抗博德特氏杆菌属引起感染的免疫保护性反应。 对降低百日咳疫苗之不良反应的要求，促使人们研究以更好地了解病原体百日咳博德特氏杆菌的免疫原性成分。新的非细胞疫苗的一个重要成分是百日咳毒素（PT），其为干扰哺乳动物细胞中激素信号转导的异六聚体ADP-核糖基转移酶（1-3）。存在于毒素S1亚基（4）中的这种酶催活性导致对百日咳疫苗接受者的毒性，且一般认为是引起不良反应的根源。因此，在生产毒素基百日咳疫苗中，主要关心的是除去S1亚基的酶促活性。目前，一般是用热或甲醛和戊二醛等类毒素剂处理疫苗材料，以达到使S1失活目的。这些物理失活方法的缺点是，严格地说，它们实质降低了毒素的保护性免疫原性;退一步说，则可在存放后出现分子的毒素相关性酶活性（5）。
已发展了在大肠杆菌中以重组技术生产各百日咳毒素亚基（6），以及鉴定S1亚基上与酶促活性有关的关键性区域和形成优势保护性抗原决定基（7）的方法。借助位点特异性诱变，可消除S1亚基地酶促活性，以损害S1亚基获得与形成保护性抗原决定基（8）或使该亚基与B寡聚体结合以组装或全毒素样多聚体（9）相适应的构象。
据信B寡聚体具有细胞受体识别区域，其为S1亚基的传递平台（1.10-13）;它可以作为没有S1亚基的，由亚基S2、S3、S4和S5，以分别为1∶1∶2∶1的近似比例组成的亚聚体大分子分离得到（1）。最近已证明，本来不具有与百日咳毒素毒性相关之ADP-核糖基转移酶活性的天然B寡聚体本身即足以诱发免疫保护反应（14-16）;另外，在与美国食品与医药管理局Drusilla L.Burns博士和Juan L.Arciniega博士合作进行的重组蛋白质研究中，显示S1亚基似乎对B寡聚体的保护性反应没有明显贡献。因此，B寡聚体显然具有作为非细胞百日咳疫苗成分的可能。然而，在这些研究中所使用的天然B寡聚体是从全毒素分子中分离的，而且大多没有S1亚基（＞95%），故以这种方式得到的B寡聚体具有可检测量的S1相关活性，而这一活性对其反应原性起到很大作用。
图1显示本发明重组B寡聚体样多聚体（以下简称B寡聚体）的SDS-PAGE图谱。B寡聚体是按下文所述由重组体大肠杆菌产生的亚基S2、S3、S4和S5在体外组装而成，并在胎球蛋白-Sepharose柱上亲和层析纯化的（17）。用三氯乙酸（TCA）沉淀已用4M MgCl2从层析柱上洗脱的样品，并进行SDS-PAGE（19）。然后用考马斯蓝染色。泳道1）是天然PT（商品级）;泳道2）是天然B寡聚体（商品级）;泳道3）是重组B寡聚体。
图2是图解显示B寡聚体制剂，包括本发明的重组B寡聚体制剂的促细胞分裂活性。在RPMI1640培养基中以两倍系列稀释所指出的B寡聚体制剂。然后在B寡聚体制剂中加入小鼠脾淋巴细胞，达到如横座标上标示的B寡聚体浓度。用常规方法检测[3H]胸苷掺入（19）。因为重组B寡聚体制剂储存在高浓度尿素（2M）中，而且因其初始蛋白浓度相当低，所以低稀释度的重组B寡聚体制剂中含有大量足可导致细胞死亡的残留尿素。各制备是：天然B寡聚体（0）;显示有最高浓度的含0.125M尿素的天然B寡聚体（b）;以及含有0.125M尿素显示最高浓度的重组B寡聚体。
图3说明用B寡聚体制剂免疫小鼠对PT之白细胞增多促进活性的影响。5只小鼠分别经腹腔内注射（i.p.）本发明的重组B寡聚体制剂（rB）或天然B寡聚体制剂（B），加在总体积为0.5ml的含明矾佐剂的PBS-凝胶中，剂量分别为8μg（rBM/BH）1μg（rBM/BM）或0.1μg（rBL/BL）（见表1）。一组5只小鼠（标示“PT”）用PBS-凝胶作为对照免疫。一个月后，各组小鼠均用500ngPT（i.p.）攻击（但标示为“PBS＊”的组除外，该组用PBS攻击）;4天后测白细胞计数。结果以白细胞计数的平均值加一个标准差表示。
本发明提供了衍生于重组体材料之百日咳毒素的基因工程化改造的B寡聚体样多聚体蛋白质（重组B寡聚体），以及其制备方法。简单地说，经基因操作（如位点特异性诱变）产生毒素之S2、S3、S4和S5亚基和这些亚基类似物的顺反子成分（“基因”）及其衍生物，并分别在不同转化的异源（“外来”）宿主中表达并收获之，然后于体外结合成类似天然B寡聚体的多聚体合成物，该合成物具有在白细胞中引发有丝分裂反应的能力，且更重要的是可诱导抗百日咳毒素的免疫保护反应。
用本发明的重组B寡聚体或从百日咳博德特氏菌产生的PT中分离的天然B寡聚体免疫小鼠，产生在ELISA分析中显示可与PT反应并能中和PT对培养的中国仓鼠卵（CHO）细胞之细胞病理效应的抗体;由各制剂诱发的抗体滴度均相似。另外，用天然或重组B寡聚体免疫的小鼠可对抗PT的白细胞增多促进活性。这些数据证明，在体外由个别重组亚基组装的本发明的百日咳毒素B寡聚体是参予构成非细胞百日咳疫苗的适用候选成分。
按以前所述的方法在重组大肠杆菌中生产各亚基（6）。在该重组体生产系统中，用起始蛋氨酸残基取代其固有信号肽序列以合成委员长亚基多肽;除亚基S4外，异源氨基末端蛋氨酸残基实质上均被内源性蛋氨酰氨基肽酶从各重组体蛋白质上切掉。因此S4亚基是一种“蛋氨酰成熟”多肽，也就是说，它是在其氨基末端携带蛋氨酸残基的天然成熟S4亚基的类似物。分别发酵以在各自的大肠杆菌重组体中合成各个重组体亚基蛋白质。从发酵液中回收细胞团，然后置于-60℃到-80℃下保存。于大约4℃，在1mM二硫苏糖醇（DTT）存在下，使细胞团两次通过压力为大约104psig的French榨压器，以破碎细胞。在这些发酵条件下，重组体亚基蛋白质是作为大肠杆菌中的不溶性包含体合成的。从细胞溶胞产物中回收这些包含体，并以差速离心法至少洗两次;第一次是在1%脱氧胆酸（DOC）和25mM Tris-HCl（pH7.9）中，第二次是在4M尿素和25mM Tris-HCl（pH7.5）中。
将各种包含体制剂称重，并根据它们与亚基蛋白质的相对百分比例，即它们在天然B寡聚体中的近似摩尔比以化学计算量混合之（S2∶S3∶S4∶S5分别为1∶1∶2∶1）。加入在25mM Tris-Hcl（pH8.5）中的6M盐酸鈲（GuHCl）和10mM DTT溶液，以溶解包含体混合物;然后在室温下将混合物轻轻搅拌过夜。离心（用JA20转子，以18，000rpm于2℃室温下离心30分钟）以除去不溶性材料。回收可溶性上清，并在GH25层析柱中用不含DTT的上述GuHCl-Tris缓冲液洗脱以除去过多的DTT。回收在或近似GH25柱之空体积处洗脱的蛋白峰部分。可在该步骤后的任何时间用6MGuHCl洗脱样品。
加入Cu2SO4至终浓度为50μM;在室温和大气环境下将样品缓慢搅抖过夜。经此再氧化步骤后，使样品对含有2M尿素的100mM磷酸钾缓冲液（pH7.4）透析两次（每次用5升）。/透析包装管应有3，500道尔顿的截留分子量。透析期间形成一种不溶性沉淀物，其可经离心（JA14转子，13，000rpm，室温下离心20分钟）除去。收集上清于2-8℃下保存。然后将样品对磷酸盐缓冲盐水（PBS）于室温下透析过夜;透析液体积应不超过样品体积的10倍，并至少应换液一次。另外，透析包装管应有3，500道尔顿的截留分子量。
用市售胎球蛋白Sepharose 4B制备胎球蛋白-Sepharose亲和柱，用Spiro方法（购自Gibco）纯化，并在已公开的条件下共价连接。透析的样品于2℃室温下分两次上胎球蛋白-Sepharose层析柱;也可利用散体（无柱）层析、洗涤及洗脱方法。相继用PBS和含有1M NaCl的缓冲液A（0.05M Tris-HCl，pH7.5）洗已上样的亲合树脂。用含有4M MgCl2的缓冲液A洗脱在这些条件下结合到树脂上的样品。
总体说来，可于溶解细菌后，作为不溶性包含体分离各重组亚基。将各包含体制剂溶解在加有1mM二硫苏糖醇（DTT）的6M盐酸鈲（GuHCl）中，并参照天然B寡聚体中的估计的近似摩尔比例结合各亚基（即S2∶S3∶S4∶S5分别为1∶1∶2∶1）。用基于分子大小的排阻层析法除去还原剂，在50μM Cu2SO4存在下于大气环境中搅抖使之再氧化，并对2M尿素进行，平衡透析，以利于各亚基的自发结合。借助其结合复杂碳水化合物的能力[一种毒素的细胞击靶机制（20）]，通过在胎球蛋白-Sepharose柱上进行亲和层析将重组B寡聚体纯化到均质程度（根据多聚体中各亚基的纯度估计之）（图1）;根据我们的经验，个别亚基几乎不能与胎球蛋白树脂特异地结合，这表明大部分在MgCl2中洗脱的材料是多聚体形式的。检验洗脱物，发现其对鹅红细胞的凝集反应为阳性。用多克隆抗毒素血清进行Western吸印分析，并进行改良的ELISA试验（使用胎球蛋白包被的平板和抗S2、S3、S4和S5单克隆抗体，并用抗S1单克隆抗体作对照）进一步证实各免疫反应性B亚基多肽的存在。虽然亚基S2和S3和比例（用整合扫描光密度法对已染色的SDS-聚丙烯酰胺进行检测）与天然B寡聚体稍有不同，但这可解释为存在过多的S2亚基（见上文所述）或从胎球蛋白-Sepharose亲和树脂上共洗脱的S3-S4二聚体。但显然可通过致有丝分裂性实验证明分离的多聚体含有显著量的五元B寡聚体（图2）;而B寡聚体和某些个别亚基及含有它的二聚体能够使红细胞聚集，且只有完整的B寡聚体是有促有丝分裂活性的。值得注意的是，不管个别蛋白质亚基（S2、S3、S4和S5）的相对比例如何，本发明的重组B寡聚体终究不同于天然形式的B寡聚体，因其中它已具有了蛋氨酰一成熟的S4亚基。
然后使用一种估测百日咳疫苗之效能的标准方法，检测重组B寡聚体制剂在实验动物中刺激毒素中和性免疫反应的能力。这一试验方法是由FDA的D.L.Burns博士和J.L.Arciniega博士完成的。首先用确定剂量的天然或重组B寡聚体经腹腔内注射接种小鼠。免疫后两周，小鼠放血以用ELISA方法检测抗毒素抗体的浓度，然后再用致死量PT攻击之;观察动物因毒素引起的死亡数，并在攻击后4天估测所有动物的毒素介导的白细胞增多。如表1的结果所证明的，对各免疫剂起反应的小鼠均有明显的抗毒素和毒素中和浓度，其中后者是根据对PT介导的CHO细胞簇集的减小作用测定的;另外，重组B寡聚体诱导的中和抗体滴度与使用天然B寡聚体作免疫原时观察到的浓度相似。
表1
免疫原aB寡聚体 PT 中和湿度c
天然B寡聚体
1°免疫 4,838 2,478 226
2°免疫 223,664 41,085 1,810
重组B寡聚体
1°免疫 12,068 1,933 113
2°免疫 144,813 79,834 2,506
a、于室温下，使已用含0.02%明胶的磷酸盐缓冲盐水（PBS-gel）稀释的抗原经1小时吸附到相当于总蛋白质（抗原加明胶）量的氢氧化铝上，然后于4℃下对PBS透析以除去尿素和盐。1组5只BALB/C雌性小鼠（14-16g）分别经腹腔内注射（i.p.）抗原（6μg）。29天后，放血并制备血清。第二天，再次对小鼠进行免疫（2μg抗原/小鼠，i.p.）。14天后对小鼠放血并制备血清。
b、各数值是作为从各曲线之线性部分外推得到的x截距之反对数的例数计算的，其中所说的曲线为log10血清稀释度对405nm处吸光率值作图得到的;各数值代表了由5只小鼠的合并血清测得的结果。注射PBS-gel+Al（OH）3之小鼠的血清没有表现出可测定的抗B寡聚体或PT滴度。
c、按已述方法（25）检测血清中和百日咳毒素诱导之CHO细胞群集的能力。数值以代表全毒素中和CHO细胞群集活性的最大血清（合并的5只小鼠的血清）稀释度的倒数表示。注射PBS-gel+Al（OH）3之小鼠的血清没有显示有可测定的中和抗体浓度。
试验的最小稀度为1∶20。
更重要的是，在用天然B寡聚体或用重组B寡聚体免疫的动物中，所赋予的对抗PT之毒性作效应的保护作用水平没有明显差异（图3）。B寡聚体的个别亚基（6，22）和个别S2-S3或S3-S4二聚体（23）均不能引发对抗PT之白细胞增多促进效应的免疫保护作用。虽然最低剂量（0.1μg）重组材料的效力可能稍低于同等量天然B寡聚体的效力，但这种差异很可能是由于在对染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行整合光密度测定以确定重组B寡聚体之蛋白质浓度时存在的准确度差异所致。
本文中提出的结果证明了由重组DNA衍生的亚基产生复合异聚体蛋白质的可行性。对于PT来说，现在有可能生产有高免疫原性的亚毒素分子形式。虽然可通过在其编码顺反子结构中造成突变。使S1亚基结合B寡聚体的能力失活而在百日咳博德特氏菌中生产B寡聚体，但由该微生物产生的B寡聚体即使有也非常少（24）。也可以从天然毒素中纯化B寡聚体，但这是一个花费工作量很大的方法，且仍会造成含S1全毒素所致的可检测的污染（9，19，25）。本发明的重组B寡聚体不仅由于缺失S1亚基而没有其固有的毒性，面且因在制造过程中除去了病原生物体，所以还消除了污染其他百日咳博德特氏菌毒性成分的可能性（26，27），而后者也可能是百日咳疫苗之不良反应的原因。
可按常规方法将本发明的基因工程化改造的B寡聚体样多聚体配成疫苗。在毒素已经在“遗传上”被失活的情况下，例如本发明的百日咳毒素，一般将不必使用其他灭活步骤（如化学处理或热处理），因为这些材料是在非致病性生物体中产生的，并且本来就没有普扁认为可引起对全细胞百日咳疫苗和末经处理的（或没有严格失活的）百日咳全毒素疫苗之不良反应的S1相关酶活性。尽管如此，仍有必要控制重组产品的纯度，特别是控制内毒素含量。一般说来，本发明中描述的重组B亚基作为有潜在应用价值的疫苗接种抗原，应该纯化到≥90%均质性。如果有的话，应该估价污染物的性质及估测量，以保证内毒素污染的程度符合各管理机构的标准。
为了进行胃肠外途径输送，一般应将疫苗材料吸附到铝佐剂上。这至少可用两种方法完成：与初加工的明矾一起沉淀和与铝盐一起沉淀。然后将吸附的沉淀物悬浮在赋形剂中，以得到单剂浓度一般为每剂5-100μg，且氢氧化铝量不超过每剂1.5mg的疫苗抗原;每剂体积一般在0.1-1.0ml范围内。悬浮赋形剂通常是缓冲溶液（如磷酸盐缓冲盐水，pH7.0），且可含有稳定剂（如甘油）及防腐剂以防止微生物污染并延长有效储存期。为了刺激分泌性粘膜免疫反应，应能使抗原运送到粘模的淋巴组织。在这方面，可将疫苗材料制成肠溶胶囊或其他运交载体，以防止在其到达道肠淋巴组织（如派伊尔氏淋巴集结）之前被降解。在肠道中引发次级免疫反应可完全地传递到其他粘膜起皱器官的固有层，特别是传递到呼吸道以预防百日咳。另外，可将疫苗产品加在适当赋形剂和/或运送载体（如脂质体）中配成适于经呼吸道、口或鼻给药的气雾剂或液体，这样疫苗即可在支气管中直接刺激次级免疫反应或从口或鼻淋巴组织传递（如上所述）到呼吸道的固有层。
虽然已借助特定实例举例说明了本发明，但应明确的是，以能够实施本发明的方式作其他一些改动和改变是可能的。本发明将包括属于待批权利要求所限定之本发明范围内的所有这些改动和改变。
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