用于HER2表达阳性肿瘤PET成像的靶向正电子示踪剂及其制备方法.pdf

本发明提供一种用于HER2表达阳性肿瘤PET成像的靶向正电子示踪剂及其制备方法，所述正电子示踪剂为建立在序列为亮氨酸-苏氨酸-缬氨酸-丝氨酸-脯氨酸-色氨酸-酪氨酸的寡肽基础上的化合物，寡肽的氨基端上连接6-肼基烟酰基，并标记放射性核素[18F]氟，羧基端可连接氨基。本发明所制备正电子示踪剂体内生物学分布良好，体外细胞试验证实有较好的靶向性，可用于HER2表达阳性肿瘤的特异性成像、靶向治疗药物的选择与疗效判断，本发明建立了一套完整、流程化、全自动合成方法，制备过程简单易行、方便高效，有利于今后批量、规模化生产与商品化供应。

1.  一种用于HER2表达阳性肿瘤PET成像的靶向正电子示踪剂，其特征在于：该正电子示踪剂包括具有如式1所示结构的化合物：

式1中，R₁为寡肽氨基端脱去一个氢原子后剩余的部分，所述寡肽具有如SEQ.ID.NO.1所示的氨基酸序列，或者R₁为：

R₂为4-[¹⁸F]氟苯甲醛脱去醛基氧原子后剩余的部分，或者，R₂为2-[¹⁸F]氟-2-脱氧-D-葡萄糖脱去醛基氧原子后剩余的部分。

2.  根据权利要求1所述一种用于HER2表达阳性肿瘤PET成像的靶向正电子示踪剂，其特征在于：所述正电子示踪剂还包括溶剂。

3.  根据权利要求2所述一种用于HER2表达阳性肿瘤PET成像的靶向正电子示踪剂，其特征在于：所述溶剂为20mmol/L磷酸二氢钠水溶液与乙醇按照80:20的体积比混合得到的混合物。

4.  根据权利要求2所述一种用于HER2表达阳性肿瘤PET成像的靶向正电子示踪剂，其特征在于：所述正电子示踪剂的比活度为370～740MBq/mL。

5.  一种用于HER2表达阳性肿瘤PET成像的靶向正电子示踪剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)准备试剂：
将2～3mg碳酸钾溶于0.3～0.5mL水中得试剂1-1，将10～20mg氨基聚醚 溶于1～2mL乙腈中得试剂1-2，将试剂1-1与试剂1-2混合得试剂1；将10～20mg三氟甲磺酸-4-N,N,N-三甲基铵基苯甲醛溶于0.5～1mL无水二甲基亚砜中得到试剂2；将0.1mol/L的醋酸钠缓冲溶液与乙醇按体积比9:1混合，得试剂3-1，将1～2mg HYNIC-LTVSPWY或HYNIC-LTVSPWY-NH₂溶解于1～2mL的试剂3-1中得试剂3，所述HYNIC-LTVSPWY-NH₂为具有如式2-1所示结构的化合物：

所述HYNIC-LTVSPWY为具有如式2-2所示结构的化合物：

将20mmol/L NaH₂PO₄水溶液与乙醇按照80:20的体积比混合得试剂4-1，取1～2mL试剂4-1作为试剂4；
2)将回旋加速器制备的活度为200～400mCi的[¹⁸F]氟离子通入并吸附在阴离子交换柱上，然后将吸附在阴离子交换柱上的[¹⁸F]氟离子用试剂1洗脱至合成器的反应瓶中，然后在氮气或氦气保护下升温至60～70℃并保持3～4min，然后再升温至85～95℃后抽真空并保持10～15min，然后停止抽真空并降至室温；
3)经过步骤2)后，将试剂2加入所述反应瓶中后升温至105～110℃并保持10～15min得混合物1，待混合物1降至室温后向所述反应瓶中加入5～10mL水得混合物2，将混合物2依次通过阳离子交换柱和反相固相萃取柱，然后用0.5～1.0mL无水乙醇将反相固相萃取柱上的吸附物洗脱至所述反应瓶中；
4)经过步骤3)后，将试剂3加入所述反应瓶中，然后升温至100～105℃ 并保持10～15min，然后降至室温，然后向所述反应瓶中加入试剂4得混合物3，以试剂4-1为流动相，将混合物3经合成器的制备液相色谱进行分离，收集γ色谱图上保留时间为13～18min的分离产物。

6.  根据权利要求5所述一种用于HER2表达阳性肿瘤PET成像的靶向正电子示踪剂的制备方法，其特征在于：所述合成器为GE Tracerlab FX FN自动化合成器。

7.  根据权利要求5所述一种用于HER2表达阳性肿瘤PET成像的靶向正电子示踪剂的制备方法，其特征在于：所述步骤2)至步骤4)中，升温过程通过电热套加热或微波加热完成。

8.  一种用于HER2表达阳性肿瘤PET成像的靶向正电子示踪剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)准备试剂：
将2～3mg K₂CO₃溶于0.3～0.5mL水中得试剂1-1，将10～20mg氨基聚醚溶于1～2mL乙腈中得试剂1-2；将试剂1-1与试剂1-2混合得试剂1；将10～20mg 1,3,4,6-四乙酰基三氟甲磺酰基甘露糖溶于1～2mL无水乙腈中得试剂2；将0.1mol/L醋酸钠缓冲溶液与乙醇按体积比9:1混合，得试剂3-1，将1～2mg HYNIC-LTVSPWY或HYNIC-LTVSPWY-NH₂溶解于1～2mL试剂3-1中得到试剂3，所述HYNIC-LTVSPWY-NH₂为具有如式2-1所示结构的化合物：

所述HYNIC-LTVSPWY为具有如式2-2所示结构的化合物：

将20mmol/L NaH₂PO₄水溶液与乙醇按照80:20的体积比混合得试剂4-1，取1～2mL试剂4-1作为试剂4；
2)将回旋加速器制备的活度为200～400mCi的[¹⁸F]氟离子通入并吸附在阴离子交换柱上，然后将吸附在阴离子交换柱上的[¹⁸F]氟离子用试剂1洗脱至合成器的反应瓶中，然后在氮气或氦气保护下升温至60～70℃并保持3～4min，然后再升温至85～95℃后抽真空并保持10～15min，然后停止抽真空并降至室温；
3)经过步骤2)后，将试剂2加入所述反应瓶中后升温至80～90℃并保持4～5min，然后升温至105～110℃并保持4～5min；
4)经过步骤3)后，将所述反应瓶降温至35℃，然后将1～2mL 1mol/L氢氧化钠水溶液加入所述反应瓶中并进行水解反应5min，水解反应结束后用盐酸调节pH值至4～5，然后静置5～10min；
5)经过步骤4)后，将试剂3加入所述反应瓶中，然后升温至100～105℃并保持10～15min，然后降至室温，然后向所述反应瓶中加入试剂4得到混合物3’，以试剂4-1为流动相，将混合物3’经合成器的制备液相色谱进行分离，收集γ色谱图上保留时间为10～15min的分离产物。

9.  根据权利要求8所述一种用于HER2表达阳性肿瘤PET成像的靶向正电子示踪剂的制备方法，其特征在于：所述合成器为GE Tracerlab FX FN自动化合成器。

10.  根据权利要求8所述一种用于HER2表达阳性肿瘤PET成像的靶向正电子示踪剂的制备方法，其特征在于：所述步骤2)至3)以及步骤5)中，升温过程通过电热套加热或微波加热完成。

用于HER2表达阳性肿瘤PET成像的靶向正电子示踪剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及用于PET成像的正电子示踪剂，具体涉及一种用于HER2表达阳性恶性肿瘤靶向诊断、药物选择与疗效评价的正电子示踪剂及其合成方法。
背景技术
人表皮生长因子受体2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2,HER2)在恶性肿瘤的发生、发展中具有重要作用，针对HER2的靶向治疗药物如易瑞沙等已广泛应用于临床，取得了一定效果。然而，由于肿瘤组织HER2基因表达的个体差异与肿瘤异质性，相当一部分患者靶向药物治疗无效或效果不佳，造成不必要的人力及财力耗费，甚至延误了治疗最佳时机，导致病情进展。通过正电子发射计算机断层扫描(Positron Emission Tomography,PET)技术在体检测与动态监测患者肿瘤组织HER2基因的表达水平及变化有利于合理选择靶向治疗药物，评价治疗效果。
正电子核素[¹⁸F]氟是最理想的、也是目前最常用的PET示踪剂标记核素，其物理半衰期为109分钟，制备过程简单，标记方法成熟，适于临床普及应用。目前国内外尚未见针对HER2寡肽片段的PET正电子示踪剂研究报道。
基于寡肽分子的¹⁸F标记正电子示踪剂近年才出现。[¹⁸F]氟标记肽的策略主要包括直接标记法和间接标记法。直接标记对被标记肽的结构影响最小，但反应条件苛刻，不利于肽保持活性，且选择性差，故不常用；间接标记法需对被标记肽进行修饰以提供特定[¹⁸F]氟标位点，并预先保护可能产生副反应的基团，将[¹⁸F]氟标记到特定反应中间体上之后，再连接反应中间体与修饰肽得到目标产物。间接法的优点是反应条件温和、快速、选择性好、活性高，缺点是在被标记肽与[¹⁸F]氟之间引入了连接基团会改变被标记肽的性质，因此标记方法需慎重选择。间接标记法主要包括：辅基法(活化羧基辅基法、醛基成腙法、巯基还原法、点击化学法)、固相法、配合物法(AlF法)、同位素交换法(SiF法)、芳环取代法(亲电取代法、亲核取代法)等。其中固相法条件温和、标记时间短，但对肽的保护和固化操作复杂；配合物法条件温和，产率高，可一步反应实现，但产物体内脱氟严重；同位素交换法操作方便，但标记时间长、产率低、产物与原料分离困难； 芳环取代法反应时间短，但对被标记肽结构有特殊要求，条件苛刻，产物复杂，难分离，标记率低；辅基法是最常见的方法，其中活化羧基辅基法研究较多，是最早报道的经典方法，主要缺点是反应步骤多，操作复杂，对产率影响大；巯基还原法和点击化学法均需特殊中间体和修饰肽，因难以获得而不利于应用；含醛基辅基标记法操作相对简单，反应条件温和，产率较高，产物易纯化、体内稳定性好，只是对反应体系设计有一定要求。
迄今为止尚未见利用正电子核素[¹⁸F]氟标记LTVSPWY制备PET正电子示踪剂的任何报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于HER2表达阳性肿瘤PET成像的靶向正电子示踪剂(简称为[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY或[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY-NH₂)及其制备方法。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种用于HER2表达阳性肿瘤PET成像的靶向正电子示踪剂，该正电子示踪剂包括具有如式1所示结构的化合物：

式1中，R₁为寡肽氨基端脱去一个氢原子后剩余的部分，所述寡肽具有如SEQ.ID.NO.1所示的氨基酸序列，或者R₁为：

R₂为4-[¹⁸F]氟苯甲醛(4-[¹⁸F]fluorobenzaldehyde,[¹⁸F]FBA)脱去醛基氧原子后剩余的部分，或者，R₂为2-[¹⁸F]氟-2-脱氧-D-葡萄糖(2-[¹⁸F]fluorine-2-deoxy-D-glucose,[¹⁸F]FDG)脱去醛基氧原子后剩余的部分。
所述正电子示踪剂还包括溶剂。
所述溶剂为20mmol/L磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)水溶液与乙醇(Ethanol)按照80:20的体积比混合得到的混合物。
所述正电子示踪剂的比活度为370～740MBq/mL。
一种用于HER2表达阳性肿瘤PET成像的靶向正电子示踪剂的制备方法，包括以下步骤：
1)准备试剂：
将2～3mg碳酸钾(K₂CO₃)溶于0.3～0.5mL水中得试剂1-1，将10～20mg氨基聚醚(Kryptofix 2.2.2,K 2.2.2)溶于1～2mL乙腈(Acetonitrile)中得试剂1-2，将试剂1-1与试剂1-2混合得试剂1；将10～20mg三氟甲磺酸-4-N,N,N-三甲基铵基苯甲醛溶于0.5～1mL无水二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)中得到试剂2；将0.1mol/L的醋酸钠(sodium acetate,NaAc)缓冲溶液(pH 3～4)与乙醇(Ethanol)按体积比9:1混合，得试剂3-1，将1～2mg HYNIC-LTVSPWY或HYNIC-LTVSPWY-NH₂溶解于1～2mL的试剂3-1中得试剂3，所述HYNIC-LTVSPWY-NH₂为具有如式2-1所示结构的化合物：

所述HYNIC-LTVSPWY为具有如式2-2所示结构的化合物：

将20mmol/L NaH₂PO₄水溶液与乙醇按照80:20的体积比混合得试剂4-1，取1～2mL试剂4-1作为试剂4；
2)将回旋加速器制备的活度为200～400mCi的[¹⁸F]氟离子([¹⁸F]F^-)通入并吸附在阴离子交换柱上，然后将吸附在阴离子交换柱上的[¹⁸F]氟离子用试剂1洗脱至合成器的反应瓶中，然后在氮气(N₂)或氦气(He)保护下升温至60～70℃并保持3～4min，然后再升温至85～95℃后抽真空并保持10～15min，然后停止抽真空并降至室温；
3)经过步骤2)后，将试剂2加入所述反应瓶中后升温至105～110℃并保持10～15min得混合物1，待混合物1降至室温后向所述反应瓶中加入5～10mL水得混合物2，将混合物2依次通过阳离子交换柱和反相固相萃取柱，然后用0.5～1.0mL无水乙醇(anhydrous ethanol)将反相固相萃取柱上的吸附物洗脱至所述反应瓶中；
4)经过步骤3)后，将试剂3加入所述反应瓶中，然后升温至100～105℃并保持10～15min，然后降至室温，然后向所述反应瓶中加入试剂4得混合物3，以试剂4-1为流动相，将混合物3经合成器的制备液相色谱进行分离，收集γ色谱图上保留时间为13～18min的分离产物。
所述合成器为GE Tracerlab FX FN自动化合成器。
所述步骤2)至步骤4)中，升温过程通过电热套加热或微波加热完成。
一种用于HER2表达阳性肿瘤PET成像的靶向正电子示踪剂的制备方法，包括以下步骤：
1)准备试剂：
将2～3mg K₂CO₃溶于0.3～0.5mL水中得试剂1-1，将10～20mg氨基聚醚(Kryptofix 2.2.2,K 2.2.2)溶于1～2mL乙腈中得试剂1-2；将试剂1-1与试剂 1-2混合得试剂1；将10～20mg 1,3,4,6-四乙酰基三氟甲磺酰基甘露糖(1,3,4,6-tetraacetyl-mannose triflate)溶于1～2mL无水乙腈中得试剂2；将0.1mol/L醋酸钠(sodium acetate,NaAc)缓冲溶液(pH 3～4)与乙醇按体积比9:1混合，得试剂3-1，将1～2mg HYNIC-LTVSPWY或HYNIC-LTVSPWY-NH₂溶解于1～2mL试剂3-1中得到试剂3，所述HYNIC-LTVSPWY-NH₂为具有如式2-1所示结构的化合物：

所述HYNIC-LTVSPWY为具有如式2-2所示结构的化合物：

将20mmol/L NaH₂PO₄水溶液与乙醇按照80:20的体积比混合得试剂4-1，取1～2mL试剂4-1作为试剂4；
2)将回旋加速器制备的活度为200～400mCi的[¹⁸F]氟离子([¹⁸F]F^-)通入并吸附在阴离子交换柱上，然后将吸附在阴离子交换柱上的[¹⁸F]氟离子([¹⁸F]F^-)用试剂1洗脱至合成器的反应瓶中，然后在氮气(N₂)或氦气(He)保护下升温至60～70℃并保持3～4min，然后再升温至85～95℃后抽真空并保持10～15min，然后停止抽真空并降至室温；
3)经过步骤2)后，将试剂2加入所述反应瓶中后升温至80～90℃并保持4～5min，然后升温至105～110℃并保持4～5min；
4)经过步骤3)后，将所述反应瓶降温至35℃，然后将1～2mL 1mol/L氢 氧化钠(NaOH)水溶液加入所述反应瓶中并进行水解反应5min，水解反应结束后用盐酸(HCl)调节pH值至4～5，然后静置5～10min；
5)经过步骤4)后，将试剂3加入所述反应瓶中，然后升温至100～105℃并保持10～15min，然后降至室温，然后向所述反应瓶中加入试剂4得到混合物3’，以试剂4-1为流动相，将混合物3’经合成器的制备液相色谱进行分离，收集γ色谱图上保留时间为10～15min的分离产物。
所述合成器为GE Tracerlab FX FN自动化合成器。
所述步骤2)至3)以及步骤5)中，升温过程通过电热套加热或微波加热完成。
本发明的有益效果体现在：
本发明所述正电子示踪剂克服了传统抗体类正电子示踪剂分子量较大、组织渗透性较差、在肿瘤内的聚集受到限制的缺点。首先，该正电子示踪剂建立在LTVSPWY寡肽结构(Leu-Thr-Val-Ser-Pro-Trp-Tyr,LTVSPWY)基础上，具有针对HER2靶向性；其次，该正电子示踪剂合成效率高，从轰击结束起计算，制备总时间为50～60min，可有效减少受检者的等待时间；此外，该正电子示踪剂主要通过肾脏排泄，肝脏摄取率低，排泄快，因而可降低受检者体内辐射剂量。
本发明采用了[¹⁸F]FBA或[¹⁸F]FDG与前体(HYNIC修饰LVTSPWY)连接，从而合成[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY的合成路线，产率高(达到45％)，前体在与正电子核素[¹⁸F]氟连接(标记)后，既不改变前体的生物学性能，又能起到成像目的，制备过程简单易行，有利于建立针对[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY的完整、流程化、全自动化合成方法，实现规模化生产与普及化使用，具有较高的实用价值和社会效益。为了抑制体内蛋白酶对寡肽的水解作用，延长其体内生物半衰期，本发明在原有氨基酸序列(LTVSPWY)的基础上在其羧基端连接氨基(-NH₂)，实验证明[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY-NH₂更加适合PET成像。
附图说明
图1为HYNIC结构式；
图2为LTVSPWY结构式；
图3为HYNIC-LTVSPWY-NH₂结构式；
图4为实施方案一合成的正电子示踪剂的结构式；
图5为实施方案二合成的正电子示踪剂的结构式；
图6为本发明的合成路线；
图7为不同时相[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY-NH₂体内分布；
图8为体外细胞结合试验，其中，(a)为MD-MA-231细胞，(b)SK-BR-3细胞。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作详细说明。
本发明提供一种用于人类表皮生长因子受体2(human epidermalgrowth factor receptor-2,HER2)表达阳性肿瘤正电子发射断层成像(positron emission tomography,PET)的靶向正电子示踪剂(简称为[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY或[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY-NH₂)及其制备方法。
该正电子示踪剂建立在寡肽LTVSPWY基础上，于寡肽的氨基端上连接6-肼基烟酰基(6-hydrazinonicotinoyl,HYNIC)，羧基端连接氨基(-NH₂)，标记放射性核素[¹⁸F]氟([¹⁸F]fluorine,[¹⁸F]F)后获得，结构如图4、图5所示；或者该正电子示踪剂建立在寡肽LTVSPWY基础上，于寡肽的氨基端上连接6-肼基烟酰基(6-hydrazinonicotinoyl,HYNIC)，标记放射性核素[¹⁸F]氟([¹⁸F]fluorine,[¹⁸F]F)后获得。
上述正电子示踪剂(以[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY-NH₂为例)的全自动化合成方法具体说明如下：
在LTVSPWY寡肽(结构如图2，以及SEQ.ID.NO.1)的氨基端连接HYNIC(结构如图1)，羧基端连接氨基-NH₂形成前体(即HYNIC-LTVSPWY-NH₂，结构如图3)，以HYNIC作为双功能连接体，并利用正电子核素[¹⁸F]氟对前体进行标记(HYNIC用于与[¹⁸F]FBA或[¹⁸F]FDG连接)，采用全自动化合成技术合成[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY-NH₂。
合成路线(图6)如下：
1)合成LTVSPWY寡肽后，采用HYNIC和-NH₂进行修饰获得前体(强耀生物科技(苏州)有限公司合成并提供)。
2)采用[¹⁸F]标记三氟甲磺酸-4-N,N,N-三甲基铵基苯甲醛合成[¹⁸F]FBA，或准备[¹⁸F]FDG([1]李谷才等.4-[¹⁸F]氟苯甲醛的放射化学合成.同位素,2006, 19(2):87-91；[2]王明伟等.常用¹⁸F标记中间体的合成及其应用研究.核技术,2006,29(1):63-71)。
3)基于生成腙的反应机理，将[¹⁸F]FBA或[¹⁸F]FDG与前体连接，获得[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY-NH₂。
实施方案一
通过[¹⁸F]FBA合成[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY-NH₂(结构如图4)。以下步骤1)至步骤8)通过GE Tracerlab FX FN合成器全自动化完成。
1)称取3mg K₂CO₃溶于0.5mL水中得K₂CO₃溶液；称取15mg K 2.2.2溶于1mL乙腈中得K 2.2.2溶液；将K₂CO₃溶液以及K 2.2.2溶液注入所述合成器的1号储管混合；将15mg三氟甲磺酸-4-N,N,N-三甲基铵基苯甲醛溶于500μL无水DMSO后注入所述合成器的2号储管；将0.1mol/L NaAc缓冲溶液(pH3～4)与乙醇以体积比9:1混合得混合溶液，称取1mg HYNIC-LTVSPWY-NH₂，溶于1mL所述混合溶液中后注入所述合成器的3号储管；将20mmol/L NaH₂PO₄水溶液与乙醇混合制备液相色谱流动相(NaH₂PO₄水溶液:乙醇＝80:20,v/v)，取所述流动相2mL注入所述合成器的4号储管，另取所述流动相1000mL，超声振荡30min后注入所述合成器的流动相瓶；将0.5mL无水乙醇注入所述合成器的5号储管；将10mL注射水(water for injection)注入所述合成器的6号储管；
2)用高纯氦气将回旋加速器制备的[¹⁸F]F^-(活度200～400mCi)传入并吸附在QMA阴离子交换柱上。
3)用1号储管中的混合溶液将吸附在QMA阴离子交换柱上的[¹⁸F]F^-洗脱进反应瓶，在N₂或He的保护下升温至65℃保持3.5min，然后升温至90℃抽真空，保持10min后将反应瓶压强调节至大气压，温度降至室温；
4)经过步骤3)后，将2号储管中的溶液加入反应瓶，升温至110℃保持10min；待反应瓶降至室温，将6号储管中的注射水注入反应瓶，然后将反应瓶内的液体依次通过一根阳离子交换柱(ion-exchange cartridge)LiChrolut SCX-cartridge(200mg,Merck公司)和一根反相固相萃取柱(reverse phase-solid phase extraction cartridge)Sep-Pak C18light cartridge(Waters公司)，使反应产物[¹⁸F]FBA吸附在反相固相萃取柱上，用5号储管中的无水乙醇将4-[¹⁸F]氟苯甲醛洗脱至反应瓶；
6)经过步骤5)后，将3号储管溶液注入反应瓶，升温至100℃保持10分钟；
7)经过步骤6)后，将反应瓶降至室温，将4号储管中的流动相溶液注入反应瓶；将反应瓶内混合溶液注入制备液相色谱进行分离，流速为8mL/min，紫外检测器检测波长为220nm，同时采用γ检测器检测，收集γ色谱图上保留时间约为16min的分离产物；
8)经过步骤7)后，将收集到的分离产物经除菌滤器(Merck Millipore MILLEX-GS 0.22μm SLGSV255F)过滤后得到可供注射的[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY-NH₂溶液。
经质谱分析，分离产物样品质谱图可见质荷比(m/z)为1104.5的离子峰，m/z值符合预期的化合物分子量，说明分离产物中含有预期的化合物(图4)。
经检测，本方案合成产率可达45％，放射化学纯度大于98％。
实施方案二
通过[¹⁸F]FDG合成[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY-NH₂(图5)。步骤1)至步骤8)通过GE Tracerlab FX FN合成器全自动化完成。
1)称取3mg K₂CO₃，溶于0.5mL水中得K₂CO₃溶液；称取15mg K 2.2.2，溶于1mL无水乙腈得K 2.2.2溶液；将K₂CO₃溶液以及K 2.2.2溶液注入所述合成器的1号储管混合；称取20mg 1,3,4,6-四乙酰基三氟甲磺酰基甘露糖溶于1mL无水乙腈后注入所述合成器的2号储管；配制1mol/L NaOH水溶液，取1mL注入所述合成器的3号储管；将0.1mol/L NaAc缓冲溶液(pH＝3～4)与乙醇按体积比9:1混合混合得混合溶液，称取1mg HYNIC-LTVSPWY-NH₂，溶于1～2mL所述混合溶液中，注入所述合成器的4号储管；以20mmol/L NaH₂PO₄水溶液与乙醇的混合溶液为制备液相色谱流动相(NaH₂PO₄水溶液:乙醇＝80:20,v/v)，取所述流动相2mL注入所述合成器的5号储管，将0.5mL盐酸(1％,w/v)注入所述合成器的6号储管，另取所述流动相1000mL，超声振荡30min后注入所述合成器的流动相瓶；
2)用高纯氦气将回旋加速器制备的[¹⁸F]F^-(活度200～400mCi)传入并吸附在QMA阴离子交换柱上。
3)用1号储管中的混合溶液将吸附在QMA阴离子交换柱上的[¹⁸F]F^-洗脱进反应瓶，在N₂或He保护下升温至65℃保持3.5min，然后升温至90℃，抽真空，保持10min，然后将反应瓶压强调节至大气压，温度降至室温；
4)经过步骤3)后，将2号储管中的溶液注入到反应瓶，升温至85℃保持 5min；反应结束后升温至105℃保持5min，蒸干乙腈；
5)经过步骤4)后，将反应瓶降温至35℃，将3号储管中的溶液注入反应瓶进行5min水解反应；反应结束后，将6号储管的盐酸注入反应瓶，将反应瓶中溶液的pH值调至4，放置5min；
6)经过步骤5)后，将4号储管中的溶液注入反应瓶，升温至100℃保持10min；
7)经过步骤6)后，将反应瓶降至室温，将5号储管中的溶液注入反应瓶；将反应瓶内的混合溶液注入制备液相色谱进行分离，流速为8mL/min，紫外检测器检测波长为220nm，同时采用γ检测器检测，收集γ色谱图上保留时间约为13min的分离产物；
8)经过步骤7)后，将收集到的分离产物经除菌滤器(Merck Millipore MILLEX-GS 0.22μm SLGSV255F)过滤后得到可供注射的[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY-NH₂溶液。
经质谱分析，分离产物样品质谱图可见质荷比(m/z)为1162.5的离子峰，m/z值符合预期的化合物分子量，说明分离产物中含有预期的化合物(图5)分子。
经检测，本方案合成产率可达40％，放射化学纯度大于98％。
上述实施方案一、二中，若利用70W微波对反应瓶进行加热，则升温所需时间相较合成器自带普通电热套可以缩短1～2min，提高了升温速度。
[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY的制备与上述实施方案一、二相同，仅是前体有所不同，前体建立在寡肽LTVSPWY基础上，于寡肽的氨基端上连接6-肼基烟酰基，羧基端未进行连接氨基的修饰。[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY结构如下：
或

发明效果说明
(一)质量控制：
1)鉴别：采用TLC和HPLC分析产物的放射化学纯度及产率。TLC条件：固定相硅胶G，厚度0.25mm，展开剂为乙腈:水＝95:5(v/v)；HPLC条件：色谱柱为十八烷基键合硅胶反相色谱柱(Inertsil ODS-SP,4.6mm I.D.×150mm,5μm,Shimadzu公司)，流动相为乙腈-三氟乙酸水溶液(0.1％,v/v)混合溶液(乙腈:三氟乙酸水溶液＝75:25，体积比)，等度洗脱，流速1mL/min。
2)检查：pH值为5.0～8.0(中国药典2010年版,二部,附录VI H)。细菌内毒素检测：取适量本品(即经除菌滤器过滤后得到可供注射的[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY溶液或[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY-NH₂溶液)，以细菌内毒素检查用水稀释60倍后，依照标准方法进行检测(中国药典2010年版,二部,附录XI E)，本品每1mL的内毒素含量小于15EU。无菌检查：取适量本品，依照标准方法进行检测(中国药典2010年版,二部,附录XI H)，本品符合要求。
3)比活度：精确量取一定体积的本品，置于活度计中测量活度，根据样品体积及其活度计算比活度。本品比活度范围为370～740MBq/mL。
4)有效期：从标定时刻开始计算大于6h。
(二)动物体内分布
选择健康新西兰大白兔(体重3.0kg)作为观察对象，先用3％戊巴比妥溶液(0.8mL/kg)实施基础麻醉，然后由耳缘静脉缓慢注射[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY-NH₂溶液(2.0mCi/kg)，于10、30、60、90、120min行PET/CT全身扫描，扫描仪为飞利浦公司GEMINI 64TF PET/CT成像系统，设置CT管电压为120V，管电流为350mA，PET每床位采集3min，采用仪器自带的图像后处理软件进行数据处理与图像重建，获得[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY-NH₂ 在动物体内的分布图。不同时相[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY-NH₂在兔体内的分布情况参见图7，图中显示该正电子示踪剂([¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY-NH₂)主要通过肾脏排泄，肝脏和胃肠道摄取率低，满足体内成像要求，[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY有类似的结果。
(三)体外细胞结合试验
选择高表达HER2的人乳腺癌SK-BR-3细胞和HER2表达阴性的MD-MA-231细胞作为观察对象，后者为对照。将细胞培养至对数生长期，制备细胞爬片，然后滴入FITC标记的[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY-NH₂，37℃孵育30min，PBS冲洗后于荧光显微镜下观察荧光分布情况。结果如图8所示，[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY-NH₂与SK-BR-3细胞爬片孵育后细胞膜表面可清晰显示绿色荧光，勾勒出细胞的轮廓(图8b)，而与MD-MA-231细胞孵育后可见荧光颗粒散在分布于视野中，细胞轮廓显示不清(图8a)，由此提示正电子示踪剂[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY-NH₂可与肿瘤细胞表面HER2特异性结合，适合高表达HER2肿瘤成像。[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY有类似的结果。
(四)本发明在原有氨基酸序列(LTVSPWY)的基础上在羧基端连接氨基(-NH₂)，修饰后的寡肽片段LTVSPWY-NH₂体内生物学分布更加适合PET成像，与[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY比较，[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY-NH₂优势在于：在寡肽的羧基端添加氨基(-NH₂)修饰，有利于封闭寡肽的蛋白酶解位点，减少其水解作用，增加寡肽在血液中的稳定性，延长寡肽的生物半衰期，提高示踪剂在病变组织的滞留时间和放射性浓聚，此次合成的氨基修饰后示踪剂([¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY-NH₂)显示出更好的体内分布，血液清除率高，放射性本底低，图像质量更好。
本发明建立了用于制备[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY或[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY-NH₂的一套完整、流程化、全自动合成和质量控制方法。实验表明，[¹⁸F]HYNIC-LTVSPWY-NH₂具有合适的理化与放射学性质，较为理想的生物学特性，可用于高表达HER2肿瘤的PET成像，有助于此类肿瘤的特异性诊断、靶向治疗药物的选择与疗效评价。