一种解淀粉芽孢杆菌BAKA3及其应用.pdf

本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciense）BA-KA3及其应用，该解淀粉芽孢杆菌于2013年10月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC 8342；其对番茄灰霉病菌具有明显的拮抗作用，对小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、烟草赤星病菌、辣椒疫霉病菌、辣椒炭疽病菌、花生褐斑病菌、梨黑斑病菌、大蒜菌核病菌等多种病原真菌均具有明显的抑制作用；并且可以显著的提高种子萌发率、出芽率和根长等植物生长指标；尤其适用于制作为农用制剂用于防治番茄由于灰霉病菌侵染而引起的病害并且具有一定的促长作用。

1.  一种解淀粉芽孢杆菌BA-KA3，该解淀粉芽孢杆菌于2013年10月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC No. 8342。

2.  根据权利要求1所述的一种解淀粉芽孢杆菌BA-KA3，其特征在于其具有广谱的抑菌活性。

3.  根据权利要求1所述的一种解淀粉芽孢杆菌BA-KA3，其特征在于其具有抑制番茄灰霉病菌、小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、烟草赤星病菌、辣椒疫霉病菌、辣椒炭疽病菌、花生褐斑病菌、梨黑斑病菌以及大蒜菌核病菌生长的活性。

4.  根据权利要求1所述的一种解淀粉芽孢杆菌BA-KA3，其特征在于其在制备农作物用生物防治制剂中的应用。

5.  解淀粉芽孢杆菌BA-KA3在制备农作物用生物防治制剂中的用途。

6.  根据权利要求5所述的解淀粉芽孢杆菌BA-KA3在制备农作物用生物防治制剂中的用途，所述农作物为番茄、花生、梨、大蒜或小麦。

7.  根据权利要求5所述的解淀粉芽孢杆菌BA-KA3在制备农作物用生物防治制剂中的用途，其特征在于所述生物防治制剂中含有解淀粉芽孢杆菌BA-KA3菌体和/或其代谢产物。

一种解淀粉芽孢杆菌BA-KA3及其应用
技术领域
本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciense）BA-KA3及其应用，属于微生物技术及生物防治领域。
背景技术
番茄灰霉病是由半知菌亚门真菌—灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引发的一种番茄真菌病害，可为害番茄的茎、叶、花和果实。发病后传播迅速，对番茄生产构成极大威胁，尤其是北方冬春季节的保护地番茄，棚室中低温、高湿的气候条件为灰霉病菌的侵染和传播提供了有利的环境，常造成番茄减产20%～40%，严重时可达 60% 以上。目前化学农药仍是防治该病害的主要措施，但长期使用不仅诱发病原菌产生抗药性，增加了番茄灰霉病的防治成本而且容易杀死环境中的有益微生物。因此寻求高效、安全的生物防治方法成为番茄灰霉病防治的关键。
解淀粉芽孢杆菌是一种好氧产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，具有抑制植物病害的能力, 又是广泛存在的非致病细菌,对人畜无害,不污染环境，还促进植物生长,抑制线虫,治理水环境污染等。其代谢产物较为丰富,具有广谱抗菌活性和较强的抗逆能力,稳定性较好，可制成生物制剂应用于植物根部、枝干、叶、花部以及果蔬采后病害防治上。如专利CN201110389068.X（申请日2011年11月30日）公开了一种解淀粉芽孢杆菌在防治花生果腐病中的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种编号为BA-KA3的解淀粉芽孢杆菌，其挥发性物质和代谢产物均可明显抑制番茄灰霉病病原菌的生长、降低病原菌的生长速率和引起菌丝的畸形；并且该菌株还具有促进植物生长的作用。另一方面本发明还提供了上述菌株的用途。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：
本发明所述解淀粉芽孢杆菌BA-KA3已于2013年10月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC No. 8342。
本发明所述解淀粉芽孢杆菌BA-KA3具有广谱的抑菌活性。
本发明所述解淀粉芽孢杆菌BA-KA3具有抑制番茄灰霉病菌、小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、烟草赤星病菌、辣椒疫霉病菌、辣椒炭疽病菌、花生褐斑病菌、梨黑斑病菌以及大蒜菌核病菌生长的活性。
本发明所述解淀粉芽孢杆菌BA-KA3在制备农作物用生物防治制剂中的应用。
本发明所述解淀粉芽孢杆菌BA-KA3在制备农作物用生物防治制剂中的用途。
本发明所述解淀粉芽孢杆菌BA-KA3在制备用于番茄、花生、梨、大蒜或小麦的生物防治制剂中的用途。
本发明所述解淀粉芽孢杆菌BA-KA3生物防治制剂中含有解淀粉芽孢杆菌BA-KA3菌体和/或其代谢产物。
本发明所述的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciense CGMCC No.8342的形态学特征为菌体杆状，产生芽孢；革兰氏阳性，生理生化鉴定结果为：甲基红试验（-）；丙二酸盐利用（-）；明胶液化（+）；柠檬酸盐利用（+）；硝酸盐利用（+）；吲哚试验（+）；脂肪酶（-）；V-P试验（+）；酪氨酸水解（-）；纤维素分解（+）；淀粉水解（+）；H₂S产生试验（+）。平板对峙试验表明对番茄灰霉病菌具有明显的抑制作用。对番茄果实、离体叶片和盆栽番茄的灰霉病均有很好的防治效果；并且其可以显著的提高番茄种子萌发率、出芽率和根长等植物生长指标。
本发明的解淀粉芽孢杆菌BA-KA3对小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、烟草赤星病菌、辣椒疫霉病菌、辣椒炭疽病菌、花生褐斑病菌、梨黑斑病菌、大蒜菌核病菌等多种病原真菌均具有明显的抑制作用；并且尤其适用于制作为农用制剂用于防治番茄由于番茄灰霉病菌感染而引起的病害并且促进农作物生长。
生物样品保藏信息
解淀粉芽孢杆菌BA-KA3，分类命名为Bacillus amyloliquefaciense，已于2013年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，菌种保藏号为CGMCC  No. 8342。
附图说明
图1为本发明解淀粉芽孢杆菌BA-KA3与番茄灰霉病菌的平板对峙试验结果；
图2为本发明解淀粉芽孢杆菌BA-KA3的16S rDNA序列系统发育树；
图3为本发明解淀粉芽孢杆菌BA-KA3挥发性物质对菌丝生长和显微镜观察的抑菌效果；
图4为本发明解淀粉芽孢杆菌BA-KA3不同浓度无菌发酵液对番茄灰霉病的抑菌效果；
图5发明解淀粉芽孢杆菌BA-KA3无菌发酵液对灰霉病菌菌丝的影响；
图6本发明解淀粉芽孢杆菌BA-KA3抑菌谱的测定结果。
具体实施方式
实施例1解淀粉芽孢杆菌BA-KA3的分离
解淀粉芽孢杆菌BA-KA3是从河北省石家庄市栾城县柳林屯乡保护地番茄的根际土壤中分离获得。
具体方法是：采集于河北省石家庄市栾城县柳林屯乡保护地番茄的根际土壤，4℃保存，用于拮抗菌的分离。将5g番茄根际土壤用0.9%生理盐水分别稀释为10^-4、10^-5、10^-6。各吸取100μL至PB培养基，用玻璃涂布器涂布均匀。于28℃培养箱中培养3d后， 挑取菌落形态不同的细菌进行分离纯化。以番茄灰霉病菌为指示菌，采用平板对峙法对番茄灰霉病菌的拮抗菌进行筛选，22℃ 黑暗培养5d 后，选出具有抑菌圈的菌株进入复筛。采用十字交叉法将初筛后的菌株点接在距平板中央3cm 处的4 个角上，平板中央同时移入直径5mm 的长有灰霉病菌的琼脂块，22℃培养5d 后，选出具有抑菌圈且拮抗作用持久的菌株。测量、记录抑菌圈直径的大小并计算抑制率。抑制率（%）=（对照组病原菌菌落直径-处理组病原菌菌落直径）/对照组病原菌菌落直径×100%。
如图1所示，A为对照组，B组加入解淀粉芽孢杆菌BA-KA3，待对照组病原菌长满平皿后，测定抑菌圈直径，计算解淀粉芽孢杆菌BA-KA3抑菌率为63% 。
实施例2解淀粉芽孢杆菌BA-KA3的鉴定
该菌株BA-KA3，在LB培养基上生长不产生色素，菌落扁平或圆形、乳白色不透明、菌落边缘不整齐。表面有褶皱。革兰氏阳性、杆状、形成芽孢，芽孢椭圆或柱形。参照《常见细菌鉴定手册》进行菌株的生理生化鉴定：V-P试验阳性、甲基红试验阴性、吲哚试验阳性、明胶液化试验阳性、柠檬酸盐利用试验阳性、淀粉水解试验阳性、脂肪酶阴性、H₂S产生试验阳性、硝酸盐还原试验阳性、丙二酸盐的利用阴性、酪氨酸水解阴性、纤维素分解阳性。
菌株16S rDNA序列分析：拮抗细菌通过扩增16S rDNA的方法，进行菌种的分子鉴定。
正向引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′),
反向引物1492R(5′-GGYTACCTTGTTACGACTT-3′)。
PCR扩增反应体系配制为(50μL)：10× Buffer 5μL，10mmol/L dNTP  4μL，Taq酶 1μL，模板 2μL，引物1 和引物2 各1μL，灭菌双蒸水36μL。
PCR 扩增条件为：95℃初始变性4min；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸10min。
将16SrDNA扩增产物回收纯化后测序，测序所得序列通过NCBI数据库进行BLAST比对，通过MEGA5.2软件与模式菌进行系统发育分析。如图2所示，拮抗菌BA-KA3与解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloloquefaciense亲缘关系最接近，菌株BA-KA3被鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciense）。
将解淀粉芽孢杆菌BA-KA3于2013年10月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC No. 8342。
实施例3解淀粉芽孢杆菌BA-KA3对番茄的室内防效试验
以无菌水为阴性对照，嘧菌酯作为常用的药剂对照，测定解淀粉芽孢杆菌BA-KA3无菌发酵液和菌悬液对番茄离体叶片、果实和盆栽番茄的防治效果。
将番茄果实和离体叶片进行表面消毒处理，75%酒精浸泡30s，无菌水清洗三次。将菌体浓度为1×10⁹CFU /mL的解淀粉芽孢杆菌BA-KA3，4℃，8000rpm离心20min，取上清，用0.22μm微孔滤膜去除菌体，得到无菌发酵液；沉淀用无菌水重悬，得到菌悬液。
测定BA-KA3对番茄灰霉病离体果实的防治效果：灭菌的枪头打孔，每个番茄4个孔，每组10个番茄；在孔中分别加入20μL无菌水、无菌发酵液、菌悬液、嘧菌酯，2h后加入20μL浓度为1×10⁶个/mL的番茄灰霉病菌孢子悬液。
测定对番茄灰霉病离体叶片的防治效果：将番茄叶片分别放入无菌水、无菌发酵液、菌悬液、嘧菌酯浸泡2h后，在叶片上放入直径为5mm的番茄灰霉病菌块。
测定对盆栽番茄灰霉病的防治效果：分别用无菌水、无菌发酵液、菌悬液、嘧菌酯对盆栽番茄进行叶面喷施，2h后接种1×10⁶个/mL的番茄灰霉病菌孢子悬液。黑暗保湿48h，22℃恒温培养，观察发病情况，计算病情指数。
试验结果如表1示，解淀粉芽孢杆菌BA-KA3的无菌发酵液对番茄灰霉病的防效效果最佳，能够明显的降低发病率和病情指数，对离体叶片的防效可达到100%，对离体果实的防效可达到96.47%，盆栽防效可达到43.86%，对农业生产的实际应用具有很好的指导意义。
表1番茄的室内防效试验

实施例4解淀粉芽孢杆菌BA-KA3促长试验
将解淀粉芽孢杆菌BA-KA3划线培养，挑取单菌落于LB液体培养基中，28℃摇床震荡培养24h，然后将菌体浓度分别稀释至1×10⁵CFU/mL、1×10⁶CFU/mL和1×10⁷CFU/mL，番茄种子置于不同菌体浓度的菌液中浸泡4h，设置无菌水为空白对照。其中一组放入装有滤纸的培养皿中，光照时长12h，22℃恒温培养2d后记录发芽个数，计算萌发率，7d测量根长；另外一组放入蛭石中，22℃恒温培养，15d记录出苗率。
试验结果表明，用浓度为1×10⁷CFU /mL的菌液处理的种子，萌发率、出苗率和根长提高最显著，分别提高14.34%、24.69%和68.95%，说明解淀粉芽孢杆菌BA-KA3具有显著的促生作用。
实施例5解淀粉芽孢杆菌BA-KA3挥发性物质对番茄灰霉病菌的抑菌作用测定
（1）对菌丝生长的影响
采用平板对扣法，用移液器吸取培养24h的解淀粉芽孢杆菌BA-KA3菌液 100 μL，均匀涂布于PB平板上，用打孔器在生长5d 的灰霉病菌边缘打孔，菌块接种于另一PDA平板中央,与涂有解淀粉芽孢杆菌BA-KA3的平板对扣，密封，22℃ 黑暗培养，以不接种解淀粉芽孢杆菌BA-KA3的平板作对照，待对照平板菌丝长满平皿时，测量各平皿菌落直径，计算生长速率，每个处理3个重复，计算抑制率，观察解淀粉芽孢杆菌BA-KA3的拮抗效果。
（2）对菌丝形态的影响
挑取培养3d的菌落边缘菌丝，在光学显微镜下观察菌丝形态及变化。
如图3示其中A为对照组，在PDA培养基上菌落生长正常，菌落直径为85mm，生长速率为17mm/d，B为处理组，菌丝覆盖稀薄，菌落直径为78mm，生长速率为15.6mm/d。根据公式[抑菌率=(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径]，计算抑菌率为11.76%。显微镜观察发现，对照组C菌丝直径为9.856μm，产生孢子，菌丝生长正常；处理组D菌丝直径为5.520μm，不产生孢子，而且出现菌丝断裂的情况。说明解淀粉芽孢杆菌BA-KA3的挥发性物质可以明显的降低番茄灰霉病病原菌的生长速率、抑制病原菌的生长和引起菌丝的畸形。
实施例6 不同稀释倍数的解淀粉芽孢杆菌BA-KA3无菌发酵液对病原菌的抑制作用
将菌体浓度为1×10⁹CFU /mL的解淀粉芽孢杆菌BA-KA3，4℃，8000rpm离心20min，取上清，用0.22μm微孔滤膜去除菌体，得到无菌发酵液。然后将该无菌发酵液分别稀释成10倍、20倍、40倍、80倍、160倍，于PDA培养基中。用打孔器在生长5d 的灰霉病菌边缘打孔，菌块接种于PDA平板中央，密封，22℃ 黑暗培养，以混入无菌水的平板作对照，待对照平板菌丝长满平皿时，测量各平皿菌落直径，每个处理3个重复，计算抑制率，确定不同浓度无菌发酵液对病原菌的抑制效果。
由图4可以看出稀释10倍后的无菌发酵液对番茄灰霉病菌具有极显著的抑制效果，抑制率达到85.13%，稀释20倍的无菌发酵液对番茄灰霉病菌的抑制率达到78.73%，稀释40倍的无菌发酵液对番茄灰霉病菌的抑制率达到62.84%，随着稀释倍数的增大，抑制效果逐渐减弱，但稀释160倍后的无菌发酵液依然对番茄灰霉病菌仍具有抑菌效果。
实施例7解淀粉芽孢杆菌BA-KA3无菌发酵液对灰霉病菌菌丝的影响
将菌体浓度为1×10⁹CFU /mL的解淀粉芽孢杆菌BA-KA3，4℃，8000rpm离心20min，取上清，用0.22μm微孔滤膜去除菌体，得到无菌发酵液。将该无菌发酵液分别稀释成80倍和160倍，采用摇瓶试验法，用打孔器在生长5d 的灰霉病菌边缘打孔，菌块接种于装有50mL PDA液体培养基的250mL三角瓶中，处理组分别加入不同浓度的无菌发酵液，对照组加入同体积的无菌水，每个处理3个重复。22℃、180rpm摇床震荡培养3d，显微镜观察各处理中病原菌菌丝生长情况。并用灭菌滤纸收集各处理菌丝，分别称量菌丝的鲜重和干重。
如图5示，A为对照组，显微镜观察可以看出A菌丝直径为9.500μm，产生大量孢子，菌丝生长正常；处理组B菌丝直径为5.388μm，产生少量孢子。说明解淀粉芽孢杆菌BA-KA3的代谢产物可以明显的抑制番茄灰霉病病原菌的生长和引起菌丝的畸形。
如表2所示，稀释80倍和160倍的无菌发酵液均能明显降低番茄灰霉病菌的菌丝生物量，其中80倍稀释的无菌发酵液可以降低60%以上的菌丝生物量。
表2解淀粉芽孢杆菌BA-KA3对番茄灰霉病菌菌丝的影响

实施例8解淀粉芽孢杆菌BA-KA3抑菌谱的测定
选择小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、烟草赤星病菌、辣椒疫霉病菌、辣椒炭疽病菌、花生褐斑病菌、梨黑斑病菌、大蒜菌核病菌等八种真菌作为指示菌对筛选后的拮抗菌进行抑菌谱的测定，如图6所示，解淀粉芽孢杆菌BA-KA3对八种病原真菌均具有明显的抑制作用，具有广泛的抑菌谱，但对不同病原真菌的拮抗能力表现有所不同。其中对6种病原真菌的抑制率都达到60%以上，分别是：对辣椒炭疽病菌抑制率为76.47%，对大蒜菌核病菌抑制率为68.57%，对梨黑斑病菌抑制率为68.75%，对烟草赤星病菌抑制率为63.7%，对小麦纹枯病菌抑制率为62.35%，对花生褐斑病菌抑制率为62.5%。
SEQUENCE LISTING
 
<110>  河北省科学院生物研究所
 
<120>  一种解淀粉芽孢杆菌BA-KA3及其应用
 
<130>  2014
 
<160>  1    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  1408
<212>  DNA
<213>  解淀粉芽孢杆菌BA-KA3
 
<400>  1
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