一种重组人参亲环素蛋白及其编码基因及制备方法和用途.pdf

本发明提供一种重组人参亲环素蛋白及其编码基因及制备方法和用途，属于基因工程技术领域。重组人参亲环素蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所述，所述的人参亲环素重组表达载体构建及重组蛋白制备工艺包括：人参亲环素基因的克隆、原核表达载体pGEX-6p-CYP的构建、在宿主菌E.coli BL21中的诱导表达、重组蛋白的分离纯化等步骤。本发明利用基因工程技术首次尝试了对人参亲环素基因的体外表达，成功构建了pGEX-6p-CYP原核表达载体，并实现高效表达，纯化后的重组蛋白纯度可达85％～95％。经体外活性研究发现，重组人参亲环素蛋白对人参疫病菌具有明显的抑制作用。本发明对开发新型生物农药、防治人参病害等具有重大意义，且应用前景广阔。

1.  一种重组人参亲环素蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID No.2所述。

2.  一种编码如权利要求1所述重组人参亲环素蛋白的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID No.1所述。

3.  一种如权利要求1所述重组人参亲环素蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)人参亲环素基因的克隆：采用Trizol法提取人参总RNA，设计及合成亲环素特异引物，上游引物为5′—CGGATCCATGGCCAACCCAA—3′，下游引物为5′—ATTTGCGGCCGCGTGGTGGTGGTGGTGGTG GTGCTCGAG—3′，通过RT-PCR方法扩增得到人参亲环素基因，全长为525bp，与载体pMD18-T连接，获得克隆载体pMD18-T-CYP，将其转化至E.coli DH5α感受态细胞中，提取质粒，用BamhⅠ和NotⅠ双酶切鉴定并进行测序验证；
(2)人参亲环素基因原核表达载体的构建：用BamhⅠ和NotⅠ将测序正确的克隆载体pMD18-T-CYP和表达载体pGEX-6p-1分别进行双酶切，回收表达载体片段和目的基因片段，连接后转化至E.coli DH5α感受态细胞中，提取质粒，双酶切鉴定并进行测序验证；
(3)人参亲环素基因表达和蛋白纯化：将构建成功的表达载体pGEX-6p-CYP转化到宿主菌E.coli BL21中，用IPTG诱导表达，采用DEAE阴离子交换层析、镍离子亲和层析进行分离纯化，并用Sephadex G-25凝胶层析除盐，收集除盐后的样品，冷冻干燥即得。

4.  如权利要求3所述的重组人参亲环素蛋白的制备方法，其特征在于：所述的构建的表达载体pGEX-6p-CYP的核苷酸序列如SEQ ID No.3所述。

5.  如权利要求3所述的重组人参亲环素蛋白的制备方法，其特征在于：所述的IPTG诱导表达中的诱导浓度为0.2mmol/L～1mmol/L，诱导时间为5h。

6.  如权利要求5所述的重组人参亲环素蛋白的制备方法，其特征在于：所述的IPTG诱导表达中的诱导浓度为0.9mmol/L。

7.  如权利要求3所述的重组人参亲环素蛋白的制备方法，其特征在于：所述的采用DEAE阴离子交换层析时，平衡液为20mm/L Tris-HCl缓冲液，pH7.8，洗脱液为含有500mm/L NaCl的Tris-HCl缓冲液，pH7.8。

8.  如权利要求3所述的重组人参亲环素蛋白的制备方法，其特征在于：所述的 镍离子亲和层析进行分离纯化时，结合液为含有10mm/L咪唑，150mmol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.8，洗脱液为含有500mm/L咪唑的磷酸盐缓冲液，pH7.8。

9.  如权利要求1所述的重组人参亲环素蛋白在制备抑制疫病菌的药物中应用。

一种重组人参亲环素蛋白及其编码基因及制备方法和用途
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组人参亲环素蛋白、基因克隆、重组表达载体构建及制备工艺和用途。
背景技术
人参(Panax ginseng C.A.Meyer.)为五加科多年生草本植物，是拥有数千年药用历史的名贵中药材，在我国享有“百草之王”的美誉。虽然人参化学成分复杂，生物活性广泛，药理作用独特，但由于其生长周期较长，在整个生长发育过程中容易遭受病源微生物的侵袭，从而引发一系列的病虫害。传统的防治人参病害的方法是喷洒波尔多液、敌克松、多菌灵等农药，但是长期喷洒这些化学农药会对环境造成污染，因此，开发新型的生物农药对防治人参病害以及保护环境显得尤为重要。
亲环素(Cyclophilins，CyP)是一类多功能蛋白质家族，广泛分布于脊椎动物、无脊椎动物、植物、细菌、真菌等几乎所有生命体中。亲环素在结构上高度保守，具有肽脯氨酰顺反异构酶活性，参与免疫抑制、蛋白质折叠以及细胞信号传导等多种生物学过程。植物亲环素与其他生物亲环素的结构有一定的相似性，除具有一般亲环素的功能外，还在植物生物学、胁迫应答、抗病原体免疫等方面发挥重要作用。
发明内容
本发明提供一种重组人参亲环素蛋白及其编码基因及制备方法和用途，用于开发新型生物农药、防治人参病害。
本发明采取的技术方案是：
一种重组人参亲环素蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所述。
一种编码所述重组人参亲环素蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所述。
所述重组人参亲环素蛋白的制备方法，包括如下步骤：
(1)人参亲环素基因的克隆：采用Trizol法提取人参总RNA，设计及合成亲环素特异引物，上游引物为5′—CGGATCCATGGCCAACCCAA—3′(标记部分为BamhⅠ酶切位点)，下游引物为5′—ATTTGCGGCCGCGTGGTGGTGGTGGTGGTG GTGCTCGAG—3′(标记部分为 NotⅠ酶切位点)，通过RT-PCR方法扩增得到人参亲环素基因，全长为525bp，与载体pMD18-T连接，获得克隆载体pMD18-T-CYP，将其转化至E.coli DH5α感受态细胞中，提取质粒，用BamhⅠ和NotⅠ双酶切鉴定并进行测序验证；
(2)人参亲环素基因原核表达载体的构建：用BamhⅠ和NotⅠ将测序正确的克隆载体pMD18-T-CYP和表达载体pGEX-6p-1分别进行双酶切，回收表达载体片段和目的基因片段，连接后转化至E.coli DH5α感受态细胞中，提取质粒，双酶切鉴定并进行测序验证；
(3)人参亲环素基因表达和蛋白纯化：将构建成功的表达载体pGEX-6p-CYP转化到宿主菌E.coli BL21中，用IPTG诱导表达，采用DEAE阴离子交换层析、镍离子亲和层析进行分离纯化，并用Sephadex G-25凝胶层析除盐，收集除盐后的样品，冷冻干燥即得。
所述的重组人参亲环素蛋白的制备方法，所述的构建的表达载体pGEX-6p-CYP的核苷酸序列如SEQ ID No.3所述。
所述的重组人参亲环素蛋白的制备方法，所述的IPTG诱导表达中的诱导浓度为0.2mmol/L～1mmol/L，诱导时间为5h。
所述的重组人参亲环素蛋白的制备方法，所述的IPTG诱导表达中的诱导浓度为0.9mmol/L。
所述的重组人参亲环素蛋白的制备方法，所述的采用DEAE阴离子交换层析时，平衡液为20mm/L Tris-HCl缓冲液，pH7.8，洗脱液为含有500mm/L NaCl的Tris-HCl缓冲液，pH7.8。
所述的重组人参亲环素蛋白的制备方法，所述的镍离子亲和层析进行分离纯化时，结合液为含有10mm/L咪唑，150mmol/L NaCl的磷酸盐缓冲液，pH7.8，洗脱液为含有500mm/L咪唑的磷酸盐缓冲液，pH7.8。
所述的重组人参亲环素蛋白在制备抑制疫病菌的药物中应用。
本发明利用基因工程技术首次尝试了对人参亲环素基因的体外表达，成功构建了pGEX-6p-CYP原核表达载体，并实现高效表达，纯化后的重组蛋白纯度可达85％～95％。经体外活性研究发现，重组人参亲环素蛋白对人参疫病菌具有明显的抑制作用，本发明对开发新型生物农药、防治人参病害等具有重大意义，且应用前景广阔。
附图说明
图1为重组人参亲环素蛋白基因PCR扩增产物电泳图，1.亲环素基因；M.Maker自上而下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp；
图2为原核表达载体pGEX-6p-CYP构建图；
图3为原核表达载体pGEX-6p-CYP双酶切鉴定电泳图，1.表达载体片段和目的基因；M.Maker自上而下依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp；
图4为不同浓度IPTG诱导表达人参亲环素基因的SDS-PAGE电泳图，1-3.IPTG诱导浓度依次为0mmol/L、0.2mmol/L、0.4mmol/L；4.Maker；5-10.IPTG诱导浓度依次为0.5mmol/L；0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L、0.9mmol/L、1mmol/L；
图5为重组人参亲环素蛋白纯化后SDS-PAGE电泳图，1.未纯化样品；2.纯化后样品；3.Maker；
图6为重组人参亲环素蛋白抑制真菌活性图，1.空白对照组(25mM Hepes，pH7.2)；2-4.依次载有重组蛋白100μg、60μg、10μg。
具体实施方式
以下实施例所用主要材料表


实施例1：人参亲环素基因的克隆
1.提取人参总RNA：迅速称取液氮冻存的人参叶组织0.1g左右，置于加有液氮的研钵中迅速研磨。待研磨成细粉后，加入1mL的Trizol,待样品溶化后继续研磨10min，取研钵内的混合液1mL至1.5mL的EP管中，加氯仿200uL，加无水乙醇120uL，充分混匀后冰浴静止5min，离心，取上清，再加入氯仿200uL，并用振荡器混匀，冰浴静止2min，离心，重复萃取3次。待中间层消失后，取上清液并加入等体积预冷的异丙醇与1/5体积的NaAc(pH＝5.8)混匀，置于-20℃中静置1h，离心，弃掉上清液，用75％乙醇洗涤沉淀3次，将EP管倒置10min，待沉淀控干后，加入20uL的1％DEPC水溶解。经琼脂糖凝胶电泳检测，条带清晰明亮，无降解。
2.特异引物的设计：应用软件Primer 5设计亲环素特异引物，上游引物为5′—CGGATCCATGGCCAACCCAA—3′(标记部分为BamhⅠ酶切位点)，下游引物为5′—ATTTGCGGCCGCGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG—3′(标记部分为NotⅠ酶切位点)。
3.目的基因RT-PCR扩增：按照TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0说明书操作，扩增目的基因。PCR参数为94℃2min循环1次，94℃30s、57℃30s、72℃60s循环30次。用DNA胶回收试剂盒回收PCR产物。经琼脂糖凝胶电泳检测，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，在525bp处得到单一清晰条带，与预测的碱基数相吻合(图1)。
4.目的基因与载体pMD18-T连接及鉴定：将目的基因克隆到载体pMD18-T上，获得克隆载体pMD18-T-CYP，并转化至E.coli DH5α感受态细胞中，取适当浓度的菌液均匀涂在37℃预热的LB固体培养基(含有50μg/mL Amp+)上，37℃平板倒置 培养过夜。筛选阳性单菌落接种于LB培养基(含有50μg/mL Amp+)中，37℃振荡培养12h。根据第三版《分子克隆》小剂量法提取质粒，通过BamhⅠ和NotⅠ双酶切鉴定，目的基因与载体pMD18-T连接成功，进一步测序结果正确。
实施例2：人参亲环素基因原核表达载体的构建
用BamhⅠ和NotⅠ将测序正确的克隆载体pMD18-T-CYP和表达载体pGEX-6p-1分别进行双酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离，按照胶回收方法分别回收表达载体pGEX-6p-1和目的基因片段，用T4DNA连接试剂盒16℃连接过夜，转化至E.coli DH5α感受态细胞中，涂板并于37℃培养，筛选阳性单菌落，用BamhⅠ和NotⅠ双酶切鉴定后，经琼脂糖凝胶电泳检测，表达载体片段和目的基因两条电泳条带清晰可见，且表达载体片段和目的基因的分子量均和理论值相符，初步鉴定原核表达载体pGEX-6p-CYP构建成功(图2、图3)，进一步测序，比对测序结果证实序列完全匹配，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所述，即原核表达载体构建成功。
实施例3：人参亲环素基因表达和蛋白纯化
1.人参亲环素基因的表达：将构建成功的原核表达载体pGEX-6p-CYP转化到宿主菌E.coli BL21中，以37℃恒温震荡培养过夜后，按1:100的比例将菌液接种到新的LB(含有50μg/mL Amp+)培养基里，37℃震荡培养，每隔1h测定一次OD₆₀₀，在培养5h时达到其对数生长期。此时进行IPTG诱导表达，通过比较IPTG不同诱导浓度和不同诱导时间的SDS-PAGE电泳结果，优化出最佳IPTG诱导浓度为0.9mmol/L，最佳诱导时间为5h(图4)。将表达菌进行破壁处理后分别将上清和沉淀做SDS-PAGE电泳检测，显示重组人参亲环素以包涵体形式表达。
2.重组人参亲环素蛋白的纯化：采用1.5％的SKL变性剂溶解包涵体，离心取上清透析；透析后总蛋白应用DEAE阴离子交换柱进行纯化，平衡液为20mm/L Tris-HCl缓冲液(pH7.8)，洗脱液为含有500mm/L NaCl的Tris-HCl缓冲液(pH7.8)，收集第一个洗脱峰；由于在构建重组基因表达载体时，在目的基因末端添加了组氨酸标签(His-tag)，所以进一步采用镍离子亲和层析进行分离纯化，结合液为含有10mm/L咪唑，150mmol/L NaCl的磷酸盐缓冲液(pH7.8)，洗脱液为含有500mm/L咪唑的磷酸盐缓冲液(pH7.8)。经亲和层析后，再用Sephadex G-25凝胶层析进行除盐，收集除盐后的样品，冷冻干燥即得。经SDS-PAGE电泳检测，纯化后的重组亲环素呈现单一条带(图5)，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所述。用Bradford法检测其蛋白纯 度可达85％～95％。
实施例4：重组人参亲环素蛋白抑制真菌活性试验
将人参易感染的真菌：疫病菌Phytophthora cactorum；分别接种在PDA培养基上，28℃培养48h后，将无菌的直径为1cm的滤纸片放在离真菌边缘适当位置，设置不同人参亲环素蛋白浓度梯度，实验组的滤纸片分别载有10ug、60ug、100ug的蛋白，以加Hepes缓冲液的滤纸片作为空白对照组。继续培养120h后，根据抑菌圈的形成与直径大小判断真菌对蛋白的敏感程度，结果发现，重组人参亲环素蛋白对人参疫病菌具有明显的抑制作用(图6)。