泰山紫草萘醌活性单体制备工艺
技术领域
本发明涉及醌类色素分离纯化领域，具体为一种泰山紫草萘醌活性单体制备工艺。
背景技术
据药典记载，入药的紫草为紫草科植物紫草、新疆假紫草或滇紫草的根。其中新疆紫草和滇紫草为一年生草本植物，称为软紫草。泰山所产紫草主要在泰山山脉海拔200-600米之间的区域生存，为多年生木本，称为硬紫草。两种紫草都可以入药，所含主要活性成分主要是具有5,8-二羟基萘醌结构的萘醌色素。泰山紫草为泰山的四大名药之一，因其独特的地理环境和气候条件，产量极少，而且，我们购买的商品单体在进行药理活性实验时，效果非常不理想。
目前，紫草的提取分离方法主要是利用各种有机试剂，加以物理方法例如微波和超声波提取。单体的分离主要采用传统的硅胶柱层析或者制备液相色谱技术分离得到。传统的分离方法耗时费力，一次实验等到的单体种类少而量小，由于紫草中的萘醌色素对光，对热都敏感。所以普通的提取分离方法在提取过程中就会对活性成分造成一定的破坏。市面上商品单体售价达到每毫克几百元，不能满足药理研究及质量控制的需要；而且市面上购买的软紫草来源的单体在诱导ROS活性氧导致的DNA损伤，从而导致癌细胞凋亡方面效果并不显著。
发明内容
本发明针对以上不足之处，提供了一种泰山紫草萘醌活性单体制备工艺，利用本工艺生产的泰山紫草来源的单体相比软紫草来源的单体，具备更好的抗癌活性，可以为进一步开发泰山珍稀紫草资源提供研究资料。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种泰山紫草萘醌活性单体制备工艺，包含有如下步骤：
（1）泰山紫草原料处理
将泰山紫草放在低温环境下进行干燥48小时，温度设置为35°C，干燥完毕后将泰山紫草粉碎至60目；
（2）超临界萃取工艺
将得到的泰山紫草干燥粉末使用超临界萃取装置进行萃取，使用超临界二氧化碳为萃取剂，在压力为40 MPa 、温度为45°C、萃取剂流速为35 L h-1的条件下进行萃取，在压力为6MPa 、温度为30°C的条件下进行分离，得到深紫色油状萃取物；
（3）将上一步中得到的深紫色油状萃取物使用高速逆流色谱仪进行分离纯化，逆流色谱的溶剂体系是石油醚-乙酸乙酯-乙醇-水，比例为(5:5:6:4, v/v)，形成互不相溶的上下两相，以上相作为固定相，固定相的保留率为55%，将2.35g超临界流体萃取样溶解于5ml等量的上相与下相，进行进样，分离过程中，流速为2ml/min，转速为850rpm，检测波长254nm. 根据逆流色谱图谱，收集所需组分；得高纯度活性单体I β-羟基异戊酰基紫草素；II 乙酰紫草素；III 异丁酰紫草素。
本发明从泰山紫草制备的单体比市面上购买的软紫草来源的单体在诱导ROS活性氧导致的DNA损伤，从而导致癌细胞凋亡方面具有更好的效果；
本研究选取泰山紫草为原料，利用超临界萃取和高速逆流色谱为主要工艺设备，独创了一条简单，高效的制备泰山紫草中三种主要活性单体的工艺流程，并利用制备的单体对前列腺癌进行了一系列的氧化应激反应；
超临界二氧化碳流体萃取技术是在接近于室温的条件下进行，无溶剂残留，特别适合萘醌这类热敏物质的分离；
而高速逆流色谱（High speed counter-current chromatography, HSCCC）是一种新型的分离技术，该技术不采用固态吸附剂，与其它的色谱技术相比，HSCCC能够消除固体吸附剂所导致的样品不可逆吸附和对样品的沾染、失活、变性等影响，实现复杂混合物中各组分的高纯度分离。而且，由于其没有固体吸附柱，可以提高进样量，能够达到一定的制备级别；
利用本工艺生产的泰山紫草来源的单体相比软紫草来源的单体，具备更好的抗癌活性，可以为进一步开发泰山珍稀紫草资源提供研究资料；
可以为泰山紫草的质量控制和药理研究快速、高效的提供高纯度，无任何溶剂残留的活性单体。
附图说明
图1所示为乙酰紫草素抑制PC3和DU145细胞增殖的时间、剂量关系图；
图2所示为显微镜拍摄的乙酰紫草素对两种前列腺癌细胞的IC50的作用图；
图3所示为高速逆流色谱分离泰山紫草萘醌活性单体时的 HSCCC 色谱图；
图4所示为逆流色谱得到的组分单体I的氢谱；
图5所示为逆流色谱得到的组分单体I的碳谱；
图6所示为逆流色谱得到的组分单体II的氢谱；
图7所示为逆流色谱得到的组分单体II的碳谱；
图8所示为逆流色谱得到的组分单体III的氢谱；
图9所示为逆流色谱得到的组分单体III的碳谱。
具体实施方式
实施例1
一种泰山紫草萘醌活性单体制备工艺，其特征在于，包含有如下步骤：（1）泰山紫草原料处理
将泰山紫草放在低温环境下进行干燥48小时，温度设置为35°C，干燥完毕后将泰山紫草粉碎至60目；
（2）超临界萃取工艺
将得到的泰山紫草干燥粉末使用超临界萃取装置进行萃取，使用超临界二氧化碳为萃取剂，在压力为40 MPa 、温度为45°C、萃取剂流速为35 L h-1的条件下进行萃取，在压力为6MPa 、温度为30°C的条件下进行分离，得到深紫色油状萃取物；
（3）将上一步中得到的深紫色油状萃取物使用高速逆流色谱仪进行分离纯化，逆流色谱的溶剂体系是石油醚-乙酸乙酯-乙醇-水，比例为(5:5:6:4, v/v)，形成互不相溶的上下两相，以上相作为固定相，固定相的保留率为55%，将2.35g超临界流体萃取样溶解于5ml等量的上相与下相，进行进样，分离过程中，流速为2ml/min，转速为850rpm，检测波长254nm. 根据逆流色谱图谱（如图3所示），收集所需组分；得高纯度活性单体I β-羟基异戊酰基紫草素；II 乙酰紫草素；III 异丁酰紫草素。
实施例2
一种泰山紫草萘醌活性单体制备工艺，包含有如下步骤：
（1）泰山紫草原料处理
将泰山紫草放在低温环境下进行干燥48小时，温度设置为35°C，干燥完毕后将泰山紫草粉碎至60目；
（2）超临界萃取工艺
将得到的泰山紫草干燥粉末使用超临界萃取装置进行萃取，使用超临界二氧化碳为萃取剂，在压力为40 MPa 、温度为45°C、萃取剂流速为35 L h-1的条件下进行萃取，在压力为6MPa 、温度为30°C的条件下进行分离，得到深紫色油状萃取物；
（3）将上一步中得到的深紫色油状萃取物使用高速逆流色谱仪进行分离纯化，逆流色谱的溶剂体系是石油醚-乙酸乙酯-乙醇-水，比例为(5:5:6.5:3.5, v/v)，形成互不相溶的上下两相，以上相作为固定相，固定相的保留率为65%，将2.35g超临界流体萃取样溶解于5ml等量的上相与下相，进行进样，分离过程中，流速为2ml/min，转速为800rpm，检测波长254nm. 根据逆流色谱图谱（如图3所示），收集所需组分；得高纯度活性单体I β-羟基异戊酰基紫草素，41.6 mg；II 乙酰紫草素，43.4 mg；III 异丁酰紫草素，49. 3mg。
实施例3
一种泰山紫草萘醌活性单体制备工艺，其特征在于，包含有如下步骤：
（1）泰山紫草原料处理
将泰山紫草放在低温环境下进行干燥48小时，温度设置为35°C，干燥完毕后将泰山紫草粉碎至60目；
（2）超临界萃取工艺
将得到的泰山紫草干燥粉末使用超临界萃取装置进行萃取，使用超临界二氧化碳为萃取剂，在压力为40 MPa 、温度为45°C、萃取剂流速为35 L h-1的条件下进行萃取，在压力为6MPa 、温度为30°C的条件下进行分离，得到深紫色油状萃取物；
（3）将上一步中得到的深紫色油状萃取物使用高速逆流色谱仪进行分离纯化，逆流色谱的溶剂体系是石油醚-乙酸乙酯-乙醇-水，比例为(5:5:6.5:3.5, v/v)，形成互不相溶的上下两相，以上相作为固定相，固定相的保留率为60%，将2.35g超临界流体萃取样溶解于5ml等量的上相与下相，进行进样，分离过程中，流速为2ml/min，转速为900rpm，检测波长254nm. 根据逆流色谱图谱（如图3所示），收集所需组分；得高纯度活性单体I β-羟基异戊酰基紫草素，41.6 mg；II 乙酰紫草素，43.4 mg；III 异丁酰紫草素，49. 3mg。
本发明所得三种单体的核磁数据如下：
组分1的核磁数据：
H NMR (400 MHz, CDCl3)d12.59 and 12.40 (each 1H, s, 5- and 8-OH),7.18 (2H, s, H-6 and 7), 7.03 (1H, d,J=1.0 Hz, H-2), 6.09 (1H, ddd,J=7.6,4.6, 1.0 Hz, H-11), 5.12 (1H,br t,J=7.6 Hz, H-13), 2.63 (1H, m, H-12a),2.49 (1H, dt,J=15.3, 7.6 Hz, H-12b),1.69 (3H, d,J=0.9 Hz, 15-CH3), 1.59
(3H, d,J=0.9 Hz, 16-CH3), 1.30 (6H, s,40-CH3 and 50-CH3).13C NMR(100 MHz, CDCl3):175.6 (C-1), 136.6(C-2), 147.7 (C-3), 177.1 (C-4), 168.9(C-5), 133.5 (C-6), 133.3 (C-7),168.4(C-8), 111.8 (C-9), 112.0 (C-10), 69.4(C-11), 33.1 (C-12), 117.8 (C-13), 131.5(C-14),26.0 (C-15), 18.2 (C-16), 171.9(C-10),46.7 (C-20), 69.4 (C-30), 29.4 (C-40),29.3. (C-50)
组分1氢谱如图4所示；
组分1的碳谱如图5所示；
Peak II:
组分2的核磁数据：
H NMR (400 MHz,CDCl3) d12.59 and 12.40 (each 1H, s,5- and 8-OH), 7.19 (2H, s, H-6 and 7),
6.99 (1H, s, H-2), 6.02 (1H, ddd,J=7.4,4.6, 0.9 Hz, H-11), 5.12 (1H, br t,J=7.6 Hz, H-13), 2.61 (1H, br dt,J=15.0, 7.3 Hz, H-12a), 2.49 (1H, dt,J=15.0, 7.3 Hz, H-12b), 2.14 (3H, s,COCH3), 1.58 (3H, s, 15-CH3), 1.26(3H, s, 16-CH3).13C NMR (100 MHz,CDCl3):176.8 (C-1), 136.3 (C-2), 148.4(C-3), 178.3 (C-4), 167.8 (C-5), 133.1(C-6), 132.9 (C-7),167.2 (C-8), 111.8 (C-9),112.1 (C-10), 69.7 (C-11), 33.1 (C-12),117.9 (C-13), 131.7 (C-14), 26.0 (C-15),18.1 (C-16), 169.9 (C-1
0), 21.2 (C-20).
组分2的核磁图谱
组分2的氢谱如图6所示；
组分2 的碳谱如图7所示；
Peak III:
H NMR (400 MHz,CDCl3)1H NMR (CDCl3) d12.59 and12.40 (each 1H, s, 5- and 8-OH), 7.18(2H, s, H-6 and 7), 6.98 (1H, s, H-2),6.02 (1H, ddd, J=7.4, 4.6, 0.9 Hz,H-11), 5.12 (1H, br t,J=7.6 Hz, H-13),2.64 (2H, m, H-12a and H-2’), 2.49 (1H,dt,J=15.0, 7.3 Hz, H-12b), 1.69 (3H, s,
15-CH3), 1.59 (3H, s, 16-CH3), 1.22 (3H,s, 30 -CH3), 1.20 (3H, s, 40 -CH3).13CNMR (100 MHz, CDCl3):177.0 (C-1),136.2 (C-2), 148.8 (C-3), 178.5 (C-4),167.6 (C-5), 133.0 (C-6), 132.9 (C-7),
167.0 (C-8), 111.8 (C-9), 112.0 (C-10),69.3 (C-11), 33.2 (C-12), 118 (C-13),131.6 (C-14), 26.0 (C-15), 18.2 (C-16),176.0 (C-10), 34.3 (C-20), 18.3 (C-30), 18.2(C-40).
组分III的氢谱如图8所示；
组分III的碳谱如图9所示；
采用MTT法检测了不同来源的乙酰紫草素对前列腺癌PC3和DU145细胞株增殖的影响，并计算其半数抑制率（IC50）。结果表明，商品化及本发明纯化的乙酰紫草素均能显著抑制PC3和DU145细胞的增殖，并呈时间、剂量依赖性（图1）。本发明纯化的乙酰紫草素对两种前列腺癌细胞的IC50略高于商品化的乙酰紫草素（表1）。在倒置显微镜下，对照组细胞边缘清晰，细胞折光度好，8μM本发明纯化的乙酰紫草素作用24h后，大量细胞开始皱缩，相互界线不清，并伴有部分细胞脱落（图2）。
表1. 不同来源的乙酰紫草素对前列腺癌细胞的IC50IC50PC3细胞株DU145细胞株
乙酰紫草素（本团队提取）8.59μM7.5 μM
乙酰紫草素（购自上海江莱生物科技有限公司）8.90μM7.91μM
当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。