用于镰刀菌产孢细胞及其分生孢子产生方式的显微分析方法.pdf

本发明具体涉及一种用于镰刀菌产孢结构的显微分析方法，包括以下步骤：分生孢子获得、分生孢子悬浮液的制备、制备SNA观察平板、接种培养、制备观察玻片、显微观察等。本发明显微观察方法可以直接观察到产孢细胞形态典型特征及其分生孢子的产生方式，可以根据需要，设定不同时间分析点，随时切取培养菌块，直接进行显微观察分析，一次接种，多次观察，可拍摄高质量的产孢细胞及其分生孢子产生方式图片。

1.   一种用于镰刀菌产孢细胞及其分生孢子产生方式的显微分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）分生孢子获得：取-80℃或4℃条件下保存的镰刀菌菌株，接种于PDA平板培养基上，25℃条件下培养7～10d；
（2）分生孢子悬浮液的制备：
① 向接种培养了7～10d的PDA平板培养基中加入15～25mL无菌水，用无菌涂布器轻轻涂布菌落表面，使分生孢子充分释放于水中，获得分生孢子悬浮液；
② 取2～4层无菌擦镜纸过滤步骤①中所得分生孢子悬浮液，去除菌丝或菌块，镜检其浓度后，调配成浓度为1×10⁵个/mL的分生孢子悬浮液；
（3）制备SNA观察平板：将制备好的、50～55℃的SNA培养基轻轻倒入一次性无菌培养皿中，制备厚度为1～1.2mm的SNA观察平板，待观察平板凝固后备用；
（4）接种培养：取10μL浓度为1×10⁵个/mL的分生孢子悬浮液与150 μL无菌水均匀混合后，均匀涂布于步骤（3）制备的SNA观察平板上，盖上培养皿盖并封口保湿，于25℃培养24～48h备用；
（5）制备观察玻片：根据镰刀菌产孢细胞及其分生孢子产生发育进程，设定不同时间分析点，用无菌切割刀切取厚度为1～1.2mm，大小为5～12mm×5～12mm的SNA观察培养菌块，倒扣于大小为40mm×18 mm的盖玻片上，轻轻挤压，赶出盖玻片与培养物之间的气泡；
（6）显微观察：采用倒置显微镜观察镰刀菌在个体发育进程中不同时期的产孢细胞形态特征及其分生孢子的产生方式。

2.   根据权利要求1所述的显微分析方法，其特征在于，所述PDA平板培养基的制备方法如下：取马铃薯400g加水煮沸10min的滤液、葡萄糖20g、琼脂粉15g，加蒸馏水至1000mL，调节pH至7.0，于121℃下灭菌15min。

3.   根据权利要求1所述的显微分析方法，其特征在于，所述SNA培养基的制备原料如下：蒸馏水 1L、KH₂PO₄ 1g、KNO₃ 1g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、KCl 0.5g、葡萄糖 0.2 g、蔗糖 0.2g、1mol/L的NaOH 0.6mL、琼脂粉15 g，调节pH至6.5～7.0，于121℃下灭菌15min。

用于镰刀菌产孢细胞及其分生孢子产生方式的显微分析方法
技术领域
本发明属于微生物学领域，具体涉及一种用于镰刀菌产孢细胞及其分生孢子产生方式的显微分析方法。
背景技术
镰刀菌属(Fusarium)属于半知菌类(Imperfecti fungi)、从梗孢目(Moniliales)、瘤座孢科(Tuberculariaceae)，该属分为蛛丝组、马特组、色变组和美丽组等多个组，各个组内又可分为不同的种，如蛛丝组中包含有焦斑镰刀菌、烟草镰刀菌、单隔镰刀菌和雪腐镰刀菌。镰刀菌属的各个种广泛分布于土壤和有机体中，一些镰刀菌，如尖孢镰刀菌和禾谷镰刀菌等或可以寄生于生物体，直接造成人类、动物、植物疾病；或产生有毒物质，污染人们和动物的食物。因此，开展不同镰刀菌分类鉴定研究具有十分重要的意义。另外，由于镰刀菌具有高度的适应性和变异性，容易随环境条件的变化而变异，有些镰刀菌种间差异很小，因而，给镰刀菌种类鉴定工作造成一定的困难。
目前，对镰刀菌分类除了采用分子系统学，如主要基因位点β-tubulin、mtSSU rDNA、28S rDNA、ITS、EF-1α、IGS等作为辅助分类外，更多的还是采用镰刀菌属种的传统分类鉴定：1）用PDA培养基培养，观察其培养性状, 如颜色、气味、生长速度、气生菌丝等；2）用SNA 或CLA 培养基培养观察其显微特征，如大、小型分生孢子的产生情况及其形态，厚垣孢子的有无和产生方式(假头状/假链状)，产孢细胞的类型(简单瓶梗或多出瓶梗)，粘孢团、菌核的产生情况等。因此，产孢细胞及其大、小型分生孢子产生方式的特征准确定性，是鉴定工作的重要一环，目前，人们常用的镰刀菌产孢细胞及其大、小型分生孢子产生方式的显微分析方法有：
1.插片法，其步骤是：（1）制备培养平板：将固体培养基（PDA或水琼脂）倒入无菌的培养皿中，厚度约0.3～0.5 cm，待培养平板凝固后进行后续试验；（2）接种：取出-80℃（或4℃）保存的菌株并接种于培养平板中央；（3）插片：用无菌镊子将无菌的盖玻片以 45 度角斜插于培养基中，插片位置与接种块距离为1.0～1.5cm；（4）培养：处理后的接种平板倒置，放于22～25℃适宜镰刀菌生长的环境中培养，待菌丝铺展开来，长过插片的位置后，即可取出玻片进行后续试验；（5）制片：打开培养皿盖，用镊子将生长有菌丝的玻片取出，除去玻片背面的菌丝及培养基，另取一个干净的载玻片，载玻片上滴一滴染料或蒸馏水，将玻片正扣在载玻片上，此时，菌丝在载玻片与盖玻片之间，避免制片过程中产生气泡；（6）封片：用甘油、树脂或指甲油等在上面做好的玻片四周涂抹封片；（7）观察：显微镜观察。
2.水琼脂凹槽接种法，其步骤如下：（1）在水琼脂培养平板上挖取一个凹槽，移除凹槽内的培养基；（2）将一块尺寸小于凹槽的水琼脂培养基块放置在凹槽内；（3）挑取待鉴定真菌培养物接种于位于凹槽内的水琼脂培养基块朝上的一面，然后将无菌盖玻片盖于水琼脂培养基块上；（4）盖上培养皿盖，密封后于22～25℃下培养；（5）培养结束后取出盖玻片，制作成真菌的观察玻片。可以根据不同菌种的生长周期，采用连续取片的方式，获得不同发育时期菌体观察玻片。
3.挖沟边沿接种法，步骤如下：（1）制备培养平板：将固体培养基（PDA或水琼脂）倒入无菌的培养皿中，厚度约0.3～0.5 cm，待培养平板凝固后进行后续试验；（2）在（1）制备培养平板上用无菌刀挖沟，除去沟内固体培养基，一般直径为9cm的培养皿挖两条沟，放上四个盖玻片；（3）接种培养，在沟的内侧涂抹制备的分生孢子悬浮液，盖上盖玻片，放于22～25℃培养；（4）根据实验设计，取出不同时期培养玻片进行观察，拍照。
4.菌块培养法，其步骤如下：（1）取直径7cm左右的圆形滤纸一张，铺放于一个直径9cm的平皿底部；（2）滤纸上放一个U形玻棒，其上再平放一张干净的载玻片与一张盖玻片，盖好平皿盖，进行灭菌，或者将物品分别灭菌，再按次序组装；（3）从事先准备好的平板中切一块边长1cm左右的正方形培养基，放在载玻片中央；（4）在培养基的四个侧面接种，然后用镊子夹起盖玻片盖在培养基上，轻轻压一下；（5）在滤纸上滴加无菌水或10%甘油3～4mL，盖上平皿盖，22～25℃下保湿培养；（6）培养结束后，直接取盖玻片制片观察。
5.挑取菌丝法，其步骤如下：（1）取出一片干净载玻片，滴一滴乳酸棉兰染色剂；（2）用接种针从接种10d的PDA培养平板上挑取少量菌丝（含有孢子）；（3）适当处理使菌丝均匀分散于染色液当中，盖上盖玻片并除去气泡；（4）制片2min后，即可用于显微镜观察。
以上报道的产孢结构玻片制作方法中，虽然某种程度上可以用于产孢细胞及其大小型分生孢子产生方式的观察鉴定，但在许多方面亟待改进：（1）早期需要借助玻片，连续观察需要更多的无菌玻片及其培养平板，容易造成污染且比较麻烦；（2）而直接挑取含有分生孢子的菌丝或加水、染色液处理玻片，玻片需要在含有水或染色剂中菌丝铺开，分生孢子易脱落，难以判断观察到产孢细胞及其分生孢子的产生方式等显微特征，不加水的玻片由于与培养基接触，培养基水分蒸发，附着于玻片上，有些呈现小水滴状，直接取出玻片观察时， 容易产生大量不易去除的气泡，影响观察效果；一些干燥少水的培养玻片，其表面附着菌丝长距离水分运输，距离培养基较远的生长菌丝营养、水分相对缺乏，其产孢结构及其分生孢子产生不能完全反应该物种的典型特征，加上无水玻片折射率存在，影响观察效果；（3）上述所有的用于产孢细胞及其分生孢子的产生方式观察菌体材料，接种方式都是群体接种，没有单个菌落培养，不能观察到单个孢子的发育过程，且群体接种，菌丝比较稠密，影响观察效果，尤其是观察该镰刀菌物种产孢细胞及其分生孢子产生方式的典型特征几率下降。总之，上述现有的不同观察分析方式从某种程度上都存在不足，都会给产孢细胞及其分生孢子产生方式的显微观察分析带来一定的麻烦。另外，分生孢子从萌发、生长、发育、产孢及其产孢结构形成等全生育阶段的研究迄今还没有详尽的报道；产孢结构及其分生孢子产生方式的观察和鉴定是尖孢镰刀菌分类的一个重要组成部分。因此，探索一种简单、高效、实用的分析产孢细胞的类型及其产孢方式，对准确鉴定镰刀菌种类具有重要作用。
发明内容
针对上述问题，本发明公开一种用于镰刀菌产孢细胞及其分生孢子产生方式的显微分析方法，可以直接观察到产孢细胞形态典型特征及其分生孢子的产生方式。
为解决上述问题，本发明通过以下技术方案实现：
设计一种用于镰刀菌产孢细胞及其分生孢子产生方式的显微分析方法，包括以下步骤：
（1）分生孢子获得：取-80℃或4℃条件下保存的镰刀菌菌株，接种于PDA平板培养基上，25℃条件下培养7～10d；
（2）分生孢子悬浮液的制备：
① 向接种培养了7～10d的PDA平板培养基中加入15～25mL无菌水，用无菌涂布器轻轻涂布菌落表面，使分生孢子充分释放于水中，获得分生孢子悬浮液；
② 取2～4层无菌擦镜纸过滤步骤①中所得分生孢子悬浮液，去除菌丝或菌块，镜检其浓度后，调配成浓度为1×10⁵个/mL的分生孢子悬浮液；
（3）制备SNA观察平板：将制备好的、50～55℃的SNA培养基轻轻倒入一次性无菌培养皿中，制备厚度为1～1.2mm的SNA观察平板，待观察平板凝固后备用；
（4）接种培养：取10μL浓度为1×10⁵个/mL的分生孢子悬浮液与150 μL无菌水均匀混合后，均匀涂布于步骤（3）制备的SNA观察平板上，盖上培养皿盖并封口保湿，于25℃培养24～48h备用；
（5）制备观察玻片：根据镰刀菌产孢细胞及其分生孢子产生发育进程，设定不同时间分析点，用无菌切割刀切取厚度为1～1.2mm，大小为5～12mm×5～12mm的SNA观察培养菌块，倒扣于大小为40mm×18 mm的盖玻片上，轻轻挤压，赶出盖玻片与培养物之间的气泡；
（6）显微观察：采用倒置显微镜观察镰刀菌在个体发育进程中不同时期的产孢细胞形态特征及其分生孢子的产生方式。
所述PDA平板培养基的制备方法：取马铃薯400g加水煮沸10min的滤液、葡萄糖20g、琼脂粉15g，加蒸馏水至1000mL，调节pH至7.0，于121℃下灭菌15min。
所述SNA培养基的制备原料：蒸馏水 1L、KH₂PO₄ 1g、KNO₃ 1g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、KCl 0.5g、葡萄糖 0.2 g、蔗糖 0.2g、1mol/L的NaOH 0.6mL、琼脂粉15g，调节pH至6.5～7.0，于121℃下灭菌15min。
本发明具有积极有益的技术效果：
1.本发明方法可以直接观察到单个孢子在个体发育进程中，产孢细胞形态特征及其分生孢子产生方式，克服了现有方法是群体接种不能观察单个孢子的发育进程的不足。
2.本发明方法进行产孢结构观察，在同一个培养平板上，根据镰刀菌产孢细胞及其分生孢子产生发育进程，可以根据需要，设定不同时间分析点，随时切取培养菌块，直接进行显微观察分析，一次接种，多次观察；同时，同一个培养皿中一次接种分生孢子数量众多，开展其产孢结构及其分生孢子产生方式观察，具有多种选择，更容易找到本物种产孢结构及其分生孢子产生的典型特征。
3.本发明直接利用较薄、透光度较高的固体培养菌块，用于显微观察。既有一定的水分保证，又不致使分生孢子脱落，既方便又快捷，而现有技术中的产孢细胞及其分生孢子的产生观察分析均借助于盖玻片、染色剂或无菌水等，若有水或染色剂，分生孢子容易脱落，如果不加水或染色剂，由于玻片折射作用，观察到的产孢细胞及其孢子形态不十分清楚，不能完全体现该物种的典型特征。
4.本发明观察到的是一个分生孢子发育而成，在24～48h内菌丝相对稀疏，更容易找到产孢细胞及其分生孢子的产生方式，有利于观察和拍摄，而现有其它方法接种是群体，菌丝密集生长，产孢细胞及其产生分生孢子容易与不同菌丝等交叉重叠，不容易找到产孢细胞及其分生孢子的产生方式，拍摄高质量的产孢细胞及其分生孢子产生方式比较困难。
5.本发明在SNA观察平板上一次单孢接种多个分生孢子，可形成多个单孢菌落，产孢细胞及其分生孢子的产孢方式分析具有可挑选性，可同时对多个菌落进行扫描观察。
附图说明
图1为串珠镰刀菌小分生孢子产孢细胞及其分生孢子的产生方式显微结构图；
图2为西瓜尖孢镰刀菌小分生孢子产孢细胞及其分生孢子的产生方式显微结构图；
图3为芝麻尖孢镰刀菌大分生孢子产孢结构及其大分生孢子的产生方式显微结构图；
图4为西瓜尖孢镰刀菌大分生孢子产孢结构及其大分生孢子的产生方式显微结构图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种用于串珠镰刀菌产孢细胞及其分生孢子产生方式的显微分析方法，包括以下步骤：
（1）分生孢子获得：取4℃条件下保存的镰刀菌菌株，接种于PDA平板培养基上，25℃条件下培养8d；
（2）分生孢子悬浮液的制备：
① 向接种培养了8d的PDA平板培养基中加入20mL无菌水，用无菌涂布器轻轻涂布菌落表面，使分生孢子充分释放于水中，获得分生孢子悬浮液；
② 取3层无菌擦镜纸过滤所得分生孢子悬浮液，去除菌丝或菌块，镜检其浓度后，调配成浓度为1×10⁵个/mL的分生孢子悬浮液；
（3）制备SNA观察平板：将制备好的、50℃的SNA培养基轻轻倒入一次性无菌培养皿中，厚度保持1.1mm，待观察平板凝固后备用；
（4）接种培养：取10μL浓度为1×10⁵个/mL的分生孢子悬浮液与150 μL无菌水均匀混合后，均匀涂布于（3）制备的SNA观察平板上，盖上培养皿盖并封口保湿，于25℃培养36h备用；
（5）制备观察玻片：根据镰刀菌产孢细胞及其分生孢子产生发育进程，设定不同时间分析点，用无菌切割刀切取厚度为1.1mm，大小为6mm×12mm的SNA观察培养菌块，倒扣于大小为40mm ×18 mm的盖玻片上，轻轻挤压，赶出盖玻片与培养物之间的气泡；
（6）显微观察：采用倒置显微镜观察镰刀菌在个体发育进程中不同时期的产孢细胞形态特征及其分生孢子的产生方式，见图1。
实施例2
一种用于西瓜尖孢镰刀菌产孢细胞及其分生孢子产生方式的显微分析方法，包括以下步骤：
（1）分生孢子获得：取-80℃条件下保存的镰刀菌菌株，接种于PDA平板培养基上，25℃条件下培养7d；
（2）分生孢子悬浮液的制备：
① 向接种培养了7d的PDA平板培养基中加入15mL无菌水，用无菌涂布器轻轻涂布菌落表面，使分生孢子充分释放于水中，获得分生孢子悬浮液；
② 取2层无菌擦镜纸过滤所得分生孢子悬浮液，去除菌丝或菌块，镜检其浓度后，调配成浓度为1×10⁵个/mL的分生孢子悬浮液；
（3）制备SNA观察平板：将制备好的、52℃的SNA培养基轻轻倒入一次性无菌培养皿中，厚度保持1mm，待观察平板凝固后备用；
（4）接种培养：取10μL浓度为1×10⁵个/mL的分生孢子悬浮液与150 μL无菌水均匀混合后，均匀涂布于（3）制备的SNA观察平板上，盖上培养皿盖并封口保湿，于25℃培养24h备用；
（5）制备观察玻片：根据镰刀菌产孢细胞及其分生孢子产生发育进程，设定不同时间分析点，用无菌切割刀切取厚度为1.2mm，大小为12mm×12mm的SNA观察培养菌块，倒扣于大小为40mm ×18 mm的盖玻片上，轻轻挤压，赶出盖玻片与培养物之间的气泡；
（6）显微观察：采用倒置显微镜观察镰刀菌在个体发育进程中不同时期的产孢细胞形态特征及其分生孢子的产生方式，见图2、4。
实施例3
一种用于西瓜尖孢镰刀菌产孢细胞及其分生孢子产生方式的显微分析方法，包括以下步骤：
（1）分生孢子获得：取4℃条件下保存的镰刀菌菌株，接种于PDA平板培养基上，25℃条件下培养10d；
（2）分生孢子悬浮液的制备：
① 向接种培养了10d的PDA平板培养基中加入25mL无菌水，用无菌涂布器轻轻涂布菌落表面，使分生孢子充分释放于水中，获得分生孢子悬浮液；
② 取4层无菌擦镜纸过滤所得分生孢子悬浮液，去除菌丝或菌块，镜检其浓度后，调配成浓度为1×10⁵个/mL的分生孢子悬浮液；
（3）制备SNA观察平板：将制备好的、55℃的SNA培养基轻轻倒入一次性无菌培养皿中，厚度保持1.0mm，待观察平板凝固后备用；
（4）接种培养：取10μL浓度为1×10⁵个/mL的分生孢子悬浮液与150 μL无菌水均匀混合后，均匀涂布于（3）制备的SNA观察平板上，盖上培养皿盖并封口保湿，于25℃培养48h备用；
（5）制备观察玻片：根据镰刀菌产孢细胞及其分生孢子产生发育进程，设定不同时间分析点，用无菌切割刀切取厚度为1mm，大小为8mm×9mm的SNA观察培养菌块，倒扣于大小为40mm ×18 mm的盖玻片上，轻轻挤压，赶出盖玻片与培养物之间的气泡；
（6）显微观察：采用倒置显微镜观察镰刀菌在个体发育进程中不同时期的产孢细胞形态特征及其分生孢子的产生方式，见图3。
本发明并不局限于上述具体实施方式，本领域技术人员还可据此做出多种变化，但任何与本发明等同或者类似的变化都应涵盖在本发明权利要求的范围内。