环脯氨酸-2-N-羟基-异亮氨酸在海洋污损生物防除中的应用 【技术领域】
本发明属于海洋防污涂料领域，具体涉及一种环二肽在海洋污损生物防除中的应用。
背景技术
海洋污损生物是指固着或栖息在船舶和各种人工设施水下固体表面上，对人类经济活动产生不利影响的海洋生物，其危害主要为增加船舶行进阻力，降低航速，增大燃料消耗；堵塞用水管道；改变金属腐蚀过程，导致局部腐蚀或穿孔；妨碍各类海洋设施的正常工作，引发漂移、失衡甚至导致倾覆；在海洋水产养殖方面，还会与养殖贝类争夺附着基和饵料，妨碍养殖对象的生长发育，并降低水产品品质等。
在海洋污损生物防除技术和方法中，以防污涂料的应用最为广泛。传统的防污涂料以毒料释放型防污为主要途径，通过释放涂料中的铜、汞、锡、砷等防污剂，在材料周围形成对海洋植物孢子以及海洋动物幼虫有毒杀作用的毒料浓度层，从而达到防污目的。然而，以砷、汞等的化合物为防污剂的防污涂料因毒性太大，已于上世纪50年被淘汰，从20世纪60年代起，含铜和含锡的防污涂料开始被大量使用。
有机锡化合物涂料曾经是世界上应用最为广泛的海洋防污产品，以三丁基锡(TBT，Tribultytin)为代表，其作用机制在于破坏生物细胞膜的正常功能，妨碍氧化磷酸化过程，破坏动物的线粒体，影响生物体正常的生命活动，造成污损生物体的死亡和脱落。自其20世纪60年代投入市场以来，因良好的防污效果倍受市场的青睐。然而，有机锡类化合物会干扰牡蛎的钙代谢，诱发海产腹足类性畸变，累积在鱼、贝等生物体内，通过食物链对人类健康产生不良影响，并对海洋生态系统造成严重的破坏。自上世纪80年代中期以来，在世界各地的海水、底泥和生物中都相继发现了有机锡化合物的存在。因此，国际海事组织(IMO)规定，自2008年起全面禁止在防污涂料中使用有机锡化合物。
而含铜的防污涂料的大量使用则会导致铜元素也会在海洋中，特别是海港中大量的聚集，从而对海洋生态环境产生不良影响，故其应用势必也会受到一定限制。目前海洋防污领域仍缺乏有效而安全的防污涂料，由此导致的环境问题已经十分严峻，因此，防污涂料的研究对象越来越倾向于由海洋动物中获取天然的防污物质。如目前已有报到从红藻(Delisea pulchra)中分离纯化得到的一系列卤代呋喃酮混合物，能够有效抑制纹藤壶、石莼和某些海洋细菌的附着；从苔藓动物(Zoobotryon pellucidum)中提取的2，5，6-三溴-1-甲基芦竹碱(TBG)对纹藤壶幼虫的附着有显著地抑制作用；从棘皮动物海星的体壁提取物也能抑制纹藤壶和多室草苔虫Bugula neritina的附着；从海绵提取物中分离出硫酸化甾醇、萜类、溴化产物和脂肪酸等多种次级代谢产物，其中从海绵Acanthellacavernosa提取的9种吡喃类次级代谢产物对纹藤壶的附着有抑制作用，从海绵Toxadocia zumi中提取的3种甾体硫酸盐则可阻止管栖多毛类Salmacinatribranchiata的生长；而从海绵Aplysina fistularis受伤组织中分离出的两种复合物也与该海绵良好的防污特性有关。此外，人们从不同海绵提取的嘌呤碱、酰胺及呋喃萜类次级代谢物，均被证实具有一定的防污作用。海洋生物中具有如此丰富的具有防污效果的物质，是与他们的生理习性及长期的净化结果密切相关的。由于海洋环境中各物种之间对空间的竞争十分激烈，各种大型动物和植物都是其他生物潜在的附着污损对象，为避免其它生物附着可能产生的危害，海洋中一些生物在长期的进化过程中，各自形成了许多独特的自我保护机制来保持自身体表的洁净。
因此，海洋世界中蕴含着极为丰富的防污资源有待研究及利用开发。但是，目前在防污领域的相关研究应用仍很少，被发现的防污物质仅占极少部分，并且，这些物质多为海洋生物体中含量低的代谢产物，自然生物体中含量极少，且其合成工艺复杂，不利于推广应用。因此，寻求更为适用于大规模人工合成和推广应用的天然海洋防污物质，成为这一领域一大迫切的问题。
环二肽(2，5-二酮哌嗪)是最小的环肽，许多天然环二肽化合物都具有明确的生物活性。环二肽结构的特殊性使得这类化合物的合成自成体系，通常由N端游离的直链肽酯在极性溶剂中回流，便可以很容易地得到目的物。因此，这类物质在人工合成方面研究深入，合成工艺成熟，获取途径简便，适合于大规模生产。但目前，在海洋防污领域，未有任何相关报道公开过有环二肽在污损生物防除中的作用。
【发明内容】
本发明地目的是针对现有技术的不足，提供一种安全无毒的，易于人工合成的天然产物在海洋污损生物防除中的应用。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
本发明是环脯氨酸-2-N-羟基-异亮氨酸在海洋污损生物防除中的应用，其分子式为C11H18N2O3，分子量226，结构式为：
本发明所述的环脯氨酸-2-N-羟基-异亮氨酸通过涂覆于固体表面，可以抑制海洋生物在固体表面的附着。但涂覆于固体表面仅是应用本发明的其中一种方式，任何将该物质应用于防治海洋生物附着的都属于本发明的保护范围。
本发明所述的环脯氨酸-2-N-羟基-异亮氨酸在涂覆量为1μg/cm2以上时，即对污损生物的附着产生明显的抑制作用。其优选的涂覆量为5μg/cm2以上。试验表明，环脯氨酸-2-N-羟基-异亮氨酸在抑制海洋动物附着的同时，并不会杀灭海洋生物，毒性极小。
本发明经过大量的实验，发现脯氨酸-2-N-羟基-异亮氨酸对蔓足类和双壳类的附着有很好的抑制作用。由于海洋污损生物由动物、植物和微生物三大类组成，其中危害较大且附着后难以清除的种类主要是具石灰质外壳、营固着生活的无柄蔓足类(藤壶)和双壳类软体动物(贻贝和牡蛎)等生物。因此，防污化合物筛选测试工作多选用无柄蔓足类和双壳类为实验对象。其中的无柄蔓足类又以网纹藤壶为代表，网纹藤壶是主要的污损生物中的一种，在浙江南部的洞头岛以南海域，其在污损生物群落中占绝对优势；而马氏珠母贝是一种生活在热带、亚热带海区的双壳类软体动物，在我国南海广泛分布，栖息于自低潮线附近至水深10m左右的海底，成体终生以足丝附着在岩礁、石砾上生活，可作为双壳类污损生物的代表。因此，本发明的验证试验采用网纹藤壶和马氏珠母贝作为实验对象，具有重要的代表性意义。
基于污损生物通常可分为两个生活阶段，其一为从幼虫脱出卵膜发育至时断时续地探索物体表面准备附着变态为止，为浮游生活阶段；自幼虫选好定居位置，在其表面附着、变态形成幼体后，为固着或附着生活阶段。从污损角度来看，污损生物对人类产生危害始于其营固着或附着生活以后。如能有效地抑制幼虫的附着变态，就能达到污损生物防除的目的。因此，本发明采用该两类海洋生物的幼虫为实验对象来检验化合物的防污效果，是具有科学合理性和代表性意义的。
本发明所述的环脯氨酸-2-N-羟基-异亮氨酸可以通过从海洋生物中提取获得。
其提取方法包括以下步骤：将海绵用酒精提取，提取液经减压浓缩、氯仿萃取后，再用石油醚萃取得初提液；初提液经反相硅胶柱进行2次纯化后，洗脱液再用半制备高效液相分离即得。其中所述的酒精优选95％的工业酒精；洗脱液均为水/甲醇。
本发明的提取方法优选以下方案：
将采集的美丽属海绵用95％的工业酒精常温下提取三次，浸提液减压浓缩后分散于水并用氯仿萃取三次；氯仿萃取部分用85％酒精溶解并用石油醚萃取三次；85％酒精萃取部分经反相硅胶柱层析，以水/甲醇(6∶4；5∶5；4∶6；3∶7；2∶8；1∶9；0∶10)梯度洗脱得到25个组分F1-F25；将其中的组分F2进一步用反相硅胶柱层析分离，以水/甲醇(9∶1；8∶2；7∶3；6∶4；5∶5)梯度洗脱得到12个组分G1-G12；用半制备高效液相分离组分G2，流动相为水/甲醇(75∶25)，即可获得该化合物。
本发明所述的环脯氨酸-2-N-羟基-异亮氨酸还可以通过人工合成获得。环脯氨酸-2-N-羟基-异亮氨酸属于环二肽中的一种，容易通过人工合成途径获得。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明公开的环脯氨酸-2-N-羟基-异亮氨酸对海洋生物在固体上的附着具有显著的抑制作用，当固体表面涂覆了低含量的该物质时，即有明显的防治海洋生物附着的作用。
2.本发明公开的环脯氨酸-2-N-羟基-异亮氨酸为天然存在的有机化合物，不会造成水体环境的污染，不会通过食物链传递导致其在生物体中的富集，对环境友好，安全性高。
3.本发明公开的环脯氨酸-2-N-羟基-异亮氨酸在有效抑制海洋生物附着的同时，安全无毒，不含铜和锡等重金属元素，不会杀灭海洋生物，只起到驱赶作用，从环境保护角度而言具有良好的社会效益。
4.本发明公开的环脯氨酸-2-N-羟基-异亮氨酸是天然产物，但其人工合成工艺成熟，获取途径简便，适合于大规模生产，不受限于生物体内的含量，具有可靠稳定的来源，推广应用潜力大，在各类海洋人工设施的污损生物防除中具有良好的应用前景。
【具体实施方式】
实施例1
实验组I：将环脯氨酸-2-N-羟基-异亮氨酸用甲醇溶解，配制浓度为28.26μg/ml的溶液。在直径为6cm的培养皿中加入1ml该溶液，并使其均匀覆盖培养皿底部。待溶剂完全挥发后，涂覆于培养皿底部的环脯氨酸-2-N-羟基-异亮氨酸含量为1μg/cm2。加入10ml海水。
实验组II：将环脯氨酸-2-N-羟基-异亮氨酸用甲醇溶解，配制浓度为149.78μg/ml的溶液。在直径为6cm的培养皿中加入1ml该溶液，并使其均匀覆盖培养皿底部。待溶剂完全挥发后，涂覆于培养皿底部的环脯氨酸-2-N-羟基-异亮氨酸含量为5.3μg/cm2。加入10ml海水。
对照组：加1ml甲醇，使溶液均匀分布于培养皿底部，待溶剂挥发完全，再加入10ml海水。
空白组：加入10ml海水。
实验组、空白组和对照组各设5个平行样。于各样品中分别加入30只网纹藤壶金星幼虫。置于温度为29℃左右的恒温培养箱内于黑暗环境中培养。每隔24小时观察一次。培养72小时后对各组幼虫最终的附着和死亡状况进行统计分析。
表1列出了实验组、对照组和空白组网纹藤壶金星幼虫的附着和死亡率。可见，在恒温培养箱中培养72小时后，空白组的幼虫附着率约为54％，对照组约50％，空白组和对照组金星幼虫的附着率无显著差异(p＞0.05)，表明作为溶剂的甲醇挥发后不会遗留影响金星幼虫活性的有害物质，适于溶解该化合物。至于经环脯氨酸-2-N-羟基-异亮氨酸处理的实验组，其金星幼虫的附着率为0，远远低于对照组，差异极其显著(p＜0.01)，表明这种化合物具有极好的抑制网纹藤壶金星幼虫附着的能力。
表1
组别 测试剂量 附着率 (％) 死亡率 (％) 空白组 - 54.4 0 对照组 - 50.0 0 实验组I 1μg/cm2 0 0 实验组II 5.3μg/cm2 0 0
实施例2
实验组：将环脯氨酸-2-N-羟基-异亮氨酸用甲醇溶解，配制浓度为282.6μg/ml的溶液。在直径为6cm的培养皿中加入1ml该溶液，并使其均匀覆盖培养皿底部。待溶剂完全挥发后，涂覆于培养皿底部的环脯氨酸-2-N-羟基-异亮氨酸含量为10μg/cm2。加入10ml海水。
对照组：加1ml甲醇，使溶液均匀分布于培养皿底部，待溶剂挥发完全，再加入10ml海水。
空白组：加入10ml海水。
幼虫数量的确定：从育苗池取含马氏珠母贝面盘幼虫的水体并用筛绢浓缩。分三次各取50ml，滴入1-2滴福尔马林溶液杀死幼虫后于显微镜下计数，所得平均值即为水体中幼虫的密度。
实验组、空白组和对照组均设5个平行样，在各样品中加入约30个幼虫。在温度约为26℃的培养箱中于黑暗环境下培养。每隔24小时观察一次。培养72小时后对各组幼虫最终的附着和死亡状况进行统计分析。
表2列出了实验组、对照组和空白组马氏珠母贝幼虫的附着和死亡率。可见，在恒温培养箱中培养72小时后，空白组的幼虫附着率约为33％，对照组约32％，空白组和对照组面盘幼虫的附着率无显著差异(p＞0.05)，表明作为溶剂的甲醇挥发后不会遗留影响面盘幼虫活性的有害物质，适于溶解该化合物。而经环脯氨酸-2-N-羟基-异亮氨酸处理的实验组，其幼虫的附着率为0，远远低于对照组，差异极其显著(p＜0.01)，表明这种化合物能有效地抑制马氏珠母贝幼虫的附着。
表2
组别 测试剂量 附着率 (％) 死亡率 (％) 空白组 - 32.6 0 对照组 - 31.8 0 实验组 10μg/cm2 0 0