含活性蛋白质的苦瓜降糖原药的制备方法 【技术领域】
本发明涉及含活性蛋白质的苦瓜降糖原药的制备方法。
背景技术
作为一种夏季时令蔬菜，苦瓜已有数百年食用和药用历史。苦瓜有清暑涤热、明目解毒的功能，主治热病烦渴引饮、中暑、痢疾、赤眼疼痛、痈肿丹毒、恶疮。苦瓜中含有苦瓜素(α-，β-Momordicin)、苦瓜凝聚素(Momordica Charantia Lectins I，II，MCL)、苦瓜抗免疫缺陷病毒蛋白(Momordica Anti-HIV Protein，MAP30)、苦瓜抑制剂(Momordica CharantiaInhibitor，MCI)、核糖失活蛋白(Ribosome Inactivating Protein，RIP)、苦瓜甙类(MomordicosideA，B，C，D，F1，G，H，I，L)等多种活性成分。大量的药理研究表明，苦瓜果实果汁对实验性四氧嘧啶大鼠具有降血糖作用，治疗21d后，大鼠血糖明显下降。近几年有有关苦瓜降糖产品的研制与开发成为糖尿病防治的热门，开发出的产品也多种多样。但在苦瓜活性蛋白质的分离技术上主要沿用了传统的两种加工工艺：水提取再加热浓缩工艺和水提取再冷冻浓缩工艺。这两种加工工艺存在着明显的缺点，水提取加热浓缩工艺需要加热蒸发水，耗时耗能，而且加热浓缩很容易使活性蛋白质变性失活，使药效大大减弱，甚至没有药效；而水提取后再冷冻干燥成冻干粉的工艺虽然很好地保证了活性蛋白质的药效活性，但更加耗时耗能，成本极高。同时这两种工艺所得产品均须在低温下保存，有效期短。
【发明内容】
本发明所要解决的问题是提供一种含活性蛋白质的苦瓜降糖原药的制备方法，该方法可得到一种相对比较稳定的容易保存的含活性蛋白质的苦瓜降糖原药；所含蛋白质不易失去活性，成本较低。
本发明提供的技术方案是：含活性蛋白质的苦瓜降糖原药的制备方法，在温度为-10～40℃、溶液pH＝4.0～7.0、搅拌条件下，先将苦瓜果汁与2～5g/100ml聚赖氨酸水溶液和2～5g/100ml氯化钙水溶液按苦瓜果汁∶聚赖氨酸水溶液∶氯化钙水溶液＝700ml∶6-15ml∶1-3ml的比例进行混合，静置2-4小时，加入2～5g/100ml卡波沫水溶液2.5-4.5ml，进一步搅拌半小时后，再静置4-8小时，离心分离；将所得固体低温0～-5℃下真空干燥，即得含活性蛋白质的苦瓜降糖原药。
所述卡波沫为卡波沫934P或卡波沫974P。
上述温度为-10～40℃、溶液pH＝4.0～7.0、搅拌速度为600～800转/分；苦瓜果汁∶5％(wt/ml)聚赖氨酸水溶液∶5％(wt/ml)氯化钙水溶液∶5％(wt/ml)卡波沫水溶液＝700ml∶6-15ml∶1-3ml∶2.5-4.5ml。
将上述制得的含活性蛋白质的苦瓜降糖原药和市售魔芋精粉以1∶10～15的重量比物理混合干燥，以每袋10克分装真空密封，制得含活性蛋白质的苦瓜降糖冲剂。
本发明采用药物制剂中常用的高分子辅料聚赖氨酸和卡波沫为共沉降剂，其中聚赖氨酸是文献报道具有稳定蛋白质和抑菌作用，卡波沫可与聚赖氨酸很好共沉。因此，通过共沉降的方法，将苦瓜活性蛋白质与共沉降剂(聚赖氨酸和卡波沫)一起沉降下来，从而得到一种相对比较稳定的容易保存的含活性蛋白质的苦瓜降糖原药。这种共沉降技术的运用，不仅避免了水提取加热浓缩工艺中存在的蛋白质受热变性失活的问题，而且也避免了水提取冷冻干燥浓缩工艺的高成本和保存困难的不足。同时，本发明在技术实施过程中无须加热浓缩和冷冻干燥，避免了其能量消耗和工艺周期长的缺点。
【具体实施方式】
实施例1
将市售新鲜的苦瓜1公斤洗净、去籽打浆，用200目滤布过滤，得到苦瓜果汁700毫升，在-10～-5℃、800转/分的机械搅拌条件下，依次加入5wt％聚赖氨酸水溶液(聚赖氨酸平均分子量15000)6ml、5wt％氯化钙水溶液1.0ml，调节其pH＝4.0～4.5；2小时后，再加入5wt％卡波沫934P水溶液2.5ml。在此温度条件下继续搅拌约半小时，静置沉降4小时；然后通过虹吸，小心转移出上清液，所得下层用其2.0倍体积的丙酮处理，过滤，在-5～0℃条件下真空干燥，粉碎，用100目筛网过筛，即得含苦瓜降糖蛋白的原药干粉11.3克。
实施例2
将新鲜的苦瓜1公斤洗净、去籽打浆，用200目滤布过滤，得到苦瓜果汁700毫升，在35～40℃、600转/分的机械搅拌条件下，依次加入2wt％聚赖氨酸水溶液(聚赖氨酸平均分子量22000)15ml、5wt％氯化钙水溶液3.0ml，调节其pH＝6.5～7.0；4小时后，再加入5wt％卡波沫934P水溶液4.5ml。在此温度条件下继续搅拌约半小时，静置沉降8小时，然后通过虹吸，小心转移出上清液，所得下层用其2.0倍体积的丙酮处理，过滤，在-5～0℃条件下真空干燥，粉碎，用100目筛网过筛，即得含苦瓜降糖蛋白的原药干粉9.7克。
实施例3
将新鲜的苦瓜1公斤洗净、去籽打浆，用200目滤布过滤，得到苦瓜果汁700毫升，在10～15℃、600转/分的机械搅拌条件下，依次加入5wt％聚赖氨酸水溶液(聚赖氨酸平均分子量20000)10ml、2wt％氯化钙水溶液2.0ml，调节其pH＝5.0～5.5；3小时后，再加入5wt％卡波沫934P水溶液4.5ml。在此温度条件下继续搅拌约半小时，静置沉降5小时，然后通过虹吸，小心转移出上清液，所得下层用其2.0倍体积的丙酮处理，过滤，在-5～0℃条件下真空干燥，粉碎，用100目筛网过筛，即得含苦瓜降糖蛋白的原药干粉10.7克。
实施例4
将新鲜的苦瓜1公斤洗净、去籽打浆，用200目滤布过滤，得到苦瓜果汁700毫升，在0～5℃、800转/分的机械搅拌条件下，依次加入5wt％聚赖氨酸水溶液(聚赖氨酸平均分子量20000)10ml、5wt％氯化钙水溶液1.5ml，调节其pH＝5.0～5.5；4小时后，再加入2wt％卡波沫934P水溶液3.5ml。在此温度条件下继续搅拌约半小时，静置4小时；然后通过虹吸，小心转移出上清液，所得下层用其2.0倍体积的丙酮处理，过滤，在-5～0℃条件下真空干燥，粉碎，用100目筛网过筛，即得含苦瓜降糖蛋白的原药干粉12.3克。
实施例5
将新鲜的苦瓜1公斤洗净、去籽打浆，用200目滤布过滤，得到苦瓜果汁700毫升，在0～5℃、800转/分的机械搅拌条件下，依次加入5wt％聚赖氨酸水溶液(聚赖氨酸平均分子量18000)10ml、5wt％氯化钙水溶液1.5ml，调节其pH＝5.0～5.5；3小时后，再加入5wt％卡波沫974P水溶液3.5ml。在此温度条件下继续搅拌约半小时，静置4小时；然后通过虹吸，小心转移出上清液，所得下层用其2.0倍体积的丙酮处理，过滤，在-5～0℃条件下真空干燥，粉碎，用100目筛网过筛，即得含苦瓜降糖蛋白的原药干粉14.3克。
实施例6
将实施例3和实施例4所得的苦瓜降糖蛋白原药干粉20克先与50克烘干过的市售魔芋精粉进行物理混合，待其充分混均后，再将其分次加入到200克的干燥魔芋精粉中，并使其充分混合，以每袋约10克装入专用塑料袋中，真空密封。即分别得到苦瓜降糖冲剂I号和II号。
实施例7
取喂养4个月体重30-40克的实验小鼠50只，适应喂养5天，空腹24小时后，以70mg/Kg剂量给尾静注射四氧嘧啶，每天一次，五天后测空腹血浆葡萄糖，取血糖值在20-35之间，体重为30-40克之间的小鼠30只为理想糖尿病模型。将这些小鼠随机分成3组，每组10只，雌雄同笼，第一组为对照组，第二、三组为用药组，第一组正常喂养，第二、三组继续喂养5天后，开始分别加入苦瓜降糖冲剂I号和II号喂养20天，用量为0.6克冲剂粉/Kg体重。用药前后鼠尾巴取血，用葡萄糖氧化酶—过氧化酶(GOP--PAP)法，应用血糖试剂盒及分光光度计测定血糖值。结果如下：
组 数 用药前(mmol/L) 用药后(mmol/L) 差值 降糖效果
第一组 21.66±5.25 20.03±4.73 1.71±3.46
第二组冲剂I号 18.09±4.07 8.20±4.29 10.58±5.07 58.49％
第三组冲剂II号 23.78±3.72 13.69±5.24 10.92±5.33 42.05％
(P＜0.01)
结论：表中数据说明：苦瓜降糖冲剂I号和II号均有好的降糖效果，并且I号降糖冲剂比II号降糖冲剂的更好些，表明采用此工艺制备含活性蛋白质的苦瓜降糖原药是切实可行的实用方法。