适用于制备药物和化妆品组合物的亚细 亚酸盐和羟基积雪草酸盐 【发明领域】
本发明涉及适用于制备药物和化妆品组合物的亚细亚酸盐和羟基积雪草酸(madecassic acid)盐的制备。
现有技术
亚细亚(2α，3β，23-三羟基脲(trihydroxyurs)-12-烯-28-酸)酸(1)，羟基积雪草酸(2)和积雪草苷(3)是积雪草(CentellaAsiatica)三萜总馏分(FTT)的主要组成成份。
所述FTT的消化、利尿、再生、降温、营养，退热和结瘢等特性已为人们所认识。但是药理学兴趣主要集中在最后一种特性上。
实际上已经证明，通过对成纤维细胞以及对胶原代谢所必需的两种氨基酸--脯氨酸和丙氨酸产生作用，积雪草FTT可以对结缔组织提供独特的调节活性。
所有上述作用将导致较强生物刺激作用的伤口愈合过程产生，并导致较好的上皮再形成。
因此，积雪草FTT的治疗用途被定位于治疗红斑，静脉曲张性溃疡，褥疮，结瘢缓慢，灼伤，外伤和手术创伤，全身和局部发炎过程。
文献资料一致认为在成纤维细胞刺激以及随后促进上皮再形成的过程中，亚细亚酸是积雪草FTT中最具活性的成分(F.Bonte，M.Dumas，C.Chaudagne，A.Meybeck.Planta Med.60，133，1994.F.X.Maquart，G.Bellon，P.Gillery，Y.Wegrowski，J.Borcel，ConnetTissue Res.24，107，1990)，但是在制备适用于进行局部治疗的组合物的过程中存在相当的问题。同样，羟基积雪草酸也有类似的问题。
实际上，虽然在它们的分子结构中存在4个亲水功能基团(4个羟基中3个基团为醇基，一个基团为酸)，但是亚细亚酸和羟基积雪草酸的可湿性都比较差，几乎不溶于水，其理化特性要求在配制用于局部使用的制剂、尤其是亲水型制剂时需要使用独特方法和特殊的赋形剂。另外，人们还了解到皮肤吸收主要以经表皮地方式(在细胞内和通过细胞)进行，并且主要通过有效组分对主要由角蛋白和水组成的角质层的作用来控制。
因此，除了配制方面的问题以外，亚细亚酸和羟基积雪草酸在表皮水平上具有适当的生物利用度这个问题也仍然未能解决(P.-J.Shim，J.-H.Park，M.-Sun Chang，M.-J.Lim，D.Kim，Y.H.Yung，S.-S.Jew，E.H.Pavk，H.-Doo Kim，Bio Organic and MedicalChemistry Letters 24，2937，1996)。
图表说明
表1显示了使用不同剂量的Asialene(a)和L-Asialene(b)所观察到的水肿抑制百分比。
发明概述
目前发现积雪草三萜馏分中酸类的盐，如本发明所述的与药学上可接受的有机碱成盐的亚细亚酸和羟基积雪草酸的盐类可以解决现有技术中的问题。
实际上，上述盐类可以：
a)用来容易地制备有利于局部用组合物配制的亲水性凝胶；
b)增强亚细亚酸和羟基积雪草酸在表皮水平上的局部生物利用度；另外还适用于制备用于系统治疗的药物组合物。
本发明所述的亚细亚酸和羟基积雪草酸盐类的上述及其它特性将主要在以下详细描述中进行说明。
本发明的详细描述
本发明涉及与药学上可接受的有机碱形成的亚细亚酸盐和羟基积雪草酸盐，其适用于制备药物和化妆品组合物。
所述碱类包括乙二胺，乙醇胺，二乙醇胺，赖氨酸，氢氧化苄基三甲基铵和氢氧化四甲基铵。
根据以下几个步骤制备所述盐类：
a)在室温条件下，在例如氯仿或乙醇等有机溶剂中制备上述有机碱溶液；
b)在例如甲醇等有机溶剂中制备亚细亚酸或羟基积雪草酸溶液，并加热至60-80℃；
c)在室温条件和搅拌下，将亚细亚酸或羟基积雪草酸溶液慢慢加入到有机碱溶液中；
d)将通过步骤c)制得的混合物加热至60-70℃并持续10至30分钟；
e)在真空和55-60℃的条件下除去溶剂；
f)用有机溶剂洗涤得到的残渣，然后用合适的有机溶剂进行结晶。
反应中使用的有机碱和亚细亚酸或羟基积雪草酸的摩尔比在3∶1到1∶1范围之间。
所得盐类除通过实施例中将要报告的常用分析方法进行定性之外，还使用PERKIN ELMER 398分光光度计通过红外分光光度法进行了定性。
所得盐类的红外(K Br)光谱表明，由于羧基化基团的不对称和对称搅动频率的原因，分别在1540和1380cm-1的位置上存在很强的吸收带，其可作为已发生成盐作用的分光光谱证据。
另外，还可以在3600和3100cm-1之间观察到由氨和醇带形成的强吸收带。
在2500和2000cm-1之间这个区域中主要由伯氨基团引起的泛频峰带或混合峰带存在于实施例中所描述的盐类4，5a，5c，7和8a的光谱中。
如按照盐与水1∶12到1∶20的比例(重量比)，用水对本发明所描述的盐类进行处理，就可以形成凝胶。这种特性有助于带有亲水性凝胶的局部用组合物的制备。
另外，上述盐类还可以通过具有(羟基或α-氨基酸)极性基团或(四甲基或苄基三甲基)非极性取代基的有机碱的适当选择来调节亲水性-亲脂性之间的平衡。
本发明所述的盐类具有比积雪草三萜总馏分(FTT)出乎意料高的抗炎和结瘢功效，因此可以成功地用于局部治疗红斑，静脉曲张性溃疡，静脉供血不足，褥疮，结瘢缓慢，灼伤，外伤和手术创伤，眼部和皮肤营养疾病(alloeosises)，以及发炎过程的药物和化妆品组合物的制备。另外，上述盐类还可用于制备具有同样的治疗和化妆目的的全身用口服和非肠道组合物。
上述组合物含有与药学上可接受的或化妆上适合的赋形剂和/或稀释物质相混合的并具有治疗有效或化妆适合剂量的本发明所述的盐类。
现报告以下实施例来说明本发明：
实施例1
与乙二胺成盐的亚细亚酸盐的制备(4)
根据下列反应进行制备：
- + + - (4)
其中亚细亚酸用HAs表示。这个缩写在以下实施例中还将会用到，含义相同。
在室温和搅拌条件下，将在60℃条件下制得的亚细亚酸(4.89g，10mmol)的甲醇溶液(50ml)逐滴加至乙二胺(1.80 g，30mmol)的氯仿溶液(30ml)中。
滴加完成后，将混合物在60-65℃下加热20分钟。真空除去溶剂以后，所得粘稠残渣用乙醚(30ml X2)洗涤两次，再用乙腈(30ml)洗涤一次，最后用乙醇(95％)热结晶。得到白色无定型固体，其与两个水分子形成结晶，M.p.311-317℃。C62H108N2O12 理论值：C：69.37；H：10.14；N：2.61
实测值：C：69.16；H：10.10；N：2.59
使用Fisher-John仪来测定熔点，使用FISON INSTRUMENTS S.p.Asociety(米兰)公司的EA1110元素分析仪进行元素分析。
实施例2
分别与乙醇胺(5a)、二乙醇胺(5b)和赖氨酸(5c)形成的亚细亚酸盐的制备
根据下列反应进行制备：
在室温和搅拌条件下，将亚细亚酸(4.89g，10mmol)的甲醇溶液(80ml)分别加至有机碱(12mmol)乙醇胺，二乙醇胺和赖氨酸的甲醇溶液(80ml)中。
加入开始15分钟后，将所得混合物在50-60℃下加热20分钟。
在真空条件下蒸除甲醇以后，用合适的有机溶剂对所得残渣进行结晶，特别地，化合物5a和5b使用甲醇-丙酮的混合物进行结晶，化合物5c使用甲醇进行结晶。制得的三种化合物的熔点如下：
5a：241-245℃；
5b：299-305℃；
5c：300-314℃；
制得的三种化合物的元素分析结果如下：
5a：C32H59NO8 理论值：C：65.61；H：10.15；N：2.39
实测值：C：65.41；H：10.07；N：2.45
5b：C34H63NO9 理论值：C：64.83；H：10.08；N：2.22
实测值：C：64.95；H：9.98；N：2.30
5c：C36H66N2O9 理论值：C：64.45；H：9.92；N：4.18
实测值：C：64.65；H：9.99；N：4.07
实施例3
与氢氧化四甲基铵(6a)和氢氧化苄基三甲基铵(6b)成盐的亚细亚酸盐的制备
根据下列反应进行制备：
6a：R3＝CH3
6b：R＝C6H5CH2
在室温和搅拌条件下，将亚细亚酸(4.89g，10mmol)的甲醇溶液(80ml)分别加入氢氧化四甲基铵和氢氧化苄基三甲基铵(12mmol)的甲醇溶液(80ml)中。
15分钟后，将所得混合物在50-60℃条件下加热20分钟。
真空条件下除去甲醇以后，用合适的溶剂将所得残渣进行结晶，特别地，化合物6a使用甲醇-丙酮的混合物进行结晶，化合物6b使用甲醇-乙腈的混合物进行结晶。制得的两种化合物的熔点如下：
6a：214-220℃；
6b：203-209℃；
制得的两种化合物的元素分析结果如下：
6a：C34H63NO7 理论值：C：68.30；H：10.62；N：2.34
实测值：C：68.12；H：10.43；N：2.38
6b：C40H67NO7 理论值：C：71.28；H：10.02；N：2.08
实测值：C：71.54；H：10.21；N：1.98
实施例4
与乙二胺(7)成盐的羟基积雪草酸盐的制备
根据下列反应进行制备：
- +
(7)
其中羟基积雪草酸用HMAD表示。这个缩写在以下实施例中还将会用到。
制备过程与实施例1相同，但用羟基积雪草酸(5.05g，10mmol)的甲醇溶液(50ml)代替亚细亚酸。
盐与一个水分子形成结晶，M.p.170-178℃。
制得的化合物的元素分析结果如下：
C32H58N2O7 理论值：C：65.95；H：10.03；N：4.81
实测值：C：65.66；H：9.78；N：4.74
实施例5
与乙醇胺(8a)和二乙醇胺(8b)成盐的羟基积雪草酸盐的制备
按照下列反应进行制备：
8a-8b8a：R1＝H，R2＝CH2CH2OH8b：R1＝R2＝CH2CH2OH
制备过程与实施例2相同，但用羟基积雪草酸(5.05g，10mmol)的甲醇溶液(80ml)代替亚细亚酸。
在甲醇-丙酮混合物中进行结晶。
制得的两种化合物的元素分析结果证实了以下分子式：
8a：C32H58NO8
88：C36H61NO9实施例6
与氢氧化四甲基铵(9a)和氢氧化苄基三甲基铵(9b)成盐的羟基积雪草酸盐的制备
按照下列反应进行制备：
9a：R3＝CH3
9b＝R3＝CH2C6H5
制备过程与实施例3相同，但用羟基积雪草酸(5.05g，10mmol)的甲醇溶液(80ml)代替亚细亚酸。
9a的结晶在甲醇-丙酮混合物中进行，9b的结晶在乙醇-乙腈混合物中进行。
制得的两种化合物的元素分析结果证实了以下分子式：
9a：C34H61NO7
9b：C41H65NO7
实施例7
与乙二胺成盐的亚细亚酸盐凝胶的制备
将按照实施例1所述方法制得的1g乙二胺与亚细亚酸盐所成—盐(4)，装入配备有磁力搅拌器的烧瓶中。在室温条件下加入15ml水，然后开始低速(每分钟100-150转)搅拌。
在搅拌转速逐渐加快至每分钟1000-1500转的同时，逐渐向盐中加水以便形成凝胶。经过4-6分钟后，制得一种具有半固体稠度的凝胶，继续搅拌5-8分钟后其呈半透明状。
生物实验
为了通过与现有技术的产品进行比较来证实本发明所述盐类的结瘢和血小板抗凝集活性，对按照实施例1所述方法制得的表示为Asialene的盐和表示为FTT的积雪草三萜总馏分进行了对比实验。
另外，还对Asialene和按照实施例2所述方法制得的L-Asialene即与赖氨酸成盐的亚细亚酸盐同NSAID吲哚美辛的抗炎活性进行了对比评估。
1.来自人类培养内皮细胞的PG1和纤连蛋白的生成实验。
用可以推断该物质的血管渗透性和结瘢功效的体外实验对表示为Asialene的按照实施例1所述方法制得的盐的结瘢活性进行了评估。
该项实验在于对人类脐带静脉胶原酶提取的细胞的PG1生成的评价，所述细胞悬浮并接种于合适的培养基(E199+FCS 20％+L-谷氨酰胺2mM+青霉素200U/ml+链霉素200μg/ml)上，并在75ml或25ml烧瓶中培养48-72小时。
用0.05％的胰蛋白酶和0.02％的EDTA除去细胞，然后再用接种在35mmPetri皿中的次级培养物制备传代培养物，置于带有5％CO2 100％湿度的培养箱中。为了评估细胞的形态和融合以及PG1的生成，使用约300,000细胞/毫升的培养基按照以下三种方案在Burker室中进行计数：
1.细胞+培养基+EtOH(0.75g/dl)
2.细胞+培养基+EtOH(0.75g/dl)+FTT(15μg/ml)
3.细胞+培养基+EtOH(0.75g/dl)+Asialene(1.5μg/ml)
在24小时和48小时时，用倒置光学显微镜对培养物进行评估，监测细胞的附着和生长情况，同时还要用RIA方法对上清液等分试样中的前列环素(6-Keto PGF1)的稳定代谢进行测定。
下面的表格中给出了以μg/ml为单位的6-Keto PGF1数值(结瘢活性与6-Keto PGF1的水平相互关联)。 24h 48h培养基+EtOH(0.75g/dl) 415 380培养基 +EtOH(0.75g/dl)+FTT(15μg/ml) 520 475培养基 +EtOH(0.75g/dl)+Asialene(1.5μg/ml) 980 889
为了对纤连蛋白进行评估，将初级培养物再次悬浮于0.05％的胰蛋白酶/0.02％的EDTA中。对用Hanks溶液洗涤两次的细胞进行计数，以保证至少达到300,000细胞/毫升并进行接种。48小时后除去上层清液，制备载玻片，用PBS洗涤两次后进行干燥，并于醋酸/乙醇中固定30分钟；然后再用PBS洗涤一次，加入多克隆兔抗人纤连蛋白抗体(1∶40，Dako)。室温条件下孵育30分钟后，用PBS进行洗涤，然后加入荧光化的抗兔免疫球蛋白抗体(1∶100，Dako)。将载玻片孵育30分钟后置于物镜架上，并用荧光电子显微镜进行读取观察。
在下面的表格中列出了与纤连蛋白细胞间丝(1∶100比例)有关的数目。培养基 +EtOH(0.75g/dl)1培养基 +EtOH(0.75g/dl)+FTT(15μg/ml)7培养基 +EtOH(0.75g/dl)Asialene(1.5μg/ml)85
2.对血小板聚集抑制作用的评价
按照1∶9的比例，将从一周内未曾接受过任何药物治疗的健康志愿者身上抽取血液收集到装有3.8％柠檬酸钠的试管中，在1000g下离心10分钟，以获得高血小板浓度的血浆(PRP)，并在3000g下离心15分钟，以获得低血小板浓度血浆(PPP)。在37℃并分别在100μl FTT(700μg/ml)和10μl Asialene(70μg/ml)存在下，将两份400μlPRP样品(最终浓度为300,000+/-10000血小板/毫升)培养60秒。然后将每份样品分为三份，分别用10μl的血小板聚集剂，ADP(最终浓度为4mM)，胶原(最终浓度为4μg/ml)和花生四烯酸(最终浓度为0.2mg/ml)进行处理，然后纪录下4分钟内的聚集情况。
所得结果报告如下表中。 对照品 FTT 700μg/ml ASIALENE 70μg/ml来自胶原的聚集(4μg/ml) 100 70 50来自ADP的聚集(4mM) 88 45 32来自花生四烯酸的聚集(0.2mg/ml) 81 31 23
3.局部抗炎活性实验
通过与NSAID吲哚美辛的抗炎活性相对比来进行Asialene和L-Asialene的抗炎活性的评估。采用诱发于小鼠耳部的巴豆油皮炎作为试验模型(Tubaro et al.，Agents & Actions 17：347-349)。
在经麻醉的小鼠(145mg/kg氯胺酮盐酸盐i.p.)的右耳(表面积：约1平方厘米)上使用溶于15μl丙酮中的80μg巴豆油(Sigma-Italy)诱发试验用炎症，而小鼠左耳则不做任何处理。将受试物质溶于巴豆油溶液中。皮炎诱发六个小时后，将动物处死，切孔经处理和未经处理的耳部(直径6mm)并称重。通过测定处理后和未处理的(另一侧)耳部样品重量差异，对巴豆油诱发的水肿进行定量。用受试物质处理的动物与只接受刺激剂处理的动物相比较的水肿反应百分抑制来表示抗水肿活性。采用重量为20-32g的雄性白化病瑞士小鼠CD-1(Harlan-Italy)进行试验。在试验过程中，每种物质和剂量水平均使用10只动物。
将对血管反应的作用评价为水肿百分抑制。通过Student’s“t”检验对试验结果进行分析，P值小于0.05为具显著性。通过线性内插法，从剂量-反应关系计算每种物质可降低水肿反应50％的剂量(ID50)。
以等摩尔剂量给予Asialene和L-Asialene。所得试验结果见下表。物质 剂量 (μ9/cm2) 水肿(mg) m+E.S. 抑制剂率(％)Asialene 0 30 100 300 1000 6.9±0.2 5.0±0.4* 2.2±0.5* 0.6±0.1* 0.4±0.1* - 27.5 68.1 91.3 94.2L-Asialene 0 42 141 423 7.0±0.4 3.9±0.7* 2.6±0.5* 0.4±0.2* - 44.6 63.5 94.5吲哚美辛 90 3.5±0.4* 49.3
*在Student’s“t”检验中为0.05
这两种产品对巴豆油诱发的水肿都以剂量依赖关系表现出了很强的抑制作用。在受试的最低剂量(30μg/cm2)下，Asialene具有显著的水肿抑制作用，其抑制作用在300μg/cm2几乎达到最高值。如图1所示，Asialene的剂量-活性关系显示为经典S曲线中的升高部分，在30至300μg/cm2这个区间里为线性关系，而在1000μg/cm2时活性显示为曲线的渐近线部分。从线性部分可以计算出ID50数值为62μg/cm2。L-Asialene表现出的实际上是一种叠加作用，从中获得ID50值为60μg/cm2。对照药物吲哚美辛在剂量达到90μg/cm2时可以抑制水肿反应几乎50％；根据以往数据，我们可以认定这个剂量代表着吲哚美辛的ID50值。
通过对比受试物质的ID50数值可以确定Asialene和L-Asialene具有基本相同的功效，至少在本试验模型中显示比对照药物高出50％。