环孢菌素类似物的合成 相关申请的交叉参考文献
本申请要求美国专利申请系列号60/346201(2001年10月19日提交)和60/370596(2002年4月5日提交)的权益，此两申请的全部内容整体纳入本文参考文献。
【发明领域】
本发明涉及与环孢菌素A有关的环孢菌素类似物的异构体混合物。该混合物与各异构体、天然存在的环孢菌素和其它现有的环孢菌素和环孢菌素衍生物相比，具有增强的功效和降低的毒性。此外，本发明还涉及生产环孢菌素A类似物异构体地合成路线，这些合成路线因具体反应条件的不同而立体选择性程度不同。
参考文献
以下的参考文献通过专利或申请编号或作者和年份在括号中引用在本说明书的相关部分：
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以上各专利、专利申请书和出版物的内容都全部结合在本文作为参考。
【发明背景】
环孢菌素衍生物由一类环状多肽组成，该多肽含有11个氨基酸，作为真菌Tolypocladium inflatum Gams的次级代谢物而产生。已观察到它们能可逆地抑制处于细胞周期G0或G1期的免疫活性的淋巴细胞、特别是T-淋巴细胞。还观察到环孢菌素衍生物能可逆地抑制淋巴因子的产生和释放(Granelli-Piperno等，1986)。虽然已知有许多环孢菌素衍生物，但最广泛使用的是环孢菌素A。环孢菌素A的抑制作用涉及到对T-细胞参与的活化的抑制。该抑制作用是通过环孢菌素与普遍存在的细胞内蛋白质亲环蛋白的结合而实现的。该复合物进而抑制钙调磷酸酶的钙-和调钙蛋白-依赖性的丝氨酸-苏氨酸磷酸酶活性。钙调磷酸酶的抑制阻止了转录因子(如NFATp/c和NF-κB)的活化，这些转录因子是诱导T-细胞活化一点点细胞因子基因(IL-2、IFN-γ、IL-4、和GM-CSF)所必需的。环孢菌素还抑制T-辅助细胞在体外产生淋巴因子，并且使胸腺中成熟CD8和CD4细胞的发育停止(Granelli-Piperno et al.，1986)。环孢菌素的其它体外性能包括抑制产生IL-2的T-淋巴细胞和细胞毒T-淋巴细胞，抑制活化的T-淋巴细胞释放IL-2的、在对同种抗原和外源性淋巴因子的应答时抑制静止T-淋巴细胞、抑制IL-1产生、以及抑制产生IL-2的T-淋巴细胞的要丝分裂素活化(Graneeli-Pipernoet al.，1986)。
环孢菌素是一种强力免疫抑制剂，已显示能抑制体液免疫和细胞介导免疫反应(如同种移植排异、迟发超敏性、实验性过敏性脑脊椎炎、福氏佐剂关节炎和移植物抗宿主疾病)。可用于预防器官移植后的器官排异；治疗类风湿性关节炎；治疗牛皮癣；和治疗其它自免疫疾病，包括I型糖尿病、Crohn氏病、红斑狼疮，等等。
自从最初发现环孢菌素以来，已经分离并鉴定了多种天然存在的环孢菌素，并且通过全合成或半合成方法或通过应用改进的培养技术制备了许多非天然的环孢菌素。环孢菌素组成的这一类物质现在内容丰富，包括，例如，天然存在的环孢菌素A-Z[参见Traber et al.，(1977)；Traber et al.，(1982)；Kobel et al.，(1982)；von Warburg et al.，(1986)]以及各种非天然的孢胞菌素衍生物和人造的或合成的环孢菌素包括：二氢-和异-环胞菌素；衍生的环孢菌素(如，其中-MeBmt-残基的3’-O-原子被酰化或3-位的肌甘酸残基的α-碳原子上引入了进一步的取代基)；分子中-MeBmt-残基以异构体形式存在的环孢菌素(如，其中跨MeBmt-残基6’和7’位的构型是顺式而不是反式)；和采用R.Wenger开发的全合成生产环孢菌素的方法，在该肽序列的特定位置加入变种氨基酸而产生的环孢菌素——见，例如，Traber et al.，(1977)，Traber et al.，(1982)，Kobel et al.，(1982)，美国专利4108985，4210581，4220641，4288431，4554351和4396542；欧洲专利出版物0034567和0056782；国际专利出版物WO86/02080；Wenger(1983)；Wenger(1985)；Wenger(1986)。在1-含有修饰氨基酸的环孢菌素A类似物由Rich et al.报道(1986)。免疫抑制性、抗炎性和抗寄生虫性环孢菌素A类似物，可见美国专利4384996、4771122、5284826和5525590中所述，全都转让给了山道士(Sandoz)。其它的环孢菌素类似物公开在WO99/18120中，转让给了Isotechnika。术语Ciclosporin，ciclosporin，cyclosporine，和Cyclosporine可以互换使用，都指环孢菌素。
环孢菌素A治疗相关副作用有许多，在此列举几种，包括肾毒性、肝毒性、致白内障作用、多毛症、和牙龈增生(Sketris et al.，1995)。其中，肾毒性是最严重的，是服环孢菌素导致的剂量相关性有害作用之一。其药物产品(如Neoral_和Sandimmune_)会引起肾毒性和毒性副作用，这是由于该药物的快速释放和高血浓度吸收所致。已有人提出，药物的峰值浓度与其副作用相关联(Bennett，1998)。环孢菌素引起肾损伤的确切机理尚不知道；但是，已有人提出，在肾脏中血管收缩物质浓度增加可导致肾小球输入小动脉血管收缩。这可能导致肾局部缺血，肾小球过滤速度降低，长时间后发生间质纤维化。当降低剂量或用另一种免疫抑制剂代替时，肾功能得到改善(Valatine和Schroeder，1995)。
因此，存在着对有效低毒性免疫抑制剂的需要。
含1-氨基酸修饰的环孢菌素类似物公开在WO99/18120中，已转让给本申请的受让人，其整体内容纳入本文中。还有转让给本受让人的是美国临时专利申请60/346201，其中申请人公开了特别优选的环孢菌素A类似物，称为“ISATX247”。该类似物结构上与环孢菌素相同，只是在1-氨基酸残基上作了修饰。申请人披露，ISATX247的顺式和反式异构体的某些混合物，与天然存在的和现有的环孢菌素相比，显示出效力增强、和/或毒性降低的组合。还公开了某些烷基化、芳基化和氘化ISATX247的衍生物。
通常，在美国临时专利申请60/346201中所公开的混合物含约10-90重量％的反式异构体和约90-10重量％的顺式异构体；在另一个实施方案中，此混合物含约15-85重量％反式异构体和约85-15重量％的顺式异构体；在另一个实施方案中，此混合物含约25-75重量％的反式异构体和约75-25重量％的顺式异构体；在另一个实施方案中，此混合物含约35-65重量％的反式异构体和约65-35重量％的顺式异构体；在另一个实施方案中，混合物含约45-55重量％的反式异构体和约55-45重量％的顺式异构体。在另一个实施方案中，该异构体混合物是ISATX247混合物，它含有约45-50重量％的反式异构体和约50-55重量％的顺式异构体。这些重量百分数是根据组合物的总重量计算的。换句话说，混合物可含65重量％的(E)-异构体和35重量％的(Z)-异构体，反之也然。在另一种命名法中，顺式异构体也可以称为(Z)-异构体，反式异构体也可以称为(E)-异构体。
因此，在本领域存在对制备环孢菌素类似物(包括ISATX247的异构体)的方法的需要。需要能产生富含各异构体的组合物，以及产生具有此二异构体理想比例的异构体混合物的合成方法。也需要制备ISATX247的衍生物的方法。
发明概述
环孢菌素及其类似物是一类具有强力免疫抑制活性的环状多肽的成员。尽管这些药物为免疫抑制、抗炎和抗寄生虫活性提供了许多优点，但存在许多与环孢菌素A治疗相关的不良作用，包括肾毒性和肝毒性。因此，需要新的免疫抑制剂，它们具有与天然存在的化合物环孢菌素A同样的药理活性，但没有相关的毒副作用。
本发明的实施方案提供环孢菌素A类似物的顺式和反式异构体的某些混合物，它们是药学上有用的。一种优选的类似物称为ISATX247。与天然存在的现在已知的环孢菌素相比，ISATX247异构体的混合物显示效力增强和毒性降低的组合。
本发明部分是基于这样的发现，环孢菌素类似物的某些异构体混合物提供优越的免疫抑制作用而没有与环孢菌素A相关不良作用。具体地说，我们意外地发现，异构体混合物(即，顺式和反式异构体二者的混合物)即含有约10∶90到约90∶10(反式∶顺式)范围的1--氨基酸残基被修饰的环孢菌素类似物可提供优越的效能和安全性。这些类似物的例子公开在WO99/18120中，包括氘化和非氘化的化合物。具体地，发现约45∶55到约50∶50(反式∶顺式)范围的混合物和约50％至55％反式和约45％至50％顺式范围的混合物是特别有效的。
而且，已证明这些异构体混合物与天然存在的和其它现在已知的环孢菌素和环孢菌素衍生物相比，显示了优越的效力和毒性降低的组合。
一种特别优选的类似物(在本文中称为“ISATX274”)在结构上与环孢菌素A相似，只是在分子的周边1-氨基酸有一个修饰的功能基团。此具体的异构体类似物混合物的结构，与环孢菌素A的结构相比，示于图1A，1B，2A，2B。
按照本发明的实施方案，ISATX247异构体(及其衍生物)可通过立体选择性路线合成，其选择性程度不同。立体选择性路线产生的组合物富含(E)-异构体和(Z)-异构体，可将这些组合物组合，使得产生的混合物具有两中异构体的理想比例。或者，可以调整立体选择性路线的反应条件，以在制备的混合物中直接产生此理想比例。混合物中一种异构体或另一种异构体的百分比可用核磁共振谱(NMR)或其它本领域已知的技术验证。
每条路线通常都要对敏感的醇功能基团采用保护基团。在一个实施方案中，保护醇为乙酸酯；在另一个实施方案中，保护基团是苯甲酸酯或硅醚。虽然本领域中乙酸酯保护基团是常用的，但重要的是要强调在本文中所述许多示范性实施方案中通过使用苯甲酸酯或硅醚作为保护基团可以避免与乙酸酯有关的某些不良副反应。
该受保护化合物然后可用作前体，进行各种立体选择性的合成路线，包括有些路线在Wittig反应中采用含磷试剂作为反应物，和无机元素作为有机金属试剂成员的反应。后一种类型可能通过六元环过渡态进行，其中立体文障支配着构型结局。许多有机金属试剂是可以得到的，包括那些特征性无机元素如硼、硅、钛、锂和硫。各个异构体可从单一或多个前体制备。
任何混合物中(E)对(Z)-异构体的比例，无论是立体选择性或非立体选择性产生的，可取宽广的数值范围。例如，此混合物可含约10-90％的(E)-异构体到约90-10％的(Z)-异构体。在另一个实施方案中，此混合物可含约15-85重量％的(E)-异构体和约85-15重量％的(Z)-异构体。在另一个实施方案中，此混合物可含约25-75重量％的(E)-异构体和约75-25重量％的(Z)-异构体。在另一个实施方案中，混合物可含有从约35-65重量％(E)-异构体和约65-35重量％(Z)-异构体。在另一个实施方案中，此混合物可含约45-55重量％的(E)-异构体和约55-45重量％的(Z)-异构体。在另一个实施方案中，此异构体混合物是ISATX247混合物，含约45-50重量％的(E)-异构体和约50-55重量％的(Z)-异构体。这些百分数是根据组合物的总重量计算的，并应理解，(E)-异构体和(Z)-异构体的重量百分数之和是100。换句话说，混合物可含有65重量％的(E)-异构体和35重量％的(Z)-异构体，反之也然。
因此，一方面，本发明提供制备1-氨基酸残基被修饰的环孢菌素A类似物的异构体混合物的方法，其中合成路线包括以下步骤：将乙酰基-η-卤代环孢菌素A与三烷基膦、三芳基膦(如三苯基膦)、芳基烷基膦和三芳基砷一起加热，产生乙酰基环孢菌素A的中间体磷鎓卤化物；并通过将乙酰基环孢菌素A的中间体磷鎓卤化物与甲醛，任选在卤化锂存在下，一起搅拌，制备乙酰基-1，3-二烯的(E)和(Z)-异构体的混合物；通过用碱处理乙酰基-1，3-二烯的(E)和(Z)-异构体的混合物制备ISATX247的(E)和(Z)-异构体的混合物。
另一方面，本发明涉及制备1-氨基酸残基被修饰的环孢菌素A类似物的异构体混合物的方法，其中合成路线包括以下步骤：任选地在卤化锂存在下，通过使中间体与磷内鎓盐经过Wittig反应，将该中间体如受保护的三甲基甲硅烷基(TMS)或乙醚环孢菌素A醛转变为乙酰基-1，3-二烯的(E)和(Z)-异构体；在乙酰保护基情况下通过用碱，或在TMS-保护基情况下用酸，处理乙酰基-1，3-二烯的(E)和(Z)-异构体混合物，制备ISATX247的(E)和(Z)-异构体的混合物。
另一方面，本发明涉及制备1-氨基酸残基被修饰的环孢菌素A的富含E-异构体混合物的方法，其中富含E-异构体材料的立体选择性合成包括以下步骤：使乙酰基环孢菌素A醛与选自三烷基甲硅烷基烯丙基硼酸酯和E-γ-(三烷基甲硅烷基烯丙基)二烷基硼酸酯的试剂反应，形成β-三烷基甲硅烷基醇；用酸处理β-三烷基甲硅烷基醇，形成乙酰-(E)-1，3-二烯；用碱处理乙酰-(E)-1，3-二烯，形成ISATX247的(E)-异构体。
另一方面，本发明涉及本发明涉及制备1-氨基酸残基被修饰的环孢菌素A的富含Z-异构体混合物的方法，其中富含Z-异构体材料的立体选择性合成包括以下步骤：使乙酰基环孢菌素A醛与选自三烷基甲硅烷基烯丙基硼酸酯和Z-γ-(三烷基甲硅烷基烯丙基)二烷基硼酸酯的试剂反应，形成β-三烷基甲硅烷基醇；用酸处理β-三烷基甲硅烷基醇，形成乙酰-(Z)-1，3-二烯；用碱处理乙酰-(Z)-1，3-二烯，形成ISATX247的(Z)-异构体。
还有一方面，本发明涉及制备在1-氨基酸残基被修饰的环孢菌素A的富含E-异构体混合物的方法，其中富含E-异构体材料的立体选择性合成包括以下步骤：使乙酰基环孢菌素A醛与锂化的烯丙基二苯基膦氧化物反应，形成乙酰-(E)-1，3-二烯；用碱处理乙酰-(E)-1，3-二烯，形成ISATX247的(E)-异构体。
还有一方面，本发明涉及制备1-氨基酸残基被修饰的环孢菌素A的富含Z-异构体混合物的方法，其中此富含Z-异构体材料的立体选择性合成包括以下步骤：使乙酰基环孢菌素A醛与[3-(二苯基膦基)烯丙基]钛反应，形成含钛中间体；使含钛中间体转化成赤式-α-加成物；用碘甲烷处理，将赤式-α-加成物转变为β-氧化磷鎓盐；将β-氧化磷鎓盐转变为乙酰-(Z)-1，3-二烯；用碱处理乙酰-(Z)-1，3-二烯，形成ISATX247的(Z)-异构体。
还有一个方面，本发明提供(E)和(Z)-异构体的混合物，此混合物通过包括以下步骤的方法制备：保护环孢菌素A的β-醇形成乙酰基环孢菌素A；使乙醚环孢菌素A的1-氨基酸残基侧链的η-碳溴化，产生第一中间体乙酰基-η-溴代环孢菌素A；将该第一中间体乙酰-η-溴代环孢菌素A与选自三苯膦和三烷基膦的试剂一起加热，产生选自乙酰基环孢菌素A的三苯基-和三烷基磷鎓溴化物的第二中间体；搅拌由乙酰基环孢菌素A的三苯基-或三烷基磷鎓溴化物第二中间体与甲醛生成的内鎓盐，制备乙酰-1，3-二烯的(E)和(Z)-异构体的混合物；用碱处理乙酰-1，3-二烯的(E)和(Z)-异构体的混合物制备ISATX247的(E)和(Z)-异构体的混合物。
本发明还涉及以下物质的组合物，包括乙酰基环孢菌素A的三苯基-和三烷基磷鎓溴化物、通过以下步骤制备的产物：保护环孢菌素A的β-醇；使环孢菌素A1-氨基酸残基侧链的η-碳溴化，产生第一中间体乙酰基-η-溴代环孢菌素A；将第一中间体乙酰-η-溴代环孢菌素A与选自三苯膦和三烷基膦的试剂一起加热，产生选自乙酰基环孢菌素A的三苯基-和三烷基磷鎓溴化物。还提供包含乙酰基环孢菌素A的三苯基-或三烷基磷鎓溴化物衍生物的组合物和含环孢菌素A的β-三甲基甲硅烷基醇衍生物的组合物。
其它一方面，本发明提供选择性制备环孢菌素A醛的方法，此方包括以下步骤：通过形成乙酰基环孢菌素A或三甲基甲硅烷基(TMS)环孢菌素A，保护环孢菌素A的β-醇；用臭氧作为氧化剂与还原剂一起使用，氧化此乙酰基环孢菌素A或三甲基甲硅烷基(TMS)环孢菌素A。
其它另一方面，本发明涉及制备1-氨基酸残基被修饰的环孢菌素A类似物的异构体混合物的方法，其中合成路线包括以下步骤：任选地在卤化锂存在下，通过Wittig反应，使该中间体与由三丁基烯丙基磷鎓卤化物制得的磷内鎓盐反应，将中间体乙酰基环孢菌素A醛转变为乙酰基-1，3-二烯的(E)和(Z)-异构体；并用碱处理乙酰-1，3-二烯的(E)和(Z)-异构体混合物，制备ISATX247的(E)和(Z)-异构体的混合物。
在另一个方面，本发明提供ISATX247的E-异构体的选择性的合成方法，包含以下步骤：用三烷基甲硅烷基烯丙基硼酸酯与三甲基甲硅烷基(TMS)环孢菌素A醛反应，形成β-三甲基甲硅烷基醇；处理β-三甲基甲硅烷基醇，直接形成ISATX247的E-异构体。
另一个方面，本发明提供ISATX247的Z-异构体的选择性的合成方法，此方法包括以下步骤：用三烷基甲硅烷基烯丙基硼酸酯与三甲基甲硅烷基(TMS)环孢菌素A醛反应，形成β-三烷基甲硅烷基醇；用碱处理该β-三烷基甲硅烷基醇，形成TMS-(Z)-1，3-二烯；使TMS-(Z)-1，3-二烯脱保护，形成ISATX247的Z-异构体。
本发明还涉及制备1-氨基酸残基被修饰的环孢菌素A类似物的异构体混合物的方法，该方法包括制备ISATX247的(E)和(Z)-异构体的合成路线，使得在混合物中(E)-异构体和(Z)-异构体按预定比例存在，其中合成路线包括以下步骤：保护环孢菌素A的β-醇；氧化该受保护的环孢菌素A，产生第二中间体受保护的环孢菌素A醛；任选地在卤化锂存在下，通过Wittig反应使该第二中间体与磷内鎓盐反应将该第二中间体保护的环孢菌素A醛转变为受保护的1，3-二烯的E-和Z-异构体混合物；通过将受保护的1，3-二烯脱保护，制备E-和Z-异构体的混合物。
本发明还提供其它制备这种混合物的方法，包括制备1-氨基酸残基被修饰的环孢菌素A类似物的异构体混合物的方法，该方法包括制备ISATX247的(E)和(Z)-异构体的合成路线，使得混合物中(E)-异构体和(Z)-异构体在按预定比例存在，其中混合物中异构体的比例的范围是，约45-55重量％的(E)-异构体对约55-45重量％的(Z)-异构体，以混合物的总重量为基准。
本发明还提供制备1-氨基酸残基被修饰的环孢菌素A类似物的预定异构体混合物的方法，该方法包括以下步骤：制备富含ISATX247的(E)-异构体的第一材料；制备富含ISATX247的(Z)-异构体的第二材料；按照设计为的所需异构体组成的比例，混合此第一和第二材料。
附图的简要说明
图1A是环孢菌素A的结构，表明构成该分子的环状肽环的11个氨基酸残基，以及1-氨基酸残基的侧链的结构；
图1B是环孢菌素A的结构的另一个说明，特别强调用于本发明的术语”CsA”的定义；
图2A是环孢菌素A类似物称为ISATX247的E-异构体(或反式异构体)的结构；
图2B是环孢菌素A类似物称为ISATX247的Z-异构体(或顺式异构体)的结构；
图3是示范性合成路线的概况，可用来制备本发明环孢菌素类似物，其中的立体选择性路线按反应条件分组；
图4是一合成路线，它从溴前体产生ISATX247的(E)-和(Z)-异构体；
图5是另一个合成路线，可从醛前体产生ISATX247的(E)-和(Z)-异构体；
图6是示范性的立体选择性反应方案，可用来制备富含ISATX247的(E)-或(Z)-异构体的组合物，其中此二异构体都可从相同的前体醇制备。
图7是另一个反应方案，用来立体选择性合成富含ISATX247的(Z)-异构体的组合物；
图8是另一个反应方案，用来立体选择性合成富含ISATX247的(E)-异构体的组合物；
图9A-C是示范性的合成路线，可产生ISATX247的(E)-和(Z)-异构体混合物，每个反应的条件已经调整，以产生这2种异构体的具体示范性比例；
图10是示范性的合成路线，可产生ISATX247的(E)-和(Z)-异构体混合物，其中首先制备富含2种异构体之一的组合物，然后按照预定的比例混合，达到所需的比例；
图11是测试结果，显示与环孢菌素A相比，ISATX247(45-50％E-异构体和50-55％Z-异构体)对钙调磷酸酶磷酸酯酶活性的抑制效力要强3倍(通过IC50测定)。
图12是一些氘化和非氘化类似物异构体混合物的结构和异构体组成。
图13是测试结果，显示与环孢菌素A相比，各种氘化的和非氘化的类似物异构体混合物对钙调磷酸酶磷酸酯酶活性的抑制至少与环孢菌素A是一样强(通过IC50测定)。
发明的详细描述
合成
环孢菌素及其类似物是一类具有强力免疫抑制活性的环状多肽的成员。尽管这些药物为免疫抑制、抗炎和抗寄生虫活性提供了许多优点，但存在许多环孢菌素A治疗相关不良作用，包括肾毒性和肝毒性。因此，需要新的免疫抑制剂，它们具有与天然存在的化合物环孢菌素A同样的药理活性，但没有相关的毒副作用。
本申请人早先公开了称为ISATX247的环孢菌素A类似物。该类似物在结构上与环孢菌素A相似，只是在1-氨基酸残基上进行了修饰。本申请人发现，ISATX247的顺式和反式异构体混合物与天然存在的和现今已知的环孢菌素相比，显示出效力增强和毒性降低的组合。
按照本发明的实施方案，ISATX247异构体(及其衍生物)可通过立体选择性路线合成，这些路线在其立体选择性程度上可有不同。此立体选择性路线产生富含(E)-或(Z)-异构体的组合物，这些组合物可混合，从而得到的混合物具有的2种异构体的理想比例。或者，此立体选择性路线的反应条件可以调整，以在制备的混合物中直接产生此理想比例。
本发明称为ISATX247的一种免疫抑制性环孢菌素类似物的化学名称是环{{E，Z}-(2S，3R，4R)-3-羟基-4-甲基-(2-甲基氨基)-6，8-壬二烯酰基}-L-2-氨基丁酰基-N-甲基-甘氨酰基-N-甲基-L-亮氨酰基-L-缬氨酰基-N-甲基-L-亮氨酰基-L-丙氨酰基-D-丙氨酰基-N-甲基-L-亮氨酰基-N-甲基-L-亮氨酰基-N-甲基-L-缬氨酰基}。其经验分子式是C63H111N11O12。分子量约1214.85。术语“ISATX247”是为这个药理活性化合物起的商品名。
ISATX247的结构主要通过核磁共振(NMR)已得到实验证明。用一系列一维和二维NMR实验，并通过与已知的环孢菌素A的NMR排布比较，排布了1H和13C谱图。ISATX247的(E)和(Z)-异构体，绝对排布是用NuclerOverhauser Effect(核Overhauser效应)(NOE)实验确认的。其它的支持性证据由质谱分析提供，它确认了分子量；由红外谱提供，发现它与环孢菌素A极为相似。由于此2种化合物之间的相似形，后者是在预料之中的。
环孢菌素A的结构可见图1A说明。该结构包括组成分子的环状肽环的11个氨基酸残基的身份。这11个氨基酸残基按顺时针方向递增编号，从环中央最高处的氨基酸开始(并用参考标记“1-氨基酸”表示)。为清楚起见，该第一个氨基酸被放在虚线方框中。1-氨基酸残基的侧链按化学方法画出，因为它处在本发明所采取的合成反应的首位置。通常，与氨基酸羰基相邻的碳标为α-碳，从此肽环沿此链向下，用渐进的希腊字母标记相邻的碳。对于环孢菌素A，如图1A所示，该侧链的β-碳与羟基连接，在该侧链的ε和ζ碳之间有一个反式取向的双键。
环孢菌素A结构的另一个示意图见图1B，其中此分子的不同部分包含在用虚线方框内。此图定义了本发明中所用的命名，其中术语”CsA”指方框中包括的环孢菌素A的部分。本命名提供了显示将要发生本文所述的合成反应的区域的简便方法(即1-氨基酸残基的侧链，它已在图1B中画在虚线方框的外面)，在每次叙述反应时，无需再画出此分子的其余部分。本领域技术人员将会明白，此侧链的α和β-碳之间的链具有正常长度，但是在该图中为了有助于术语”CsA”的定义而将其放大。
如上所述，特别优选的环孢菌素A类似物称为“ISATX247”，其2种立体异构体E(或反式)和Z(或顺式)分别示于图2A和2B。这些立体异构体的顺式和反式的性质指此侧链ε和ζ碳之间的双键(即，更靠近肽环，与链末端的双键相反)的构型。
关于立体化学命名应该说一下。本发明中术语顺式和(Z)可互换使用，术语反式和(E)也可互换使用。术语“赤式”和“苏式”的使用将尽可能减少，因为关于它们的含义文献中出现明显混乱。参见R.W.Hoffmann和H.-J.Zei“Seteroselective synthesis of alcohols.8.Diastereoselective synthesis ofbeta-methylhomoallyl alcohol via crotylboronates”，J.Org.Chem.，Vol.46，pp.1309-1314(1981)；A.Streitwieser and C.H.Heathcock，Introductionto organic chemistry，2nded.(Macmillan，New York，1981)，pp.845-846；andM.B.Smith and J.March，March’s Advanced organic chemistry(Wiley，NewYork，2001)，pp.144-147。在本发明少数几个使用苏式/赤式术语的例子中，使用Streiwieser和Heathcock的惯例，其中：“赤式”异构体指(R，S)和(S，R)构型，“苏式”异构体指(R，R)和(S，S)构型。
关于命名的最后评论是关注图2A和2B中所示的末端碳-碳双键。在另一个编号的图式中，1-氨基酸残基侧链中的碳可从此末端(θ)碳开始编号，然后朝着肽环返回。在这系统中，按照有机化学常规的命名法，ISATX247异构体可被看作1，3-二烯，其中各双键以其最低编号的碳表示。
现在讨论图3-8说明的合成路线。按照本发明实施方案，可以直接制备异构体混合物，其中具体合成路线的反应条件可以调整，以在混合物中达到所理想的异构体比例。或者，可以制备富含环孢菌素A类似物2种几何异构体之一的组合物，按预定的比例混合这些组合物，获得所需的混合物。
本发明实施方案合成路线的概况见图3，其中特别强调按化学和立体选择性将反应路线分组。参阅图3，应用Wittig反应的合成路线通常示于此图右侧，用编号31表示，而采用有机金属试剂(认为是形成六元环过渡态)的路线32和33示于此图中间和左侧。这些路线的任何一个都能产生此异构体混合物，或能产生富含2种异构体之一的组合物。
本发明实施方案提供了能获得所需异构体混合物的多种路线。本文公开的合成策略的可行性和多用途性可部分从图3的对称性和不对称性得到反映。每条路线共同的反应是环孢菌素A 34中功能基团的保护；在该示范性的实施方案中反应是环孢菌素A 34转变为乙酰基环孢菌素A 35。图3的不对称性是使用乙酰基环孢菌素A醛化合物51作为前体用于所有的钛和锂有机金属试剂的路线，但只用于一些含磷Wittig反应路线。
一般，对图3的合成路线(可调整其反应条件，以产生具有理想比例的异构体混合物)采用含磷试剂作为Wittig反应中的反应物。其它立体选择性路线也采用无机元素，通常是作为有机金属试剂的成员，通过六元环过渡态进行，其中立体位障决定了构型的结局。
许多有机金属试剂可用于本发明，包括那些特性的无机元素如硼、硅、钛、锂、和硫。
富含一对异构体中的一种或另一种的组合物可从一种前体制备；或者，可从不同的前体制备2种组合物。图3的立体选择性路线之一(路线32)，取决于所选的反应条件，一种前体可产生ISATX247的2种异构体。在另一个立体选择性路线中(路线33)，需要2种不同的前体产生每一种富含的组合物。
现在详细讨论图3的反应。各个路线共同的反应是1-氨基酸残基侧链的β-位醇的保护。这种保护方案说明了有机合成中共同遇到的问题，其中第一功能基团被打算用于此分子别处的第二(类似/和或相同的)功能基团的反应错误修饰。为了实施采方案，使第一功能基团与一保护基团反应，然后在第二功能基团上进行所需的反应，再去除第一功能基团的保护基。
有机合成中的保护基是人们熟知的，在J.R.Hanson的出版物ProtecitingGroups in Organic Synthess(Sheffield Academic Press，Sheffield，England，1999)，第二章“The protection of alcohols”，pp.24-25中有所讨论。
Hanson教我们如何通过转变羟基成为酯或醚来保护羟基。乙酸酯也许是保护羟基最常用的类型。有许多条件可用来引入乙酸酯基团。这些试剂和溶剂包括乙酐和吡啶；乙酐、吡啶和二甲基氨基吡啶(DMAP)；乙酐和乙酸钠；乙酐和对甲苯磺酸；乙酰氯、吡啶和DMAP；和乙烯酮。DMAP是有用的酰化反应催化剂，因为它可从酸酐形成高反应性N-酰基吡啶盐。
在本发明的一实施方案中，环孢菌素A34的β-醇通过使34与乙酰氯、乙酸乙酯或其组合反应形成化合物乙酰基环孢菌素A35而得到保护。在另一实施方案中，此β-醇经历对乙酐的亲核加成，形成乙酰基环孢菌素A35和乙酸。这些反应可在DMAP存在下进行，过量的乙酐起溶剂作用。在这些情况下，前缀“乙酰基”可在整个合成路线的命名中使用，或直到乙酰基被去除。例如，在一路线中β-碳具有乙酰基的最后一个中间体称为“乙酰-(E)-1，3-二烯”。
虽然乙酰基环孢菌素A的制备在文献已中有充分报道，本领域技术人员会理解，可以采用乙酸酯以外的保护基来保护环孢菌素A 34 1-氨基酸残基的β-醇。这些保护基可包括苯甲酸酯、取代的苯甲酸酯、醚、和硅烷基醚。在某些反应条件下，此乙酸酯保护基有引起不良副反应(如消除和水解)的倾向。因为苯甲酸酯、醚和硅烷基醚在这些相同条件下更能抵抗这种副反应，所以使用这些保护基代替乙酸酯常常是更有利的。已受乙酰基或任何其它保护基保护的环孢菌素或环孢菌素衍生物称为“受保护的环孢菌素A”。同样，此示范性的路线中的最终中间体称为“受保护的-(E)-1，3-二烯”而不是“乙酰-(E)-1，3-二烯”。所选保护基的性质空白对此反应程序中的后续步骤所需的进程有影响。
请参阅图3，乙酰基环孢菌素A35在该示范性的路线中保护了β-醇，该化合物在几条合成路线中的作用是合成ISATX247异构体的前体。以下先讨论Witting反应路线。
通过Wittig反应合成ISATX247的(E)和(Z)-异构体混合物
本文举例的Wittig反应路线见图3中参照编号31所示。方法1通过溴中间体乙酰-η-溴代环孢菌素41进行，而方法2使用乙酰基环孢菌素A醛51作为起始点。以下叙述的示范性方法采用Wittig反应以立体化学构型的混合物引入烯功能团。
本文公开的一示范性实施方案中采用Wiitig反应来合成ISATX247的(E)和(Z)-异构体混合物，可任选地在卤化锂存在下进行。Wittig反应中卤化锂的存在已知对产生的几何异构体的比例有影响，因此加入此类化合物可能有助于产生ISATX247的(E)和(Z)-异构体的所需混合物。
方法1
在本发明的一个实施方案中，ISATX24的(E)和(Z)-异构体混合物如图4所示那样制备。图4中用波状线(见化合物43和44)表示该示范性反应产生的(E)和(Z)-异构体的混合物。在一个实施方案中，产生的(E)和(Z)-异构体的百分比例范围约为10-90％的(E)-异构体和90-10％的(Z)-异构体，但这些范围只是示范性的，许多其他范围也是可能的。例如，此混合物可含有约15-85％的(E)-异构体到约85-15％的(Z)-异构体。在其他实施方案中，此混合物可含有约25-75％(E)-异构体和75-25％(Z)-异构体；约35-65％(E)-异构体和约65-35％(Z)-异构体；约45-55％(E)-异构体到约55-45％(Z)-异构体。在另一个实施方案中，此异构体混合物是ISATX247混合物，含有约45-50重量％的(E)-异构体和50-55重量％的(Z)-异构体。这些重量百分数是根据组合物的总重量计算的，应该理解，(E)异构体和(Z)异构体的重量百分数之和是100重量％。换句话说，混合物可含有65重量％的(E)-异构体和35重量％的(Z)-异构体，反之也然。
参看图4，乙酰基环孢菌素A 1-氨基酸残基侧链的末端η-碳，在反应的下一步通过将乙酰基环孢菌素A 35与N-溴琥珀酰亚胺和偶氮二异丁腈在溶剂(如四氯化碳)中回流而被溴化，形成中间体乙酰-η-溴代环孢菌素A41。N-溴琥珀酰亚胺是经常用于用溴取代烯丙基氢的试剂，据信这是通过自由基机理。中间体41的制备见M.K.Eberle和F.Nuninger在“Synthesisof the main metabolite(OL-17)of cyclosporin A”，J.Org.Chem.，Vol.57，pp.2689-2691(1992)中叙述。
乙酰基环孢菌素A 42的新中间体三苯基膦鎓溴化物，可从乙酰-η-溴代环孢菌素A 41通过后者与三苯膦在溶剂(如甲苯)中加热而制备。
新中间体42，以及类似的其他中间体，在许多在1-氨基酸残基含共轭二烯体系的环胞菌素A类似物的合成中被认为是关键性中间体。例如，除了三苯膦外，如三芳基膦、三烷基膦、芳基烷基膦和三芳基砷等化合物可以与乙酰-η-溴代环孢菌素A 41反应，从而制备其他与42类似的活化的化合物。
参见图4，乙酰-1，3-二烯43的(E)和(Z)-异构体混合物，可通过室温在甲苯中搅拌乙酰基环孢菌素A 42的三苯基磷鎓溴化物与过量的甲醛而制备。加入甲醛后，滴加碱如氢氧化钠，二烯的异构体混合物用乙酸乙酯提取。
许多有机化学教科书都叙述了Wittig反应。特别是在J.McMurry的Organic Chemistry，5thed.(Brooks/Cole，Pacific Grove，2000)，pp.780-783。Wittig反应可用来将酮或醛转变为烯烃。在该过程中，磷内鎓盐，也称为正磷，与醛或酮反应，生成称为内铵盐的偶极中间体。通常不必分离该内铵盐，它可自发地通过四元环分解，产生烯烃和三苯膦氧化物。最终结果是羰基氧原子被原来结合于磷的R2C＝基团取代。
本领域技术人员应该理解的是，许多试剂可用来代替上述Wittig反应的示范性试剂。例如，各种烷基、芳基、醛和酮化合物可代替甲醛，来制备各种各样的环孢菌素衍生物。本申请人已用醛来，如乙醛、氘化甲醛、氘化乙醛、2-氯苯甲醛、苯甲醛和丁醛代替甲醛进行了上述合成。这样的Wittig反应可以用三苯基膦鎓衍生物以外的化合物进行，例如三芳基膦、三烷基膦、芳基烷基膦、和三芳基砷。各种其他碱可用来代替氢氧化钠，如碳酸钠、丁基锂、己基锂、酰胺钠、锂的位阻碱(如二异丙基酰胺锂)、和碱金属醇化物。除了改变这些试剂外，此反应可在各种有机溶剂或有机溶剂和水的混合物中，在各种盐的存在下，特别是锂的卤化物存在下，在不同温度进行。上述所有因素都可由本领域技术人员合理地选择，以便对所形成的双键立体化学具有所需的影响；即，对顺式与反式的比例具有所需的影响。在本发明的一个实施方案中，Wittig反应在选自四氢呋喃和甲苯的溶剂中进行，其中溶剂在选自丁基锂、低级醇化钠、低级醇化钾和碳酸盐存在下，在约-80℃至110℃之间的温度下使用。该低级醇化钾可以是叔丁醇钾。而且，溶剂可以是四氢呋喃，在叔丁醇钾存在下在-70℃至100℃之间的温度下使用。
在该合成的最后一步，用以下程序脱去β-碳的保护基。将乙酰-(E)-1，3-二烯和乙酰-(Z)-1，3-二烯的混合物溶解在甲醇中，加入水。加入碱(如碳酸钾)，室温搅拌此反应混合物。可用除碳酸钾以外的碱，包括氢氧化钠、碳酸钠、醇钠和醇钾。通常用乙酸乙酯提取最终产物ISATX247的(E)和(Z)-异构体的混合物。
方法2
在通过Wittig反应策略合成ISATX247的(E)和(Z)-异构体混合物的另一条反应路线中，可采用如下四步合成路线：(1)如方法1那样保护β-醇；(2)氧化第一步产生的乙酰基环孢菌素A，产生醛；(3)Wittig反应；(4)除去Wittig反应产物的乙酰基，或者等价地，水解乙酸酯重新回到醇。该反应程序见图5中说明。
这个合成路线与图4Wittig反应路线类似方式开始进行，第一步用乙酸酯基保护β-醇。但是，这2条路线从此开始不同，方法2的第二步将乙酰基环孢菌素A 35转变为醛，即乙酰基环孢菌素A醛51。该反应使用强度足以断裂C＝C键的氧化剂产生2种片段。烯烃的断裂在本领域是已知的。臭氧大概是最常用的双键断裂试剂，但是其他氧化剂如高锰酸钾(KMnO4)或四氧化锇也可引起双键断裂。
按照本发明的一个实施方案，乙酰基环孢菌素A用臭氧作氧化剂转变为醛，然后用还原剂处理形成乙酰基环孢菌素A醛。臭氧分解步骤在温度约-80℃至0℃下进行。臭氧分解所用溶剂是低级醇如甲醇。还原剂可以是三烷基膦(如三丁基膦)、三芳基膦、三烷基胺(如三乙胺)、烷基芳基硫化物、硫代硫酸盐或二烷基硫化物如二甲基硫化物。当用三丁基膦作还原剂时，本领域技术人员会知道，该反应是剂量控制的。
按照本发明的另一个实施方案，环孢菌素A的β-醇用三甲基甲硅烷基(TMS)保护并用臭氧氧化，接着用还原剂处理，形成TMS环孢菌素A醛。臭氧分解步骤在约-80℃至0℃之间的温度进行。臭氧处理所用的溶剂是低级醇和二氯甲烷的混合物。还原剂可选自三烷基膦(如三丁基膦)、三芳基膦、三烷基胺(如三乙胺)烷基芳基硫化物、硫代硫酸盐或二烷基硫化物(如二甲基硫化物)。当用三丁基膦作为还原剂时，本领域技术人员应知道该反应是剂量控制的。
此外，环孢菌素A醛的制备可通过形成乙酰基环孢菌素A保护环孢菌素A的β-醇，然后用单过硫酸盐，优选用oxone，在酮(如乙酰氧基丙酮或二乙酰氧基丙酮)存在下，将乙酰环胞菌素A转变为乙酰基环孢菌素环氧化物。这一步在有机溶剂(该溶剂在反应条件下是惰性的)(如乙腈和水)中进行。加入乙二胺四乙酸二钠盐捕获可能存在的任何重金属离子。环氧化反应优选在pH大于7下进行。该环氧化反应接着用过碘酸或过碘酸盐在酸性条件下，进行环氧化物的氧化断裂。任选地，氧化和氧化断裂可在后处理步骤中合并进行。这些反应可见Dan Yang，et al.，在“A C2 symmetric chiralketone for catalytic asymmetric epoxidation of unfunctionalized olefins”，J.Am.Chem.Soc.，Vol.118，pp.491-492(1996)，和“Novel cyclic ketones forcatalyric oxidation reactions”，J.Org.Chem.，Vol.63，pp.9888-9894(1998)中所述。
钌基的氧化剂的应用见H.J.Carlsen et al.，在“A greatly improvedprocedure for ruthenium tetroxide catalyzed oxidations of organic compounds”，J.Org.Chem.，Vol.46，No.19，pp.3736-3738(1981)中所述。Carlsen et al.说，历史上，昂贵的钌金属为催化程序的开发提供了推动力，其中应用最广的是过碘酸盐和次氯酸盐用作化学计量的氧化剂。研究者发现在常规采用钌的反应过程中催化活性丧失，推测是由于存在羧酸。并发现，将腈类(特别是乙腈)加入反应混合物中显著提高了CCl4/H2O/IO4-体系中烯烃的氧化断裂速度和程度。
按照本发明的实施方案，乙酰基环孢菌素A醛51可通过将它溶解于乙腈和水的混合物中，然后先加入过碘酸钠，后加入氯化钌水合物，从乙酰基环孢菌素A 35产生。醛51可用乙酸乙酯提取。应注意的是，通过该氧化断裂策略合成醛51对于下述许多立体选择性路线是重要的，因此读者在以后还会回来参考这一节。
此外，环孢菌素A醛的制备可通过形成乙酰基环孢菌素A保护环孢菌素A的β-醇，然后用单过硫酸盐，优选用oxone，在酮(如乙酰氧基丙酮或二乙酰氧基丙酮)存在下，将乙酰基环孢菌素A转变为乙酰基环孢菌素环氧化物。这一步在有机溶剂(该溶剂在反应条件下是惰性的)(如乙腈和水)中进行。加入乙二胺四乙酸二钠盐捕获可能存在的任何重金属离子。环氧化反应优选在pH大于7下进行。该环氧化反应接着用过碘酸或过碘酸盐在酸性条件下进行环氧化物的氧化断裂。任选地，氧化和氧化断裂可在后处理步骤中合并进行。这些反应见Dan Yang，et al.，在“A C2 symmetric chiralketone for catalytic asymmetric epoxidation of unfunctionalized olefins”，J.Am.Chem.Soc.，Vol.118，pp.491-492(1996)，和“Novel cyclic ketones forcatalyric oxidation reactions”，J.Org.Chem.，Vol.63，pp.9888-9894(1998)中所述。
方法2的第三步包括通过Wittig反应将醛51转变成为(E)和(Z)-二烯混合物，所用方法与方法1类似。如在方法1中一样，磷内鎓盐加入醛中，生成甜菜碱(不分离)，最后结果是此醛的碳氧原子被原来结合于磷的R2C＝基团取代。另外，这种Wittig反应可以用三苯基膦鎓衍生物以外的含磷化合物进行，例如三芳基膦、三烷基膦、芳基烷基膦、和三芳基砷在不同的温度，用各种碱性溶液和溶剂，或加入可用于影响新形成双键的立体化学的各种无机盐。
在一个实施方案中，将乙酰基环孢菌素A醛51溶于甲苯，加入溶解在水中的碱(如氢氧化钠)。然后加入三苯基膦鎓溴化物52，将反应物搅拌一些时间。乙酰(E)和(Z)-1，3-二烯52的产物混合物的后处理包括用己烷和/或乙酸乙酯提取，在此术语“后处理”意指从反应物、产物和溶剂等的混合物中提取和/或分离反应产物的过程。
方法2的最后一步，与方法1的最后一步类似，将受保护β-碳位上的醇的乙酸酯基团用碳酸钾脱除，产生ISATX247的(E)和(Z)-异构体混合物。除了碳酸钾以外的碱也可用来脱除此保护基团，包括氢氧化钠、碳酸钠、醇钠和醇钾。
通过有机金属路线合成富含ISATX247的(E)和(Z)-异构体之一的组合物
按照本发明的实施方案，立体选择性合成路线可以利用含有元素如硅、硼、钛、硫、磷和/或锂的无机试剂。这些路线可通过六元环过渡态进行，其中六元环的一个成员是有机金属试剂的无机元素。在一些实施方案中，与过渡态相关的立体位障作用可能影响此反应的立体化学结果。
在本发明中将要讨论2种示范性的立体选择性方案中。第一个立体选择性方案(方法3，示于图3的路线32)，使含硅化合物经历消除反应，产生(E)或(Z)异构体，这取决于是在酸性还是在碱性条件下进行。这是Peterson烯化的例子。在第二个立体选择性方案中，(方法4，也示于图3的路线33)，从不同的前体产生各个异构体。(Z)异构体从含钛和磷的中间体产生，而(E)-异构体通过含锂中间体产生。
方法3
该合成路线通过乙酰基环孢菌素A醛51进行。
D.J.S.Tsai and D.S.Matteson在“A stereocontrolled synthesis of(Z)and(E)terminal dienes from pinacol(E)-1-trimethylsilyl-1-propene-3-boronate”，Tetrahedron Letters，Vol.22.No.29，pp.2751-2752(1981)一般讨论了类似的反应方案。此方法可见图6的说明。一般，该合成包括制备三甲基甲硅烷基烯丙基硼酸酯试剂62，然后用62处理乙酰基环孢菌素A醛51，形成β-三甲基甲硅烷基醇64。该醇据信是由含硼过渡态63形成的。由于在烯丙基硼化反应中该硼酸酯的慢反应性，本领域技术人员应该知道使用快反应的硼烷试剂如E-γ-三甲基甲硅烷基二乙基硼烷或9-(E-γ-三甲基甲硅烷基烯丙基)-9-BBN是有利的。β-三甲基甲硅烷基醇64然后可发生Peterson烯化反应以制备烯烃，在此情况下是二烯65或二烯67。
烯烃的形成有2条不同的路线，取决于消除反应(烯化)是在酸性条件下还是在碱性条件下进行。在酸性条件下，发生反式消除产生(E)-异构体，而在碱性条件下发生顺式消除形成(Z)-异构体。本领域技术人员知道，采用这个合成路线，可从相同的前体合成二异构体的任何一种。各消除反应的产物都包含富含2种异构体之一的组合物。在一个实施方案中，富含是指组合物中含有大于或等于75重量％的一种异构体。在其他实施方案中，富含组合物可含有80、85、90重量％的一种异构体。然后可以按预定的比例合并富含一种异构体的组合物，以得到如图10所示的理想混合物。
现在详细讨论图6的反应，从含硼试剂62的制备开始。在碳-碳键形成反应中采用硅试剂的一般研究见E.Ehlinger and P.Magnus在“Silicon insynthesis.10.The)trimethylsilyl)allyl anion：A β-acyl anion equivalent forthe conversion of aldehydes and ketones into γ-lactones”，J.Am.Chem.Soc.，vol.102，No.15，pp.5004-5011(1980)中2所述。具体地说，这些研究者说明了(三甲基甲硅烷基)烯丙基阴离子和醛之间的反应。该阴离子可通过用仲丁基锂在四氢呋喃(含1当量四甲基亚乙基二胺(TMEDA))中-76℃去脱烯丙基三甲基甲硅烷的质子而制备。
烯丙基三甲基硅烷的去质子化(该步在图6未示出)可见J.-F.Biellmannand J.-B.Ducep在“Allylic and benzylic carbanions substituted byheteroatoms”，Organic Reactions，Vol.27(Wiley，New York，1982)，p.9中所述。对取代的烯丙基系统中杂原子α位质子可用更加碱性的试剂除去。有许多这样的试剂可以得到，也许正丁基锂最为常用。采用正丁基锂以化学计量与待金属化的化合物在四氢呋喃(THF)溶液中反应。温度通常维持在0℃以下(常常是-76℃以下)，由于正丁基锂的聚合性质，此时它具有低的反应性。加入螯合试剂如N，N，N’，N’-四甲基亚乙基二胺(TMEDA)使聚合物解离。但是，该反应也可在室温进行，甚至在不存在TMEDA的情况下。
烯丙基硅烷易脱去质子，因为生成的阴离子不仅通过与相邻的双键共轭，而且通过临近的硅烷基反应而稳定化。该阴离子可通过其α-碳或其γ-碳与亲电子试剂反应。这些反应的区域化学和立体化学产出结果取决于几个因素，最重要的一个是抗衡离子的种类。参见烯丙基硅烷的讨论，S.E.Thomas在Organic Synthesis：The roles of boron and silion(Oxford University Press，New York，1991)，pp.84-67。
在该反应方案中，去质子的烯丙基硅烷然后被三甲基硼酸酯亲电子捕获，产生一个中间体，此中间体与频那醇反应时，产生反式-(三甲基甲硅烷基)硼酸酯化合物62。硼酸酯62也可称为“烯丙基硼烷”(烯丙基硼酸酯)。或者，如果9-甲氧基-9二烷基硼烷用于亲电子捕获，它将产生硼酸酯复合物，该复合物可用三氟化硼试剂(如BF3Et2O)脱甲氧基，产生相应的9-(γ-反式-三甲基甲硅烷基烯丙基)-9-二烷基硼烷。
S.E.Thomas在上述参考文献p34-35中讨论了醛对烯丙基硼烷的加成。将醛加入烯丙基硼烷中，后者在碳-碳双键的远端(“远端”指离硼原子最远)被不对称取代，产生含2种相邻手性中心的高烯丙基醇。(E)-烯丙基硼烷产生苏式非对映体，而(Z)-烯丙基硼烷产生赤式非对映体。(E)-烯丙基硼烷62与环胞菌素A醛51的示范性反应示于图6，其中在THF溶液中搅拌反应物几天后形成了硼中间体63。
硼中间体63中的编号69(图6)是指在硼的位置上任何数目的结构多是可能的。例如，如果硼酸酯试剂62是三烷基甲硅烷基烯丙基硼酸酯，则69上的结构将含有包括2个氧原子的5-元环。在62中使用的在硼酸酯或硼烷试剂上的取代将会出现在63的结构中。
据推测，在涉及烯丙基硼烷与醛的反应中实现立体选择性可能是由于此六元环椅形过渡态，见图6的硼中间体63所示。只有醛的2种羰基原子(由双键连接的碳和氧)成为六元环过渡态的成员；醛的其余部分从环中伸出。推测伸出远离此六元环的醛的CsA部分，相对于此环以平伏位而非直立位存在，因为后一个构型在取代基和烯丙基硼烷62的氧原子之间会产生不利的空间位障。本领域技术人员知道，如图6中SiMe3基团相对于(三甲基甲硅烷基)烯丙基阴离子的位置占据了平伏位置。或者，如果起始的烯丙基硼烷是(Z)-非对映体，SiMe3基团可能是直立位置。
或者，可考虑制备赤式-甲硅烷基醇，它的酸可消除将产生的顺式异构体，而碱消除则产生反式异构体，与上述消除反应的方式相反。本领域技术人员懂得在合成结束时会得到相同的产物。
过渡态产物63用三乙醇胺处理，产生β-三甲基甲硅烷基醇64。另一方面，(三甲基甲硅烷基烯丙基)二烷基硼酸酯的烯丙基硼化产物，在用NaOH/H2O2氧化或水性后处理时，产生甲硅烷基醇64。图6中所示的醇64是苏式非对映体，因为过渡态烯丙基硼烷63是(E)-构型的，虽然本领域技术人员知道，如果从Z-烯丙基硼烷试剂开始，也可以制备其他非对映异构体。由于在合成的后阶段这些手性中心的除去，新产生的手性中心中的非对映选择性在本阶段不能确定。图6显示的β-三甲基甲硅烷基醇64的结构本申请人采用光谱技术予以证实。
在称为Peterson烯化的烯烃合成方法中，从β-三甲基甲硅烷基醇64消除三烷基甲硅烷基和羟基产生了烯烃；在此情况下是二烯，这是由于此链的2个末端碳之间已存在双键。β-羟基硅烷转变为烯烃的讨论，见S.E.Thomas的参考文献p.68-69中所述。该反应的进一步讨论见P.F.Hurdlik and D.Peterson“Stereospecific olefin-forming elimination reaction of β-hydroxysilane”，J.Am.Chem.Soc.，Vol.97，No.6，pp.1464-1468(1975)。
请参阅图6，将醇64转变为二烯的消除反应，可能按2种不同机理的路线进行，取决于反应在酸性还是在碱性条件下进行。一条路线产生二烯65，而另一条路线产生二烯67。酸性条件下发生反式消除，而碱性条件下发生顺式消除。换句话说，β-羟基硅烷的消除反应是立体专一性的，酸-和碱-催化的反应采取相反的立体化学过程。用于酸催化反应的典型酸包括乙酸、硫酸和各种路易斯酸；典型的碱包括氢化钠和氢化钾或叔丁醇钾。情况可能是用氢化钠在THF中进行的消除反应在室温时反应缓慢的，而用氢化钾的消除反应则进行得相比快。
在此反应路线的此阶段产生立体专一性，因为在酸性条件下消除反应要求三甲基甲硅烷基和羟基处于反迫(扭转角180度)(antiperiplanar)关系。相反，在碱性条件下消除反应要求三甲基甲硅烷基和羟基采取顺叠(synperiphanar)关系。后一个条件有利于牢固硅-氧键和中间体四元环的形成，以Wittig反应最后一步类似的方式断裂。本领域技术人员知道，牢固硅-氧键取代弱硅-氧键，超过用弱的碳-碳π键取代牢固碳-氧键。
因此，β-羟基烷基硅烷的立体专一性消除产物是乙酰-(E)-1，3-二烯化合物67和乙酰-(Z)-1，3-二烯化合物65。如先前的方法中那样，此时可通过在甲醇和水中用K2CO3处理，脱除这两种二烯的保护基。这样脱除了与1-氨基酸残基β-碳连接的乙酸酯基，使该碳上的功能基团返回成醇。可用于脱除保护基的碳酸钾以外的碱，包括氢氧化钠、碳酸钠、醇钠和醇钾。
在制备的这个阶段合成基本上完成了。富含二种异构体之一的组合物可以混合，以在混合物中达到理想的异构体比例。在此处“富含”表示产物含有至少约75重量％的那种异构体；换句话说，产物可含有高达25重量％“不需要”的另一种异构体。通过设计，可使该混合物达到所需的药理学结果。
方法4
该路线还通过乙酰基环孢菌素A醛51进行。
用于产生立体选择性异构体的另一个方案，见图7-8说明。该合成路线与先前所述的不同，其中(1)产生ISATX247的(E)-异构体的合成路线通过与生成(Z)-异构体不同的中间体进行；(2)这些合成路线采用含钛和含锂的试剂和/或中间体。
已知钛试剂在有机合成中特别有用，因为在与醛和酮的反应中钛试剂是区域-和立体选择性的。在立体选择性化学中钛的一般性质见M.T.Reetz在Organotitanium Reagents in Organic Synthesis(Spriger-Verlage，Berlin，1986)，pp.VII，148-149，和164-165中所述。在此处要说的是，钛配体的性质可以改变，以便可以操纵该试剂的电子和立体个性，许多C-C键形成反应的立体化学结果可以预测。按照立体化学，非手性分子的2个前手性中心的联合可产生2个手性中心。控制立体选择性结果的一般规律是Z-构型的烯醇盐或巴豆酰基金属化合物优先生成顺式加成物，而E-构型的试剂有利于生成反式非对映体。该倾向可再次用假定具有椅形几何的六元环的过渡态加以解释。
这种类型的立体选择性合成的具体例子见Y.Ikeda et al.，“Stereoselective synthesis of(Z)-and(E)-1，3-alkadienes from aldehydes usingorganotitanium and lithium reagents”，Tetrahedron，Vol.43，No.4，pp.723-730(1987)中所述。该参考文献披露了烯丙基二苯基膦可用来产生[3-(二苯基膦基)烯丙基]钛试剂，进而可与醛缩合，再形成磷鎓盐，产生高区域-和立体选择性的(Z)-1，3-烷二烯。相反，锂化的烯丙基二苯基膦氧化物可与醛缩合，直接产生(E)-1，3-烷二烯，仍具有所需的立体选择性。
参看图7，ISATX247的(Z)-异构体合成(如先前方案那样)可通过从环孢菌素A34产生乙酰基环孢菌素A醛进行。[3-(二苯基膦基)烯丙基]钛试剂72可通过烯丙基二苯基膦7 1用强碱如t-BuLi去质子化，然后使产物与四异丙氧化钛反应而制备。理论上提出过渡态73产生赤式-α-加成物74，然后用碘甲烷(MeI)处理74可将其转变为β-氧化膦鎓盐75。据推测过渡态73的存在至少部分导致该合成路线的立体选择性。
按照本发明所述的示范性方法，有机金属试剂的金属位点可能是控制区域选择性的主体(Ikeda，p.725)。这意味着图7中的醛51与二苯基膦基化合物72的α位发生反应，产生相应的α-加成物74，因为二苯基膦基的γ-碳与金属配位，在此情况下该金属是钛。观察到的二烯产物的Z选择性可认为是六元环过渡态73而致来解释。因为醛35的庞大环孢菌素A侧链和二苯基膦基据推测在过渡态中采取平伏位置，所以选择性地形成了赤式α-加成物74，产生(Z)-1，3-二烯76。
与图7反应路线相反，图7中经过钛过渡态产生ISATX247的(Z)-异构体，此方法不那么容易产生(E)-异构体。事实上，用此方法合成(E)-异构体的尝试通常得到低产率。相反，如图8所示，锂衍生物82可与醛51反应，生成含锂过渡态83，它以E/Z比例超过约75∶25的范围形成1，3-二烯。如图7所示，此反应产物的高立体选择性可能是由于过渡态83，其中锂试剂82的乙烯基和醛51的环孢菌素A的侧链据推测是占据了平伏位置的，因此以立体选择性方式产生(E)-1，3-二烯84。如先前所述，通过采用保护基(如苯甲酸酯或甲硅烷基醚)在所有的立体选择性合成中可以避免与乙酸酯保护基有关的某些不需要的副反应。
混合物的制备
如前所述，发现ISATX247的顺式和反式异构体的某些混合物能显示比天然存在的和现今已知的环孢菌素增强的效力和毒性降低。
按照本发明的实施方案，ISATX247异构体(和它的衍生物)可通过立体选择性程度不同的立体选择性合成路线合成。此立体选择性路线可产生富含(E)-异构体的第一材料或组合物，和富含(Z)-异构体的第二材料或组合物，然后可以混合这些材料，以使得到的混合物具有2种异构体的理想比例。或者，可考虑通过分离反应产物，以分离并富集(E)-异构体而制备第一材料，或通过分离反应产物，以分离并富集(Z)-异构体而制备第二材料。在另一个实施方案中，可以调整立体选择性合成路线的反应条件，以在制备的混合物中直接产生理想的比例。
这些原则见图9A-C和10说明。图9A-C中，显示了3种假定的合成反应，分别产生(E)对(Z)-异构体的比例为约65∶35重量％、50∶50重量％、和35∶65重量％。当然，这些比例是示范性的，目的只用于说明，可以选出任何假定的数字组合。本领域技术人员懂得，用于产生图9A比例的反应条件可能与图9B和9C不同，以便在产物混合物中达到二异构体的不同比例。各反应的条件已被调整，以便产生在该情况下2种异构体的特定比例。
与一些产生异构体混合物的合成路线相反，可以先分别制备两种异构体，然后以预定的比例混合，以达到理想的比例。这个概念可见图10中说明，一种立体选择性路线的产物富含一种异构体，其产物含有大于75重量％以上的(E)异构体，另一种立体选择性路线的产物富含另一种异构体，其产物含有大于75重量％以上的(Z)异构体。这些数字也是说明性的，立体选择性路线产生的所需异构体的纯度在一个实施方案中可以大于或等于75重量％。在其它实施方案中所需异构体可分别含有大于或等于约80、85、90、或95重量％。
在分别合成了各异构体后，混合它们，达到所需的比例，如图10所示那样。为了说明的目的，图10中和在图9A-C中一样选择了相同的假定比例。请参阅图10，混合(E)和(Z)-异构体，产生3种不同的混合物，分别含有(E)∶(Z)的比例大约为65∶35重量％、50∶50重量％和35∶65重量％。
在另一个实施方案中，可以分离ISATX247异构体的(E)和(Z)-异构体混合物，使该混合物中富含一种异构体超过另一种。例如，可利用Diels-Alder反应使顺式异构体与烯烃反应而转变为闭环化合物。如果烯烃连接于一种能够分离(如可过滤)的底物，该顺式异构体就能基本上从混合物中分离出来，留下富含反式异构体的组合物。通过加热可从闭环化合物重建该顺式异构体，产生富含顺式异构体的组合物。因此，用这种方式，可以分开顺式和反式异构体。
实际上，任何混合物中的(E)∶(Z)-异构体比例，无论产生它们的方法的立体选择性程度如何，可有宽广的数值范围。例如，此混合物可含有约10-90重量％的(E)-异构体和约90-10重量％的(Z)-异构体。在其它实施方案中，此混合物可含有约15-85重量％的(E)-异构体和约85-15重量％的(Z)-异构体；或约25-75重量％的(E)-异构体到约75-25重量％的(Z)-异构体；或约35-65重量％的(E)-异构体到约65-35重量％的(Z)-异构体；或约45-55重量％的(E)-异构体到约55-45重量％的(Z)-异构体。在还有其它实施方案中，异构体混合物是ISATX247混合物，包含约45-55重量％的(E)-异构体到约55-45重量％的(Z)-异构体。约45-55重量％的(E)-异构体到约55-45重量％的(Z)-异构体。这些重量百分数是根据组合物的总重量计算的，本领域技术人员知道，(E)和(Z)-异构体的重量百分数之和是100重量％。换句话说，此混合物可含有65重量％的(E)-异构体和35重量％的(Z)-异构体，反之亦然。
混合物中一种异构体或另一种异构体的百分数可用核磁共振(NMR)或本领域公知的其它技术来验证。
药物组合物
本发明也涉及治疗需要免疫抑制的病人的方法，包括给予含有本发明混合物作为活性组分的药物组合物。该组合有兴趣的病征具体包括自身免疫疾病和炎症疾病以及与移植物排斥有关或引起它的疾病，如以下疾病的治疗(包括改善、减轻、消除或治愈病原学或症状)或预防(包括基本或完全限制、预防或避免)：
(a)急性器官或组织移植排斥，如接受心、肺、心-肺联合、肝、肾、胰、皮肤、肠、或角膜移植者的治疗，特别是预防和/或治疗T-细胞介导的排斥，以及移植物抗宿主疾病，如骨髓移植后产生的疾病；
(b)移植器官的慢性排斥，特别是，预防移植物的血管疾病，此病的特征是由于平滑肌细胞增生和相关作用导致内膜增厚，结果移植物动脉发生狭窄。
(c)异种移植物排斥，包括器官的急性、亚急性、或慢性排斥，当器官供体和受体属于不同物种时发生，最特别是B-细胞介导的排斥或抗体介导的排斥。
(d)自身免疫疾病和炎症疾病，特别是病原学包括免疫学或自身免疫成分的炎症疾病，诸如关节炎(例如类风湿性关节炎、慢性进行性关节炎和关节炎变形)和其他风湿性疾病。可采用本发明的协同性组合治疗的具体自身免疫疾病包括：自身免疫血液疾病(包括，如溶血性贫血、再生障碍性贫血、纯红细胞贫血和自发性血小板减少)、全身性红斑狼疮、多软骨炎，硬皮病，Wengener肉芽肿病，皮肌炎，慢性活动性肝炎、重症肌无力，牛皮癣、Steven-Johnson综合症、自发性口炎性腹泻，(自身免疫)炎性肠病(包括如溃疡性结肠炎和Crohn氏病)、内分泌眼病、Graves氏病、肉样瘤病，多发性硬化病、原发性胆汁性肝硬化、少年糖尿病(I型糖尿病)、眼色素层炎(前和后)、干性角膜结膜炎和春季角膜结膜炎，间质性肺纤维化、牛皮癣关节炎、肾小球性肾炎(有或无肾病综合症，如包括自发性肾病综合症或最小改变肾病)和春季性皮肌炎。皮肤的自身免疫和炎症疾病也考虑可用本发明协同性组合进行预防和治疗，如牛皮癣、接触性皮炎、特应性皮炎、簇状脱发、多形态红斑、疱疹样皮炎、硬皮病、白斑、过敏性血管炎、荨麻疹、大疱天疱疮、红斑狼疮、天疱疮、获得性大疱性表皮松解、和其它炎性或过敏性皮肤疾病，如肺和气道炎性疾病，包括哮喘、过敏症和尘肺病。
可单纯给予本发明的异构体类似物或与药学上可接受的载体一起给予有此需要的温血动物。药物载体可是液体或固体。本发明混合物可以含有常规的无毒性药学上可接受的载体、辅佐剂、和运载体的单位剂量制剂口服、局部应用、胃肠外、吸入喷雾或直肠给药。本文所用术语“胃肠外”包括皮下、静脉内、肌肉内、胸骨内注射或灌注技术。
含有本发明混合物的药物组合物可优选适合于口服应用的形式，例如，药片、锭剂、糖锭、水性或油性悬浮液、可分散的粉末或颗粒、乳剂、硬或软胶囊、或糖浆或酏剂。打算口服应用的组合物可按照本领域已知的制造药物组合物的方法制备，这样的组合物可含有一种或多种选自以下的药剂：甜味剂、调味剂、着色剂、和防腐剂，以提供药学上优雅的和可口的制剂。含有与无毒性药学上可接受的赋形剂混合的活性成分的药片，也可通过已知的方法制造。所用的赋形剂例如是：(1)惰性稀释剂，如碳酸钙、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；(2)造粒剂或崩解剂，如玉米淀粉、或海藻酸；(3)黏结剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；(4)润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。药片可以无包衣或用已知的技术包衣，以便延缓在胃肠道内崩解和吸收，因此在较长的时间内提供持续的作用。例如，可以利用时间延迟材料如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。它们也可用美国专利4256108；4160452；4265874中所述技术包衣，形成渗透性治疗药片用于受控释放。在某些情况下，用于口服的制剂可以是硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂混合，如硬酸钙、磷酸钙或白陶土。他们也可以是软明胶胶囊形式，其中活性成分与水性或油性介质混合，例如花生油、液体石蜡或橄榄油。
水性悬浮液通常含有活性成分与适合制造水性悬浮液的赋形剂混合。这样的赋形剂可包括：(1)悬浮剂，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶、和阿拉伯胶；或(2)分散剂或润湿剂，可以是天然存在的磷脂如卵磷脂、氧化烯与脂肪酸的缩合产物如聚氧乙烯硬脂酸酯、环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物如十七亚乙基氧十六烷醇、环氧乙烷与部分酯(衍生自脂肪酸和己糖醇)的缩合产物如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯、或环氧乙烷与部分酯(衍生自脂肪酸和己糖醇酐)的缩合产物如聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。
水性悬浮液还可含有一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯；一种或多种着色剂；一种或多种调味剂；和一种或多种甜味剂，如蔗糖、阿司巴坦或糖精。
油性悬浮液可将活性成分悬浮在植物油中配制，例如，花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油，含ω3脂肪酸的鱼油或矿物油如液体石蜡。油性悬浮液可含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或十六烷醇。也可加入甜味剂和调味剂，提供可口的口服制剂。这些组合物可通过加入抗氧化剂如抗坏血酸保存。
可分散的粉剂和颗粒剂适合于制备水性悬浮液。它们可提供与分散剂或润湿剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的活性成分。合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂上述已有举例。也可存在其它的赋形剂，例如，上述的那些甜味剂、调味剂和着色剂。
含本发明混合物的药物组合物还可以是水包油乳剂形式。油相可以是植物油，如橄榄油或花生油，或矿物油如液体石蜡，或它们的混合物。合适的乳化剂可以是(1)天然存在的树胶，如阿拉伯胶和黄蓍胶；(2)天然存在的磷脂如大豆和卵磷脂；(3)酯或部分酯30，衍生自脂肪酸和己糖醇酐，如失水山梨糖醇单油酸酯；(4)所述部分酯与环氧乙烷的缩合产物，如聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。乳剂也可含甜味剂和调味剂。
糖浆剂和酏剂可用甜味剂配制，如甘油、异丙醇、山梨糖醇、阿司巴坦或蔗糖。这样的制剂还可含湿润剂、防腐剂和调味剂及着色剂。
此药物组合物可以是灭菌可注射的水性或油性悬浮液。该悬浮液可按照已知方法用上述那些合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。灭菌可注射制剂也可以是以无毒性胃肠外可接受的稀释剂或溶剂(如1，3-丁二醇)配制的灭菌可注射溶液或悬浮液。可采用的可接受载体和溶剂是水、Ringer氏溶液、等渗氯化钠溶液。此外，灭菌固定的油常规用作溶剂或悬浮介质。为此目的，任何温和固定的油均可使用，包括合成的单或二甘油酯。此外，脂肪酸如油酸也可用在注射液中。
本发明混合物还可以栓剂形式用于直肠给药。这些组合物可通过将药物与合适的无刺激性赋形剂混合制备，赋形剂在常温下是固体，但在直肠温度下是液体，因此在直肠中会融化释放出药物。这样的材料是可可脂和聚乙二醇。
对于局部外用，含有本发明公开的环胞菌素的霜剂、软膏、凝胶、溶液、或悬浮液等等都可使用。
在特别优选的实施方案中，应用含有表面活性剂、乙醇、亲脂和/或两性溶剂作为非活性成分的液体溶液。特别是采用含此异构体类似物混合物和以下非药物成分的口服多重乳液配方：d-α生育酚基聚乙二醇1000琥珀酸酯(维生素E TPGS)、中长链三甘油酯(MCT)油、Tween40、和乙醇。也可优选采用含此异构体类似物混合物和与口服溶液相同的非药物成分的软明胶胶囊(包含明胶、甘油、水和山梨糖醇)。
0.05mg/kg体重/天-50mg/kg体重/天的剂量水平可用于治疗上述疾病。剂量水平和给药安排可按照所用的具体异构体混合物、待治疗的疾病、和其它因素(如年龄和患者状况)而不同。优选剂量约0.5-约10mg/kg/天和约0.1-约10mg/kg/天。在优选的实施方案中，约2-约6mg/kg/天，口服，b.i.d.。特别优选实施例中，口服bid给予约0.5-3mg/kg/天。
可与载体材料混合产生单剂型的活性成分的量，根据治疗的宿主和具体的给药方式而不同。例如，用于人口服给药的制剂可含2.5mg-2.5g活性化合物，与合适的常用量的载体材料混合，载体材料的量可在总组合物的约5-95％范围内变化。单位剂型一般含约5mg-约500mg活性成分。在一优选的实施方案中，单个胶囊含约50mg异构体混合物用于口服给药。在另一个优选实施方案中，含约50mg异构体混合物的口服溶液用于口服给药。
但是，应该明白，对于任何具体患者的具体剂量水平取决于各种因素，包括所用的具体化合物的活性、年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度、药物配伍以及所治疗具体疾病或病症的性质和严重性。
方法学
环孢菌素衍生物(一类由真菌Tolypocladium inflatum Gams产生的环状多肽)，由于主要作用于T细胞介导的反应而在免疫抑制治疗中越来越多地使用。已经观察到环孢菌素衍生物能可逆地抑制免疫活性淋巴细胞，特别是T-淋巴细胞，以及抑制淋巴因子的产生和释放。该作用主要通过环孢菌素A-诱导的钙调磷酸酶(在细胞的胞浆中发现的一种磷酸酯酶)抑制而介导(Schreiber and Crabtree，1992)。环孢菌素A或环孢菌素A衍生物的效应指示物，是其抑制钙调磷酸酶的磷酸酯酶活性的能力。钙调磷酸酶抑制试验可测量此药物在其作用位点的活性，并因此是评价环孢菌素A类似物药效的最精确和直接的体外评价方法(Fruman et al.，1992)。
ISATX247是与环孢菌素A类似的环胞菌素A类似物，不同之处是对该分子1-氨基酸残基上的功能基团作了新颖修饰。在体外钙调磷酸酶抑制试验中我们发现，ISATX247显示的药效比环孢菌素A强3倍。
药效学研究(体内和体外)表明，ISATX247比现有的其它环孢菌素化合物更为强效。环孢菌素类似物的异构体混合物(约10∶90至约90∶10，反式∶顺式)，特别是具有50-55％Z-异构体和45-50％E-异构体的ISATX247，作为免疫抑制剂(相对与环孢菌素A)的药效，已在体外钙调磷酸酶活性试验、大鼠心脏移植模型、胰岛细胞同种移植小鼠模型、胶原诱导的小鼠关节炎模型、和/或抗原诱导的兔关节炎模型中得到证明。数据显示，这些异构体混合物的药效相当于或更强于环孢菌素A，因此可用于免疫调整失调的治疗。
与环孢菌素A治疗有关的副作用有许多，列举几个，包括肾毒性、肝毒性、致白内障作用、多毛症、和牙龈增生(Sketris et al.，1995)。其中，肾毒性是最严重之一，是应用环孢菌素导致的剂量相关不良作用。环孢菌素引起肾损伤的确切机理尚不知道；但是，已经提出，血管收缩物质在肾脏中浓度的增加会导致肾小球输入小动脉局部血管收缩。这可能导致肾局部缺血，肾小球过滤速度降低，长时间以后发生间质性纤维化。
ISATX247的非临床安全性已在许多动物种类中作了评价。对大鼠、狗、和灵长类的重复剂量口服毒性研究表明，ISATX247是良好耐受的，并产生与免疫抑制相一致的作用。在所有种类动物中观察到的唯一毒理学作用是腹泻。
在体外细菌逆向突变和染色体畸变试验中，和体内大鼠小核试验中，已证明ISATX247不显示突变活性。迄今致癌性研究尚未完成。ISATX247的生殖毒性研究已在妊娠大鼠和兔中完成。没有发现与治疗有关的畸形和改变。观察了导致母系中毒及相应的胚胎毒性的所有剂量。
实施例
实施例1：环孢菌素A的乙酰化
将乙酐(140毫升)加入环孢菌素A(50.0克，41.6毫摩尔)中，室温氮气中搅拌混合物，直到环孢菌素A溶解。加入二甲基氨基吡啶(7.62g，62.4mmol)，反应在室温氮气中搅拌3小时，或直到反应完全。将反应混合物冷却到5℃然后过滤。用己烷洗涤收集到的固体，洗去多余的乙酐。将得到的糊状固体缓慢转移到剧烈搅拌的5％碳酸氢钠水溶液(1.5L)中。搅拌得到的悬浮液，直到得到细浆和CO2停止释放。过滤收集固体，用水洗涤，直到滤液的pH呈中性。固体产物在真空烘箱中(55℃)干燥过夜，得到44.0g(85％)无色固体产物。
实施例2：实施例1产物的氧化
将乙腈(320毫升)和水(80毫升)加入乙酰基环孢菌素A(42.97g，34.54mmol)中，搅拌混合物，直到全部物质溶解。加入过碘酸钠(14.77g，69.08mmol)，然后加入氯化钌水合物(0.358g，1.73mmol)，在氮气中室温搅拌反应物3小时。加入水(300毫升)，将混合物转移到分液漏斗。混合物用乙酸乙酯(300毫升，然后200毫升)提取2次。合并暗黑色乙酸乙酯提取液，用250毫升水，然后用250毫升盐水洗涤。有机溶液用硫酸镁干燥，蒸发溶剂，得到墨绿色固体。粗产物硅胶层析，用40％丙酮/60％己烷洗脱，得到无色固体产物(29.1g，68％)。
实施例3：乙酰ISATX247的制备
(i)内鎓盐的原位产生
将乙酰基环孢菌素A醛(31.84g，25.84mmol)加到340毫升甲苯中，搅拌混合物，直到完全溶解。向生成的溶液加入340毫升1当量氢氧化钠水溶液。剧烈搅拌混合物，然后加入烯丙基三苯基膦鎓溴化物(58.22g，151.90mmol)。室温搅拌反应物24小时。再加入烯丙基三苯基膦鎓溴化物(16.64g，43.42mmol)，再搅拌24小时。混合物转移到分液漏斗中，分出甲苯层。水层用200毫升甲苯提取。合并2次甲苯层，依次用200毫升去离子水、200毫升饱和氯化钠水溶液洗涤，用硫酸镁干燥。过滤，蒸发甲苯，得到极粘的胶质。该物质用120毫升乙酸乙酯处理，搅拌至形成细浆。快速搅拌下将己烷(570毫升)缓慢加入。再搅拌30分钟。过滤得到的悬浮液。用160毫升5∶1己烷/乙酸乙酯洗涤收集的固体。合并的滤液在旋转蒸发仪上浓缩，得到粘性的半固体。该物质用75毫升乙酸乙酯处理，搅拌到形成细浆。快速搅拌下缓慢加入己烷(225毫升)。再搅拌30分钟，过滤得到的悬浮液。用100毫升5∶1己烷/乙酸乙酯洗涤收集的固体。滤液在旋转蒸发仪上浓缩，得到淡黄色固体。粗产物上硅胶层析，用40％丙酮/60％己烷洗脱，得到无色固体产物(14.09g)。
(ii)预先形成内鎓盐和在LiBr存在下的反应
将烯丙基三苯基膦鎓溴化物(7.67g，20mmol)在四氢呋喃THF(20mL)中搅拌悬浮并冷却到0℃，加入KOBut的THF(20mL，20mmol，1M溶液)溶液。在此温度再搅拌30分钟，加入LiBr的THF(10mL，10mmol，1M溶液)溶液。再搅拌反应混合物30分钟，通过插管加入乙酰基CsA-醛(4.93g，4mmol)的THF(10mL)溶液。室温搅拌15分钟后，用饱和NH4Cl溶液(25毫升)终止反应。后处理和层析如前所述，得到乙酰化的ISATX247无色固体(3.5g)。
实施例4：ISATX247的制备
将乙酰ISATX247(14.6g，11.62mmol)溶于340毫升甲醇中，然后加入135毫升去离子水。加入碳酸钾(13.36g，96.66mmol)，室温搅拌混合物24-48小时，直到反应完全。蒸发去大部分甲醇，搅拌下加入250毫升乙酸乙酯。缓慢加入10％柠檬酸水溶液(120毫升)，然后分出乙酸乙酯层。水层用另外200毫升乙酸乙酯提取。合并的乙酸乙酯提取物依次用150毫升去离子水、100毫升10％柠檬酸水溶液、150毫升饱和氯化钠洗涤，用硫酸镁干燥。蒸发乙酸乙酯，得到淡黄色固体。粗产物上硅胶层析，用40％丙酮/60％己烷洗脱，得到无色固体产物ISATX247(10.51g，75％)。ISATX247含45-50％E-异构体和50-55％Z-异构体。
实施例1-4的产物用质谱和/或核磁共振谱特征分析。
实施例5：乙酰-η-溴代环孢菌素A的制备
如实施例1制备乙酰基环孢菌素A(41.48g，33.3mmol)，将N-溴代琥珀酰亚胺(10.39g，58.4mmol)和偶氮二异丁腈(1.09g，6.67mmol)溶于250毫升四氯化碳中加热回流混合物2.5小时。冷却混合物，蒸发溶剂。用350毫升乙醚处理残留物，过滤除去不溶性物质。滤液依次用150毫升水和150毫升盐水洗涤，用硫酸镁干燥。蒸发溶剂。粗产物上硅胶层析，用40％丙酮/60％己烷洗脱，得到乙基-η-溴代环孢菌素A黄色固体28.57g(65％)。
实施例6：乙酰基环孢菌素A的三苯基膦鎓溴化物的制备
将乙酰基-η-溴代环孢菌素A(28.55g，21.6mmol)和三苯膦(7.55g，28.8mmol)溶解在210毫升甲苯中，得到的溶液加热100℃21小时。冷却溶液，蒸发甲苯。得到的油状半固体用250毫升己烷/乙醚(1∶4)处理，充分混合，轻轻倒出溶剂。用150毫升乙醚重复该过程3次。然后将残留物溶于50毫升乙酸乙酯，用220己烷沉淀。过滤收集产生的固体，得到乙酰基环孢菌素A的三苯基膦鎓溴化物褐色固体22.5g(66％)。
实施例7：Wittig反应
将乙酰基环孢菌素A的三苯基膦鎓溴化物(100mg，0.06mmol)、过量的37％甲醛(0.25mL)和甲苯(2mL)室温快速搅拌。滴加1N氢氧化钠水溶液(2mL)，再搅拌3.5小时。用20毫升乙酸乙酯和10毫升水稀释反应混合物。分出乙酸乙酯层，依次用10毫升水、10毫升盐水洗涤，用硫酸镁干燥，蒸发溶剂。粗产物上硅胶层析，用丙酮/己烷(2∶3)洗脱，得到70mg(88％)乙酰ISATX247的E-异构体和Z-异构体混合物无色固体。
实施例8：Wittig反应产物的脱乙酰化
将实施例7的异构体混合物(70mg，0.056mmol)溶于5毫升甲醇，然后加入1毫升水。加入碳酸钾(75mg)，室温搅拌反应物19小时。蒸发大部分甲醇，在残留物中加入15毫升乙酸乙酯，再加入10毫升10％柠檬酸水溶液。分出乙酸乙酯层，水层再用10毫升乙酸乙酯提取。合并的乙酸乙酯提取物依次用10毫升水、10毫升10％柠檬酸水溶液和10毫升盐水洗涤，用硫酸镁干燥，蒸发溶剂。粗产物上硅胶层析，用丙酮/己烷(2∶3)洗脱，得到37mg(54％)ISATX247无色固体，含85％E-异构体和15％Z-异构体。
实施例5-8的产物用质谱和/或核磁共振谱作特征分析。
实施例9：ISATX247的几何异构体的制备
ISATX247的顺式和反式异构体可用以下反应方案分别合成。该反应顺序包括烯丙基三甲基甲硅烷的金属化、用硼酸三甲酯的亲电捕获、接着水解、然后转酯化，产生中间体反式-(三甲基甲硅烷基)烯丙基硼酸酯。环孢菌素醛的烯丙基硼化产生硼中间体，通过螯合此中间体转变为所需的β-三甲基甲硅烷基醇。由于产生的新的手性中心将在下一个阶段被去除，这些手性中心的非对映选择性不取决于这个阶段。应该注意，在β-三甲基甲硅烷基醇中的2种中心的相对立体化学是于预料相一致的反式排列，这是由于在反式-(三甲基甲硅烷基)烯丙基硼酸酯前体中的反式双键所致。
β-三甲基甲硅烷基醇的碱催化去除(Hudrlick et al.，1975)产生富含乙酰-(Z)-1，3-二烯的组合物，而酸催化去除产生富含乙酰-(E)-1，3-二烯的组合物。脱保护产生各自二烯醇，分别为ISATX247的E-异构体和Z-异构体。
产生二烯的另一条途径是利用烯丙基正膦。金属化烯丙基二苯基膦然后用Ti(OPri)4转金属化，产生钛中间体。烯丙基钛化随后被立体专一性消除产生富含(Z)-二烯的组合物。
另一方面，当烯丙基二苯基膦氧化物发生类似的反应顺序时(图8)，则主要产生E-异构体。
(i)乙酰CsA-CHO的烯丙基硼化：
按照先前报告的方法(Ikeda，et al.，1987)制备(E)-1-三甲基甲硅烷基-1-丙烯-硼酸酯。向搅拌的(E)-1-三甲基甲硅烷基-1-丙烯-硼酸酯(0.2g，0.832mmol)的THF溶液在氮气中加入乙酰基环孢菌素A醛(1.026g，0.832mmol)。用高效液相层析(C-8柱，反相)临测反应混合物，共搅拌7天。然后加入三乙醇胺(0.196g，1.3mmol)，再搅拌4天。用硅胶柱纯化得到的β-三甲基甲硅烷醇。MS(ES)m/z 1368.9(M++Na+)。
向KH(3.5mg，26.4μmol，30％矿物油分散液，用无水己烷洗涤)的无水THF(1mL)悬浮液中加入β-三甲基甲硅烷醇(10mg，7.4μmol)，室温搅拌10分钟。用乙醚(10mL)稀释反应混合物，用饱和NaHCO3溶液(2×5mL)洗涤。干燥(Na2SO4)并蒸发去除溶剂，得到富集的(Z)-乙酰-1，3-二烯。MS(ES)m/z 1294.8(M++K+)。
(ii)乙酰CsA-CHO的烯丙基钛化：
向搅拌并冷却(-78℃)的烯丙基二苯基膦(0.54g，2.4mmol)的无水THF(8mL)溶液加入t-BuLi(1.42mL，2.4mmol，1.7m戊烷溶液)。同一温度搅拌砖红色溶液15分钟，然后0℃搅拌30分钟。再冷却到-78℃，加入Ti(OPri)4(0.71mL，2.4mmol)。在此温度搅拌此棕色溶液15分钟，然后通过插管加入乙酰CsA-CHO(2.5g，2mmol)的THF(10mL)溶液。再搅拌淡黄色溶液30分钟，然后加热到室温过夜。0℃向反应混合物加入MeI(0.15mL，2.4mmol)。在此温度再搅拌1小时，然后室温搅拌2小时。将反应混合物倒入冰冷的1％HCl(100mL)。水层用EtOAc(3×50mL)提取。合并的有机提取物用水(2×25mL)和盐水(25mL)洗涤。蒸发溶剂得到黄色固体，用硅胶柱层析纯化。用1∶3丙酮己烷洗脱。得到ISATX247的(Z)-富集异构体(Z/E比例：75∶25)。
实施例10：ISATX247异构体(E)-富集混合物的制备
在-78℃向烯丙基二苯基膦氧化物(1mmol)和六甲基磷酰胺(2mmol)的THF(5mL)溶液加入正丁基锂(1mmol，溶于己烷)。-78℃搅拌混合物30分钟。加入乙酰环胞菌素醛(0.8mmol)的THF(7mL)溶液，让反应混合物逐渐升温至室温，然后搅拌18小时。将混合物倒入冰冷的1N盐酸(50mL)中，然后用乙酸乙酯提取。用水洗涤有机提取物，用硫酸镁干燥，蒸发溶剂。残留物用硅胶柱层析纯化。用25％丙酮/75％己烷洗脱。得到乙酰ISATX247的(E)-和(Z)-异构体的混合物。如实施例4脱除乙酸酯保护基团，得到ISATX247的(E)-富集异构体。质子NMR谱表明此混合物含有ISATX247的75％(E)-和25％(Z)-异构体。该反应也可按Schlosser改进法变体进行(R.Liu，M.Schlosser，Synlett，1996，1195)。向搅拌并冷却的(-78℃)的烯丙基二苯基膦氧化物(1.21g，5mmol)的THF(20mL)溶液中加入n-BuLi(2mL，5mmol，2.5M，溶于己烷)。-78℃搅拌此红色溶液40分钟。在15分钟内通过插管加入乙酰CsA-CHO(1.25g，1.02mmol)的THF(12mL)溶液。室温搅拌反应混合物2小时。如上后处理和层析得到乙酰ISATX247(Z∶E比例40∶60，由NMR分析确定)。
实施例11：苯甲酰基保护的环孢菌素A的制备
将环孢菌素A(6.01g，5mmol)和4-二甲基氨基吡啶(305mg，2.5mmol)溶于吡啶(5mL)中。加入苯甲酸酐(3.4g，15mmol)，50℃搅拌混合物19小时。再加入苯甲酸酐(1.7g，7.5mmol)和DMAP(305mg，2.5mmol)。50℃再搅拌24小时。加入苯甲酸酐(0.85g，3.8mmol)，再搅拌反应物23小时。搅拌下将反应混合物缓慢倒入水中。过滤沉淀的环胞菌素A苯甲酸酯，用水洗涤。收集的滤饼溶解在最小体积的甲醇中，将其加入10％柠檬酸溶液，搅拌1小时。过滤收集沉淀的产物，用水洗涤，直到滤液的pH和水一样。50℃真空干燥固体环孢菌素A苯甲酸酯，得到无色固体。
实施例12：三乙基甲硅烷基醚保护的环孢菌素A的制备
将环孢菌素A(3.606g，3mmol)溶解在无水吡啶(8mL)中，加入DMAP(122mg，1mmol)。反应混合物冷却到0℃，滴加三乙基甲硅烷基三氟甲烷磺酸酯(3.6mmol)。将混合物升温至室温，搅拌过夜。搅拌下将混合物缓慢倒入水中。过滤沉淀的三乙基甲硅烷基醚，用水洗涤。收集的滤饼溶解在最小体积的甲醇中，将其加入5％柠檬酸溶液，搅拌30分钟。过滤收集沉淀的产物，用水洗涤，直到滤液的pH和水一样。50℃真空干燥固体，得到无色固体三乙基甲硅烷基醚。通过类似方法，引入三异丙基甲硅烷基和叔丁基二甲基甲硅烷基保护基团。
实施例13：用钙调磷酸酶抑制试验测定免疫抑制活性
环孢菌素A或环孢菌素A衍生物效力的指标是其抑制钙调磷酸酶磷酸酯酶活性的能力。钙调磷酸酶抑制试验可测定该药物在其作用位点的活性，因此可直接体外评估环孢菌素A类似物的药效(Fruman et al.，1992)。
对ISATX247(45-50％E-异构体和50-55％Z-异构体)与环孢菌素A的免疫抑制活性已用钙调磷酸酶(CN)抑制试验作了评估。该试验的结果显示，ISATX247(45-50％E-异构体和50-55％Z-异构体)对钙调磷酸酶磷酸酯酶活性的抑制比环孢菌素A强3倍(由IC50测定)(图11)。
各种氘化和非氘化异构体类似物混合物与环孢菌素A免疫抑制活性已用此钙调磷酸酶(CN)抑制试验作了评估。这些类似物的结构和异构体组成见图12，图12中，编号“I4”相应于ISATX247的结构。I4-M2指用实施例5-8所述的方法制备的ISATX247(在该图中标为方法2)。I4-D4指氘化的ISATX247，由实施例1-4所述方法产生。I4-D2指氘化的ISATX247，由实施例5-8所述方法产生。其他异构体混合物如图中所示。
该测试结果显示，这些异构体类似物混合物对钙调磷酸酶磷酸酯酶活性的抑制作用至少和环孢菌素A的强度相同(通过IC50测定)(图13)。CsA指环孢菌素A；Isocyclo4指用实施例1-4方法产生的ISATX247。Isocyclo5相应于图12的I5-M1。Isocyclo4-d4相应于图12的I4-D4。Isocyclo5-d5相应于图12的I5-D5。Isocyclo4-d2相应于图12的I4-D2。Isocyclo4-M2相应于图12的I4-M2。Isocyclo5-m2相应于图12的I5-M5。
实施例14：用大鼠心脏移植模型测定免疫抑制活性
评价了ISATX247(45-50％E-异构体和50-55％Z-异构体)对不同品系的大鼠之间心脏移植排异的预防效果，并与环孢菌素A作相比。大鼠心脏移植模型是用来评价新的免疫抑制药物体内效果的最常用模型，因为由于免疫排斥，此模型的移植体长期存活很难达到。
该方法涉及将Wistar Furth大鼠的心脏异位移植给Lewis大鼠(腹部主动脉和下静脉腔)。环孢菌素A或异构体类似物混合物的腹膜内注射在移植前3天开始给予移植物接受体大鼠，并在移植后继续30天。如果在移植后30天期间观察到移植物机能不良，即处死该动物。如果在移植后动物存活超过30天，停止试验和对照，该让动物继续生存，直到移植物机能不良或在移植后生存至100天。
每组接受移植大鼠的平均存活率总结在表1中。这些结果显示，ISATX247(45-50％E-异构体和50-55％Z-异构体)在1.75mg/kg/天最佳剂量时比环孢菌素A增加存活时间大约3倍。许多接受ISATX247的动物在移植后100天(停止给药后70天)，移植物仍能发挥机能。这些数据证明该异构体类似物混合物在预防移植物排斥中具有免疫抑制活性。
表1 ISATX247和环孢菌素A腹膜内给药对移植的大鼠心脏平均存活时间的作用[2次分别研究的平均值，n 13] 剂量 平均存活时间(手术后天数)(mg/kg/天) 平均±SEM(扫描电子显微镜) 载体对照 环孢菌素A ISATX247 0 9±1 0.5 13a±4 11a±2 1.75 18b±7 57b±32 3 50c±8 55c±12
a.c没有显著差异
b有显著差异(p＜0.01)
对各种氘化和非氘化异构体类似物混合物(结构见图12)在预防不同品系大鼠之间心脏移植排斥中的作用也作了评价，并与环孢菌素A相比。剂量是1.75mg/kg/天共30天。结果总结在表2中。这些结果显示，剂量为1.75mg/kg/天的异构体混合物增加存活时间至少和环孢菌素A一样多，并证明这些异构体类似物混合物在预防移植物排斥中具有免疫抑制活性。
表2各种异构体类似物混合物和环孢菌素A以1.75mg/kg/天腹膜内给药对移植的大鼠心脏平均存活时间的作用 试验化合物 平均存活时间(手术后天数) 载体对照 9 环孢菌素A 20 I5-M1 20 I4-M2 20+ I4-D2 30
实施例15：在胰岛细胞同种异体移植中的免疫抑制活性
研究了ISATX247(45-50％E-异构体和50-55％Z-异构体)与环孢菌素A在小鼠模型中延长移植的胰岛细胞的存活的能力，将CBA/J小鼠的500个胰岛移植给糖尿病Balb/c接受小鼠的肾囊中进行研究。
移植后，ISATX247或环孢菌素A通过腹膜内(ip)注射(剂量为0(载体)、1.75、10、20、或25mg/kg/天)给药，共30天。每天监测血糖，直到移植物衰竭时，以连续2天血糖水平大于17mmol/L定义。
结果表明，ISATX247以20mg/kg/天的剂量增加了移植物存活时间40％(表3)。还注意到，当剂量增大时，ISATX247的毒性比环孢菌素A低。这在25mg/kg/天剂量水平时特别明显。
表3在1.75、10、20、或25mg/kg/天剂量水平腹膜内注射ISATX247或环孢菌素A时，小鼠胰岛同种异体移植物在受体糖尿病小鼠中的存活剂量(mg/kg/天)处理 N中位数存活 (天)平均存活 (天) 0 1.75 1.75 载体 CsA ISA 7 9 9 17 17 18 16.8 17.4 18.7 10 10 CsA ISA 6 5 21 18 25.3 19.2 0 20 20 载体 CsA ISA 12 9 9 16 19 ＞28 15.9 20.2 ＞28 0 25 25 载体 CsA ISA 5 10 8 21 ND* 50 21.1 ND* 46.4
*在该组中10个动物有7个死于CsA的毒性。因此，仅有3个动物完成实验，没有作统计。
实施例16：在关节炎中的免疫抑制活性
在过去30年中，有3种人类风湿性关节炎动物模型已获得深入研究并广泛应用于新的抗类风湿药物的临床前筛选和开发。这些包括佐剂诱导的、胶原诱导的、和抗原诱导的关节炎模型。设计以下研究来评价ISATX247(45-50％E-异构体和50-55％Z-异构体)在小鼠胶原诱导的关节炎模型和兔抗原诱导的关节炎模型中的抗炎效果。在这2种模型中观察到的组织病理学和免疫病理学与在人类疾病中的发现相似。在这2种模型中，考察了ISATX247预防关节炎发作(预防方案)和治疗关节炎(治疗方案)的效果。这些研究支持了本发明所主张的异构体类似物混合物的免疫抑制作用。
A.胶原诱导的关节炎
将雄性DBA/1 Lac J小鼠饲养在无病毒抗体的条件下，8-10周龄时用100微克小鸡II型胶原(用Freund氏完全佐剂乳化)皮下免疫。将ISATX247、环孢菌素A或载体(Chremophor EL/乙醇72∶28，体积/体积)原药用生理盐水稀释1-50倍(0.25、0.5、或1mg/mL)得到浓度为0(载体)；125、250、或500μg/每鼠(ISATX247)；和250或500μg/每鼠(环孢菌素A)，每天腹膜内注射给药。设计用于预防方案的动物(12只/组)从用胶原免疫的那天(第0天)开始给药，直到第40天处死。设计为治疗方案的动物(12只/组)从发病那天(～第28天)开始给药，直到第38天处死。
评价参数包括死亡率、血清肌酸酐、组织学和结果评价，如临床评分(目测)、后爪肿胀、组织学评分、糜烂评分、和免疫组织化学。糜烂评分以盲法检查中趾近端趾节间(PIP)关节前后部位，查看有无糜烂(以在软骨或骨中充满炎性组织作为区别性缺陷来确定)。该方法能用于相同关节的相比。过去的研究证明未治疗动物的该关节90％以上发生糜烂。
该结果表明，ISATX247高剂量治疗组(500μg/每鼠)负糜烂评分显著高于载体治疗组的负糜烂评分(p＜0.05)。中剂量ISATX247(250μg/每鼠)和高剂量环孢菌素A(500μg/每鼠)治疗组的负糜烂评分均比载体治疗组高(p＜0.1)。而且，低剂量ISATX247(125μg/每鼠)和中剂量环孢菌素A对照(250μg/每鼠)治疗组，当与载体对照组相比时，虽然统计学上不显著，但也显示更高的负糜烂评分。
显著防止关节糜烂发生的唯一治疗是ISATX247 500μg/每鼠。相对于载体对照组小鼠，ISATX247治疗组小鼠显示糜烂变化的PIP关节比例显著减少，证明了ISATX247具有改善疾病的性能。
B.抗原诱导的关节炎
将新西兰白兔，饲养在无特定病原体的条件下，用10mg生理盐水配的卵白蛋白(用Freund氏完全佐剂乳化)免疫，颈背部多点肌肉内和皮下注射。14天后，所有的动物开始接受每天2次关节内注射5mg卵白蛋白和65ng人重组转化生长因子2的生理盐水溶液。
将ISATX247、环孢菌素A或载体(Chremophor EL/乙醇72∶28，体积/体积)原药(在载体中)用生理盐水稀释1-4倍，得到浓度为0(载体)；2.5、5.0、或10mg/kg/天(ISATX247)；和5.0、10、或15mg/kg/天(环孢菌素A)，每天皮下注射给药。设计用于预防方案的动物(8只/组)从用卵白蛋白免疫那天(第0天)开始给药，直到第42天处死。设计用于治疗方案的动物(8只/组)从发病那天(～第28天)开始给药，直到第42天处死。
评价参数包括死亡率、体重、血清肌酸酐、组织学、和结局评价，如膝关节肿胀、滑液液体计数、总尸体解剖分析、和组织学。
与载体对照组动物相比，治疗28天后(预防方案)，在ISATX247(P 0.05)和环孢菌素A(P 0.05)组动物中观察到滑液组织病理学评分显著降低。这伴随着滑液液体计数显著降低(ISATX247，P 0.05；环孢菌素A，P 0.05)。与载体对照组相比，ISATX247(P 0.05)和环孢菌素A(P 0.05)治疗14天后，患关节炎动物的滑液组织病理学评分显著减少(治疗方案)。ISATX247(P＝0.01)组宏观关节炎评分显著降低是明显的，但环孢菌素A治疗动物则不明显。根据血清肌酸酐分析或尸体解剖组织学分析，治疗耐受性良好，没有显著毒性。
数据显示，家兔的抗体诱导关节炎模型中，对类风湿性关节炎的治疗和预防，ISATX247与环胞孢素A等价或可能更为强效。
实施例17；药物动力学和毒物动力学性能
在兔模型中测试了ISATX247(45-50％E-异构体和50-55％Z-异构体)和环孢菌素A的药物动力学和毒物动力学参数。家兔也可用作研究环孢菌素A肾毒性的模型，但远不如大鼠常用。研究发现，给予家兔给予环孢菌素A可引起结构和机能的改变，所用剂量不仅低于先前其它动物模型中已报道的剂量，而且也至少在人的治疗范围上限中(Thliveris et al.，1991，1994)。除了肾小管的细胞学改变外，间质纤维化和动脉病理的发现也提示，家兔是研究肾毒性的更合适模型，因为这些结构变化是在人类中观察到的肾毒性的标志。按照以下时间安排，在头7天静脉(i.v.)给予、然后23天皮下(s.c.)给予ISATX247。
表4家兔模型中ISATX247的药物动力学和毒物动力学性能研究的剂量给药时间安排治疗组 天：1-7 i.v剂量(mg/kg) 天：8-30 s.c剂量(mg/kg)动物数雄 雌 1.载体对照0 0 4 4 2.环孢菌素A对 照10 10 6 6 3.低剂量5 5 0 2 4.中剂量10 10 4 4 5.高剂量15 15 4 4
用无病原家兔(SPF)来确保观察到的任何肾改变都是由于ISATX247的作用而非病原体的作用。在第一天和第7天，在给药前和在给药后0.5、1、2、4、8、12、18、和24小时收集血样，作药物动力学曲线。其它评价参数包括临床观察、体重、饲料消耗、血液学、临床化学、总病理学、和所选组织/器官的组织病理学检查。
通过与质谱联用的高效液体层析(LCMS)分析血样。表5总结了接受10mg/kg环孢菌素A或ISATX247家兔的平均药物动力学参数。
表5雄兔静脉给予环孢菌素A和ISATX247，剂量10mg/kg/天的药物动力学参数
结果表示为平均值±SD
接受10mg/kg/天的环孢菌素A和ISATX247的雄兔药物动力学参数之间没有显著的统计学差异。接受相同剂量的雌兔ISATX247药物动力学参数与雄兔中观察到的没有显著差异，例外是第7天为最大浓度。
接受载体对照、环孢菌素A或ISATX247家兔的血液学参数没有看到显著改变。研究过程中在不同组中观察到肌酸酐水平的差异，如下表6所示。这些差异表明，环孢菌素A与载体对照或ISATX247相比，对肾脏具有显著更大的负面作用。应注意，甚至在50％的较高剂量，即15mg/kg/天，与环孢菌素A 10mg/kg/天相比，ISATX247也没有造成任何显著的血清肌酸酐水平升高。
表6接受载体、环孢菌素A或ISATX247注射30天的雄性家兔血清肌酸酐水平相对于基线的变化百分数治疗组第15天第30天载体+6％-3％环孢菌素A(10mg/kg)+22％+33％ISATX247(10mg/kg)+1％+10％ISATX247(15mg/kg)-19％-11％
检查所有接受载体对照、10mg/kg环孢菌素A、5mg/kg ISATX247或10mg/kg ISATX247的家兔器官，没有发现显著的不正常。对肾脏而言尤其如此，肾脏中没有发现通常在环孢菌素A处理的动物中常见的间质纤维化(Thliveris，et al.，1991，1994)的证据。接受15mg/kg ISATX247的雄兔中，发现精子发生减少。完成15mg/kg ISATX247剂量研究的3只雌兔中没有发现变化。
实施例18：ISATX247的免疫抑制作用
将猕猴(n＝4)的全血与ISATX247或环孢菌素A共温育，并在培养介质中用不同的有丝分裂原刺激。通过氚标胸腺嘧啶渗入法和对SG2M期细胞的增殖性细胞核抗原(PCNA)表达作流式细胞计数分析，评价淋巴细胞增生。流式细胞计数也用于评价T-细胞产生的细胞内细胞因子以及T淋巴细胞活化抗原的表达。EC50(达到最大效应50％所需的药物浓度)用WinNonlinTM软件计算。结果显示，淋巴细胞增殖、细胞因子产生、和T细胞表面抗原的表达受ISATX247的抑制较受环孢菌素A的抑制更强，如下表7中EC50(以ng/mL表示)所示。
表7 参数ISATX247 环孢菌素 3H-胸腺嘧啶摄取160.54 565.52 PCNA表达197.72 453.88 IL-2产生103.35 504.80 IFN-产生102.67 465.65 TNF-产生90.58 508.29 CD 71表达149.84 486.82 CD 25表达121.00 431.53 CD 11a表达204.40 598.90 CD 95表达129.98 392.97 CD 154表达160.87 975.10
因此，用体外全血试验，我们发现，ISATX247对各种免疫功能的抑制比环孢菌素要强2.3-6倍。
实施例19；采用三丁基烯丙基膦鎓溴化物的Wittig反应
将叔丁醇钾(0.31g，2.8mmol)溶于20mL四氢呋喃中。在约-40℃缓慢加入三丁基烯丙基膦鎓溴化物(0.99g，3.1mmol)的3mL四氢呋喃溶液。生成的黄色混合物在约-40℃搅拌10分钟，然后缓慢加入乙酰基环孢菌素A醛(1.5g，1.2mmol)的6mL四氢呋喃溶液。搅拌黄橙色反应混合物1.5小时后，反应完成。将反应混合物转移到磷酸(1.2g，1.0mmol)水溶液中终止反应。用100mL甲苯然后用50mL甲苯提取得到的水溶液。合并的有机层用水洗涤，然后减压浓缩至干。产物乙酰化的ISATX247为淡黄色固体(产率～90％)。异构体比例约为87％E-异构体和13％Z-异构体(由1H NMR测定)。
实施例20：采用三丁基烯丙基膦鎓溴化物和锂碱的Wittig反应
将三丁基烯丙基膦鎓溴化物(1.38g，4.3mmol)溶于20mL甲苯和3mL四氢呋喃的混合物中。在约-78℃，缓慢加入丁基锂(1.6M溶于己烷中，2，43mL，3.9mmol)。形成的黄色混合物在约-78℃搅拌10分钟，然后缓慢加入乙酰基环孢菌素A醛(1.5g，1.2mmol)的6mL甲苯溶液。搅拌黄橙色反应混合物3.5小时后，反应完成。将反应混合物转移到50mL甲苯和磷酸(0.25g，2.2mmol)水溶液中终止反应。将得到的两相混合物加热到室温，然后分离两相层。甲苯层用20mL水洗涤，然后减压浓缩至干。产物乙酰化的ISATX247为淡黄色固体(产率～80％)。异构体比例约为70％E-异构体和30％Z-异构体(由1H NMR测定)。
实施例21：采用三丁基烯丙基膦鎓溴化物和锂碱的Wittig反应
如上所述进行SAP018，但在约-40℃进行。重复实施例20的实验条件，这次采用约-40℃的反应温度。在这些条件下分离到的产物乙酰化的ISATX247的异构体比例约为74％E-异构体和26％Z-异构体(由1H NMR测定)。
实施例22：采用三丁基烯丙基膦鎓溴化物的Wittig反应
将乙酰基环孢菌素A醛(1.5g，1.2mmol)和三丁基烯丙基瞵鎓溴化物(0.99g，3.1mmol)的15mL四氢呋喃溶液冷却到约-80℃。缓慢加入叔丁醇钾(0.19g，1.7mmol)溶解在9mL四氢呋喃中的溶液。在约-80℃搅拌产生的黄色混合物1小时完成反应，然后缓慢加入6mL四氢呋喃溶液。搅拌黄橙色反应混合物1.5小时，至反应完全。加入磷酸(0.15g，1.3mmol)水溶液以终止反应。浓缩所得混合物，残留物用5mL甲醇溶解。将混合物缓慢加入5mL水中。过滤产生的沉淀物，用4mL甲醇/水(1∶1)洗涤，真空干燥，产物乙酰化的ISATX247为无色固体(产率～90％)。异构体比例约为91％E-异构体和9％Z-异构体(由1H NMR测定)。
实施例23：乙酰基CsA的臭氧解
将乙酰CsA(15g，12.1mmol)的200mL甲醇溶液约-78℃在1.1巴用Sander臭氧发生器臭氧化，流速为300L O2/小时，直到反应完全(约5分钟)。溶液用氩气通气，用溶于甲醇的二甲基硫醚终止反应。为了使还原完全，室温搅拌混合物过夜。浓缩到约50mL后，将溶液缓慢加入500mL水中。过滤产生的沉淀，用60mL水洗涤，真空干燥。获得的产物乙酰CsA醛为无色固体，产率约95％，纯度约98％(由HPLC测定)。
实施例24：三甲基甲硅烷基保护的环孢菌素A的制备
将环孢菌素A(40g，1当量)在30℃溶于二氯甲烷(100mL)中。加入N，N-二(三甲基甲硅烷基)脲(1.1当量)。30℃搅拌5分钟后，加入对甲苯磺酸(0.02当量)。加热回流反应混合物，直到反应完全，用薄层层析(TLC)、高压或高效液体层析(HPLC)或质谱(MS)检测，然后冷却到室温。加入碳酸氢钠半饱和溶液(100mL)。分离水相，用二氯甲烷再提取。合并的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤。减压蒸发掉溶剂，得到三甲基甲硅烷基保护的环孢菌素A粗产物。
实施例25：三甲基甲硅烷基保护的环孢菌素A醛的制备
将三甲基甲硅烷基保护的环孢菌素A(5g，1当量)溶于二氯甲烷(50mL)中。溶液冷却到-78℃，然后将臭氧鼓泡通入溶液，直到出现蓝色。然后，为了除去过量的臭氧，将氩气鼓泡通入溶液，直到得到无色溶液；进行这一步骤是为了除去过量的臭氧。加入三乙胺(5当量)，室温搅拌反应混合物17小时。在用水处理后，得到三甲基甲硅烷基保护的环孢菌素A醛。
实施例26：通过Wittig反应制备三甲基甲硅烷基保护的环孢菌素A二烯的Z∶：E＝3∶1双键异构体混合物
向已经先搅拌60分钟的叔丁醇钾(3当量)和烯丙基三苯基膦鎓溴化物(2当量)的甲苯(10mL)混合液加入三甲基甲硅烷基保护的环孢菌素A醛(1g，1当量)。室温反应1小时后，反应物后处理得到三甲基甲硅烷基保护的环孢菌素A二烯的Z和E双键异构体3∶1混合物(由NMR测定)。
实施例27：通过Wittig反应制备三甲基甲硅烷基保护的环孢菌素A二烯Z∶：E＝1∶1双键异构体混合物
将三甲基甲硅烷基保护的环孢菌素A醛(2.5g)溶于25mL甲苯，用1N氢氧化钠水溶(10当量)液处理。剧烈搅拌反应混合物，加入烯丙基三苯基膦鎓溴化物(7.5当量)。反应混合物室温反应几小时，后处理得到三甲基甲硅烷基保护的环孢菌素A二烯的Z和E双键异构体约1∶1混合物(由NMR测定)。
实施例28：通过Wittig反应制备三甲基甲硅烷基保护的环孢菌素A二烯的Z∶：E＝1∶2双键异构体混合物
将三甲基甲硅烷基保护的环孢菌素A醛(1g)，与碳酸钾(1.5当量)和烯丙基三苯基膦鎓溴化物(1.5当量)一起溶于5mL甲苯中。反应混合物剧烈搅拌回流4小时，后处理得到三甲基甲硅烷基保护的环孢菌素A二烯的Z和E双键异构体约1∶2混合物(由NMR测定)。
实施例29：通过Wittig反应制备三甲基甲硅烷基保护的环孢菌素A二烯的Z∶：E＝1∶3双键异构体混合物
将烯丙基三苯基膦鎓溴化物(3当量，从烯丙基溴和三苯膦制备)溶于THF(3.5mL)中。加入甲苯(7.5mL)，接着加入叔丁醇钠(4当量)。室温搅拌1小时后，溶液冷却到约-30℃。滴加入三甲基甲硅烷基保护的环孢菌素A醛(1g，1当量)的5mL甲苯溶液。约-30℃搅拌45分钟，处理反应混合物后，得到三甲基甲硅烷基保护的环孢菌素A二烯的Z和E双键异构体约1∶3混合物(由NMR测定)。
下面的2种实施例(实施例30和31)涉及烯丙基金属化。
实施例30：乙酰基保护的环孢菌素A β-三甲基甲硅烷基醇的制备
室温向烯丙基三甲基硅烷(10.1当量)的THF(15mL)溶液加入丁基锂(1.6M溶于己烷中，10当量)。反应30分钟后，溶液冷却到-75℃，用二乙基-B-甲氧基硼烷(10.1当量)处理。1小时后，加入三氟化硼二乙醚复合物(10.1当量)，生成B-(γ-三甲基甲硅烷基-烯丙基)-二乙基硼烷试剂。1小时后，滴加乙酰基保护的环孢菌素A醛(5克，1当量)的THF(15mL)溶液。20分钟后，反应混合物温热到-10℃，加入饱和NH4Cl水溶液。室温搅拌1小时，加入45mL水，反应混合物用25mL乙酸乙酯提取3次。有机层依次用水(25mL)、饱和NH4Cl水溶液(25mL)洗涤。合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩。粗产物层析(硅胶，二氯甲烷/甲醇或乙酸乙酯/庚烷)，得到乙酰基保护的环孢菌素A β-三甲基甲硅烷基醇。
实施例31：三甲基甲硅烷基保护的环孢菌素A β-三甲基甲硅烷基醇的制备
室温向烯丙基三甲基硅烷(10.1当量)的THF(15mL)溶液加入丁基锂(1.6M溶于己烷中，10当量)。反应30分钟后，溶液冷却到-65℃，用二乙基-B-甲氧基硼烷(10.1当量)处理。1小时后，加入三氟化硼二乙醚复合物(10.1当量)，生成B-(γ-三甲基甲硅烷基-烯丙基)-二乙基硼烷试剂。1小时后，滴加三甲基甲硅烷基保护的环孢菌素A醛(5克，1当量)的THF(15mL)溶液。15分钟后，反应混合物升温到10℃，加入饱和NH4Cl水溶液。室温搅拌1小时，加入12.5mL水和25mL及饱和NaHCO3水溶液，反应混合物用25mL甲基叔丁基醚提取3次。有机层依次用水(2×25mL)、饱和NaCl水溶液(25mL)洗涤二次。合并的有机层用Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩。粗产物层析(硅胶，乙酸乙酯/庚烷)，得到三甲基甲硅烷基保护的环孢菌素A β-三甲基甲硅烷基醇。
以下的3个实施例(实施例32、33、和34)涉及Peterson消除反应。
实施例32：E-乙酰基保护的环孢菌素A二烯的制备
将乙酰基保护的环孢菌素A β-三甲基甲硅烷基醇(10g，1当量)溶于THF(50mL)中。加入浓硫酸(1.24mL，3当量)，室温搅拌反应混合物20小时。加入水(150mL)，反应混合物用甲基叔丁基醚(200mL)提取。水相用甲基叔丁基醚(150mL)再提取。有机相用水(150mL)洗涤。合并的有机相用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到粗制乙酰基保护的环孢菌素A二烯(乙酰基保护的ISATX247)。粗产物用甲基叔丁基醚/THF结晶，用甲基叔丁基醚/DCM重结晶，得到乙酰基保护的环孢菌素A二烯(乙酰基保护的ISATX247)，为E和Z双键异构体的99-97％∶1-3％混合物(由400MHz NMR测定，2％测量误差)。
E-乙酰基保护的环孢菌素A二烯的水解如下进行：
将乙酰基环孢菌素A二烯(4g，1当量)溶于甲醇(80mL)和水(32mL)中。加入碳酸钾(3.65g，8.3当量)。室温搅拌15小时后，反应混合物加热到40℃4小时。减压浓缩反应混合物，残留物溶解在乙酸乙酯(70mL)中。缓慢加入15％柠檬酸水溶液(30mL)，接着加入水(10mL)。分离水层，用乙酸乙酯(56mL)再提取。有机层用水(30mL)、15％柠檬酸溶液(40mL)和饱和NaCl溶液(30mL)洗涤。合并有机层，用Na2SO4干燥，减压浓缩，得到环孢菌素A二烯(ISATX247)，为E/Z双键异构体的98∶2混合物(由400MHz NMR测定，2％测量误差)。见R.W.Hoffmann，Angewandte Chemie InternationalEdition，Vol.555(1982)；W.R.Rouch，“Allylorganometallics”，ComprehensiveOrganic Synthesis，Pergamon Press，Vol.2，PP.1-53；and Y.Yamamoto，N.Asao，Chemical Reviews，p.2307(1993)。
实施例33：Z-三甲基甲硅烷基保护的环孢菌素A二烯的制备极其转变为Z-环孢菌素A二烯(ISATX247)
将三甲基甲硅烷基保护的环孢菌素A β-三甲基甲硅烷基醇(2g，1当量)溶于THF(20mL)中。溶液冷却到0-2℃，加入叔丁醇钾(4当量)。反应1.5小时后，加入乙酸乙酯(20mL)和水(40mL)。分离水层，用乙酸乙酯(20mL)再提取。有机层用饱和氯化钠水溶液(20mL)洗涤。合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到Z-三甲基甲硅烷基保护的环孢菌素A二烯(E-三甲基甲硅烷基保护的ISATX247)和Z-环孢菌素A二烯(ISATX247的Z-异构体)的混合物。通过将粗产物混合物溶解在甲醇中(10重量％溶液)，加入1M盐酸水溶液(1当量)完成脱甲硅基。室温15分钟后，加入水和乙酸乙酯。分离水层，用乙酸乙酯再提取。有机层用饱和氯化钠水溶液洗涤，合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到环孢菌素A二烯(ISATX247)为Z和E双键异构体的94∶6混合物(由NMR测定)。
实施例34：E-环孢菌素A二烯(ISATX247)的制备
将三甲基甲硅烷基保护的环孢菌素A β-三甲基甲硅烷基醇(500mg，1当量)溶于二氯甲烷中。溶液冷却到0-2℃，用三氟化硼二乙醚复合物(5当量)处理。1小时后，加入水(20mL)和二氯甲烷(20mL)。分离有机层，用水(20mL)洗涤。用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，直接得到环孢菌素A二烯(ISATX247)为E和Z双键异构体的91∶9混合物(由NMR测定)。
实施例35：三甲基甲硅烷基保护的环孢菌素A二烯的脱保护
将三甲基甲硅烷基保护的环孢菌素A二烯溶于甲醇(10重量％溶液)中。该溶液用1M盐酸水溶液(1当量)处理。室温15分钟后，加入水和乙酸乙酯。分离水层，用乙酸乙酯再提取。有机层用饱和氯化钠水溶液洗涤。合并的有机相用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到环孢菌素A二烯(ISATX247)。
实施例36：乙酰基环孢菌素A的环氧化
将乙酰基环孢菌素(2.0g，1.61mmol)溶于乙腈(30mL)中，加入1，3-二乙酸基丙酮(0.14g，0.8mmol)，接着加入0.0004M 乙二胺四乙酸二钠盐水溶液(20mL)和碳酸氢钠(0.405g，4.82mmol)。向搅拌的混合物中，在2小时内分批加入oxone(过硫酸氢钾)(43.8％KHSO5)(2.23g，6.43mmol)。通过用pH stat恒定加入1N NaOH(总共6.4mL)保持pH于8.2。通过偶然用冷水浴冷却，使温度保持在22-25℃。2.5小时后，加入几滴亚硫酸钠溶液终止反应。加入水(100mL)，混合物用叔丁基甲基醚(100mL，然后75mL)提取2次。有机层后用稀的氯化钠水溶液(100mL)洗涤，合并，用硫酸钠干燥，浓缩，得到粗制乙酰基环孢菌素环氧化物(1.92g，95％；HPLC：99.4％面积)白色固体泡沫状物。
实施例37：乙酰基环孢菌素A醛的制备
将粗制乙酰基环孢菌素环氧化物(1.92g，1.52mmol)溶于乙腈(25mL)中。加入水(20mL)，接着加入过碘酸钠(489mg，2.28mmol)和0.5M硫酸(3.05mmL，1.52mmol)。40℃搅拌反应混合物18小时，然后加入亚硫酸钠破坏过量的过碘酸钠。加入稀氯化钠水溶液(100mL)并用叔丁基甲基醚(每次100mL)提取2次。用稀氯化钠水溶液(100mL)洗涤有机抽提物，合并，用硫酸钠干燥，浓缩，得到粗制乙酰基环孢菌素A醛(1.74g，92％；HPLC：95.7％面积)，为白色泡沫状物。粗产物上硅胶层析，用40％丙酮/60％己烷为洗脱液，得到产物(1.41g，71％以乙酰基环孢菌素环A计；HPLC：100％面积)，为白色泡沫固体。
实施例38：用一锅法制备乙酰基环孢菌素A醛
将乙酰基环孢菌素A(2.0g，1.61mmol)溶于乙腈(30mL)中，加入1，3-二乙酸基丙酮(0.084g，0.48mmol)，接着加入0.0004M乙二胺四乙酸二钠盐水溶液(20mL)和碳酸氢钠(0.405g，4.82mmol)。向搅拌的混合物中，在2小时内分批加入oxone(43.8％KHSO5)(1.67g，4.82mmol)。通过用pH stat恒定加入1N NaOH(总共3.4mL)保持pH于8.2。使温度保持在22-25℃。3.5小时后，向反应混合物加入0.5M硫酸(5mL，2.5mmol)，接着加入几滴浓硫酸。使pH达到1.3。然后加入过碘酸钠(516mg，2.41mmol)，室温搅拌反应混合物2小时，40℃搅拌22小时。加入水(100mL)，混合物用叔丁基甲基醚(100mL，然后75mL)提取2次。有机抽提物用稀的氯化钠水溶液(100mL)洗涤，合并，用硫酸钠干燥，浓缩，得到粗制乙酰基环孢菌素A醛(1.9g，96％；HPLC：83.4％面积)白色固体泡沫状物。粗产物上硅胶层析，用40％丙酮/60％己烷为洗脱液，得到产物(1.35g，68％以乙酰基环孢菌素A计；HPLC：100％面积)，为白色泡沫固体。
实施例39(ISO)：乙酰基环孢菌素A醛与3-二甲基氨基丙基三苯基膦酰烯(phosphorylidene)的Wittig反应
1，3-二烯的立体选择性合成已由E.J.Corey和M.C.Desai在Tetrahedron Letters，Vol.26，No.47，pp.5747-8，中(1985)叙述。该文献公开了，通过用六甲基二硅氮化钾处理3-(二甲基氨基)丙基三苯基正膦得到的内鎓盐能与醛发生Wittig反应，选择性形成Z-烯基二甲基胺。用间氯过苯甲酸氧化该胺，得到相应的N-氧化物，然后在称为Cope消除的反应中加热此N-氧化物，形成所需的1，3-二烯，其中在Wittig步骤中形成的烯烃构型完全是Z，或顺式的。
类似地，可通过用六甲基二硅氮化钾处理3-(二甲基氨基)丙基三苯基膦鎓溴化物得到的内鎓盐与乙酰基环孢菌素A醛反应，制备ISATX247的Z-异构体。形成的中间产物然后进行氧化反应，再经Cope消除反应，得到乙酰-(Z)-ISATX247。用碱脱保护，得到(Z)-ISATX247。氧化剂可以是间氯过苯甲酸。
向3-(二甲基氨基)丙基三苯基膦鎓溴化物(2.5g，5.83mmol)的无水甲苯(20mL)悬浮液搅拌下用注射器加入六甲基二硅氮化钾(11.6mL，5.8mmol，0.5M甲苯溶液)。室温搅拌1小时后，离心红色溶液，通过插管将上清液转移到反应烧瓶中。向固体加入无水甲苯(10mL)，搅拌并离心。上清液转移到反应烧瓶中，向合并的红色溶液加入OAc-CsA-CHO(1.44g，1.17mmol)。室温继续搅拌2小时，颜色转变成淡黄色。用乙酸乙酯(50mL)稀释反应混合物，依次用饱和碳酸氢钠溶液(50mL)和盐水(50mL)洗涤。干燥，除去溶剂，得到淡黄色固体。硅胶柱层析，用丙酮-己烷混合物洗脱(梯度：10-75％丙酮，和90-25己烷)，除去所有与磷有关的杂质。再用丙酮洗脱，得到所需无色固体产物(1.28g，84％)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：2.23(s，6H)，2.03(s，3H).13C NMR(300MHz，CDCl3)：129.33，126.95；MS m/z：1301(M+)，1324(M++Na+)。
转变为N-氧化物
将Wittig反应中得到的二甲基氨基化合物(0.44g，0.34mmol)的氯仿(3mL)溶液搅拌并冷却(0℃)，加入m-CPBA(0.07g，0.405mmol)的氯仿(2mL)溶液。搅拌30分钟后，加入二甲基硫醚(0.5mL)，然后加入二氯甲烷(50mL)。用碳酸氢钠溶液(25mL)和水(25mL)洗涤，干燥，除去溶剂，得到固体(0.43g)。1H NMR(300MHz，CDCl3)：3.19(s，3H)，3.18(s，3H)，2.03(s，3H).13C NMR(300MHz，CDCl3)：131.89，124.13；MS m/z：1340(M+)。
N-氧化物的Cope消除。乙酰ISATX247的Z-异构体的制备
N-氧化物(350mg)不加溶剂搅拌并在100℃真空加热2小时。然后通过硅胶柱。用丙酮-己烷混合物洗脱(梯度：5-25％丙酮，95-75&己烷)，得到无色固体(314mg)。1H NMR(500MHz，CDCl3)：6.49(dt，J＝16.99，10.5Hz，1H).13C NMR(400MHz，CDCl3)：132.20，131.09，129.70，116.85；MS m/z：1279(M+Na+)。
ISATX247的Z-异构体
向(Z)-乙酰ISATX247(50mg)的MeOH(4mL)溶液加入水(1.5mL)和K2CO3(60mg)，室温搅拌48小时。去除反应混合物的溶剂，用乙酸乙酯(20mL)提取。有机层用水(10mL)和盐水(10mL)洗涤。干燥，去除溶剂，得到无色固体。1H NMR(500MHz，CDCl3)：6.58(dt，J＝16.99，10.5Hz，1H).MS m/z：1236。8(M+Na+)。得到的化合物是ISATX247的Z-异构体。用NMR未观察到E-异构体。
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