膦酰基吡唑的生产 本申请要求于1999年2月2日登记的美国临时申请号60/118,408的优先权，在此全文引入。
发明领域
本发明涉及一种生产膦酰基吡唑化合物及相关的组合物的方法。
发明背景
近亲植物的异体受精能产生具有所要的近交亲本不具有的综合性状的后代。这种已知被称为杂种优势的现象已经在主要的作物品种中得到了鉴定(Stuber，Plant Breeding Rev.12：29-65，1994)。杂交植物通常具有优越得多的农艺学特性，例如包括植物个体大小、谷物产量、抗病性、对除草剂的耐受性和气候适应性。
对大多数作物来说，生产杂交种子的主要的限制因素是缺乏简单、可靠并且经济的手段使得在产生雄性不育的同时，雌性配子不受影响并且能够与合适的花粉给体进行异体授粉。杀配子剂或化学杂交剂(CHAs)不仅可用于生产杂交植物，而且还能控制基因从一种基因变性的作物体流向相关的野生植物。
在某些植物例如玉米中，用物理方法除去含有雄性配子的器官相对来说比较直接了当，因为雄性器官是暴露的而且在空间上与雌性配子是分开的。然而，大多数作物的同一朵花中既有雄性器官又有雌性器官，因此去雄既不简单又不直截了当，使得去雄的过程劳动强度大、费用高。而且，在这些方法中难以确保完全隔绝自体授粉。
已经利用包括各种胞质雄性不育系(CMS)在内的几种自然发生的雄性不育遗传机制在一些植物中进行了杂交种子地生产。涉及CMS的策略的缺点是这种策略需要三种不同的系来生产单一交配的杂交体：雄性不育的母本系、具有与雄性不育系相同的基因但是含有功能完整的线粒体的保持系；和父本系。有许多种CMS存在不良的特性而减小或限制了它们的用途，包括不想要的联动性或多效性，例如易感染疾病、不育系的破坏和不一致性和/或复合体遗传的可育性的恢复。而且在许多重要作物中不能得到CMS系。
已经描述了化学杀配子剂，包括吡啶(EP276,204)、吡啶酮和哒嗪(US4,115,101和US4,345,934)、磷酸甘油酯(glyphosate)(US4,735,649)、5-氧基或氨基取代的1，2-二氮杂萘(US5,129,939)、哒嗪(US5,062,880和US4,345,934)、二氮杂双环辛烷(US4,925,477)和N-烷基-4-氧代烟酸酯化合物(US4,714,492)。一种用于小麦的杀雄性配子剂商品Genesis(Monsanto Company，St.Louis，Missouri；参见US5,062,880)是一种有效的杀配子剂，并且是用于比较和开发用于小麦的新杀配子剂的标准。另外，一些膦酰基取代的吡唑包括一些3-羟基(烷氧基)-吡唑-4-基膦酸酯在植物中具有系统性的运动，并且已经报道了它们可作为杀虫剂用于植物中。然而，据说这类化合物对植物没有毒性，也没有杀配子活性的报道(DE4139849)。
很少把化学杂交剂(CHAs)用于商业生产杂交种子，主要是因为它们一般对配子缺乏选择性，特别是对于雄性配子来说。系统性的运动和选择性的植物毒性是对有效的杀配子剂的必要的要求。许多化合物破坏或损害植物的雄性配子但是也同时杀死雌性配子和植物的组织。在更大程度上选择性地以配子而不是植物的组织为目标的化合物一般不能区分被破坏的配子的性别。另外，许多具有良好选择性的化学杀配子剂对组织或其它周围的组织具有毒性，这就限制了这些化合物在生产商品级杂交种子中的用途。
遗传工程也产生了引起雄性不育的策略。例如应用前毒素技术(U.S.5,254,801)和反义技术(U.S.5,728,926)。
其他需要的特征可以由要被处理的植物规定。例如，就小麦来说，雄性配子和雌性配子存在于同一朵花中，在雄性配子把它们的花粉释放到雌性配子上之前，花朵是闭合的。当花朵张开时，自体授粉通常已基本上完成了。一种有用的杀小麦配子剂必须能够在雌性配子准备受粉时杀死雄性配子但是又不干扰花朵的开放而使来自其它小麦植株的花粉发生授粉。因此，对有效的杀小麦配子剂或用于小麦的化学杂交剂的需求一直是进行深入研究的主题(Tschabold等人，CropScience 28：583-588，1988)。
发明概述
我们开发了一种生产膦酰基吡唑化合物的新方法：通过使3-羟基-2-(二烷基膦酰基)丙烯酸的碱金属盐与质子化的肼、质子化的烷基肼或质子化的芳基肼接触反应。在一种优选的实施方案中，该方法包括加入碱，然后酸化。与公开的环缩合反应相比，该方法有好几个优点：更简单，不需要纯化步骤；可以用水性溶剂进行反应(虽然也可以使用有机溶剂或水性溶剂和有机溶剂的混合物)。另外，中间体在室温下无限稳定。而且，该方法有更高的效率和产率。可用于该方法膦酰基吡唑的实例有[1-芳基或烷基-(3或5)-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸二烷基酯，它可以用作生产例如具有杀配子剂活性的[1-芳基或烷基-(3或5)-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸二烷基酯的反应物。
根据本发明的一种方法，使3-羟基-2-(二烷基膦酰基)丙烯酸的碱金属盐和选定的肼在水性介质中反应。为了方便地纯化该方法的产物，在酸化前用有机溶剂洗涤水相以除去杂质。
根据本发明的另一个方面，该方法中所用的膦酰基吡唑是式I或II的化合物：其中：R1是烷基、芳基、杂芳基、苄基或C3-C8环烷基，优选C3-C7环烷基；R2是H或碱金属盐；R3是H、烷基、芳基或杂芳基；R4是H、烷基、苯基或盐；R5是H、烷基、苯基或盐；R6是烷基、芳基或杂芳基；烷基是C1-C8，优选C1-C4的支链或C1-C4的直链烷基；芳基是任意选择性地被1-5个，优选1-3个选自卤素、三卤代甲基、C1-C8烷基(直链或支链的)、C1-C8烷氧基(直链或支链的)、硝基和氰基的基团取代的苯基或萘基；苄基是任意选择性地被1-3个选自卤素、三卤代甲基、C1-C8烷基(直链或支链的)、C1-C8、优选C4烷氧基(直链或支链的)、硝基和氰基的基团取代的苄基；而杂芳基是任意选择性地被1-4个选自卤素、三卤代甲基、C1-C8烷基(直链或支链的)、C1-C8烷氧基(直链或支链的)、硝基和氰基的基团取代的吡啶基。
根据本发明的另外一个方面，提供式I或II(如上所述)的化合物，其中：R1是H、烷基、芳基、杂芳基、苄基或C3-C8环烷基，优选C3-C7环烷基；R2是H、烷基、苄基、C1-C8链烯基，优选C1-C4链烯基或盐(例如，优选农业上可接受的盐例如碱金属盐或胺盐)；R3是H、烷基、芳基或杂芳基；R4是H、烷基、苯基或盐；R5是H、烷基、苯基或盐；R6是烷基、芳基或杂芳基；烷基是C1-C8，优选C1-C4的支链或C1-C4的直链烷基；芳基是任意选择性地被1-5个，优选1-3个选自卤素、三卤代甲基、C1-C8烷基(直链或支链的)、C1-C8烷氧基(直链或支链的)、硝基和氰基的基团取代的苯基或萘基；苄基是任意选择性地被1-3个选自卤素、三卤代甲基、C1-C8烷基(直链或支链的)、C1-C8、优选C4烷氧基(直链或支链的)、硝基和氰基的基团取代的苄基；而杂芳基是任意选择性地被1-4个选自卤素、三卤代甲基、C1-C8烷基(直链或支链的)、C1-C8烷氧基(直链或支链的)、硝基和氰基的基团取代的吡啶基，条件是当R3是H，而R1是芳基时，R2不是H或C1-C4烷基。
本发明化合物的实例如下：[1-环己基-5-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸二甲酯、[1-(4-氯苯基)-5-羟基-3-苯基-1H-吡唑-4-基]膦酸二甲酯、[1-(3，5-二甲基苯基)-5-羟基-3-苯基-1H-吡唑-4-基]膦酸二甲酯、{1-(4-氯苯基)-5-[(4-氯苄基)氧基]-1H-吡唑-4-基}膦酸二甲酯、{1-(4-氯苯基)-5-[(2-硝基苄基)氧基]-1H-吡唑-4-基}膦酸二甲酯、2-(4-氯苯基)-3-[(2-硝基苄基)氧基]-1H-吡唑-4-基}膦酸、[2-(4-氯苯基)-2，3-二氢-1-乙基-3-氧代-吡唑-4-基]膦酸二甲酯、[2-(4-氯苯基)-1-环己基-2，3-二氢-3-氧代-吡唑-4-基]膦酸二甲酯、[2-(3，5-二甲基苯基)-2，3-二氢-1-乙基-3-氧代-吡唑-4-基]膦酸二甲酯和[1-丁基-2-(3，5-二甲基苯基)-2，3-二氢-3-氧代-吡唑-4-基]膦酸二甲酯。
根据本发明的另一个方面，提供用于诱导植物发生雄性不育的组合物，该组合物包含杀配子有效量的式I或II(如上所述)的化合物和农业上可接受的载体，其中：R1是H、烷基、芳基、杂芳基、苄基或C3-C8环烷基，优选C3-C7环烷基；R2是H、烷基、苄基、C1-C8链烯基，优选C1-C4链烯基或农业上可接受的盐；R3是H、烷基、芳基或杂芳基；R4是H、烷基、苯基或农业上可接受的盐；R5是H、烷基、苯基或农业上可接受的盐；R6是烷基、芳基或杂芳基；烷基是C1-C8，优选C1-C4的支链或C1-C4的直链烷基；芳基是任意选择性地被1-5个，优选1-3个选自卤素、三卤代甲基、C1-C8烷基(直链或支链的)、C1-C8烷氧基(直链或支链的)、硝基和氰基的基团取代的苯基或萘基；苄基是任意选择性地被1-3个选自卤素、三卤代甲基、C1-C8烷基(直链或支链的)、C1-C8、优选C4烷氧基(直链或支链的)、硝基和氰基的基团取代的苄基；而杂芳基是任意选择性地被1-4个选自卤素、三卤代甲基、C1-C8烷基(直链或支链的)、C1-C8烷氧基(直链或支链的)、硝基和氰基的基团取代的吡啶基，根据这种组合物的一种实施方案，如果R3是H，而R1是芳基，则R2不是H或C1-C4烷基。
在本发明的杀配子组合物中，有含有一种或多种下列化合物的组合物：[1-(4-氯苯基)-5-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸二甲酯、[1-(4-氟苯基)-5-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸二甲酯、[1-(2-氯苯基)-5-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸二甲酯、[1-(4-溴苯基)-5-羟基-1H-吡唑-4-基}膦酸二甲酯、[1-环己基-5-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸二甲基酯、[1-(4-氯苯基)-5-羟基-3-苯基-1H-吡唑-4-基]膦酸二甲基酯、[1-(3，5-二甲基苯基)-5-羟基-3-苯基-1H-吡唑-4-基]膦酸二甲酯、{1-(4-氯苯基)-5-[(4-氯苄基)氧基]-1H-吡唑-4-基}膦酸二甲酯、{1-(4-氯苯基)-5-[(2-硝基苄基)氧基]-1H-吡唑-4-基}膦酸二甲酯、[2-(3，5-二甲基苯基)-3-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸甲酯、[2-(4-氯苯基)-3-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸甲酯、2-(4-氯苯基)-3-[2-硝基苄基)氧基-1H-吡唑-4-基]膦酸、2-(4-氯苯基)-3-羟基-1H-吡唑-4-基膦酸、2-(3，5-二甲基苯基)-3-羟基-1H-吡唑-4-基膦酸、[1-(4-氯苯基)-3-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸二甲基酯、[2-(4-氯苯基)-2，3-二氢-1-乙基-3-氧代-吡唑-4-基]膦酸二甲基酯、[2-(4-氯苯基)-1-环己基-2，3-二氢-3-氧代-吡唑-4-基]膦酸二甲基酯、[2-(3，5-二甲基苯基)-2，3-二氢-1-乙基-3-氧代-吡唑-4-基]膦酸二甲基酯、[1-丁基-2-(3，5-二甲基苯基)-2，3-二氢-3-氧代-吡唑-4-基]膦酸二甲基酯、[2-(3，5-二甲基苯基)-3-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸甲酯钾盐、[4-氯苯基-3-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸甲酯钾盐和[2-(3，5-二甲基苯基)-3-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸氢钾。本发明还包括通过用这种杀配子组合物处理而得到的基本上雄性不育的植物和用这种杀配子组合物处理过的种子。
根据本发明的另一个方面，描述了在植物例如单子叶植物(包括禾本科的单子叶植物如小麦)中产生雄性不育的方法，包括用这种杀配子组合物处理植物或其种子。
根据本发明的另一个方面，描述了生产杂交种子的方法，包括在减数分裂前用本发明的杀配子组合物处理植物的母本的步骤，用来自未经处理的并且与母本不同系的父本的花粉给母本授粉，使母本生产杂交种子。根据一种实施方案，通过每英亩使用大约1/32磅至大约10磅(大约0.035-大约11.2Kg/公顷)的杀配子组合物来处理母本植株，例如施用到母本植株的叶面上。另外，通过用本发明的杀配子组合物处理种子来生产杂交种子，使种子生长，得到基本上是雄性不育的母本植株；用来自未经处理的并且与母本不同系的父本的花粉给母本授粉，使母本生产杂交种子。本发明还包括用这种方法生产得到的杂交种子。
本发明的详细描述
我们这里描述改进的生产2，3-二氢-3-氧代-吡唑-4-基膦酸酯和羟基-或烷氧基-1H--吡唑-4-基膦酸酯和用这种方法生产得到的可用作例如杀配子剂的新化合物。这里所教导的方法比对比文献中已经公开的环缩合反应更加简单(Khotinen和Polozov，Phosphorus，Sulfur Silicon Relat.Elem.83：53，1990；Nifant’ev等人，Khim.Geterotsikl.Soedin.513，1977；Polozov等人，Phosphorous，Sulfur Silicon Relat.Elem.，73：153，1992；Aboujaoude等人，1985，Tetrahedron 41：427，1985)，因为不需要纯化步骤，并且反应可以用水性溶剂进行。另外，中间体在室温下无限稳定。而且该方法的效率和产率更高。
本发明的化合物例如可用于预防植物产生活的花粉，从而预防花粉从被化合物处理过的植物上飞散到包括相关作物和野生植物在内的其它植物上。
通过施用本发明的杀配子组合物，可以减少或消灭来自那些植物的繁殖器官是主要的农产品的植物(例如苜蓿、carola、胡萝卜、棉花、向日葵、大豆、甜菜、西红柿、黄瓜、甜瓜)和各种装饰性植物的花粉。当这样的杀配子组合物用于自体授粉的野生植物时，它们将会减少或断绝种子的生产。本发明的这个方面与除草剂一起通过使被处理的植物生产的种子数量减少而起到了增大除草剂效率的作用。所得的植物杀生制剂具有更宽谱的活性。
这里所用的术语“雄性不育”包括因缺乏雄性花器官而引起的不育、通过形成不育的花粉而引起的不育以及由能生产外观正常但是不能授粉的花粉的雄性花器官引起的不育。
“杀配子剂”是这样一种化合物：当其用于植物时能杀死或改变或终止植物的雄性配子的发育，从而使植物基本上雄性不育，同时能使至少相当一部分植物的雌性配子接受异体受精，以后高产率地获得能育的有生命力的种子。对于理想的杀配子剂来说，施用量有效地破坏雄性配子，但是该施用量明显低于破坏雌性配子所要的施用量。因此，杀配子组合物可用作化学杂交剂，用于植物育种项目中。这样的杀配子剂可通过喷施而用于大田中，不需要采取特殊的预防措施来防止雌性可育性的实质性减少。
“异型杂交”是指遗传信息通过花粉传播从一个植物体交换到另一个植物体。
本发明的化合物可用作杀配子剂或CHAs，用于生产杂种双子叶作物(包括但是不限于甜菜、甘蔗、马铃薯、甘薯、莴苣、甘蓝、茶、萝卜、芜菁、大蒜和洋葱)和单子叶作物，包括但是不限于禾本科作物例如小麦、大麦、玉米、水稻、高粱、谷子、燕麦、黑麦、triticale、草皮和料草等。本发明的化合物选择性地引起雄性不育，而不会引起不能接受的雌性不育。一般大约30％的雌性可育性是可以接受的，虽然当该方法在商业上使用时，这个百分数会随F1种子生产的经济学的不同而不同。用作CHAs时，本发明化合物的用量一般为大约1/32-大约20磅/英亩(0.035-22.4Kg/公顷)，优选为大约1/8-大约10磅/英亩(0.14-11.2Kg/公顷)。用量取决于被处理的作物、所用的化合物和施用方法，并且可以通过用经验方法而确定。
可以使用任何常规的杂交方法。例如把要进行异体授粉的两种亲本植株以交替的方式分区、分行或分垄种植。用本发明的化合物处理母本，使母本雄性不育。然后通过人工法或自然法例如风力授粉使来自父本(未受处理的)的花粉给母本授粉。母本生产的种子是F1杂种，可以用常规方法收集。
本发明的杀配子组合物(优选水性组合物)的一种施用方法是把这样的组合物施用到叶面上、土壤中或水表面(例如在水稻田中)。本发明的杀配子组合物优选在介于开始开花和开始减数分裂之间的时期施用。也可以通过处理种子的方式来施用这样的组合物，例如把种子浸泡在含有本发明的化合物的液体制剂中或者给种子涂覆本发明的化合物。在进行种子处理的施用方法中，本发明化合物的施用量一般为大约1/4-大约10磅(0.1-5Kg)/100重量的种子。
根据本发明的另一个方面，提供包含一种或多种本发明的化合物和任意选择性使用的其它活性组份和非活性组份，包括其它的CHAs的组合物。例如，可以把本发明的化合物与植物生长调节剂例如生长素、赤霉素、乙烯释放剂例如乙烯利、吡啶酮、细胞分裂素、马来酰肼、丁二酸-2，2-二甲基酰肼、胆碱及其盐、氯化(2-氯甲基)三甲基铵、三碘代苯甲酸、氯化三丁基-2，4-二氯苄基磷鎓、聚合的N-乙烯基-2-噁唑烷二酮、磷酸三(二甲基氨基乙基)酯及其盐和N-二甲基氨基-1，2，3，6-四氢邻氨甲酰基苯甲酸及其盐以及其它众所周知的CHAs，并且在某些条件下，与其它农业化学品例如除草剂、杀真菌剂、杀虫剂和植物杀菌剂一起使用更为有利。
本发明的化合物可以以其本身或作为制剂的一种组份用于生长介质或受处理的植物中，其中制剂还包含农业上可接受的载体和任意选择性使用的包括本发明的其它化合物在内的其它活性组份。“农业上可接受的载体”是指可用于把化合物溶解、分散或扩散到组合物中而不损害化合物的药效而其本身对土壤、设备、作物或农业环境没有显著危害的任何液体或固体物质。这样的组合物包括液体或固体制剂或溶液，包括可湿性粉剂、可乳化的浓缩液、细粉、颗粒、丸剂、气溶胶、可流动的乳液浓缩液、悬浮液和溶液，这些都可以按照常规方法制备。可以用农业上适用的液体或固体载体来稀释含有本发明化合物的组合物。这样的组合物还可以包含一种或多种农业上可接受的助剂例如阴离子型的、阳离子型的或非离子型的表面活性剂(增湿剂、铺展剂、分散剂、悬浮剂和乳化剂)、调节剂、粘着剂、黏合剂等。在“Detergents and Emulsifier’s Annual”(John W.McCutcheon，Inc.)中可以找到有用的助剂的实例。
优选的组合物包括液体和可湿性粉剂，优选含有一种或多种其数量足以使活性组份易于分散于水或油中的表面活性剂作为调节剂。把表面活性剂掺入化合物中可以增加化合物的药效。合适的增湿剂包括但是不限于烷基苯磺酸酯和烷基萘磺酸酯、磺化的脂肪醇、胺或酰胺、异硫代硫酸钠的长链酸酯、磺基丁二酸钠、硫酸化或磺化的脂肪酸酯、石油醚磺酸盐、磺化的植物油、二叔炔二醇、聚氧乙烯衍生物或己糖醇酐(例如脱水山梨糖醇)的高于九个碳的高级脂肪酸酯的烷基苯基衍生物(特别是异辛基苯酚和壬基苯酚)和聚氧乙烯衍生物。表面活性剂包括但是不限于磺基丁二酸钠的二己基酯、POE 20脱水山梨糖醇单月桂酸酯和辛基苯氧基聚乙氧基乙醇。可湿性粉剂或可分散的颗粒是指含有一种或多种活性组份、惰性的固体增量剂和一种或多种增湿剂和分散剂的可分散于水中的组合物。惰性的固体增量剂通常是矿物质例如天然粘土、硅藻土、盐和合成的矿物质、从二氧化硅得到的物质等。这种增量剂的例子包括高岭土、美国活性白土、盐和合成的硅酸镁。
本发明的化合物可溶于任何合适的溶剂中，溶剂包括但是不限于下列之一或其混合物：水、醇、酮、芳香烃、卤代烃、二甲基甲酰胺、二噁烷和二甲基亚砜。在所得的溶液中活性组份的浓度优选为大约2％-大约98％重量，更优选为大约20％-大约75％重量。
为了生产可乳化的浓缩液，把本发明的化合物与一种可分散于水中的常用乳化剂例如烷基苯酚或长链醇、硫醇、羧酸、活性胺的氧化乙烯衍生物，和部分酯化的多元醇一起溶于一种有机溶剂例如苯、甲苯、二甲苯、甲基萘、玉米油、松节油、邻二氯苯、异氟尔酮、环己烷或油酸甲酯或其混合物中。具有表面活性的可溶于溶剂的硫酸盐或磺酸盐，例如烷基苯磺酸的碱土金属盐或胺盐和脂肪醇硫酸钠可单独用作乳化剂或与一种氧化乙烯反应产物一起用作乳化剂。可流动的乳液浓缩液具有相似的配方，除上述可乳化的浓缩液的组份外，还包含水和稳定剂例如水溶性的纤维素衍生物或水溶性的聚丙烯酸盐。在这种可乳化的浓缩液中，活性组份的浓度一般为约10％-约60％重量，而在可自由流动的乳液浓缩液中，活性组份的浓度一般为约10％-约75％重量。
适于喷施的可湿性粉剂是本发明的化合物、精细分散的固体(例如粘土、有机硅酸酯或碳酸酯或硅胶)与增湿剂、黏合剂和/或分散剂的混合物。在这种粉剂中，活性组份的浓度一般为约20％-约98％重量，优选为约40％-约75％重量。任意选择性使用的分散剂的浓度为占组合物重量的约0.5％-约3％。增湿剂可以占组合物重量的约0.1％-约5％。
细粉是一种或多种本发明的化合物与精细分散的惰性有机或无机固体例如植物粉末、谷粉、硅藻土、二氧化硅、硅酸盐、碳酸盐和粘土的混合物。一种制备细粉的方法是用细分散的载体稀释可湿性粉末。可以把含有约20-约80％活性组份的细粉浓缩液稀释到最终浓度为约1％-约10％重量的细粉。
通过把活性组份包埋在固体载体例如颗粒状的富勒土、蛭石、研细的玉米穗、玉米粉、种子壳(包括糠或其它谷壳)或其它材料中来制备颗粒(例如粒状)制剂。喷施一种或多种本发明化合物在挥发性有机溶剂中的溶液或者把溶液与颗粒状固体混合，蒸发除去溶剂。颗粒状材料可以有任意合适的尺寸，优选为约16-约60目。活性组份一般占制剂重量的约2％-约15％。另外，可以通过标准方法把制剂掺入控制释放的颗粒状制剂中，例如通过界面聚合和团聚制成胶囊；通过把活性组份与聚合物一起溶于溶液中，然后蒸去溶剂；通过把活性组份与蜡或聚合物混合(通过混合干燥的组份，然后把混合物熔融或者通过把活性组份与熔融的蜡或聚合物混合，然后使混合物固化)，然后通过造粒、研磨、挤出、喷雾冷却等生产混合物的颗粒。活性组份一般占控制释放制剂的约5％-约50％。
可以把本发明化合物的盐制成制剂，以为约0.05％-约50％重量，优选为约0.1％-约10％重量的浓度以水溶液施用，并且以这种剂型施用于作物。可以把这样的溶液制成浓缩液，该浓缩液用水性溶剂或其它合适的溶剂稀释到适于使用的所要浓度。这种溶液任意选择性地包含表面活性剂和/或一种或多种助剂以增大活性组份的活性，例如甘油、甲基乙基纤维素、羟乙基纤维素、聚氧化乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯、聚丙二醇、聚丙烯酸、聚乙烯苹果酸钠或聚氧化乙烯等。这种助剂的浓度一般为溶液重量的约0.1％-约5％，优选为约0.5％-约2％。这样的组合物还可以任意选择性地包含农业上可接受的表面活性剂。
本发明的化合物和制剂可以按照常规方法施用，包括但是不限于：液压喷施、气动喷施或洒粉。对于小体积施用，通常使用化合物的溶液。最佳制剂、体积、浓度、施用频率、施用时机(包括植物的发育阶段)和施用方法将取决于多种因素例如植物类型、土壤类型、肥料、环境因素等。
这里所用的术语“(杀配子)有效量”是指足以引起雄性不育而没有商业上不能接受的植物毒性的本发明化合物(或含有一种或多种本发明化合物的组合物)的数量。本发明的化合物在杂交种子生产中的用途
杂种是由选定的具有合适的开花和农业性状的用于杂交种子生产的两种纯系亲本之间进行异体授粉而产生的第一代种子。杂交种子是通过把设定的父本和母本交替地种植在垄中而生产的。父本和母本是根据长期的已知的开花史来选定的，通常选择使父本比母本晚开花2-4天。重要的是，在雌性花可受粉的时期内可得到足够多的雄性花粉。在生产区域所属的环境条件下，用作雄性授粉体的植物系和种优选具有良好的花药泌出和花粉脱落特征，而母本优选具有良好的开花和雌性受粉特征。开花的时机常常取决于温度，而对于大多数植物，通常早在清晨温度开始升高时，花粉就已经开始脱落了。通常在炎热干燥的环境中花期较短，而在凉爽潮湿的条件下花期较长。
用本发明的CHA处理母本系会抑制它们产生花粉。种植受处理的母本植物使其充分靠近(边对边或头对头)雄性授粉体的垄，以便通过风力授粉而产生充分的异体授粉。然而，在雄性和雌性株之间要保持足够的间隙，使得CHA施用到母本上时不会明显接触到父本而影响其花粉脱落。这种间隙允许在收获杂交种子时不会明显掺混由父本生产的种子。优选把CHA均匀地施用到母本的叶面上。
提供下列实施例以说明本发明的优选实施方式。本领域技术人员应当明白，下列实施例中所公开的技术代表本发明人所发现的能够很好地实施本发明的技术，因而被认为是构成了实施本发明的优选实施方式。然而，本领域技术人员在本发明公开的指引下应当明白，可以对已经公开的具体实施方式作许多改变而依然能够得到同样的或相似的结果，而不会偏离本发明的精神和保护范围。
实施例实施例1：化合物的制备
按照方案I-III中所示的方法制备通式3、4、5、7、8、10、11的[1-芳基或烷基-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸二烷基酯和相关的膦酸酯。
通式3和5的化合物是通过在碱性条件下使烷基-或芳基肼盐酸盐与中间体2缩合然后环化而制备的。对于1，2-二烷基-或二芳基肼盐，通式5的化合物能以90％以上的纯度被分离出来。对于单烷基-或芳基肼盐，通式3的化合物能以90％以上的纯度被分离出来。通过一定的方法可以定量地制得2(Katagiri等人，1990，Chem.Lett.1855)。在120℃下，用芳基-或烷基肼盐酸盐于水中处理中间体2，然后中和，导致与不饱和体系发生1，4-C-加成，然后消去水。通过高压液相色谱(HPLC)分析观察到了初始加成产物。碱的加入则使得环化能够发生，酸化后得到产物膦酰基吡唑。酸化前，用有机溶剂洗涤水相以除去杂质。该方法更为简单，因为没有纯化步骤，并且可以用水性溶剂进行操作。另外，中间体在室温下无限稳定。而且，与已经公开的相似的缩合反应(Khotinen和Polozov，1990，Phosphorus，SulfurSilicon Relat.Elem.83：53；Nifant’ev等人，1977，Khim.Geterotsikl.Soedin.，513；Polozov等人，1992，Phosphorus，Sulfur Silicon Relat.Elem.73：153；Aboujaoude等人，1985，Tetrahedron 41：427)相比，该方法更为有效，产率更高。
反应在室温至160℃的温度下，在水中或有机溶剂例如四氢呋喃(THF)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、乙腈、甲醇、乙醇或其它醇溶剂以及这些溶剂和水的混合物中进行。在该方法中，其它碱例如氢氧化物、烷氧化物、位阻碱例如二异丙基氨基锂(LDA)、六甲基二硅烷氨基钾或钠(KHMDS、NaHMDS)；非亲核性的强碱例如氢化钠或氢化锂(NaH、LiH)也是有效的。对于在质子性溶剂中不稳定的碱，需要非质子性的有机溶剂。对于有机溶剂，在环化后和酸化前，除去溶剂，把粗混合物溶于水性溶剂中，然后用有机溶剂洗涤。
方案I
用方案II中所示的方法制备通式7的化合物。把芳基-或烷基肼盐酸盐在无水THF中的浆液冷却，用2当量的溶于THF中的强碱(例如叔丁醇钾或正丁基锂)处理。几分钟后，加入(E和Z)-2-(二甲氧基磷酰基)-3-甲氧基-2-丙烯酸甲酯(结构6)的无水THF溶液。搅拌冷却后的混合物5分钟，温热到室温，然后用过量的盐酸水溶液处理。产物用有机溶剂萃取，浓缩。粗产物(结构7)通过硅胶色谱纯化。
方案II
用方案III中所示的方法制备通式10的化合物。把二甲氧基氧膦基甲基酯(结构9)悬浮于水中，加入芳基-或烷基肼盐酸盐，加热搅拌混合物几个小时，然后加入碱发生环化，酸化后，得到式10的产物膦酰基吡唑。粗产物通过径向色谱(硅胶)纯化。
方案III
通式3、7和10的化合物可以以下面所示的酮或烯醇互变异构体形式存在。可以通过用碱处理，然后加入烷基卤化物或苄基卤化物或者通过其它已知的方法，使通式3、7和10的化合物在氧原子处发生烷基化，得到通式4、8和11的化合物。 酮互变异构体 烯醇互变异构体通式：通式3、7和10的化合物的酮和烯醇互变异构体。
通过用5-50％NaOH水溶液处理或者通过其它已知的方法，使通式3、4、5、7、8、10、11的化合物在磷处发生水解，得到单烷基膦酸酯。通过用四甲基甲硅烷基碘化物(TMSI)或四甲基甲硅烷基溴化物(TMSBr)在二氯甲烷中处理或者通过其它已知的方法，使通式3、4、5、7、8、10、11的化合物在磷处发生水解，得到膦酸。通过用烷氧化钾或烷氧化钠在甲醇中处理或者通过其它已知的方法，把单烷基膦酸酯和膦酸转变为钾盐或钠盐。产物用1H、13C、31P NMR光谱和元素分析表征。
方法A.制备[1-芳基或烷基-5-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸二烷基酯(式3的化合物)的一般方法
向100mL单颈的圆底烧瓶中加入3-烷氧基钠-2-二甲基膦酰基丙烯酸酯(式2，9.0mmol)和芳基肼盐酸盐(9.9mmol，1.1当量)的水(50ml)溶液。在氮气气氛下，在120℃的油浴中加热搅拌混合物，加热5-10分钟后，薄层色谱(TLC)(15％IPA/85％EtOAc)和HPLC(HewlettPackard Series 1100体系，使用Packard ODS超级硅胶柱，5m100×4.6mm)表明，完全转变为中间体加成物。从油浴中取出烧瓶，加入碳酸钾(9.9mmol，1.1当量)，再次在氮气气氛下在120℃的油浴中加热搅拌混合物5-10分钟或者直到TLC和HPLC表明环化已经完成。把混合物冷却到室温，用乙酸乙酯(2×30mL)洗涤。用浓盐酸酸化水相，以乙酸乙酯(3×30mL)萃取产物。干燥(硫酸镁)合并后的有机萃取液，过滤并且在真空下浓缩，得到黄色固体的产物。式3的粗产物为分析纯的。式5的粗产物需要用制备型色谱纯化(Waters Delta Prep 3000系列色谱，使用Dynamax 60A C18 83-221-C柱)。
该方法也用于烷基和苄基肼盐酸盐，然而，在这些情况下，3-和5-异构体进行分离和需要色谱纯化(使用与式5相同的体系)。可能异构体混合物的产生是由于肼的氮原子具有相当的亲核性。通过方法A制得了下列化合物。
[1-(4-氯苯基)-5-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸二甲基酯(式3a的化合物)。使用8.8mmol化合物2进行反应，得到黄色的固体产物(1.9g，6.3mmol，78％)：
1H NMR(400MHz，CDCl3)7.77(d，J＝8.9Hz，2H)，7.54(s，1H)，7.43(d，J＝8.9Hz，1H)，3.78(d，J＝11.8Hz，6H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)158.9(d，J＝22.1Hz)，139.8(d，J＝10.7Hz)，136.2，132.5，129.2，122.6，83.8(d，J＝220.5Hz)，53.0(d，J＝5.0Hz))；31P NMR(162MHz，CDCl3)19.81.C11H12ClN2O4P的分析：计算值：C 43.71；H 4.00；N 9.27测定值：C 43.71；H 3.95；N 9.20
[1-(4-氟苯基)-5-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸二甲基酯(式3b的化合物)。使用4.4mmol化合物2进行反应，得到淡黄色的固体产物(0.87g，3.0mmol，70％)：
1H NMR(400MHz，CDCl3)8.67(bs，1H)，7.76(dd，J＝9.0，4.7Hz，2H)，7.54(s，1H)，7.15(t，J＝8.6Hz，2H)，3.78(d，J＝11.8Hz，6H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)161.2(d，J＝247.2Hz)，158.7(d，J＝22.1Hz)，139.7(d，J＝10.3 Hz)，133.7，123.5(d，J＝8.8Hz)，115.9(d，J＝22.9Hz)，83.6(d，J＝220.9Hz)，53.0(d，J＝5.0Hz)；31PNMR(162MHz，CDCl3)d19.85；19F NMR(376MHz，CD3OD)-114.99(七重峰J＝4.3Hz).C11H12FN2O4P的分析：计算值：C 46.15；H 4.23；N 9.79测定值：C 45.60；H 4.33；N 9.36
[1-(2-氯苯基)-5-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸二甲基酯(式3c的化合物)。使用4.7mmol化合物2进行反应，得到淡黄色的固体产物(0.82g，2.7mmol，58％)：
1H NMR(400MHz，CDCl3)9.20(bs，1H)，7.59(s，1H)，7.55-7.39(m，4H)，3.78(d，J＝11.8Hz，6H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)159.8(d，J＝21.4Hz)，140.4(d，J＝11.1Hz)，134.3，132.1，130.7，130.4，129.3，127.5，82.6(d，J＝222.4Hz)，53.0(d，J＝5.3Hz)；31P NMR(162MHz，CDCl3)19.80.C11H12ClN2O4P的分析：计算值：C 43.71；H 4.00；N 9.27测定值：C 43.23；H 4.19；N 8.93
[1-(4-溴苯基)-5-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸二甲基酯(式3d的化合物)。使用4.4mmol化合物2进行反应，得到淡黄色的固体产物(1.05g，3.0mmol，70％)：
1H NMR(400MHz，CDCl3)9.40(bs，1H)，7.72(d，J＝9.1Hz，2H)，7.58(d，J＝8.9Hz，2H)，7.54(d，J＝0.5Hz，1H)，3.77(d，J＝11.6Hz，6H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)159.0(d，J＝22.1Hz)，139.9(d，J＝10.7Hz)，136.7，132.1，122.9，120.4，83.8(d，J＝220.9Hz)，53.0(d，J＝5.3Hz)；31P NMR(162MHz，CDCl3)19.73.C11H12BrN2O4P的分析：计算值：C 38.15；H 3.50；N 8.09测定值：C 37.82；H 3.66；N 7.70
[1-环己基-5-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸二甲基酯(式3e的化合物)。使用4.7mmol化合物2进行反应，得到3-和5-羟基异构体的混合物(1.2∶1.0，22％)。通过反相色谱(CH3CN∶H2O，10∶90至40∶60，20分钟；至100∶0，5分钟；注意：所有的溶剂都含有0.1％的三氟乙酸(TFA))纯化并且分离出白色固体的5-羟基产物(F15-17)(0.07g，0.26mmol，6％)：
1H NMR(400MHz，CDCl3)11.45(bs，2H)，7.54(s，1H)，4.20(m，1H)，3.75(d，J＝11.8Hz，6H)，1.96-1.71(m，7H)，1.41-1.24(m，3H)；13C NM(100MHz，CDCl3)157.5(d，J＝21.2Hz)，138.6(d，J＝12.6Hz)，82.6(d，J＝225.8Hz)，56.5，53.2(d，J＝5.3Hz)，31.6，25.5，25.0；31P NMR(162MHz，CDCl3)19.23.C11H19N2O4P的分析：计算值：C 48.16；H 6.99；N 10.22测定值：C 46.15；H 6.66；N 9.30。
方法B.制备[1-芳基或烷基-5-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸二烷基酯(式3的化合物)的一般方法
把三甲基膦酰基乙酸酯(13.4g，0.073mol)、N，N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(13.2g，0.11mol)和甲醇(10mL)的混合物加热回流18小时。在真空下浓缩冷的混合物，得到三甲基(二甲基氨基亚甲基)膦酰基乙酸酯的淡黄色固体/油(22.4g，129％)。在氮气气氛下，把粗的二甲基氨基亚甲基中间体(7.8g，0.032mol)、4-氯苯基肼盐酸盐(5.8g，0.032mol)和甲醇(40ml)的混合物加热回流1小时。一份样品的薄层色谱(TLC)(乙酸乙酯)分析表明，三甲基(二甲基氨基亚甲基)膦酰基乙酸酯已经消耗掉了。冷却到45℃后，加入水(15ml)，然后加入碳酸钾(4.5g，0.032mol)，加热回流混合物30分钟。一份样品的TLC分析表明，已经完全转化为产物。把混合物冷却到25℃，按照方法A中所述进行后处理，得到暗琥珀色固体的化合物3a(6.20g，64％)。1H和31P NMR光谱表明是纯的产物。
方法C.制备[1-芳基或烷基-5-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸二烷基酯(式3的化合物)的一般方法
在氮气气氛下，向3-氧基-2-二甲基膦酰基丙烯酸甲酯钠盐(4.1g，0.017mol)在无水DMSO(25mL)中的浆液中加入碘甲烷(4.5g，0.031mol)，在室温下搅拌反应混合物18小时。把混合物倒入稀的氯化钠溶液中，用二氯甲烷(6×75mL)萃取。萃取液用水(100mL)洗涤，干燥(硫酸镁)，过滤，在真空下浓缩，得到棕色的油状物(5.5g)。通过硅胶色谱(乙酸乙酯)将一半的粗产物进行部分分离，得到纯粹的E-异构体(0.27g)、E-和Z-异构体的混合物(0.75g)和纯的Z-异构体(0.14g)。分离E-和Z-异构体的总产率为52％。(E)-2-(二甲氧基磷酰基)-3-甲氧基-2-丙烯酸甲酯(E-异构体)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)：7.55(d，JH-P＝10.8Hz，1H)，4.06(s，3H)，3.78(d，JH-P＝2.7Hz，6H)，3.75(s，3H)，31P NMR(121MHz，CDCl3)20.74.(Z)-2-(二甲氧基磷酰基)-3-甲氧基-2-丙烯酸甲酯(Z-异构体)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)7.90(d，JH-P＝31.8Hz，1H)，4.03(s，3H)，3.78(d，JH-P＝5.1Hz，6H)，3.75(s，3H).31P NMR(121MHz，CDCl3)15.50.在氮气气氛下，加热回流粗的甲基-2-(二甲氧基磷酰基)-3-甲氧基-2-丙烯酸酯(6.9g，0.030mol)、4-氯苯基肼盐酸盐(5.4g，0.030mol)和甲醇(40ml)的混合物1小时。一份样品的TLC(乙酸乙酯)分析表明，甲基-2-(二甲氧基磷酰基)-3-甲氧基-2-丙烯酸酯已经被消耗掉了。冷却到45℃后，加入水(15ml)，然后加入碳酸钾(4.1g，0.030mol)，在65℃加热混合物1小时。一份样品的TLC分析表明，已经完全转化为产物。把反应混合物冷却到25℃，进一步按照方法A中所述进行分离提纯，得到红琥珀色固体的化合物3a(5.90g，65％)。1H和31P NMR光谱表明含有90％的分析产物，最后的净产率为58％。
选定的化合物通过方法A、B、C和反应中所述的方法(Khotinen和Polozov，1990，Phosphorus，Sulfur Silicon Relat.Elem.83：53；Polozov等人，1992，Phosphorus，Sulfur Silicon Relat.Elem.73：153)制备。这些仅仅是按照这些方法制备的用于比较相对产率的具有代表性的化合物。表1表明，方法A的产率一般来说大于方法B的产率，而方法B的产率一般来说又大于方法C的产率，方法C的产率一般来说大于Khotinen和Polozov所述的方法(1990，Phosphorus，Sulfur Silicon Relat.Elem.83：53)和Polozov等人所述的方法(1992，Phosphorus，Sulfur Silicon Relat.Elem.73：153)的产率。
表1.通过方法A、B、C以及Khotinen和Polozov所述的方法或Polozov所述的方法生产选定的第3组化合物的产率的比较 化合物 Ar 产率(％)a 方法 3d 4-ClPh 78 A 64 B 58 C 3a Ph 79 A 34 Khotinen；Polozov 3j 4-NO2Ph 79 A 31 Khotinen：Polozova 包括中间体的制备在内的总产率。
制备[1-芳基-3-烷基或芳基-5-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸二甲基酯(式10的化合物)的一般方法
把二甲氧基氧膦基甲基酯(1-2.5mmol)悬浮于水中，加入苯基肼盐酸盐(1-2.5mmol)，在110℃下搅拌混合物2小时。冷却反应混合物，加入碳酸钾(2当量)，在110℃下搅拌混合物2小时，冷却到室温，再搅拌16小时。用乙醚洗涤反应混合物，用0.5N盐酸酸化到pH＝2，用乙酸乙酯(3×50mL)萃取。用NaCl(饱和的)洗涤合并后的萃取液，干燥(Na2SO4)，过滤，浓缩为油状物。一部分产物通过径向色谱(硅胶)纯化，用乙酸乙酯或己烷：异丙醇(90-95％)或己烷：乙酸乙酯(90-95％)的混合物洗脱，得到所要的产物。
[1-(4-氯苯基)-5-羟基-3-苯基-1H-吡唑-4-基]膦酸二甲基酯(化合物10a)。使用化合物9(0.71g，2.5mmol)和4-Cl-苯基肼·HCl(0.49g，2.75mmol)进行反应，得到粗产物(0.81g，85％)。粗产物(0.75g)通过径向色谱(硅胶)分离两次，用乙酸乙酯洗脱，得到纯的产物(0.40g，45.3％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)11.42(bs，1H)，7.95-7.90(m，4H)，7.47-7.44(m，5H)，3.76(d，J＝12.0Hz，6H).13C NMR(75MHz，CDCl3)161.0(d，J＝22.9Hz)，151.4(d，J＝9.4Hz)，136.5，132.4，132.2，129.2，129.2，128.7，127.2，122.7，80.8(d，J＝215.2Hz)，53.1(d，J＝4.6Hz).31P-NMR(121MHz，CDCl3)δ21.93.C17H16N2O4PCl的分析：计算值：C 53.90；H 4.27；N 7.40；Cl 9.36测定值：C 55.62；H 4.35；N 7.58；Cl 9.99
[1-(3，5-二甲基苯基)-5-羟基-3-苯基-1H-吡唑-4-基]膦酸二甲基酯(化合物10b)。使用化合物9(0.71g，2.5mmol)和3，5-二甲基苯基肼·HCl(0.43g，2.50mmol)进行反应，得到粗产物(0.65g，69.8％)。粗产物(0.60g)通过径向色谱(硅胶)分离4次，用己烷∶乙酸乙酯或己烷∶异丙醇的混合物洗脱，得到纯的产物(0.10g，11.7％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)11.24(bs，1H)，7.95(d，J＝1.8Hz，1H)，7.92(d，J＝1.5Hz，1H)，7.52(s，2H)，7.50-7.40(m，3H)，7.00(s，1H)，3.76(d，J＝12.0Hz，6H)，2.42(s，6H).13C NMR(75MHz，CDCl3)160.8(d，J＝22.9Hz)，151.1(d，J＝9.4Hz)，138.9，137.6，132.5，129.0，128.9，128.6，127.2，119.8，80.2(d，J＝215.2Hz)，53.0(d，J＝4.6Hz)，21.5.31P NMR(121MHz，CDCl3)δ21.31.C19H21N2O4P的分析：计算值：C 61.28；H 5.70；N 7.52测定值：C 62.37；H 5.75；N 7.67
[2-芳基或烷基-3-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸二烷基酯烷基化的一般方法
向在0℃冷却的1.65mmol(1当量)羟基吡唑-4-基膦酸酯在20ml无水DMF中的溶液中加入1.1当量的NaH(60％的油分散液)，搅拌混合物15-20分钟。加入合适的亲电子试剂(1.1当量)，然后缓慢温热到室温，在30℃下搅拌反应混合物18小时，倒在50-100ml冰水上，用乙酸乙酯稀释，用乙酸乙酯洗涤有机层(3×50ml)。合并乙酸乙酯层，干燥(硫酸镁)，在真空下浓缩。通过Kugelrohr蒸馏(75℃/0.2mmHg)除去过量的DMF，然后通过硅胶色谱纯化(先用2％的IPA/己烷洗脱，逐渐增大到用10％的IPA/己烷洗脱)。
{1-(4-氯苯基)-5-[(4-氯苄基)氧基]-1H-吡唑-4-基}膦酸二甲基酯(化合物4a)。使用0.207mmol的[2-(4-氯苯基)-3-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸二甲基酯进行反应，得到浅褐色的油状物，粗产物通过反相色谱(CH3CN∶H2O(0.5％TFA)；20∶80至100％，20分钟)纯化，得到褐色的固体产物(12.5mg，0.031mmol，15％)：
1H NMR(400MHz，CD3OD)7.68(s，1H)，7.46(d，J＝8.6Hz，2H)，7.36(d，J＝8.9Hz，2H)，7.30(d，J＝8.6Hz，2H)，7.18(m，2H)，5.38(s，2H)；31P NMR(162MHz，CD3OD)9.14.
{1-(4-氯苯基)-5-[(2-硝基苄基)氧基]-1H-吡唑-4-基}膦酸二甲基酯(化合物4b)。使用2.02mmol的[2-(4-氯苯基)-3-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸二甲基酯进行反应，得到棕色的油状物。通过使用Kgelrohr蒸馏在50℃/0.2mmHg下除去过量的DMF，然后通过径向色谱(IPA∶乙酸乙酯＝5∶95)纯化，得到褐色的固体产物(426.8mg，0.98mmol，48％)：
1H NMR(400MHz，CDCl3)8.10(dd，J＝8.9，1.0Hz，1H)，7.76(d，J＝1.4Hz，1H)，7.65(m，2H)，7.54(d，J＝9.1Hz，2H)，7.51(m，1H)，7.39(d，J＝9.0，2H)，5.87(s，2H)，3.60(d，J＝11.5Hz，6H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)156.0 d 156.1(d，J＝8.5Hz)，147.7，144.1(d，J＝20.5Hz)，136.0，134.1，133.8，131.6，129.3，129.3，129.1，125.2，124.8，92.5(d，J＝200.0Hz)，73.9，52.9(d，J＝7.5Hz)；31PNMR(162MHz，CDCl3)15.61.
制备膦酸单烷基酯的一般方法
在一个100mL的单颈圆底烧瓶中，在搅拌下把膦酸二烷基酯悬浮于10％的氢氧化钠溶液(40-50mL)中，在油浴(80-100℃)中加热混合物2-6小时或者直到TLC(IPA∶己烷＝15∶85)表明膦酸酯已经被消耗掉了。把反应混合物冷却到室温，用浓盐酸酸化，用乙酸乙酯(3×30ml)萃取产物，干燥(硫酸镁)合并后的有机萃取液，过滤并且在真空下浓缩，得到灰白色的固体产物。
[2-(3，5-二甲基苯基)-3-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸单甲基酯(化合物3g)。使用2.4mmol的膦酸二甲基酯进行反应，得到灰白色的固体产物(640mg，2.3mmol，95％)：
1H NMR(400MHz，CD3OD)7.71(s，1H)，7.24(s，2H)，7.03(s，1H)，3.70(d，J＝11.5Hz，3H)；13C NMR(100MHz，CD3OD)156.4(d，J＝19.6Hz)，140.2(d，J＝12.6Hz)，138.0，135.7，128.0，119.5，50.7(d，J＝5.0Hz)，19.1：31P NMR(162MHz，CD3OD)14.80.
[2-(4-氯苯基)-3-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸氢甲基酯(化合物3h)。使用1.8mmol的膦酸二甲基酯进行反应，得到灰白色的固体产物(500mg，1.7mmol，94％)：
1H NMR(400MHz，CD3OD) 7.72(s，1H)，7.69(d，J＝8.9Hz，2H)，7.50(d，J＝8.9Hz，2H)，3.79(d，J＝11.8Hz，3H)；31P NMR(162MHz，CD3OD)14.43.
制备膦酸的一般方法
向50mL的单颈圆底烧瓶中加入膦酸二甲基酯的二氯甲烷溶液(30ml)，在搅拌下向溶液中加入TMSI(4当量)，在室温下搅拌所得的溶液直到TLC(IPA∶己烷＝15∶85)表明膦酸酯已经被消耗掉了(1-3小时)，在真空下除去溶剂，向残留物中加入甲醇(30ml)，搅拌所得的溶液20分钟。在真空下除去甲醇，加入新鲜的甲醇，搅拌10分钟。在真空下除去甲醇，得到一种桔红色油状物。把该残留物溶于最少量的甲醇(1-2mL)中，然后用二氯甲烷(30mL)稀释。当用二氯甲烷稀释时，产物以白色固体从溶液中沉淀出来。在冰箱中冷却混合物过夜，通过过滤把产物分离出来。
2-(4-氯苯基)-3-[(2-硝基苄基)氧基]-1H-吡唑-4-基-膦酸(化合物4c)。使用0.217mmol式3的化合物进行反应，得到淡褐色的油状物。粗产物通过反相色谱(CH3CN∶H2O(5％TFA)；20∶80至100％CH3CN，20分钟)纯化，得到褐色的固体产物(50mg，0.12mmol，56％)：
1HNMR(400MHz，CD3OD)8.00(d，J＝2.3Hz，1H)，7.68(m，1H)，7.64(m，2H)，7.52(m，1H)，7.44(m，2H)，7.36(d，J＝8.6Hz，2H)5.80(s，2H)；31P NMR(162MHz，CD3OD)9.17.
2-(4-氯苯基)-3-羟基-1H-吡唑-4-基-膦酸(化合物3j)。使用1.7mmol式1的化合物进行反应，得到一种灰白色的固体产物(424mg，1.6mmol，92％)：
1H NMR(400MHz，CD3OD)7.70(d，J＝7.0Hz，2H)，7.67(s，1H)，7.49(d，J＝7.0Hz，2H)；31P NMR(162MHz，CD3OD)11.61.
2-(3，5-二甲基苯基)-3-羟基-1H-吡唑-4-基-膦酸(化合物3k)。使用2.4mmol[2-(3，5-二甲基苯基)-3-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸二甲基酯进行反应，得到HI盐形式的产物(940mg，2.4mmol，100％)。通过溶于最少量的甲醇(1-2ml)中，然后用二氯甲烷(20-30ml)稀释来中和盐(1.7mmol)。在搅拌下，向均匀的溶液中加入环氧丙烷(2当量)。5分钟后，从溶液中沉淀并且分离出灰白色的固体产物(445mg，1.7mmol，100％)：
1H NMR(400MHz，CD3OD)7.66(s，1H)，7.25(s，2H)，7.02(s，1H)；13C NMR(100MHz，CD3OD)158.1(d，J＝19.5Hz)，141.9(d，J＝13.4Hz)，140.2，138.2，130.0，121.5，93.8(d，J＝217.4Hz)，21.4；31P NMR(162MHz，CD3OD)11.84.
制备钾盐(式3l、3m和3n的化合物)的一般方法
在一个圆底烧瓶中，在搅拌下把膦酸(1当量)悬浮于甲醇中(甲醇5mL/100mg)。向悬浮液中加入KOH溶液(1.0当量，5mg/mL的甲醇溶液)，在室温下搅拌混合物0.5-2小时，在真空下除去溶剂，得到灰白色或白色的钾盐固体。
制备(1-芳基-3-羟基-1H-吡唑-4-基)膦酸二甲基酯(式8的化合物)的一般方法
方法I：把苯基肼盐酸盐(4.4mmol)在无水THF(25mL)中的浆液放在冰浴中冷却，加入叔丁醇钾的THF溶液(10mmol，1.0M)。5分钟后，加入(E和Z)-2-(二甲氧基磷酰基)-3-甲氧基-2-丙烯酸甲酯(MX3128-F12/G1，4.4mmol)的无水THF(2mL)溶液。在冰浴中搅拌混合物5分钟，用1-2小时的时间温热到室温，然后用过量的1％的盐酸水溶液处理。用二氯甲烷(3×75mL)萃取产物，干燥(硫酸镁)萃取液，过滤并且在真空下浓缩。通过硅胶色谱纯化(IPA/己烷＝15/85)，得到所要的产物。
方法II：把苯基肼盐酸盐(4.4mmol)在无水THF(35mL)中的浆液冷却到-15℃，加入正丁基锂的己烷溶液(10mmol，2.5M)。5分钟后，加入(E和Z)-2-(二甲氧基磷酰基)-3-甲氧基-2-丙烯酸甲酯(4.4mmol)的无水THF(2mL)溶液。在-15℃下搅拌混合物5分钟，用1-2小时的时间温热到室温，然后用过量的1％的盐酸水溶液处理。用二氯甲烷(3×75mL)萃取产物，干燥(硫酸镁)萃取液，过滤并且在真空下浓缩。通过硅胶色谱纯化(IPA/己烷＝15/85)，得到所要的产物。
[1-(4-溴苯基)-3-羟基-1H-吡唑-4-基]膦酸二甲基酯(化合物8a)。使用4.9mmol的4-溴苯基肼盐酸盐实施方法I，得到红棕色的油状产物(0.56g，1.3mmol，27％)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.07(d，JH-P＝2.4Hz，1H)，7.52(d，J＝9.3Hz，2H)，7.42(d，J＝9.0Hz，2H)，3.82(d，JH-P＝11.4Hz，6H)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ164.9(d，JC-P＝9.3Hz)，137.9，132.7，132.3(d，JC-P＝21.3Hz)，120.6，120.4，92.5(d，JC-P＝219.0Hz)，53.1(d，JC-P＝5.4Hz)；31P NMR(121MHz，CDCl3)δ16.96.C11H12BrN2O4P的分析：计算值：C 38.06；H 3.48；N 8.07测定值：C 36.96；H 3.52；N 7.56
制备4-二甲氧基膦酰基-1-芳基-2-烷基-3-吡唑啉-5-酮(式5的化合物)的一般方法
向100mL的单颈圆底烧瓶中加入芳基肼盐酸盐(2.6mmol，1.2当量)的水∶甲醇(1∶1，10mL)溶液，在120℃的油浴中加热搅拌混合物。把3-烷氧基钠-2-二甲基膦酰基丙烯酸酯(式2，2.1mmol，1.0当量)溶于水∶甲醇(1∶1，5ml)，然后加入热的芳基肼溶液中。通过反相色谱(CH3CN∶H2O，20∶80；至100∶0，20分钟，注意：所有的溶剂都含有0.1％的TFA)监测反应，加热30-45分钟后，表明已经完全转化为中间体加成物。从油浴中取出烧瓶，加入碳酸钾(9.9mmol，2.1当量)，再次在120℃的油浴中加热搅拌混合物30-60分钟或者直到HPLC指示环化已经完成。把混合物冷却到室温，用乙酸乙酯(3×40mL)萃取。干燥(硫酸镁)合并后的有机萃取液，过滤，在真空下浓缩，得到黄色固体的粗产物。粗产物通过径向色谱(TLC，IPA∶EtOAc＝2∶8)纯化，得到灰白色的固体产物。
[2-(4-氯苯基)-2，3-二氢-1-乙基-3-氧代吡唑-4-基]膦酸二甲基酯(化合物5a)。使用1.5mmol的式2化合物进行反应，得到浅黄色油状的粗产物(260mg，0.8mmol，53％)。随着时间的推移，在油中形成了白色结晶，收集结晶并且用冷的乙酸乙酯洗涤：
1H NMR(400MHz，CDCl3)8.00(d，J＝4.8Hz，1H)，7.47(d，J＝8.6Hz，2H)，7.29(d，J＝8.9Hz，2H)，3.84(d，J＝11.5Hz，6H)，3.73(q，J＝7.2Hz，2H)，1.18(t，J＝7.2Hz，3H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)163.8(d，J＝14.1Hz)，148.4(d，J＝18.7Hz)，134.1，131.7，129.7，126.8，95.3(d，J＝223.5Hz)，53.0(d，J＝5.7Hz)，45.6，13.0；31P NMR(162MHz，CDCl3)15.27.C13H16ClN2O4P的分析：计算值：C 47.27；H 4.89；N 8.49测定值：C 47.12；H 4.90；N 8.40
[2-(4-氯苯基)-1-环己基-2，3-二氢-3-氧代吡唑-4-基]膦酸二甲基酯(化合物5b)。使用1.9mmol的式2化合物进行反应，得到浅黄色油状的粗产物(480mg，1.3mmol，64％)。粗产物通过径向色谱(IPA∶EtOAc＝2∶8)纯化，得到灰白色的固体产物(190mg，0.5mmol，26％)：
1H NMR(400MHz，CDCl3)8.06(d，J＝4.8Hz，1H)，7.47(d，J＝8.6Hz，2H)，7.23(d，J＝8.6Hz，2H)，3.83(d，J＝11.6Hz，6H)，3.56(m，1H)，2.03(d，J＝11.3Hz，2H)，1.84(d，J＝12.1Hz，2H)，1.68(d，J＝8.3Hz，1H)，1.40(q，J＝12.0Hz，2H)，1.17(m，3H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)164.1(d，J＝14.1Hz)，146.5(d，J＝19.1Hz)，133.9，132.2，129.7，126.8，94.9(d，J＝223.2Hz)，59.6，53.0(d，J＝5.7Hz)，31.2，25.04，24.99；31P NMR(162MHz，CDCl3)15.62.C17H22ClN2O4P的分析：计算值：C 53.11；H 5.77；N 7.29测定值：C 52.46；H 5.77；N 7.10。
[2-(3，5-二甲基苯基)-2，3-二氢-1-乙基-3-氧代吡唑-4-基]膦酸二甲基酯(化合物5c)。在这个实施例中，用1H NMR光谱测得的芳基肼的纯度是89％。根据芳基肼的数量计算产率，然而，其它试剂的数量则以芳基肼和杂质的总重量为基准。使用3.0mmol的式2化合物进行反应，得到浅黄色油状的粗产物(510mg，1.6mmol，63％)。粗产物通过径向色谱(IPA∶EtOAc＝2∶8)纯化，得到灰白色的固体产物(190mg，0.6mmol，23％)：
1HNMR(400MHz，CDCl3)7.95(d，J＝4.6Hz，1H)，7.03(s，1H)，6.94(s，2H)，3.84(d，J＝11.6Hz，6H)，3.72(q，J＝7.2Hz，2H)，2.35(s，6H)，1.19(t，J＝7.3Hz，3H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)163.8(d，J＝13.7Hz)，146.6(d，J＝19.1Hz)，139.4，132.8，130.3，123.8，94.2(d，J＝222.4Hz)，53.5(d，J＝5.7Hz)，45.3，21.2，13.2；31P NMR(162MHz，CDCl3)15.96.C15H21N2O4P的分析：计算值：C 55.53；H 6.53；N 8.64测定值：C 55.47；H 6.51；N 8.61。
[1-丁基-2-(3，5-二甲基苯基)-2，3-二氢-3-氧代吡唑-4-基]膦酸二甲基酯(化合物5d)。使用5.8mmol的式2化合物进行反应，得到浅黄色油状的粗产物(1.6g，4.4mmol，80％)。粗产物通过径向色谱(IPA∶EtOAc＝2∶8)纯化，得到灰白色的固体产物(700mg，2.0mmol，36％)：
1H NMR(400MHz，CDCl3)7.93(d，J＝4.6Hz，1H)，7.03(s，1H)，6.93(s，2H)，3.84(d，J＝11.6Hz，6H)，3.68(t，J＝7.0Hz，2H)，2.36(s，6H)，1.49(quintet，J＝7.3Hz，2H)，1.20(七重峰，J＝7.2Hz，2H)，0.85(t，J＝7.4Hz，3H)；13C NMR(100MHz，CDCl3)163.9(d，J＝13.7Hz)，147.1(d，J＝19.1Hz)，139.3，132.9，130.3，123.8，93.2(d，J＝223.2Hz)，53.0(d，J＝6.1Hz)，50.1，30.1，21.2，19.5，13.3；31P NMR(162MHz，CDCl3)16.07.C17H25N2O4P的分析：计算值：C 57.93；H 7.15；N 7.95测定值：C 57.77；H 7.07；N 7.90。实施例2：作为化学杂交剂的活性
通过下列方法，用小麦示范了化学杂交剂用于产生谷类雄性不育的试验条件。以50-1000μg/株植物的剂量施用式3的化合物及其类似物以引起花粉不育。在小麦种‘OSLO’—一种双矮化的硬红皮春小麦上测定杀雄性配子的活性。把小麦种子种植在6英寸长(15cm)的锥形容器(每个容器中种一粒种子)中，深度为0.5-1英寸(1-2.5cm)。给锥形容器装满Metromix 200陶土，陶土中添加有缓慢释放的肥料，总共为93g/立方英尺土壤(对于一个31-20-24的NPK来说)的Osmocote和Sierra。以17g/立方英尺的剂量加入含有微量养料的Micromax。肥料供应商是Hummerts，Earth City，MO 63045。RLC-4容器的尺寸为1×6英寸(2.5×15cm)，容量为4立方英寸(Stuewe&Sons，Inc.，Corvallis，OR，97333-9461)。把这些容器装在100个占地面积为1.0英尺×1.0英尺的架子上。下种后，把架子置于白天/黑夜周期为14/10的18℃的生长室中，这些生长室装有能输送大约300μE/m2/秒的金属卤化物灯。湿度维持在50％，并且在需要时给植物浇水。下种大约6星期后，选择小麦植株用于在容器中的植物发旗芽(Feekes刻度7.5-8.0)时或者刚好在发旗芽前施用药剂(Large，1954，Plant Pathology 3：128-129)。把植物放在带有纸板分隔器的架子中，纸板分隔器用于防止在给相邻植物的植物喷药时植物本身被交叉污染。下列方法用于评估本发明的化合物在诱导谷物雄性不育中的活性。植物高度不同，由于均匀性是化学用药所要求的，因此要剪去顶部的0-10cm，使得植物的高度与分隔器的顶部持平。在用药前，用150mL含有1％SILWET L-77表面活性剂(Witco Corp.，Greenwich，CT 06831-2559)和2％润湿剂(甘油，由VWR Scientific Products Co.)的水稀释50ml含有化学杂交剂的DMSO(二甲基亚砜)的溶液。以喷雾剂形式把制剂喷施到植物的叶面上。喷药后，把植物转移到生长室中使其生长，直到从植物容器中露出头。在花药挤出前(大约在喷药后10-14天)，把植物放回分隔器中以便把种子头分开，预防异体授粉。把植物转移到环境条件与生长室相似的温室中。大约一星期后(喷药3星期(WAT)后，花药挤出时)，开始对展开的花头的形态进行评价。在8天的时间内对植物作四次评价(表2)。化学杂交剂Genesis(Monsanto Co的一个注册商标)用作正对照，用于比较用药量和由不育百分数所确定的药效。负对照是用构成表面活性剂和润湿剂的制剂的化合物处理小麦植株，而不需要进行化学组合物用作化学杂交剂的试验。表2中的数据表示为不育％＝(1-(归一化的样品种子的平均数/归一化的对照种子的平均数))*100，其中处理包括进行叶面喷施和在Feekes第8阶段通过5份平行测定进行剂量滴定。大约在完成对展开的花头的形态进行评价后两星期(6个WAT)，收集种子数量。
表2-4概括了在评价式3、4、5、8和10的化合物时得到的典型结果。表2.在生长室/温室中对式3、4和10的选择化合物所作的评价化合物R1 R2 R3 R4 R5 剂量 g/植株Feekes 不育 (％) 3a 4-ClPh H H CH3 CH3 500 8 92 250 8 79 125 8 34 50 8 39 500 6 49 250 6 0 125 6 0 50 6 27 3b 4-FPh H H CH3 CH3 1000 8 98 500 8 91 250 8 90 125 8 30 50 8 23 3c 2-ClPh H H CH3 CH3 1000 8 36 500 8 53 250 8 18 125 8 29 50 8 25 3d 4-BrPh H H CH3 CH3 1000 8 54 500 8 15 250 8 17 125 8 0 50 8 0 3e 环己基 H H CH3 CH3 1000 8 44 500 8 26 250 8 17 125 8 3 50 8 15 10a 4-ClPh H Ph CH3 CH3 1000 8 45 500 8 18 250 8 27 125 8 0 50 8 1 10b 3，5- H Ph CH3 CH3 1000 8 45 二MePh 500 8 33 250 8 11 125 8 0 50 8 5 4a 4-ClPh CH2(4- ClPh) H CH3 CH3 500 8 93 250 8 93 125 8 80 50 8 48 500 6 34 250 6 9 125 6 0 50 6 0 4b 4-ClPh CH2(2- NO2Ph) H CH3 CH3 500 8 94 250 8 57 125 8 0 50 8 16 500 6 0 250 6 0 125 6 0 50 6 0 3g 3，5- 二MePh H H CH3 H 500 8 15 250 8 0 125 8 17 50 8 38 500 6 6 250 6 12 125 6 3 50 6 0 3h 4-ClPh H H CH3 H 500 8 15 250 8 9 125 8 12 50 8 31 500 6 47 250 6 22 125 6 3 50 6 0 4c 4-ClPh CH2(2- NO2Ph) H H H 500 8 67 250 8 0 125 8 4 50 8 0 500 6 21 250 6 0 125 6 0 50 6 0 3j 4-ClPh H H H H 500 8 12 250 8 0 125 8 13 50 8 31 500 6 35 250 6 0 125 6 7 50 6 4 3k 3，5-diCH H H H H 500 8 9 250 8 9 125 8 33 50 8 32 500 6 0 250 6 4 125 6 17 50 6 32 31 3，5-二CHH H CH3 K+ 500 8 39 250 8 24 125 8 28 50 8 12 500 6 54 250 6 39 125 6 17 50 6 0 3m 4-ClPhH H CH3 K+ 500 8 15 250 8 16 125 8 20 50 8 28 500 6 43 250 6 31 125 6 0 50 6 23 3n 3，5-二CHH H H K+ 500 8 20 250 8 4 125 8 11 50 8 15 500 6 31 250 6 10 125 6 7 50 6 7Genesis 500 8 90 250 8 78 125 8 93 50 8 67 500 6 97 250 6 89 125 6 86 50 6 36无组合物 - 8 0 - 6 0表3.选定的化合物8a的生物学活性化合物 R1 R2R3 R4 R5剂量μg/植株 不育 (％)8a 4-BrPh CH3CH2 H CH3 CH3 1000 15 500 25 250 44 125 0 50 12Genesis 1000 99 500 91 250 93 125 64 50 48无化合物 - 0表4.选定的式5化合物的生物学活性化合物R1R1-R5 R3 R5 剂量μg/植株 不育 (％)5a4-ClPh CH3 H Et 1000 10 500 29 250 66 125 26 50 115b4-ClPh CH3 H环己基 1000 62 500 23 250 20 125 14 50 05c3，5-二CH3Ph CH3 H Et 1000 31 500 48 250 16 125 1 50 85d3，5-二CH3Ph CH3 H丁基 1000 41 500 24 250 28 125 0 50 29Genesis 1000 99 500 91 250 93 125 64 50 48无化合物 --- 0
针对375种使用实施例2中描述的方法合成的膦酰基吡唑啉酮和膦酰基吡唑啉的不育活性百分数所作的筛选结果如表5中所示。在375种被筛选的化合物中，22种(5.9％)具有杀雄性配子的活性，其中4种(占最初被筛选化合物的1.1％)的活性在90％以上，这个水平一般被认为足以满足商业开发的要求。这22种有效的化合物的杀配子活性和有效剂量被概括在表2、3和4中。
表5.具有杀配子活性的化合物在膦酰基吡唑啉酮和膦酰基吡唑啉类化合物中所占的频数 所有的化合物(占被筛选化合物的％) 被筛选的化合物 375 活性化合物 22(5.9) 25-50％不育 13(3.5) 50-90％不育 5(1.3) ＞90％不育 4(1.1)
虽然通过优选的实施方式描述了本发明的组合物和方法，然而，很显然，本领域技术人员在不偏离本发明的概念、精髓和保护范围的情况下，可以对本文描述的合成方法、组合物、制剂和用途作各种改变。所有这种对于本领域技术人员来说是显而易见的相似替换和修饰都被认为是在所附的权利要求书所定义的本发明的保护范围内。
因此，这里为了各种目的所引用的所有专利、专利申请和科学文献都通过参考文献全文引入。