治疗和预防气道损伤的含MG53组合物及方法.pdf

本文公开用于治疗和/或保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤的组合物及方法。

1.  一种在肺细胞中调节G53活性、MG53表达或MG53介导的膜修复中至少一种的试剂用于制备治疗和/或预防肺损伤的药物的应用，所述药物包括治疗有效量的所述试剂和药学上可接受的载体。

2.  根据权利要求1所述的应用，其中所述试剂是MG53多肽；MG53受体多肽；编码MG53多肽的核酸；编码MG53受体多肽的核酸；对于编码MG53、MG53受体或小窝蛋白-3的核酸特异的抑制性或反义RNA，或MG53、MG53受体或小窝蛋白-3的激动剂或拮抗剂中的至少一种。

3.  根据权利要求1所述的应用，其中所述有效量为从0.1mg/kg和1000mg/kg体重/天。

4.  根据权利要求2所述的应用，其中MG53活性的所述激动剂包括磷脂酰丝氨酸、锌或锌盐、Zn-1-羟基吡啶-2-硫酮(Zn-HPT)、三七、氧化剂、乙基汞硫代水杨酸钠中至少一种，或其组合。

5.  根据权利要求1所述的应用，其中所述试剂是能够分化为肺细胞的干细胞，其中所述干细胞已经被修饰使得其显示增强的MG53活性或表达。

6.  根据权利要求1所述的应用，其中所述肺损伤包括由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤。

7.  根据权利要求1所述的应用，其中所述肺损伤包括由于肺直接受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的肺细胞或肺组织损伤。

8.  根据权利要求2所述的应用，其中所述MG53多肽具有SEQ IDNOs.：1、3、5、9、10、11、12、13、14、15、或16的至少一种的氨基酸 序列、或其活性部分。

9.  根据权利要求1所述的应用，其中在细胞外或全身给予所述药物连同药学上可接受的赋形剂，其中所述药物在治疗或预防肺组织损伤中是有效的。

10.  MG53多肽或MG53核酸在用于治疗肺损伤的方法中的应用，所述方法包括给予有效量的包括MG53多肽或MG53核酸和药学上可接受的赋形剂的治疗性组合物，其中所述组合物在治疗肺损伤中是有效的。

11.  根据权利要求10所述的应用，其中所述有效量为从0.1mg/kg和1000mg/kg体重/天。

12.  根据权利要求10所述的应用，其中所述治疗性组合物进一步包括MG53活性的激动剂。

13.  根据权利要求12所述的应用，其中所述激动剂包括磷脂酰丝氨酸、锌或锌盐、Zn-1-羟基吡啶-2-硫酮(Zn-HPT)、三七、氧化剂、乙基汞硫代水杨酸钠中至少一种，或其组合。

14.  包含MG53多肽和药学上可接受的载体的治疗性组合物在用于治疗和/或预防肺损伤的方法中的应用，所述方法包括给予有需要的受治疗者治疗有效量的所述组合物，其中所述组合物在治疗肺损伤中是有效的。

15.  根据权利要求10或14所述的应用，其中所述肺损伤包括由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤。

16.  根据权利要求10或14所述的应用，其中所述肺损伤包括由于肺直接受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的肺细胞或肺组织损伤。

17.  根据权利要求14所述的应用，其中所述MG53多肽具有SEQ IDNOs.：1、3、5、6、7、9、10、11、12、13、14、15、或16的至少一种的氨基酸序列、或其活性部分。

18.  根据权利要求14所述的应用，其中在细胞外或全身给予所述组合物连同药学上可接受的赋形剂，其中所述组合物在治疗或预防肺组织损伤中是有效的。

治疗和预防气道损伤的含MG53组合物及方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2011年9月7日提交的美国临时申请序列号61/531,708的权益。本申请进一步涉及2009年1月2日提交的美国专利申请序列号12/307,303以及2008年12月4日提交的美国专利申请序列号12/328,646；美国专利申请序列号12/307,303要求2007年7月11日提交的PCT/US2007/015815的权益，PCT/US2007/015815要求2006年7月11日提交的美国临时申请号60/830,013和2006年12月22日提交的美国临时申请号60/876,871的权益，美国专利申请序列号12/328,646要求2007年12月4日提交的美国临时申请61/005,410的权益，其公开内容出于所有目的全部以其整体并入本文。
通过引用并入
依照37CF.R.§1.52(e)(5)，附于此的序列信息特此以其整体通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及用于调节呼吸功能的组合物及其应用方法。
背景技术
为了维持细胞稳恒性，真核细胞必须响应于各种损伤来源通过活性再循环和修复来保持它们质膜的完整性。例如，响应于外部损伤和内部变性，身体的细胞必须修复每一个单细胞周围的膜以便维持其功能和生物体的健康。
修复质膜损伤是一个需要若干步骤的活性和动态过程，包括可检测到质膜急性伤害的分子感受器(一个或多个)的参与、胞内囊泡在受损部位的成核以及囊泡融合以能够形成膜片。已经证明细胞外钙的进入与胞内囊泡向质膜的融合有关，然而，感应受损膜信号所涉及的 分子机制和用于修复片形成的成核过程尚未得到彻底解决。
细胞修复外膜能力的缺陷与广谱的疾病和病症有关，例如神经变性疾病(如帕金森病、BSE和阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s))、心脏病发作、心脏衰竭、肌肉营养不良、褥疮、糖尿病性溃疡、氧化性损伤、以及组织损伤，如作为给予化疗药剂的副作用而发生的鼻窦炎。此外，与多种疾病相关的肌肉无力和萎缩以及正常衰老过程也与膜修复改变有关。为了这些细胞响应于急性损伤而修复其膜，这些细胞利用在细胞内的小膜袋，也称为囊泡。这些囊泡通常存在于细胞内部，但是一旦细胞膜发生损伤，则这些囊泡移至损伤部位并形成膜片以维持细胞完整性。在没有该必要功能的情况下，细胞可能死亡，且这种细胞损伤的累积效应可以最终引起组织或器官的功能障碍。
急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是严重的急性肺损伤(ALI)的综合症状，特征在于分布广的肺炎和肺血管通透性增加。ARDS/ALI的原因包括直接和间接肺损伤。直接肺损伤包括肺炎、胃内容物吸入、近乎溺死、吸入性损伤和肺挫伤。间接伤害由败血症、严重创伤、大量输血和药物过量引起(Ware，atthay，2000)。败血症和肺炎是最常见的损伤，分别见于86％和29％的ARDS(Ferguson，Frutos-Vivar，Esteban等人，2007)。高龄和吸烟是ARDS的附加风险因素(Iribarren，Jacobs，Sidney，Gross，Eisner，2000)。ARDS在刺激损伤之后快速出现；50％将患ARDS的患者在24小时之内患ARDS，且85％将患ARDS的病人在72小时之内患ARDS(Roupie，Lepage，Wysocki，Fagon，Chastre，Dreyfuss，等，1999)。ALI/ARDS的发生率还不清楚，可能由于该病症定义的变化。近来，发现美国的发生率为190，600例/年(Rubenfeld，Caldwell，Peabody，Weaver，Martin，Neff，Stern，Hudson，2005)，其中每100,000人64例(Goss，Brower，Hudson，Leonard，Rubenfeld，Gordon，2003)。
ARDS与各种各样的症状有关，包括呼吸困难、低氧血症、双肺弥漫性浸润、以及肺浸润降低(Udobi，Childs，Touijer，2003)。患者出现心动过速、发绀、粗湿罗音、以及呼吸窘迫，并通常在重症监护病房(ICU)治疗。治疗主要集中在支持性护理和预防并发症。治疗的基础是机械通风，以确保有足够的气体交换(Krishnan，Brower，2000)。 虽然机械通气是维持生命的治疗，但长期使用可能会延续或加剧现有的肺损伤并导致被称为呼吸机相关肺损伤(VALI)的并发症(Krishnan，Brower，2000.Tremblay，Slutsky，1998；International consensusconferences in intensive care medicine：ventilator-associated lung injury inARDS，1998)。在VALI的体外模型中，显示呼吸机损伤的肺细胞经历质膜应激损伤，如通过增加的碘化丙啶标记摄取所指示的。虽然最近的试图通过使用低充气压力和低呼气末正压来进一步最小化肺损伤的治疗策略已经示出降低死亡率的希望(The Acute Respiratory DistressSyndrome Network，2000；Frank，Gutierrez，Johnes，Allen，Dobbs，Matthay，2002；Marini，1998；Matthay，Zimmerman，Esmon，等，2003；Ragallar，Richter，2010)，但“保护性通气”不能完全消除VALI。就我们所知，还没有对于通风引起的细胞损伤的有效治疗。
其他治疗选择包括确保充足的营养，保持血流动力学稳定性，以及治疗潜在的感染(Udobi，Childs，Touijer，2003)。数种药物，最明显的前列腺素、一氧化氮(NO)和短疗程高剂量皮质类固醇，已被用于治疗ARDS，但这些疗法的益处已有争议(Ware，Matthay，2000；Dellinger，Zimmerman，Taylor等，1998；Bernard，Luce，Sprung等，1987)。目前用于ARDS的疗法主要针对症状缓解，并且没有一个能够改变疾病进程。ARDS的高死亡率和有效的治疗选择的缺乏表明需要直接针对根本(underlying)肺损伤的替代疗法。
具体而言，根本损伤的特征是三期病理生理学(Udobi，Childs，Touijer，2003；Tomashefski，1990)。第一，在渗出期，出现在发病后的第一周期间，肺泡上皮和血管内皮受损，导致水、蛋白、炎性细胞渗入间质组织和肺泡腔。在渗出期期间，作为放大的促炎症反应的结果，发生弥漫性肺泡损伤。炎症介质，包括乳酸脱氢酶(LDH)，肿瘤坏死因子(TNF)，白介素-1B、6和10，血小板活化因子，神经肽P物质，趋化因子和细胞因子(Cepkova，Matthay，2006；Zhou，Chen，Chen，Zhang，Andersson，2010；Puneet，Moochhala，Bhatia，2005)，以增加的水平见于ARDS患者支气管肺泡灌洗(BAL)液中(Chen，Lee，Liu，Wang，Wang，Perng，2005；Minamino&Komuro，2006)。炎症介质的存在被认为是疾病的生物标志物(Tzouvelekis，Pneumatikos，Bouros，2005)。炎 症级联反应引发肺泡I型和II型细胞的嗜中性粒细胞依赖性损伤(Cepkova，matthay，2006)。I型细胞占肺泡细胞的90％，穿过其发生气体交换。II型细胞产生表面活性剂，其在防止肺泡塌缩方面发挥作用。因此，对肺泡细胞的损伤导致气体交换降低，表面活性剂产生减少，以及肺泡塌缩(Minamino&Komuro，2006)。据我们所知，目前还没有针对这种炎症引起的肺泡损伤的有效治疗。不充分的损伤修复可导致以后的增生期，标志是从II型肺泡细胞的增殖产生的纤维症。最后，在纤维症期，外延的重塑发生在肺部，导致扩大的空气空间和僵硬肺。ARDS的预后欠佳；已经发现当前ARDS的死亡率为26-45％，并且在1979和1994之间，死亡率＞50％(Hudson，Steinberg，1999；Jardin，Fellahi，Beauchet，Vieillard-Baron等，1999；Erickson，Martin，Davis，Matthay，Eisner，2009)。
相对于以前注重状况和症状管理的疗法，针对膜修复可以是ARDS的替代疗法。不同于现有的注重支持护理的疗法，促进膜的修复将在以下三个时间点的一个或多个解决肺的根本损伤。第一，在最初损伤之后的细胞膜重封可防止首先导致ARDS的炎症级联反应。如果损伤已经导致ARDS的渗出期，当已经引起弥漫性肺泡损伤，则膜修复将减少总的肺泡坏死。在渗出期中的此时降低细胞损伤，可防止疾病发展到增生和/或纤维症期。最后，细胞膜由于VALI进一步受损，如进入呼吸机损伤肺的染料增加所表明的(Gajic等，2002)，因此膜的修复可增加使用机械通气的安全性。
针对肺泡修复的该创新治疗包括应用Mitsugumin53(MG53)，一种已经发现驱动许多细胞类型中急性膜修复过程的蛋白质(Cai等，2009A，McNeil，2009)。MG53是一种表达于人的骨骼肌和心肌细胞中的肌肉特异性三联基序家族蛋白(TRHV172)，并且与磷脂酰丝氨酸相互作用以与通行至肌纤维膜并与其融合的胞内囊泡相关联。肌纤维膜损伤导致进入胞外氧化环境和MG53低聚反应，引起含MG53囊泡至损伤部位的补充(recruitment)。在囊泡易位之后，胞外Ca2+的进入促进囊泡融合以重封膜并防止将破坏细胞膜完整性的损伤(Cai等，2009A，2009B，2009C，McNeil，2009)。本申请中示出的结果表明，当在细胞外应用MG53蛋白时，MG53蛋白可增加各种细胞类型在损伤 之后重封它们的膜的能力。因此，MG53提供独一无二用于针对肺部疾病诸如ARDS中细胞膜修复的治疗剂的潜力。
为了测试MG53在肺损伤模型中的治疗性作用，我们使用气道损伤的基于细胞的模型和动物模型。本申请示出的结果表明MG53降低了玻璃珠对培养中的气道细胞引起机械损伤之后释放的LDH。另外，MG53可降低LPS诱发的肺损伤模型中BALF中的LDH释放，一种ARDS的标志物。因为BALF中LDH增加是ARDS的标志，所以MG53在多种应用中降低LDH释放的能力进一步表明其治疗ARDS的功效。我们还发现MG53可改善肺损伤小鼠模型中的数种其他病理标志。在LPS诱发的ARDS小鼠模型中，ARDS可以通过组织病理学检查、肺水肿(较大的湿干比)、以及小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中LDH、rNF-a以及IL-6的水平增加(Li，Li，Zhou，Song，Liang，Huang，2010)进行确认。这些发现提供证明MG53可在治疗ARDS和肺损伤方面有效的数据。
基于我们之前对于MG53功效的发现以及这里示出的防止气道损伤的数据，我们确立了应用MG53还可减少ARDS病理标志物。来自我们小鼠模型的结果还提供MG53的药物动力学和服量的概念的证据，并证明MG53的治疗剂量是安全的和对于小鼠耐受良好的。此外，示出应用MG53之后LDH释放减少的先前发现提供将ARDS中膜修复联系于MG53的终点。相对于主要针对症状的并试图防止病情恶化的ARDS的当前治疗方法，MG53可具有成为恢复引起疾病的机械异常的ARDS疾病改善疗法的潜力。
发明内容
本发明涉及惊人和意外发现了保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤所涉及的蛋白和过程。
具体地讲，当前描述核酸以及从本发明的核酸编码的多肽，其可单独地或与其他组分结合调节组织修复和功能。也描述组合物，例如多肽、编码胞浆、核、膜结合、和分泌型多肽的核酸；以及载体、宿主细胞、抗体、重组蛋白、假肽、融合蛋白、化合物以及用于生成这 些物质的方法。
在某些方面，本发明还涉及作为治疗和/或预防呼吸系统细胞和/或组织由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤的治疗剂有用的组合物。
本发明的治疗性组合物包括MG53多肽、以及编码MG53多肽的核酸，例如SEQ ID NO.1蛋白和MG53受体多肽，和突变体、同系物、片段、截短体(平截，truncations)、假肽、肽类似物、和肽模拟物(拟肽，peptidomimetics)，以及可调节MG53活性或MG53与MG53受体多肽例如CSN6、驱动蛋白、小窝蛋白-3(SEQ ID NO.8)、轴突周围蛋白、和髓鞘碱性蛋白的分子间相互作用的蛋白和化合物。如本文所述，MG53起气道损伤的保护剂的作用，且因此靶向和调节MG53基因表达、多肽合成、活性或蛋白-蛋白相互作用代表一种用于治疗和/或预防损伤或疾病之后的气道机能障碍的新型治疗性干预。
在另外的方面，本发明涉及包括与试剂结合的本发明多肽的组合物，该试剂与MG53多肽或MG53受体多肽的活性协同发挥其作用。在某些实施方式中，调节性试剂包括，例如生物活性剂，磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine)；锌，例如以锌盐、锌载体或锌结合物的形式；三七(notoginsing)；以及氧化剂。
在某些另外的方面，本发明涉及与肺组织损伤治疗和/或预防相关的组合物及方法。在某些示例性实施方式中，本发明包括例如给予有效量的本发明的治疗性组合物，用于预防和/或治疗细胞或组织损伤，诸如由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合而受苦的受治疗者中发生的那些损伤。
另外，本发明涉及包括干扰性核酸的核酸和编码MG53和/或MG53相互作用蛋白的多肽，例如CSN6、驱动蛋白、小窝蛋白-3(SEQID NO.8)、轴突周围蛋白和髓鞘碱性蛋白、突变体、截短体、片段、同系物、假肽和肽模拟物，以及可调节其活性或者其与MG53分子间相互作用的化合物。因此，在另外的方面，本发明包括用于靶向小窝蛋白-3(SEQ ID NO.8)基因表达、活性和/或分子间相互作用的方法，用于治疗和/或预防受治疗者的疾病或病症，例如肺损伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合。
在另外的方面，本发明涉及筛选和鉴别作为治疗或预防肺损伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合的治疗剂有用的试剂。在某些方面，本发明包括为MG53或CaV3中至少一种的表达和/或活性和/或磷酸化的激动剂(agonists)的试剂、肽、核酸、或化合物。在另一方面，本发明包括为线粒体通透性转换孔(MPTP)的例如磷酸化的表达或活性的拮抗剂的试剂、肽、核酸、或化合物。
仍在另外的方面，本发明涉及治疗和/或预防肺损伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合的方法，包括给予有效量MG53或CaV3中至少一种的表达和/或活性的激动剂。
在一个方面，本发明提供在肺细胞中调节G53活性、MG53表达或MG53介导的膜修复中至少一个的试剂用于制备治疗和/或预防肺损伤的药物的应用，所述药物包括治疗有效量的所述试剂和药学上可接受的载体。
在又一方面，本发明提供MG53多肽或MG53核酸在制备用于治疗和/或预防肺损伤的药物中的应用，所述药物包括治疗有效量的MG53多肽或MG53核酸和药学上可接受的赋形剂。
仍在另一个方面，本发明提供在肺细胞中调节MG53活性、MG53表达或MG53介导的膜修复中至少一个的试剂在用于治疗和/或预防肺损伤的方法中的应用，所述方法包括给予有效量包括所述试剂和药学上可接受的赋形剂的治疗性组合物，其中该组合物在治疗肺损伤方面是有效的。
在另外的方面，本发明涉及MG53多肽或MG53核酸在用于治疗肺损伤的方法中的应用，所述方法包括给予有效量包括MG53多肽或MG53核酸和药学上可接受的赋形剂的治疗性组合物，其中该组合物在治疗肺损伤方面是有效的。
在某些实施方式中，该试剂是下述至少一种：MG53多肽；MG53受体多肽；编码MG53多肽的核酸；编码MG53受体多肽的核酸；对于编码MG53、MG53受体、或小窝蛋白-3的核酸特异的抑制性或反义RNA，或MG53、MG53受体、或小窝蛋白-3的激动剂或拮抗剂。
在其他实施方式中，可包括本发明的MG53多肽或MG53核酸或由其组成的试剂的有效量，可为从0.1mg/kg和1000mg/kg体重/天。
仍在其他实施方式中，MG53活性的拮抗剂包括磷脂酰丝氨酸、锌或锌盐、Zn-1-羟基吡啶-2-硫酮(Zn-HPT)、三七、氧化剂、乙基汞硫代水杨酸钠中至少一种，或其组合。
又在其他的实施方式中，该试剂是能够分化为肺细胞的干细胞，并且其中该干细胞已经被修饰使得其显示提高的MG53活性或表达。
又在其他的实施方式中，肺损伤包括由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤。
在另一个实施方式中，肺损伤包括由于肺直接受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的肺细胞或肺组织损伤。
仍在其他的实施方式中，MG53多肽具有SEQ ID NOs.：1、3、5、9、10、11、12、13、14、15、或16的至少一种的氨基酸序列或其生物活性部分。
又在其他的实施方式中，MG53核酸具有SEQ ID NOs.：2、4、或6的至少一种的核苷酸序列。
仍在另一个实施方式中，可细胞外或全身给予本发明组合物连同药学上可接受的赋形剂，其中该组合物在治疗或预防肺组织损伤方面是有效的。
仍在另一个方面，本发明涉及用于筛选对于治疗肺损伤有用的化合物的方法，其包括以下步骤：提供表达编码多肽的核酸的肺细胞，该多肽具有与MG53多肽具有至少70％同源性的氨基酸序列；提供测试化合物库；用测试化合物处理细胞；引起对肺细胞膜的损伤；测量MG53表达、活性或量以及细胞修复膜损伤能力的变化；以及比较受处理的细胞与未处理的细胞，其中能够调节MG53表达、活性或量的试剂指示对于治疗肺损伤有用的试剂。
前述一般应用领域仅举例给出，而并不旨在限制本发明公开内容和所附权利要求的范围。根据本权利要求、说明书和实施例，本领域普通技术人员将能理解本发明的另外的目的和优势。例如，本发明的各个方面和实施方式可以以多种组合应用，所有这些都被本说明书明确地考虑。这些另外的目的和优势也明确地包含在本发明的范围之内。
附图说明
并入并形成说明书的一部分的附图，示出了本发明的几个实施方式，且与描述部分一起用于解释本发明的原理。附图仅是为了示出本发明的实施方式，而不应当解释为限制本发明。
图1：MG53是TRIM蛋白家族中的一种肌肉特异性成员。比对不同生物的MG53蛋白序列(见SEQ ID NOs.：1、3、5、9-16)表明此蛋白是TRIM家族的一个成员。功能性结构域用灰色框出，而箭头表示该结构域延伸至序列的另一行上。带框的亮氨酸残基表示高度保守的亮氨酸拉链基序的位置。
图2：示出了包含存在于MG53中的一个或多个保守性三联基序的某些同源性蛋白的示例性结构域比较。MG53的独特之处在于其能够易位至多种形式损伤后细胞膜处的受损部位并介导受损膜的修复-一种所列出的其他TRIM家族蛋白未表现出的功能。虽然这些TRIM蛋白均包含类似的结构域和/或表达于横纹肌中，但均未完全重现MG53的结构域构造(结构域结构，domain organization)。
图3：MG53包含独特的TRIM和SPRY基序，且主要表达于肌肉细胞内。A.MG53基序结构的图。根据cDNA克隆和同源性搜索的结果，在如示出的MG53中检测到多个基序序列。兔和小鼠的序列MG53cDNA已经分别以登录号AB231473和AB231474存储于数据库中。B.蛋白质印迹(Western blot)分析示出了骨骼肌和心肌中MG53的特异性表达。来自小鼠组织(肺、肾、骨骼肌、肝、心脏、脑)的裂解物(每个泳道20μg总蛋白)利用抗小鼠MG53多克隆抗体进行分析。C.来自小鼠骨骼肌细胞的纵横切面的免疫荧光染色。比例尺是125um。
图4：MG53可在气道细胞中保护膜免受损伤。MG53可修复人气道上皮细胞中的膜损伤。(A)用GFP-MG53转染人C38气道上皮细胞(左)，并且然后通过微电极针穿透(箭头)使其遭受机械膜损伤。MG53可易位到气道上皮细胞中的膜修复部位(右)。通过活细胞共聚焦显微镜监测GFP-MG53易位到损伤部位(箭头)。(B)用0.005％的皂角苷处理来使膜具渗透性导致易位到质膜(右)。在两种情况下，细胞膜损伤都导致MG53易位到质膜。(C)用外部重组人 MG53或载体对照处理人IB3气道上皮细胞，并且然后使其暴露于通过玻璃珠的机械膜损伤。通过从细胞释放的由比色试验在488nm记录的LDH测量质膜损伤。MG53可防止由于机械损伤的细胞膜损伤。数据表示为平均值±S.D.，通过ANOVA*p＜0.05。
图5.MG53减少BALF中出现的细胞总数。LPS注射激发之后24小时通过气管套管用PBS灌洗而从小鼠获得BALF液体。用盐水或标示剂量的MG53处理小鼠。示出在肺灌洗之后获得的细胞总数。每一列标示八只小鼠的平均值±S.E.M。与正常组的统计学显著性差异用##标示，p＜0.05(单向ANOVA/事后邓奈特检验)。
图6：MG53阻止损伤之后的肺屏障功能崩溃。LPS注射激发之后24小时通过气管套管用PBS灌洗而从小鼠获得BALF液体。用盐水或标示剂量的MG53处理小鼠。示出在肺灌洗之后获得的蛋白浓度。每一列标示八只小鼠的平均值±S.E.M。与正常组的统计学显著性差异用##标示，p＜0.01；与载体组的统计学显著性差异用*标示，p＜0.05**，p＜0.01(单向ANOVA/事后邓奈特检验)。
图7：MG53降低肺损伤之后的膜渗透性。LPS注射激发之后24小时通过气管套管用PBS灌洗而从小鼠获得BALF液体。用盐水或标示剂量的MG53处理小鼠。示出肺灌洗之后的BALF中的LDH活性。每一列标示八只小鼠的平均值±S.E.M。与正常组的统计学显著性差异用##标示，p＜0.01；与载体组的统计学显著性差异用*标示，p＜0.05**，p＜0.01(单向ANOVA/事后邓奈特检验)。
图8：MG53降低肺损伤之后的炎性反应。LPS注射激发之后24小时通过气管套管用PBS灌洗而从小鼠获得BALF液体。用盐水或标示剂量的MG53处理小鼠。示出肺灌洗之后的BALF中的IL-6蛋白水平。每一列标示八只小鼠的平均值±S.E.M。与正常组的统计学显著性差异用##标示，p＜0.01；与载体组的统计学显著性差异用*标示，p＜0.05**，p＜0.01(单向ANOVA/事后邓奈特检验)。
图9：MG53降低肺损伤之后的水肿。在对小鼠的LPS激发之后24小时获得肺组织。用盐水或标示剂量的MG53处理小鼠。整个肺的湿：干重比用于确定肺损伤之后组织中是否出现水肿。每一列标示六只小鼠的平均值±S.E.M。与正常组的统计学显著性差异用##标示， p＜0.05；与载体组的统计学显著性差异用*标示，p＜0.01**，p＜0.01(单向ANOVA/事后邓奈特检验)。
图10：MG53可阻止LPS诱发的肺结构退化。在对小鼠的LPS激发之后24小时获得肺组织。用盐水或标示剂量的MG53处理小鼠。将肺样品埋入石蜡并且切片用于H&E染色。在光学显微镜术下估计肺损伤程度。用MG53处理之后肺泡结构中存在剂量依赖性的改善。
图11：MG53可阻止LPS诱发的肺黏膜厚度受损。在对小鼠的LPS激发之后24小时获得肺组织。用盐水或标示剂量的MG53处理小鼠。在H&E染色之后，在光学显微镜术下估计肺黏膜厚度。每一列标示六只小鼠的平均值±S.E.M。与正常组的统计学显著性差异用*标示，通过(曼-惠特尼秩检验)p＜0.05。随着MG53处理在黏膜厚度方面存在剂量依赖性的改善。
序列表简述
本发明的各个方面和实施方式可结合与此申请一起提交的序列表中列举的核苷酸和多肽序列使用；但是，本发明的方法和概念及其各个方面和实例方式绝不限于序列表内包含的生物序列。序列表如下：
SEQ ID NO：1(人MG53多肽序列)；
SEQ ID NO：2(人MG53核苷酸序列)；
SEQ ID NO：3(小鼠MG53多肽序列)；
SEQ ID NO：4(小鼠MG53核苷酸序列)；
SEQ ED NO：5(兔MG53多肽序列)；
SEQ ED NO：6(兔MG53核苷酸序列)；
SEQ ID NO：7(突变人MG53多肽序列)；
SEQ ED NO：8(人Cav3多肽序列)；
SEQ ED NO：9(负鼠MG53多肽序列)；
SEQ ID NO：10(狗MG53多肽序列)；
SEQ ED NO：11(非洲黑猩猩MG53多肽序列)；
SEQ ED NO：12(猕猴MG53多肽序列)；
SEQ ID NO：13(牛MG53多肽序列)；
SEQ ID NO：14(大鼠MG53多肽序列)；
SEQ ED NO：15(非洲爪蟾MG53多肽序列)；
SEQ ED NO：16(热带爪蟾MG53多肽序列)；
SEQ ID NO：17(TAT HIV-1多肽序列)；
SEQ ID NO：18(shRNA MG53-正义)；
SEQ ID NO：19(shRNA MG53-反义)；
SEQ ID NO：20(shRNA MG53)：
SEQ ED NO：21(shRNA MG53)：
SEQ ID NO：22(shRNA CaV3-正义)；
SEQ ID NO：23(shRNA CaV3-反义)；
SEQ ID NO：24(shRNA CaV3-正义)；以及
SEQ ID NO：25(shRNA CaV3-反义)。
具体实施方式
如本文所述，MG53可在气道细胞中提供重要的保护性反应以最小化由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的组织损伤，并且因此，靶向和调节MG53基因表达、多肽合成、活性或蛋白-蛋白相互作用代表一种用于治疗和/或预防例如ARDS、VALI以及任何其他形式的肺损伤的新型治疗性干预。
2009年1月2日提交的美国专利申请序列号12/307,303以及2008年12月4日提交的美国专利申请序列号12/328,646的内容出于所有目的全部以其整体并入本文，美国专利申请序列号12/307,303要求2007 年7月11日提交的PCT/US2007/015815的权益，PCT/US2007/015815要求2006年7月11日提交的美国临时申请号60/830,013和2006年12月22日提交的美国临时申请号60/876,871的权益，美国专利申请序列号12/328,646要求2007年12月4日提交的美国临时申请61/005,410的权益。此外，本说明书出于所有目的通过引用将，WO2008/054561；Cai等人，MG53nucleates assembly of cell membranerepair machinery.Nature Cell Biol.，11(1)：p_-_(2009年1月)；以及Cai等人，MG53regulates membrane budding and exocytosis in musclecells.Journal of Biological Chemistry，2008年12月24日网上发表，以其整体并入本文。
本发明部分地与惊人地和意外地发现重组核酸序列及相关多肽(见SEQ ID NOs.：1-15)有关，其能够促进气道细胞和/或组织由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤的治疗和保护。以前，本发明人发现急性膜修复过程中的囊泡融合由mitsugumin53(MG53)(SEQ ID NOs.1-15)驱动，MG53是一种新型的肌肉特异性三联基序(TRIM)家族蛋白。MG53表达有利于细胞内囊泡运输至质膜并与质膜融合，等等。
ARDS与各种各样的症状有关，包括呼吸困难、低氧血症、双肺弥漫性浸润、以及肺浸润降低(Udobi，Childs，Touijer，2003)。患者出现心动过速、发绀、粗湿罗音、以及呼吸窘迫，并通常在重症监护病房(ICU)治疗。治疗主要集中在支持性护理和预防并发症。治疗的基础是机械通风，以确保有足够的气体交换(Krishnan，Brower，2000)。而机械通气是维持生命的治疗，长期使用可能会延续或加剧现有的肺损伤并导致被称为呼吸机相关肺损伤的并发症(VALI)(Krishnan，Brower，2000.Tremblay，Slutsky，1998；International consensusconferences in intensive care medicine：ventilator-associated lunginjury inARDS，1998)。在VALI的体外模型中，显示呼吸机损伤的肺细胞经历质膜应激损伤，如通过增加的碘化丙啶标记摄取所指示的。虽然最近的试图通过使用低充气压力和低呼气末正压来进一步最小化肺损伤的治疗策略已经示出降低死亡率的希望(The Acute Respiratory DistressSyndrome Network，2000；Frank，Gutierrez，Johnes，Allen，Dobbs， Matthay，2002；Marini，1998；Matthay，Zimmerman，Esmon，等，2003；Ragallar，Richter，2010)，但“保护性通气”不能完全消除VALI。目前用于ARDS的疗法主要针对症状缓解，并且没有一个能够改变疾病进程。ARDS的高死亡率和有效的治疗方案的缺乏表明需要直接针对潜在肺损伤的替代疗法。另外，就我们所知，还没有对于通风引起的细胞损伤的有效治疗。
令人吃惊且意外的是，我们已经发现mitsugumin53(MG53)，肌肉特异性TRIM-家族蛋白(TRIM72)，在骨骼肌中与CaV3形成功能性复合物，并且有助于细胞内囊泡运输、膜融合、胞吐、囊泡出芽和横纹肌细胞的成肌。虽然我们的研究证实，MG53在修复骨骼肌中肌纤维膜的急性损伤中发挥作用，但MG53在心脏中的功能角色是未知的且还不能被合理地预测。
除非另外指出，本文所述的生物聚合体组合物被一般地称为“MG53核酸”或“MG53多核苷酸”，其中任何对应的编码多肽称为“MG53多肽”或“MG53蛋白”。除非另外指出，“MG53”一般用来指任何MG53相关的和/或MG53来源的生物聚合体，如本文中所明确、含蓄或本质地描述的。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与由本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。本文提到的所有公开物、专利申请、专利、以及其他参考文献的全部内容均以其整体通过引用并入。在冲突的情况下，将以本说明书——包括定义——为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的而不用于限制本发明。
响应于外部损伤和内部变性，机体的细胞必须修复每一个单细胞周围的膜以便维持其功能和生物体的健康。细胞修复外膜能力的缺陷或耐氧化应激已经与多种疾病有关，例如神经变性疾病(帕金森病)、心脏病发作、缺血、缺氧、心脏衰竭和肌肉营养不良。此外，与多种疾病相关的肌肉无力和萎缩以及正常衰老过程也与膜修复改变和/或氧化应激有关。而且，膜损伤和氧化应激发生在慢性疾病以外的许多其他病理状态中，例如糖尿病和别的健康方面患者的UV暴露、轻微割伤、皮肤擦伤、手术切口和溃疡、缺血、再灌注、缺氧都涉及到一些细胞膜和氧化应激破坏成分。为了这些细胞响应于急性损伤而修复 其膜，这些细胞利用在细胞内的小膜袋，也称为囊泡。这些囊泡通常存在于细胞内部，但是一旦细胞膜发生损伤，则这些囊泡移至损伤部位并形成膜片以维持细胞完整性。在没有该必要功能的情况下，细胞可能死亡，且这种细胞损伤的累积效应可以最终引起组织或器官的功能障碍。考虑本发明提供组合物和方法，用于治疗和/或预防细胞/组织损伤的有害作用，具体而言，保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤。
如上文所述，在某些方面，本发明涉及MG53核酸、以及从本发明核酸编码的MG53多肽，其可单独地或与其他组分结合，在宽泛范围的细胞和组织类型中调节细胞膜修复过程和保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合以及作为结果可发生的相关病理事件引起的损伤。在某些实施方式中，本发明包括组合物，其包括，例如MG53多肽、编码重组MG53多肽的MG53核酸；以及载体、和包括其的宿主细胞；抗体、假肽、融合蛋白、化合物，以及用于生产这些物质的方法。
在某些方面，本发明还涉及作为治疗和/或预防呼吸系统细胞和/或组织由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤的治疗剂有用的组合物。在某些实施方式中，本发明的此方面包括本发明的组合物连同药学上可接受的赋形剂。本文描述适合用于任何本发明任何实施方式的示例性赋形剂。在某些实施方式中，本发明的组合物可额外地包括另一种生物活性剂，其补充或增强本发明组合物的活性。
在某些实施方式中，本发明治疗性组合物包括MG53多肽、以及编码MG53多肽的核酸，例如SEQ ID NO.1蛋白以及MG53多肽突变体、同系物、片段、截短体、假肽、肽类似物、和肽模拟物，以及核酸(例如，小RNA或反义RNA)、多肽、和可调节MG53活性或MG53与其他受体(即，直接或间接结合或相互作用于蛋白)例如小窝蛋白-3(SEQ ID NO.8)的分子间相互作用的化合物。
在另外的方面，本发明包括结合协作地调节MG53多肽活性的试剂的本发明组合物。在某些实施方式中，调节性试剂包括，例如，磷 脂酰丝氨酸；锌，例如以锌盐、锌载体或锌结合物的形式；三七(notoginsing)；以及氧化剂。
在某些另外的方面，本发明还涉及用于治疗或保护气道细胞和/或组织由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤的方法。在该方面某些示例性实施方式中，本发明包括给予个体有效量本发明的治疗性组合物，其中该组合物对于保护或修复气道细胞和/或组织由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤是有效的。
在另外的方面中，本发明包括用于治疗和/或保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤的方法，其包括对个体进行治疗以及在损伤事件之前、基本同时、或损伤事件之后给予个体有效量本发明的治疗性组合物的步骤。在本发明的该方面的任何实施方式中，该方法还可包括添加调节至少一种MG53结合蛋白诸如但不限于小窝蛋白-3的活性或表达的试剂。
在另外的方面，本发明涉及调节MG53或MG53受体表达的干预和反义核酸。“MG53受体”包括与MG53直接和/或间接相互作用且包括例如小窝蛋白-3(SEQ ID NO.8)、PI3K、Akt、GS3p、和/或ERK1/2的多肽，以及可调节它们的活性或它们与MG53的分子间相互作用的化合物。因此，在另外的方面，本发明包括用于靶向小窝蛋白-3基因表达、活性和/或分子间相互作用的方法，用于治疗和/或预防受治疗者的疾病或病症，例如治疗和/或保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤。
在另外的方面，本发明包括从试剂库中筛选和鉴别作为治疗或保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤的治疗剂有用的试剂的方法。在该方面的某些实施方式中，本发明包括提供化合物库并筛选用于结合、调节MG53和/或CaV3的活性和/或表达，其中该试剂代表作为治疗/预防、和/或研究气道细胞和/或组织由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤有用的治疗剂或 研究工具的候选试剂。根据本发明方法鉴别的具体优选试剂包括对于靶标多肽高度特异性，且因此将具有较少的“脱靶”效应的那些试剂。一般而言，具有微少或非特异性效应的试剂将在体内显示较少的负作用。在某些实施方式中，该试剂是为MG53或CaV3中至少一种的表达、活性和/或磷酸化的激动剂(agonists)的肽、核酸、或化合物。在另一方面，本发明包括这样的试剂，其是为线粒体通透性转换孔(MPTP)的例如磷酸化的表达或活性的拮抗剂的肽、核酸、或化合物。
仍在另外的方面，本发明涉及治疗或保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤的方法，其包括给予有效量MG53或CaV3中至少一种的表达和/或活性的激动剂或线粒体通透性转换孔(MPTP)的表达或活性的拮抗剂。
在某些方面，本发明包括编码多肽的分离或重组的核酸，其包括氨基酸和/或肽组分(即，结构组分或氨基酸结构域)的组合，当该氨基酸和/或肽组分组合在一起时，得到本文所述的具有活性的多肽。在本发明该方面的一个实施方式中，该组分包括环锌指结合结构域(或可选地，环指锌结合结构域)、B-盒结构域、亮氨酸拉链卷曲螺旋结构域、磷脂结合结构域、氧化还原敏感性氨基酸、E3连接酶结构域、以及SPRY结构域，其中所述组分共价邻接于单个多肽中，且其中该多肽促进治疗和/或保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤。编码相应氨基酸或肽结构域的核酸可从任何期望的亲代基因克隆并且使用标准分子生物学技术结合到单个连续中。在另外的实施方式中，本发明包括通过表达基因或cDNA构建体而形成的新型多肽，该构建体通过结合编码来自TRIM家族其他成员的氨基酸或肽组分的核苷酸而构成，其中TRIM家族其他成员例如(按登录号)TRIM1(NM_012216，NM_052817)；TRIM2(AF220018)；TRIM3(AF045239)；TRTM4(AF220023)；TRIM5(AF220025)；TRIM6(AF220030)；TRIM7(AF220032)；TRIM8(AF281046)；TRJM9(AF220036)；TRIM10(Y07829)；TRTM11(AF220125)；TRIM13(AF220127， NM_001007278)；TRIM14(NM_014788，NM_033221)；TRIM15(NM_033229)；TRIM16(AF096870)；TRIM17(AF15627I)；TRIM18(AF230976，AF230977)；TRIM19(NM_033244，NM_033250，NM_033240，NM_033239，NM_033247，NM_002675，NM_033246，NM_033249，NM_033238)；TRIM20(NM_000243)；TRTM21(NM_003141)；TRIM22(NM_006074)；TRIM23(NM_033227，NM_001656，NM_033228)；TRIM24(NM_003852，NM_015905)；TRIM25(NM_005082)，TRIM26(NM_003449)；TRIM27(AF230394，AF230393)；TRIM28(NM_005762)；TRIM29(AF230388)；TRIM31(AF230386)；TRJM32(NMJH2210)；TRIM33(AF220136)；TRIM34(NM_130390，NM_001003827，NM_130389，NM_001003819)；TRIM35(AB029021)；TRIM36(AJ272269)；TRIM37(AB020705)；TRJM38(U90547)；TRIM39(NM_021253，NM_172016)；TRIM40(AF489517)；TRIM41(NM_033549，NM_201627)；TRIM42(AF521868)；TRIM43(NM_138800)；TRIM44(NM_017583)；TRIM45(NM_025188)；TRIM46(NM_025058)；TRIM47(AY026763)；TRIM48(AF521869)；TRIM49(NM_020358)；TRIM50(AY081948)；TRIM51(NM_032681)；TRIM52(NM_032765)；TRIM53(XR_016180)；TRTM54(NM_032546，NM_187841)；TRIM55(NM_184087，NM_184085，NM_184086，NM_033058)；TRIM56(NM_030961)；TRIM57(即，TRIM59)；TRIM58(NM_015431)；TRIM59(NM_173084)；TRIM60(NM_152620)；TRIM61(XM73038)；TRIM62(NM_018207)；TRIM63(NM_032588)；TRIM64(XM_061890)；TRIM65(NM_173547)；TRIM66(XM_001716253)；TRIM67(NM_001004342)；TRIM68(NM_018073)；TRIM69(AF302088)；TRIM70(DQ232882，NM_001037330)；TRIM71(NM_001039111)；TRIM72(即，MG53；NM_001008274)；TRIM73(AF498998)；TRIM74(NM_198853)；TRIM75(XM_939332)。
在另一个实施方式中，本发明包括由本发明的核酸编码的分离的或重组的多肽，其具有环指锌结合结构域、B-盒结构域、亮氨酸拉链卷曲螺旋结构域、磷脂结合结构域、氧化还原敏感性氨基酸、E3连接 酶结构域、SPRY结构域、以及可选的钙结合结构域，其中所述组分共价邻接于单个多肽中，且该多肽促进治疗和/或保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤。
本描述强调了用于产生能够促进治疗和/或保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤的重要氨基酸结构组分或特征(即，环指锌结合结构域、B-盒结构域、亮氨酸拉链卷曲螺旋结构域、磷脂结合结构域、氧化还原敏感性氨基酸、E3连接酶结构域、SPRY结构域)。重要的是注意，虽然环指锌结合结构域、B-盒结构域、亮氨酸拉链卷曲螺旋结构域、磷脂结合结构域、氧化还原敏感性氨基酸、E3连接酶结构域、SPRY结构域、以及钙结合结构域在进化相关蛋白以及无关蛋白之间可能有所不同，但如上所示，存在大量属于TRIM家族的基因，其包括包含上述结构组分或结构域的一种或全部的MG53。如本领域技术人员应当理解的，这些结构域可以易于从TRIM家族成员的基因或cDNA克隆而来，并利用分子生物学中熟知的技术移植或克隆入另一个TRIM家族基因(即MG53)的框架内，以便产生新蛋白。同样，因为通常认为进化保守的氨基酸序列将类似地发挥功能，因此按照本教导产生另外的蛋白、以及评估重组蛋白促进膜修复的能力都在本领域技术人员的能力之内，而无需过多的实验。因此，从TRIM家族成员的结构域组装的重组蛋白，例如上文指出的那些，明确地被考虑在本发明的范围之内。
在另一个实施方式中，本发明包括编码如在SEQ ID NOs.：1、3、5、7、8、9-15中所列出的MG53多肽和/或其同系物或片段的分离的或重组的核酸，其中该多肽治疗和/或保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤。
在另外的方面，本发明涉及包含本发明多肽连同至少一种其他试剂的组合物，其能够促进治疗和/或保护气道细胞和/或组织免于由于肺)受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤。在某些实施方式中，所述试剂通过与本发明的多肽直接或间 接相互作用而协同起作用以促进治疗和/或保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤。例如，诸如磷脂酰丝氨酸、锌、氧化剂和植物提取物的试剂可以调节本发明多肽的膜修复活性。
因此，在另外的实施方式中，本发明涵盖的含肽组合物中的任何一种也可以结合地包含有效量的磷脂；含锌试剂；氧化剂；植物提取物中的至少一种或其组合。在某些实施方式中，磷脂是磷脂酰丝氨酸。在另外的实施方式中，含锌试剂是锌离子载体，例如，Zn-1-羟基吡啶-2-硫酮(Zn-HPT)。在其他实施方式中，氧化剂是硫柳汞。在另外的实施方式中，植物提取物是三七提取物。
在某些另外方面，本发明涉及一种包含本发明的分离的或重组的多肽连同药学上可接受载体的组合物。在另外的实施方式中，该组合物还可以进一步结合地包括有效量的磷脂；含锌试剂；氧化剂；植物提取物中至少一种或其组合。在某些实施方式中，磷脂是磷脂酰丝氨酸。在另外的实施方式中，含锌试剂是锌离子载体，例如，Zn-1-羟基吡啶-2-硫酮(Zn-HPT)。在其他实施方式中，氧化剂是硫柳汞。在另外的实施方式中，植物提取物是三七提取物。
本发明也涉及惊人和意外发现了本发明多肽可促进治疗和/或保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤。不限于任何特定理论，认为修复机制经由蛋白中的卷曲螺旋结构域，通过多肽寡聚体如二聚体的氧化性诱导形成而介导，该卷曲螺旋结构域包含亮氨酸拉链蛋白-蛋白相互作用基序。
目前的结果表明本发明的多肽如MG53的活性主要由氧化性细胞外环境内流入细胞区室内的还原环境诱导。该机制允许多肽作为细胞氧化还原状态的感受器发挥作用，并通过与细胞膜的特异性脂质组分相互作用而在质膜处寡聚化以形成同源性复合物。例如在在先申请中描述的，锌(Zn)对于MG53介导的膜重封来说是必需的，另外的Zn的存在可以提高MG53的活性；来自植物三七的提取物也可提高MG53在膜重封方面的功能；MG53需要其内源性E3连接酶活性以产生急性损伤后的膜修复。因此，一种或多种这些活性可能对于介导治 疗和/或保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤是重要的。
本发明另外的方面涉及惊人的发现，细胞外施加或给予本发明多肽也是有效的。适合细胞外施予的多肽包括，例如，MG53，MG53融合蛋白，例如，与细胞穿透肽融合的MG53，例如，HTV-TAT蛋白(参见WO 2008/054561，其通过参考并入本文)。这样，该方面的某些实施方式包括治疗性组合物，其包含本发明的多肽例如MG53，结合药学上可接受载体，其中该治疗性组合物全身性给予，并且其中该全身性给予的组合物在促进治疗和/或保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤是有效的。
在某些另外的实施方式中，本发明的治疗性组合物结合本发明的多肽，进一步包含一种或多种另外的组分，包括磷脂；含锌试剂；氧化剂；植物提取物或其组合，其对本发明多肽的活性具有协同效应。在另外的实施方式中，本发明的治疗剂可以包含一种或多种生物学活性成分，诸如镇痛药、抗酸药、抗焦虑药、抗心律不齐药、抗菌剂、抗生素、抗凝剂和溶栓剂、抗惊厥药、抗抑郁剂、止泻剂、止吐药、抗真菌药、抗组胺剂、抗高血压药、消炎药、抗肿瘤药、抗精神病药、解热药、抗病毒药、巴比妥酸盐、β-阻滞剂、支气管扩张药、感冒药、皮质类固醇、镇咳剂、细胞毒素药、解充血药、利尿药、祛痰药、激素、降血糖药(口服)、免疫抑制剂、缓泻药、肌肉松弛剂、镇静剂、性激素、安眠药、镇静剂、维生素或其组合。
在另外的方面，本发明涉及治疗和/或保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤的方法，其包括给予个体有效量编码本发明多肽例如MG53、同系物、片段及其衍生物的核酸的步骤，其中该多肽在体内或体外治疗和/或保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤方面是有效的。在另外的方面，本发明涉及治疗和/或预防疾病或病症的方法，涉及治疗和/或保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤，该方法包 括给予个体有效量包括编码本发明多肽例如MG53、同系物、片段及其衍生物的核酸结合药学上可接受载体的组合物，其中该组合物在治疗和/或预防细胞心肌细胞或组织损伤方面是有效的。在某些实施方式中，疾病或病症涉及治疗和/或保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤。
在本文描述的任何方法中，本发明核酸或多肽可以任何药学上可接受形式和以任何下文详细描述的药学上可接受途径递送或给予。例如，包括本发明核酸和/或多肽的组合物可全身递送或直接给予细胞或组织用于治疗和/或预防肺细胞或组织损伤。在某些另外的实施方式中，本发明核酸和/或多肽包括提高生物可利用度、药物半衰期、功效或效力的载体部分。
在另外的方面，本发明涉及分离的或重组的膜修复多肽复合物。如下文详细示出的，MG53多肽表现出与多种其他细胞蛋白尤其是CaV3直接或间接相互作用(例如，以非共价键结合)并形成复合物的能力。在该方面的实施方式中，本发明包括重组嵌合核酸，其在单个可读框中包括编码MG53多肽的多核苷酸，其在连续核酸中连接至编码另一种多肽例如CaV3的另一种多核苷酸。在另外的实施方式中，嵌合体可包括多个多核苷酸，其编码包括在单个可读框内的MG53、CaV3或其他连接在单个连续核酸中的蛋白的任意组合。翻译导致MG53和/或CaV3中一种或多种的含单个多肽功能结构域，其中该嵌合蛋白复合物能够促进治疗和/或保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤。本发明进一步包括治疗和/或保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤的方法，其包括给予细胞有效量编码本发明嵌合多肽的核酸，其中该复合物能够治疗和/或保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤。仍在另外的实施方式中，本发明包括治疗或预防与细胞或组织损伤相关的疾病或病症的方法，其包括给予个体有效量本发明分离的嵌合多肽，其中该嵌合多肽复合物能够改善疾病或病症的影响。
在另外的方面，本发明涉及治疗和/或保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤的方法，其包括调节MG53和CaV3中至少一种的表达水平或活性。
仍在另外的方面，本发明涉及通过使MG53或CaV3中至少一种与测试化合物接触；以及测量测试化合物的结合，和/或MG53或CaV3的活性，和/或测量对气道细胞和/或组织由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤的效果来筛选对于治疗和/或保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤有效的化合物的方法。如下文详细描述的，以及如本领域中技术人员所易于理解的，重组的膜修复多肽可以在原核细胞或真核细胞例如哺乳动物细胞中生成，然后通过蛋白质工程分泌入细胞外溶液中，这是一种应生成大量功能蛋白的途径。
另外，本发明涉及核酸，包括干扰性核酸，其与编码MG53或CaV3的核酸、其突变体、截短体、片段、及同系物杂交，用于治疗和/或保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤。在本文所述的任何一个实施方式中，治疗性组合物可以如本文所述或如本领域中众所周知的任何适当的药物形式给予。
在一个方面，本发明提供编码多肽分子例如MG53基因杂交核酸分子的分离核酸以及编码与SEQ ID NOS：2、4和6中所公开核酸具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％同一性的MG53多肽的核酸。在某些实施方式中，本发明的分离核酸分子将在严格条件下杂交于与包括MG53核酸序列的蛋白编码序列的核酸分子互补的核酸序列。本发明还包括一种编码MG53多肽或其片段、同系物、类似物、融合蛋白、或衍生物的分离核酸。例如，该核酸可编码与包括SEQ IDNOS：1、3、5、7、8和9-15的氨基酸序列的多肽至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％同一性的多肽。该核酸可以为例如包括SEQ ID NOS：2、4和6中任何一个的核酸序列的基因组DNA片段或cDNA分子。
本发明还包括一种寡核苷酸，例如包括MG53核酸(例如SEQ IDNOS：2、4和6)中至少6个连续核苷酸的寡核苷酸或所述寡核苷酸的互补物。
本发明还包括基本上纯化的多肽，例如MG53多肽(SEQ IDNOS：1、3、5、7、8和9-15)。在某些实施方式中，多肽例如MG53多肽包含与人MG53多肽(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列。
另外，本发明包括包含有效量在肺细胞中调节MG53活性、MG53表达或MG53信号级联中至少一个的试剂的治疗性组合物在制备用于治疗和/或保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤的药物方面的应用。该治疗性组合物的应用包括从0.1mg/kg和1000mg/kg体重/天的有效量。
在某些实施方式中，该治疗剂是MG53多肽；MG53受体多肽；编码MG53多肽的核酸；编码MG53受体多肽的核酸；对于编码MG53、MG53受体、小窝蛋白-3的核酸特异性的抑制性或反义RNA，或MG53、MG53受体、或小窝蛋白-3的激动剂或拮抗剂中的至少一种。在某些实施方式中，MG53活性的激动剂包括磷脂酰丝氨酸、锌或锌盐、Zn-1-羟基吡啶-2-硫酮(Zn-HPT)、三七、氧化剂、硫柳汞中至少一种，或其组合。该多肽可具有SEQ ID NOs.：1、3、5、9、10、11、12、13、14、15、或16的至少一种的氨基酸序列或其生物活性部分。
仍在其他的实施方式中，该试剂是能够分化为肺细胞的干细胞，并且其中该干细胞已经被修饰使得其显示提高的MG53活性或表达。该治疗性组合物可进一步包括药学上可接受的载体或赋形剂。在某些实施方式中，损伤包括治疗和/或保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤。
在另一个实施方式中，本发明还包括包含有效量MG53多肽或MG53核酸的治疗性组合物在制备用于治疗和/或保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合的损伤引起的药物方面的应用。
本发明特征还在于免疫选择性结合于多肽例如MG53多肽或其片段、同系物、类似物、假肽、肽模拟物或衍生物的抗体。
在另一方面，本发明包括药物组合物，该药物组合物包括治疗或预防有效量的治疗剂和药学上可接受载体。所述治疗剂可以为核酸例如MG53核酸，如肽核酸、cDNA或RNA如小抑制性RNA；膜修复多肽例如MG53；或对MG53多肽特异的抗体。在进一步方面，本发明包括在一个或多个容器中的治疗或预防有效量的该药物组合物。
在进一步方面，本发明包括通过在适于表达由DNA编码的多肽的条件下培养包含内源性或外源性表达的编码膜修复多肽的核酸例如MG53核酸的细胞而生成多肽的方法。如果需要，随后可回收该多肽。
仍在另一方面，本发明包括一种通过培养包含编码多肽的内源性核酸例如MG53核酸——分布于外源性启动子上游或下游——而生成多肽的方法。在某些实施方式中，该外源性启动子通过同源重组、链断裂或错配修复机制而整合入宿主细胞的基因组中。
在另一个方面，本发明包括一种检测样品中多肽如MG53多肽存在的方法。在该方法中，使样品与适于在多肽与化合物之间形成复合物条件下选择性结合于多肽的化合物相接触。如果存在，则检测该复合物，从而鉴定样品中的膜修复多肽例如MG53多肽。
本发明还包括基于其表达编码本发明多肽例如MG53多肽或其相关融合多肽的核酸而鉴定特定细胞或组织类型的方法。例如，在某些实施方式中，本发明包括含“标签”或指示剂部分和例如MG53部分的融合蛋白。在某些方面，该标签或指示剂部分可以为适合于纯化目的的肽，例如FLAG标签、6xHis标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签等。在其他方面，标签肽包括适合于提供信号的肽，如抗体表位或荧光肽。其他的方面还包括MG53与适合于介导亚细胞定位或跨细胞膜易位的肽的融合，例如来自HIV病毒的TAT融合蛋白，以促进细胞通透性或细胞定位改变的标签以将MG53耦联至特定细胞的细胞器。
本发明还包括通过使样品与核酸探针或引物相接触并检测核酸探针或引物是否结合于编码例如MG53多肽的核酸而检测样品中本发明的核酸分子存在的方法。
在进一步方面，本发明提供通过使包括MG53多肽的细胞与结合于MG53多肽的化合物以足以调节所述多肽的活性的量接触而调节本发明多肽例如MG53多肽的活性的方法。该化合物可以为例如小分子如核酸、肽、多肽、肽模拟物、碳水化合物、脂质或者其他有机(含碳)或无机分子，如下文进一步描述的。
本发明的治疗剂在制备用于治疗或预防疾病或综合征的药物中的应用也在本发明的范围之内，所述疾病或综合征包括例如心血管疾病、心肌病、动脉粥样硬化、高血压、先天性心脏缺损、主动脉瓣狭窄、房间隔缺损(ASD)、房室(A-V)管缺损、动脉导管、肺动脉狭窄、主动脉狭窄(subaortic stenosis)、室间隔缺损(VSD)、瓣膜病、高凝血症、缺血/再灌注损伤、缺氧损伤、氧化性损伤、老年性组织变性、手术相关损伤、心脏衰竭、由心脏衰竭和高血压引起的继发性病状、低血压、心绞痛、心肌梗塞、结节性硬化症、心脏病发作、心脏衰竭、肌肉营养不良、中风、和/或其它病症和类似的疾病。
在某些实施方式中，本发明的治疗性组合物包括例如编码MG53的核酸；结合编码MG53的核酸的核酸；MG53多肽、基于其的肽类似物、假肽或肽模拟物；MG53或MG53蛋白-蛋白相互作用的小分子调节剂；或MG53特异性抗体或其生物活性衍生物或片段。如本文所述，MG53介导治疗和/或保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤。因此，针对这些核酸、多肽和其同系物的表达和/或活性将允许与肺损伤相关的多种急性和慢性疾病和病症的新型治疗。
仍在其他的实施方式中，本发明包括作为手术佐剂有用的治疗性组合物。在本文所述的任何一个实施方式中，本发明的手术佐剂组合物可以作为一种独立的治疗剂直接地使用或施加至手术部位，或者其可整体地与手术或医疗器械结合，例如本发明的治疗剂可以结合至(conjugate)基于聚合物的支架(stent)、管或其他可植入性设备，使得该治疗剂以可控方式扩散入作用部位，以加速愈合和/或将来自侵入性手术操作的创伤降到最低。在另一个实施方式中，本发明的治疗性组合物作为例如医疗设备的膜或涂层而应用，使得该治疗剂扩散入血流或周围组织和/或衰减，从而直接递送至组织损伤部位；将由于应用手 术器具或方法而导致的损伤量降到最低或有所缓解。
在本发明的任何方面，本发明的治疗性组合物可以为任何药学上可接受的形式并通过任何药学上可接受的途径给予，例如该治疗性组合物可以作为口服剂型每天单次剂量或单元剂型给予，用于治疗和/或保护气道细胞和/或组织免于由于肺受伤或潜在呼吸系统并发症、心血管或感染性疾病或任何其组合引起的损伤。这些药学上可接受的载体和赋形剂以及给药方法对于本领域技术人员来说是显而易见的，且包括USP-NF2008(美国药典/国家药品集)中描述的组合物和方法，USP-NF2008以其整体通过引用并入本文。
术语“药学或药理学上可接受的”指当合适时给予动物或人时不产生不良、过敏或其他不适当反应的分子实体和组合物。如本文中所使用的，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗菌药以及抗真菌剂、等渗剂以及吸收延迟剂等。药学活性物质的这些介质和试剂的用途在本领域中是熟知的。除非任何常规的介质或药剂与活性组分不相容，否则考虑其用于治疗性组合物。辅助的活性组分也可以加入到组合物中。
通常将活性化合物配制用于肠外给药，例如配制用于通过静脉内、关节内、鞘内、肌内、皮下、病灶内或甚至腹膜内途径进行注射。根据本发明公开内容，对于本领域技术人员来说，制备包含标志物抗体、结合物、抑制剂或其他作为活性组分或成分的试剂的水性组合物将是已知的。典型地，这样的组合物可以制备成注射剂——作为液态溶液或悬浮液；还可以制备成适合用来在注射前加入液体后制备溶液或悬浮液的固态形式；还可以将该制剂乳化。
另外，本发明涉及核酸，包括干扰性核酸，和编码膜修复相互作用蛋白和/或MG53相互作用蛋白的多肽、及其同系物；假肽和肽模拟物；以及可调节膜修复多肽或MG53的活性或其分子间相互作用的化合物。
例如，本发明的组合物将具有治疗患有上文所公开的疾病和病症和/或其他类似病状和病症的患者的效果。该多肽可以用作生成特异于本发明的抗体的免疫原以及用作疫苗。它们还可以用来筛选潜在的激动剂和拮抗剂化合物。此外，当给予需要其的受治疗者时，编码本发 明多肽如MG53或CaV3的cDNA可能在基因治疗方面是有用的。非限制性实例是，本发明的组合物将具有治疗患有上文所公开的疾病和病症和/或其他类似症状和病症的患者的效果。
本发明进一步包括一种用于筛选病症或综合征的诱因(predisposition)的方法，该病症或综合征包括例如上文所公开疾病和病症和/或其他类似的病状和病症。该方法包括使测试试剂与核酸或编码MG53或CaV3的多肽相接触，并测定该测试试剂是否结合于所述靶标。测试试剂与核酸或编码MG53或CaV3的多肽的结合表示该测试化合物是一种活性调节剂，或对于上述病症或综合征的潜伏期或诱因的调节剂。
也在本发明的范围之内的是一种用于筛选活性调节剂，或对于包括例如上文所公开的疾病和病症和/或其他类似症状和病症的病症或综合征的潜伏期或诱因的调节剂的方法，该方法通过将测试化合物给予处于上述病症或综合征增加风险的测试动物。该测试动物表达由本发明的核酸编码的重组多肽。随后检测测试动物内本发明多肽的表达或活性以及对照动物内蛋白的表达或活性，所述对照动物重组性表达本发明的多肽，但对于该病症或综合征没处于增加的风险。接下来，比较测试动物和对照动物内本发明多肽的表达。该多肽在测试动物内相对于对照动物内的活性变化表示该测试化合物是该病症或综合征潜伏期的调节剂。
在又一个方面，本发明包括用于测定受治疗者(例如人受治疗者)中与核酸或用于MG53或CaV3的多肽的功能失调的水平或水平改变相关的疾病的存在或对于所述疾病的诱因的存在的方法。该方法包括检测来自受治疗者的测试样品内核酸或用于MG53或CaV3的多肽量以及比较测试样品内该核酸或多肽的量和对照样品内存在的该核酸或多肽的量。与对照样品相比较，测试样品内该核酸或多肽水平的改变表示受治疗者中疾病的存在或对于该疾病的诱因存在。优选地，所述诱因包括例如上文公开的疾病和病症和/或其他类似病状和病症。而且，本发明新的多肽的表达水平也可用于一种筛查多种病症以及测定特定病症阶段的方法中。
在又一个方面，本发明可以通过本领域中通常采用的多种技术中 任何一种用于等同于本发明的MG53细胞受体和下游效应子的方法中。这些方法包括但不限于双杂交系统、亲和纯化、与抗体或其他特异性相互作用分子的共沉淀。
如本文中使用的，术语“拮抗剂”通常用来指能够直接或间接抑制表达、翻译和/或活性的试剂。此外，如本文中使用的，“MG53受体”通常涉及能够经受结合于MG53蛋白的任何蛋白或其片段。在某些方面，MG53活性的调节通过例如下述来实现，采用或调节如MG53结合伴侣，即直接或间接结合于MG53并提高或中和其生物学活性，包括如中和结合并破坏MG53或CaV3活性或分子间相互作用的抗MG53抗体、小窝蛋白-3、抗小窝蛋白-3抗体、假肽、肽类似物或肽模拟物的因子；或采用源自MG53或CaV3基因的核苷酸序列，包括编码、非编码、和/或调节性序列，以通过例如反义、核酶、和/或三链螺旋法调节表达。
在另一个方面，本发明特征在于一种核酸分子例如诱饵RNA、dsRNA、siRNA、shRNA、微小RNA、适配体(aptamer)、反义核酸分子，其下调编码MG53蛋白和/或MG53受体如小窝蛋白-3的序列的表达。在另一个实施方式中，本发明的核酸分子具有内切核酸酶活性，或是核酸酶复合体的一个组分，并且切割MG53和/或CaV3mRNA。
在一个实施方式中，本发明的核酸分子包含在12至100个之间的互补于具有编码选自MG53或CaV3组的成员的核酸序列的RNA的碱基。在另一个实施方式中，本发明的核酸分子包含在14至24个之间的互补于具有编码选自MG53或CaV3组的成员的核酸序列的RNA的碱基。在本文描述的任何一个实施方式中，该核酸分子可以按照本领域中熟知的方法进行化学合成。
在另一个方面，本发明提供一种试剂盒，该试剂盒包括一种适合的容器，设置于该容器中的能够以药学上可接受的形式抑制膜修复多肽活性、表达或结合的活性剂，以及其使用的说明书。
在另一个方面，本发明涉及用于诊断或监测病症或疾病或发展的方法，包括通过检测选自MG53或CaV3组的成员的表达水平来检测与该疾病相关的膜修复基因例如MG53基因中核苷酸多态性的存在。
已经鉴定了与疾病严重性相关的多态性。(参见，Zhong等， Simultaneous detection of microsatellite repeats and SNPs in themacrophage migration inhibitory factor gene by thin-film biosensor chipsand application to rural field studies.Nucleic Acids Res.2005Aug2；33(13)：el21；Donn等，A functional promoter haplotype of macrophagemigration inhibitory factor is linked and associated with juvenileidiopathic arthritis.Arthritis Rheum.2004May；50(5)：1604-10；出于所有目的将其全部内容通过引用并入文)。“MG53或MG53受体基因”包括5′UTR、3′UTR、启动子序列、增强子序列、基因的内含子和外显子DNA以及mRNA或cDNA序列。
如本领域普通技术人员将理解的，与组织修复病症相关的MG53或MG53受体基因多态性并因此根据本发明的方法可用作诊断标志物可以在之前指出的的任何一个核酸区域中出现。用于鉴定和检测多态性的技术在本领域中是已知的，并在Wohlgemuth的美国专利6,905,827中被详细讨论，出于所有目的将其整体通过引用并入本文。
本发明的某些方面包括利用一种或多种DNA分子检测基因表达或多态性的方法，其中一种或多种DNA分子具有检测与序列表中描述的寡核苷酸对应的基因表达的核苷酸序列。在一种形式中，寡核苷酸检测差异表达的基因的表达。该基因表达系统可以为候选库、诊断试剂、诊断性寡核苷酸组或诊断性探针组。DNA分子可以为基因组DNA、RNA、蛋白核酸(PNA)、cDNA或合成的寡核苷酸。按照本文教导的步骤，可以鉴定用于分析基因表达或多态性的感兴趣序列。这样的序列可以预测疾病状态。
本发明的寡核苷酸
如本文中使用的，术语“核酸分子”用来包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA)、利用核苷酸类似物及其衍生物、片段和同系物生成的DNA或RNA类似物。核酸分子可以为单链或双链，但优选为包含双链DNA。
在某些方面，本发明涉及诊断性寡核苷酸和诊断性寡核苷酸组，对其而言，个体健康状态与该个体对应于核苷酸序列的RNA或蛋白产物的表达之间存在关联性。在某些情况下，仅一种寡核苷酸对于这种检测是必需的。诊断性寡核苷酸组的成员可以通过能够检测RNA 或蛋白产物表达或多态性的任何方式进行鉴定，包括但不限于差异表达筛选、PCR、RT-PCR、SAGE分析、高通量测序、微阵列、液体或其他阵列、基于蛋白的方法(例如，蛋白质印迹、蛋白质组学、质谱分析、和本文中描述的其他方法)、以及数据挖掘方法，如本文进一步描述的。
在本发明的上下文中，核酸和/或蛋白可按照熟知的分子生物学技术进行处理。在例如Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology(supplemented through2000)John Wiley&Sons，New York(″Ausubel′′)；Sambrook等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(2ndEd.)，Vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989(″Sambrook″)，和Berger以及Kimmel Guide to MolecularCloning Techniques，Methods in Enzymology volume152AcademicPress，Inc.，San Diego，Calif.(″Berger″)中描述了多种这些方法的详细规程。
下文对不同方面和实施方式的描述参照本发明的示例性核酸而提供。然而，不同方面和实施方式也针对编码其他膜修复蛋白、膜修复多肽结合蛋白、和膜修复多肽受体基因的同系物、直系同源和旁系同源的基因，且包括所有的异构体、剪切变异体和多态性。可利用所述用于MG53和MG53受体蛋白、和/或基因的方法分析那些另外的基因的靶位点。因此，其他基因的抑制以及这样的抑制效果可以如本文所描述的而实施。
“下调”是指基因的表达、或者RNA或编码一种或多种蛋白的等效RNA的水平、或者一种或多种蛋白的活性降低至在本发明的核酸分子不存在的情况下观察到表达、水平或活性以下。在一个实施方式中，利用酶性核酸分子进行抑制或下调优选低于在酶失活或减弱分子存在的情况下观察到的水平，该分子能够结合于靶RNA上相同的位点但不能切割该RNA。在另一个实施方式中，用反义寡核苷酸进行抑制或下调优选低于在例如具有错乱序列或具有错配的寡核苷酸存在的情况下观察到的水平。在另一个实施方式中，在核酸分子存在的情况下，利用本发明核酸分子抑制或下调基因大于其核酸分子不存在的情况。
“上调”是指基因的表达、或者RNA或编码一种或多种蛋白亚单位的等效RNA的水平、或者一个或多个蛋白亚单位的活性高于本发明的核酸分子不存在的情况下观察到的表达、水平或活性。例如，可以增加基因的表达以便治疗、预防、改善或调节由于基因表达缺失或水平较低引起或加剧的病理状态。在一个实施方式中，本发明涉及通过上调MG53和/或MG53受体基因的表达、和/或活性来用于治疗或预防心肌组织的缺血再灌注或缺氧损伤的方法。
“调节”是指上调或下调基因的表达、或者RNA或编码一种或多种蛋白的等效RNA的水平、或者一种或多种蛋白的活性，使得表达、水平或活性高于或低于本发明的核酸分子不存在情况下观察到的表达、水平或活性。
“基因”是指编码RNA的核酸，例如包括但不限于编码多肽的节段的核酸序列。
“互补性”是指通过常规Watson-Crick或其他非常规类型核酸与另一个RNA序列形成氢键的能力。
“RNA”是指包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”或“2′-OH”是指在D-呋喃核糖部分的2′位处具有羟基的核苷酸。
“核苷酸”是指在与磷酸化蔗糖的N-糖苷键合中的杂环含氮碱基。本领域中认为核苷酸包括天然碱基(标准的)、以及本领域中熟知的修饰碱基。这样的碱基通常定位于核苷酸糖部分的1′位。核苷酸通常包括一个碱基、糖、和一个磷酸盐基团。核苷酸在糖、磷酸盐和/或碱基部分可以为非修饰或修饰的，(也可互换称为核苷酸类似物、修饰的核苷酸、非天然核苷酸、非标准核苷酸等；参见例如Usman和McSwiggen，见上文；Eckstein等人，国际PCT公开号WO92/07065；Usman等人，国际PCT公开号WO93/15187；Uhlman&Peyman，上述所有文献均通过引用并入本文)。存在本领域中已知的修饰核酸碱基的几个实例，如Limbach等，1994，Nucleic Acids Res.22，2183所总结的。可以引入核酸中的化学修饰和其他天然核酸碱基的一些非限制性实例包括例如肌苷、嘌呤、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2，4，6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二羟尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5-烷基尿核苷(例如，核糖 胸核苷(胸腺嘧啶核糖核苷，ribothymidine))，5-卤代尿苷(例如，5-溴尿苷)或6-氮杂嘧啶或6-烷基嘧啶(例如，6-甲基尿苷)、丙炔、辫苷(quesosine)、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、怀丁苷(wybutosine)、假尿苷(wybutoxosine)、4-乙酰胞嘧啶核苷、5-(羧基羟甲基)尿苷、5′-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿苷、β-D-半乳糖辫苷(galactosylqueosine)，1-甲基腺苷、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟苷、3-甲基胞苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿苷、5-甲氨基甲基尿苷、5-甲羰基乙基尿苷(5-methvlcarbonyhnethyluridine)，5-甲氧基尿苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、β-D-marmosylqueosine、尿苷-5-氧基乙酸、2-硫代胞苷、苏氨酸衍生物等(Burgin等，1996，Biochemistry，35，14090；Uhlman&Peyman，见上文)。
在该方面中“修饰的碱基”是指除在1′位的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶之外的核苷酸碱基或其等价物；这种碱基可用于任何位置处，例如在酶性核酸分子的催化核心内部和/或在核酸分子的底物结合区内。
“反义核酸”是指一种通过RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-PNA(蛋白核酸；Egholm等，1993Nature365，566)相互作用结合于靶RNA并改变靶RNA活性(综述参见Stein和Cheng，1993Science261，1004和Woolf等，美国专利号5,849,902)的非酶核酸分子。通常，反义分子沿着该反义分子的单一连续性(contiguous sequence)序列互补于靶序列。然而，在某些实施方式中，反义分子可以结合于底物，使得该底物分子形成环或发夹，和/或反义分子可以结合使得该反义分子形成环或发夹。因此，该反义分子可以互补于两个(或者，甚至多个)非连续性(non-contiguous)底物序列，或者反义分子的两个(或者，甚至多个)非连续性序列部分可以互补于靶序列，或者两种情况均存在。关于目前反义策略的综述，参见Schmajuk等，1999，J.Biol.Chem.，274，21783-21789，Delihas等，1997，Nature，15，751-753，Stein等，1997，Antisense N.A.Drug Dev.，7，151，Crooke，2000，MethodsEnzymol.，313，3-45；Crooke，1998，Biotech.Genet.Eng.Rev.，15，121-157，Crooke，1997，Ad.Pharmacol，40，1-49，其中每个都以其整 体通过引用并入本文。此外，反义DNA可以用来通过DNA-RNA相互作用而靶向RNA，从而激活RNase H，其消化双链体(duplex)中的靶RNA。反义寡核苷酸可以包含一个或多个RNAse H激活区，其能够激活RNAse H对靶RNA的切割。反义DNA可以化学地合成或通过采用单链DNA表达载体或其等价物进行表达。
长双链RNA(dsRNA；通常＞200nt)可以用来沉默(抑制，silence)多种生物和细胞类型(例如，蠕虫，果蝇和植物)中的靶基因的表达。引入后，该长dsRNA进入通常称为RNA干扰(RNAi)通路的细胞通路。首先，dsRNA通过称为Dicer的RNase III样酶(起始步骤)加工成为20-25个核苷酸(nt)小干扰RNA(siRNA)。随后，siRNA组装成含核糖核酸内切酶的复合物，称为RNA诱导的沉默复合物(RISCs)，在该过程中发生解链。siRNA链随后引导RISCs至互补性RNA分子，其中其切割并破坏同源RNA(效应步骤)。同源RNA的切割发生于通过siRNA链结合的区域的中间附近。在哺乳动物细胞内，长dsRNA(＞30nt)的引入启动了有效的抗病毒反应，这通过蛋白合成和RNA降解的非特异性抑制示例。然而，该哺乳动物的抗病毒反应可通过siRNA的引入或表达而避免。
将dsRNA注射并转染入细胞和生物体内是siRNA递送的主要方法。尽管该沉默效应持续若干天，且的确转移至子代细胞，但最终的确消失了。然而，最近多个研究组已经研发了在瞬时和稳定转染的哺乳细胞内持续表达siRNA的表达载体。(参见，例如Brummelkamp TR，Bernards R，and Agami R.(2002).A system for stable expression of shortinterfering RNAs in mammalian cells.Science296：550-553；Lee NS，Dohjima T，Bauer G，Li H，Li M-J，Ehsani A，Salvaterra P，and Rossi J.(2002).Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-I revtranscripts in human cells.Nature Biotechnol.20：500-505；Miyagishi M，以及Taira K.(2002).U6-promoter-driven siRNAs with four uridine3′overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammaliancells.Nature Biotechnol.20：497-500；Paddison PJ，Caudy AA，BernsteinE，Hannon GJ，and Conklin DS.(2002).Short hairpin RNAs(shRNAs)induce sequence-specific silencing in mammalian cells.Genes&Dev. 16：948-958；Paul CP，Good PD，Winer I，以及Engelke DR.(2002).Effective expression of small interfering RNA in human cells.NatureBiotechnol.20：505-508；Sui G.Soohoo C，Affar E-B，Gay F，Shi Y，Forrester WC，以及Shi Y.(2002).A DNA vector-based RNAitechnology to suppress gene expression in mammalian cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA99(6)：5515-5520；Yu J-Y，DeRuiter SL，和Turner DL.(2002).RNA interference by expression of short-interfering RNAs andhairpin RNAs in mammalian cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA99(9)：6047-6052，其以其整体通过引用并入本文)。
“载体”是指用来递送所需核酸例如，细菌质粒、病毒核酸、HAC，BAC等的任何核酸基技术。
本发明的核酸分子，可单独地或者与其他药物联合或结合而用来治疗上文讨论的疾病或病症。例如，如对于本领域技术人员来说很显而易见的是，在适合于治疗的条件下，单独地或与一种或多种药物结合可治疗受治疗者、或者可治疗其他适当的细胞。
“双链RNA”或“dsRNA”是指与预定基因序列相匹配的双链RNA，该预定基因序列能够激活可降解该基因相应信使RNA转录体的细胞酶。这些dsRNA称为小干扰RNA(siRNA)，且可用来抑制基因表达(参见例如Elbashir等，2001，Nature，411，494-498；和Bass，2001，Nature，411，428-429)。如本文中使用的，术语“双链RNA”或“dsRNA”是指能够进行RNA干扰“RNAi”的双链RNA分子，包括小干扰RNA“siRNA”，参见例如Bass，2001，Nature，411，428-429；Elbashir等，2001，Nature，411，494-498；以及Kreutzer等，国际PCT公开号WO00/44895；Zernicka-Goetz等，国际PCT公开号WO01/36646；Fire，国际PCT公开号WO99/32619；Plaetinck等，国际PCT公开号WO00/01846；Mello和Fire，国际PCT公开号WO01/29058；Deschamps-Depaillette，国际PCT公开号WO99/07409；和Li等，国际PCT公开号WO00/44914。
如本文中使用的，“细胞”以其通常的生物学意义应用，不是指整个多细胞生物体。细胞可以为例如体内、体外或离体地，例如在细胞培养物中，或存在于多细胞生物体，包括例如鸟、植物和哺乳动物 如人、母牛、羊、猿、猴、猪、狗和猫中。细胞可以为原核(如细菌细胞)或真核细胞(如哺乳动物或植物细胞)。
寡核苷酸(例如：反义，GeneBlocs)利用本领域中已知的规程而合成，如Caruthers等，1992，Methods in Enzymology211，319，Thompson等，国际PCT公开号WO99/54459，Wincott等，1995，Nucleic AcidsRes.23，26772684，Wincott等，1997，Methods Mol.Bio.，74，59，Brennan等，1998，Biotechnol Bioeng.，61，3345，和Brerman，美国专利号6,001,311中所描述的。所有这些参考文献通过引用并入本文。在一个非限制性实例中，在394Applied Biosystems公司合成器上进行小规模合成。可选地，本发明的核酸分子可以分别合成并在合成后接合在一起，例如通过连接(Moore等，1992，Science256，9923；Draper等，国际PCT公开号WO93/23569；Shabarova等，1991，Nucleic AcidsResearch19，4247；Bellon等，1997，Nucleosides&Nucleotides，16，951；Bellon等，1997，Bioconjugate Chem.8，204)。
本发明的核酸分子可以通过用抗核酸酶的基团如2′-氨基、2′-C-烯丙基、2′-氟、2′-O-甲基、2′-H的修饰来广泛地修饰以增强稳定性(综述参见Usman and Cedergren，1992，TIBS17，34；Usman等人，1994，Nucleic Acids Symp.Ser.31，163)。
尽管用硫代磷酸酯、硫代磷酸酯、和/或5′-甲基膦酸酯键合进行寡核苷酸的核苷酸间键合的化学修饰可增强稳定性，但这些修饰太多可能会引起某些毒性。因此，当设计核酸分子时，应该将这些核苷酸间键合的量减到最少。这些键合浓度的降低应该减弱毒性，使得这些分子的效能增强以及特异性较高。
提供了具有可保持或增强活性的化学修饰的核酸分子。这些核酸通常还比未修饰的核酸更能抗核酸酶。优选核酸分子可抗核酸酶，以便作为有效的细胞内治疗剂而起作用。RNA和DNA化学合成的改善(Wincott等，1995Nucleic Acids Res.23，2677；Caruthers等，1992，Methods in Enzymology211，3-19，通过引用并入本文)已经通过引入核苷酸修饰扩大了修饰核酸分子的能力以增强其核酸酶稳定性，如上文所述。使用本发明的核酸基分子可以通过提供结合治疗(例如，多种反义或酶性核酸分子靶向不同基因、核酸分子与已知小分子抑制剂 耦联、或者利用分子和/或其他化学或生物分子间断性治疗)的可能性而导致更好地治疗疾病进展。用核酸分子治疗受治疗者还可以包括不同类型核酸分子的组合。
在一个实施方式中，本发明表征了含磷酸盐骨架修饰的修饰核酸分子，该磷酸盐骨架修饰包括一个或多个硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、吗啉代、酰胺化氨基甲酸盐(Mamidate carbamate)、羧甲基、乙酰亚胺盐(acetamidate)、聚酰胺、磺酸盐、磺酰胺、氨基磺酸盐、甲缩醛(formacetal)、硫甲缩醛(thioformacetal)、和/或烷基甲硅烷基、取代物(substitution)。关于寡核苷酸骨架修饰的综述，参见Hunziker和Leumann，1995，Nucleic Acid Analogues：Synthesis andProperties，in Modern Synthetic Methods，VCH，331417，和Mesmaeker，1994，Novel Backbone Replacements for Oligonucleotides，inCarbohydrate Modifications in Antisense Research，ACS，2439。这些参考文献均结合于此供参考。可对核酸(例如，反义和核酶)结构进行多种修饰以增强这些分子的效用。例如，这样的修饰可以提高保质期、体外半衰期、生物可利用度、稳定性、以及将这样的寡核苷酸引入至靶部位的容易度，包括例如增强对细胞膜的通透并赋予识别和结合至靶细胞的能力。
核酸分子的给予。用于递送核酸分子的方法在Akhtar等，1992，Trends Cell Bio.，2，139；和Delivery Strategies for AntisenseOligonucleotide Therapeutics，ed.Akhtar，1995中有所描述，这两个文献均通过引用并入本文。Sullivan等，PCT WO94/02595进一步描述了用于递送酶性RNA分子的常用方法。这些规程可以用于递送几乎任何核酸分子。核酸分子可以通过本领域中的熟练技术人员已知的多种方法给予细胞，该方法包括但不限于包囊于脂质体中、通过电离子透入法、或通过掺入其他载体如水凝胶、环糊精、生物可降解纳米胶囊以及生物粘附性微球体中。可选地，核酸/载体组合通过直接注射或通过采用灌注泵而局部递送。其他递送途径包括但不限于口服(片剂或丸剂形式)和/或鞘内递送(Gold，1997，Neuroscience，76，1153-1158)。其他方法包括采用多种转运和载体系统，例如通过采用结合物和生物可降解聚合物。关于药物递送策略包括CNS递送的详细综述，参见 Ho等，1999，Curr.Opin.Mol.Ther.，1，336-343和Jain，Drug DeliverySystems：Technologies and Commercial Opportunities，Decision Resources，1998和Groothuis等，1997，J.Neuro Virol.，3，387-400。
本发明的分子可以用作药学试剂。药学试剂预防、抑制受治疗者内疾病状态的发生或对其进行治疗(一定程度上缓解症状，优选缓解所有症状)。
本发明带负电的多核苷酸可以通过任何标准方式给予(例如，RNA、DNA或蛋白)并导入受治疗者内，含或不含稳定剂、缓冲液等以形成药物组合物。当需要采用脂质体递送机制时，可遵循用于形成脂质体的标准规程。本发明的组合物还可以配制成并用作经口给药的片剂、胶囊或酏剂；用于直肠给药的栓剂；无菌溶液；可注射性给药的悬浮液；以及本领域中已知的其他组合物。
本发明还包括所描述化合物的药学上可接受制剂。这些制剂包括上述化合物的盐类，例如酸加成盐，如盐酸、氢溴酸、乙酸和苯磺酸的盐。
药学组合物或制剂指的是一种其形式适合于给药如全身给药到细胞或受治疗者优选人内的组合物或制剂。“全身给药”是指药物在血流内进行全身体内吸收或累积，接着分布于整个身体内。适当的形式部分依赖于应用或进入途径，例如经口、经皮或通过注射。这些形式不应该阻碍所述组合物或制剂到达靶细胞(即，带负电的聚合物被期望递送至的细胞)。例如，注射入血流内的药学组合物应该是可溶性的。其他因素在本领域中是已知的，包括需考虑的事项诸如毒性以及妨碍组合物或制剂发挥其作用的形式。
引起全身吸收的给药途径包括但不限于静脉内、皮下、腹膜内、吸入、口服、肺内和肌内。药物进入循环内的速率已表明是分子量或分子大小的函数。采用包含本发明化合物的脂质体或其他药物载体可以大概地将药物定位于例如某些组织类型中如网状内膜系统(RES)的组织内。可促进药物与细胞如淋巴细胞和巨噬细胞表面结合的脂质体制剂也非常有用。
药学上可接受的制剂是指一种使得本发明的核酸分子和其他生物分子有效分布于最适于其预期活性的身体部位内的组合物或制剂。适 合于与本发明核酸分子一起配制的试剂的非限制性实例包括：PEG结合的核酸、磷脂结合的核酸、含亲脂部分的核酸、硫代磷酸酯、可促进药物进入不同组织例如CNS的P-糖蛋白抑制剂(例如Pluronic P85)(Jolliet-Riant和Tillement，1999，Fundam.Clin.Pharmacol.，13，16-26)；生物可降解聚合物，如聚乙丙交酯(聚(DL-乳酸-羟基乙酸)共聚物，poly(DL-lactide-coglycolide))微球用于植入后的缓释递送(Emerich，DF等，1999，Cell Transplant，8，47-58)Alkermes，Inc.Cambridge，Mass.；以及负载性(loaded)纳米颗粒，如那些由聚氰基丙烯酸丁酯(polybutylcyanoacrylate)制成的纳米颗粒，其可跨血脑屏障递送药物且可改变神经元吸收机制(Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，23，941-949，1999)。包括核酸分子的CNS递送的递送策略的其他非限制性实例，包括在Boado等，1998，J.Pharm.Sci.，87，1308-1315；Tyler等，1999，FEBS Lett.，421，280-284；Pardridge等，1995，PNAS USA.，92，5592-5596；Boado，1995，Adv.Drug Delivery Rev.，15，73-107；Aldrian-Herrada等，1998，Nucleic Acids Res.，26，4910-4916；和Tyler等，1999，PNAS USA.，96，7053-7058中描述的材料。所有这些参考文献特此通过引用并入本文。
本发明的特征也在于包含表面修饰脂质体的组合物的应用，该脂质体包含聚(乙二醇)脂质(PEG修饰的，或长循环脂质体或隐形脂质体)。本发明的核酸分子还可以包含共价连接的不同分子量的PEG分子。这些制剂提供一种用于增加药物在靶组织中的累积的方法。这类药物载体可抵抗由单核吞噬细胞系统(MPS或RES)的调理和清除，从而能够使血液循环时间更长以及使组织暴露于该封装药物增强(Lasic等，Chem.Rev.1995，95，2601-2627；Ishiwata等，Chem.Pharm.Bull.1995，43，1005-1011)。基于其避免在代谢侵蚀性(aggressive)MPS组织如肝脏和脾脏中累积的能力，相比于阳离子脂质体，长循环脂质体还很可能在更大程度上保护药物免被核酸酶降解。所有这些参考文献通过引用并入本文。
本发明还包括制备用于储存或给药的组合物，该组合物包括在药学上可接受的载体或稀释剂中药学有效量的所需化合物。用于治疗性应用的可接受载体或稀释剂在药学领域中是熟知的，且例如在 Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)中进行了描述，特此通过引用并入本文。例如，可以提供防腐剂、稳定剂、染料和调味剂。这些包括苯甲酸钠、山梨酸、以及对羟基苯甲酸的酯类。此外，还可以采用抗氧化剂和悬浮剂。
有效量、药学有效剂量、治疗有效量、或药学有效量是预防、抑制疾病状态或病理状态发生或对其进行治疗(一定程度上缓解症状，优选所有症状)所需的剂量。有效量依赖于疾病类型、所采用的组合物、给药途径、待治疗的哺乳动物类型、所考虑的特定哺乳动物的体格特征、同时用药、以及医学领域技术人员将认识到的其他因素。通常，根据带负电聚合物的效价，给予的量在0.1mg/kg和1000mg/kg体重/天之间的活性成分。另外，本发明组合物的有效量涵盖实施例中所利用的促进预期或所需生物学效果的那些量。
这些化合物的毒性和治疗功效可以通过在细胞培养物或实验动物中例如用于确定LD50(对50％的群体致死的剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)的标准药学步骤来确定。在毒性效应与治疗效应之间的剂量比是治疗指数，可以表示为比值LD50/ED50。优选表现出较大治疗指数的化合物。尽管可以采用表现出毒性副作用的化合物，但应该注意设计一种递送系统，该递送系统将这样的化合物靶向于染病的组织部位，以便将对未被感染细胞的可能性破坏降到最小，从而减少副作用。从细胞培养实验和动物研究中获得的数据可以用于配制一范围的用于人的剂量。这些化合物的剂量优选处于循环浓度的范围内，该循环浓度包括毒性极低或无毒性的ED50。剂量可以在该范围内的根据所采用的剂型以及所利用的给药途径而变化。对于本发明方法中应用的任何化合物，最初可以从细胞培养实验中估计治疗有效剂量。可在动物模型中配制剂量，以达到包括IC50(即，可实现对症状的半数最大抑制的测试化合物的浓度)的循环血浆浓度范围，如在细胞培养中测定的。这些信息可用来更加准确地测定人体内的有用剂量。血浆中的水平可以通过例如高效液相色谱进行测定。
该制剂可以包含常规无毒药学上可接受载体、佐剂和载体的剂量单位制剂经口、局部、肠外、通过吸入或喷雾或经直肠给予。如本文中使用的，术语肠外包括经皮、皮下、血管内(例如，静脉内)、肌 内或鞘内注射或灌注技术等。另外，提供了一种包含本发明核酸分子和药学上可接受载体的药学制剂。本发明的一种或多种核酸分子可以与一种或多种无毒药学可接受载体和/或稀释剂和/或佐剂以及(如果需要)其他活性成分相结合而存在。本发明的药物组合物可以适合于经口应用的形式，例如作为片剂、锭剂、糖锭、水性或油性悬浮液、可分散性粉剂或颗粒、乳液、硬或软胶囊、或者糖浆剂或酏剂。
计划用于经口应用的组合物可以按照本领域中已知的用于制备药物组合物的任何方法进行制备，且这种组合物可以包含一种或多种这种甜味剂、调味剂、着色剂或防腐剂以便提供药学上雅致的且可口的制剂。片剂包含以与适合于制备片剂的非毒性药学上可接受的赋形剂的混合物的活性成分。这些赋形剂可以为例如惰性稀释剂如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或褐藻酸；结合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶，以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是未包被的或可以通过已知技术进行包被。在某些情况下，可以通过已知技术制备这些涂层，以延缓在胃肠道内的崩解和吸收，从而在较长的时间内提供持续作用。例如，可以采用延时材料如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。用于口服应用的制剂还可以呈现为硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固态稀释剂如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合；或软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。
水性悬浮液包含与适合于制备水性悬浮液的赋形剂的混合物形式的活性物质。这些赋形剂是悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、褐藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；分散或润湿剂可以为天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或环氧烷烃与脂肪酸的浓缩产物例如聚乙二醇硬脂酸酯(聚氧乙烯硬脂酸酯)，或环氧乙烷与长链脂肪醇的浓缩产物如十七乙氧基十六醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，或环氧乙烷与源自脂肪酸和己糖醇的部分酯的浓缩产物如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或环氧乙烷与源自脂肪酸和己糖醇酐(hexitol anhydride)的部分酯的浓缩产物如聚乙烯失水山梨糖醇单油酸酯(聚乙烯山梨糖醇酐单油酸酯)。水性悬浮液还可包含一种或多种防腐剂如乙基、或正丙基对羟基苯甲酸盐、一种或 多种着色剂、一种或多种调味剂、以及一种或多种甜味剂如蔗糖或糖精。
油性悬浮液可以通过将活性成分悬浮于植物油如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油中，或悬浮于矿物油如液体石蜡中而配制。该油性悬浮液可以包含增稠剂如蜂蜡、固体石蜡或十六醇。可以加入甜味剂和调味剂以提供可口的口服制剂。这些组合物可以通过加入抗氧化剂如抗坏血酸进行保存。
适合于通过加入水而制备水性悬浮液的可分散性粉剂和颗粒提供了以与分散剂或润湿剂、悬浮剂以及一种或多种防腐剂的混合物的活性成分。适当的分散剂或润湿剂或悬浮剂通过上文已提到的那些试剂而例证。还可以存在另外的赋形剂例如甜味剂、调味剂和着色剂。本发明的药物组合物还可以以水包油乳液的形式。油相可以为植物油或矿物油或这些油的混合物。适当的乳化剂可以为天然存在的树胶，例如阿拉伯胶或黄蓍胶，天然存在的磷脂例如大豆、卵磷脂、以及来源于脂肪酸和己糖醇、酐的酯或部分酯如山梨糖醇酐单油酸酯(sorbitanmonooleate)，以及所述部分酯与环氧乙烷的浓缩产物如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(polyoxyethylene sorbitan monooleate)。乳液还可以包含甜味剂和调味剂。
糖浆剂和酏剂可以用甜味剂如甘油、丙二醇、山梨糖醇、葡萄糖或蔗糖进行配制。这种制剂还可以包含缓和剂(demulcent)、防腐剂以及调味剂和着色剂。药物组合物可以以无菌可注射水性或油质性悬浮液的形式。该悬浮液可以利用上文提到的那些适合的分散剂或润湿剂以及悬浮剂按照已知技术进行配制。无菌可注射制剂还可以为以无毒的肠外可接受稀释剂或溶剂的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为1，3-丁二醇的溶液。可采用的可接受的载体和溶剂是水、Ringer溶液和等张氯化钠溶液。另外，常规采用无菌的不挥发油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可以采用任何柔和的不挥发油，包括合成的甘油一酯或甘油二酯。另外，脂肪酸如油酸可以用于制备注射剂。
本发明的核酸分子还可以以栓剂形式给予，例如用于直肠给予药物，或者借助于导管直接给予至膀胱本身。这些组合物可以通过将药物与适当的非刺激性赋形剂(其在常温下为固态，但在直肠温度下为 液态)混合而制备，因此将在直肠内融化以释放药物。这些物质包括可可脂和聚乙二醇。
本发明的核酸分子可以在无菌介质中肠外给予。根据所采用的载体和浓度，药物可以悬浮或溶解于载体中。有利地，可以将佐剂诸如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂溶解于该载体中。可以与载体物质相结合以生成单剂型的活性成分的量根据所治疗宿主以及特定给药模式而变化。单位剂型通常包含约1mg至约5000mg之间的活性成分。应当理解，用于任何特定患者或受治疗者的特定剂量水平依赖多个因素，包括所采用特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、以及排泄速率、药物组合以及正经历治疗的特定疾病的严重程度。
为了给予非人的动物，还可以将组合物加入动物饲料或饮用水中。配制动物饲料和饮用水组合物比较方便，使得动物随饮食一起摄入治疗适当量的组合物。将组合物呈现为用于加入饲料或饮用水中的预混合物也可以是比较方便的。该组合物还可以与其他治疗化合物一起给予受治疗者，以增加整体治疗效应。采用多种化合物以治疗一种指征可以增加有益效应，同时减少副作用的出现。
可选地，某些本发明的核酸分子可以在细胞内从真核启动子表达(例如，Izant和Weintraub，1985，Science，229，345；McGarry和Lindquist，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA83，399；Scanlon等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88，105915；ashani-Sabet等，l992，AntisenseRes.Dev.，2，315；Dropulic等，1992，J.Virol.，66，143241；Weerasinghe等，1991，J.Virol.，65，55314；Ojwang等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，108026；Chen等1992，Nucleic Acids Res.，20，45819；Sarver等，1990Science，247，12221225；Thompson等，1995，Nucleic AcidsRes.，23，2259；Good等，1997，Gene Therapy，4，45；所有这些参考文献特此以其整体通过引用并入本文)。本领域技术人员应当认识到，任何核酸均可以在真核细胞内从适当的DNA/RNA载体而表达。
在一个方面，本发明表征了包含编码至少一种本发明核酸分子的核酸序列的表达载体。编码本发明核酸分子的核酸序列以允许核酸分子表达的方式可操作地连接。
核酸分子序列的转录受用于真核RNA聚合酶I(pol I)、RNA聚合酶II(pol II)、或RNA聚合酶III(pol III)的启动子所驱动。来自pol II或pol III启动子的转录本在所有细胞中均以高水平表达；给定细胞类型中给定pol II启动子的水平依赖于附近存在的基因调节序列(增强子、沉默子等)的性质。还可以采用原核RNA聚合酶启动子，只要原核RNA聚合酶在适当的细胞内表达(Elroy-Stein和Moss，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87,67437；Gao和Huang1993，Nucleic Acids Res.，21，286772；Lieber等，1993，Methods Enzymol.，217，4766；Zhou等，1990，Mol.Cell.Biol.，10，452937)。所有这些参考文献通过引用并入本文。几个研究者已经证实，核酸分子如从这些启动子表达的核酶可以在哺乳动物细胞内发挥作用(例如，Kashani-Sabet等，1992，AntisenseRes.Dev.，2，315；Ojwang等1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89，108026；Chen等，1992，Nucleic Acids Res.，20，45819；Yu等1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90,63404；LTiuillier等，1992，EMBO J.，11，44118；Lisziewicz等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A，90，80004；Thompson等，1995，Nucleic Acids Res.，23，2259；Sullenger&Cech，1993，Science，262，1566)。
在另一个方面，本发明的特征在于以允许核酸分子表达的方式包含编码至少一种本发明核酸分子的核酸序列的表达载体。在一个实施方式中，表达载体包括：a)转录起始区；b)转录终止区；c)编码至少一种所述核酸分子的核酸序列；且其中所述序列以允许所述核酸分子表达和/或递送的方式可操作地连接于所述起始区和所述终止区。
本发明另外的目的是提供一种试剂盒，包括适当的容器、本文所公开的以药学上可接受形式的本发明治疗剂、以及其使用说明书。
在另一个实施方式中，本发明的分离的核酸分子包括为编码MG53多肽、或MG53受体多肽的核苷酸序列互补物的核酸分子。如本文中使用的，术语“互补的”是指在核酸分子的核苷酸单位之间的Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对，并且术语“结合”是指在两个多肽或化合物或者相结合多肽或化合物或者其组合之间的物理性或化学相互作用。结合包括离子、非离子、范德华、疏水性相互作用等。物理相互作用可以为直接或间接的。
如本文中使用的，“片段”定义为至少6个(连续的)核酸的序列或至少4个(连续的)氨基酸的序列，长度足以使得在核酸情况下特异性杂交以及在氨基酸情况下表位的特异性识别，且“片段”至多为少于全长序列的某些部分。
如本文所述的宿主细胞可包括可能用来携带异源核酸或表达由异源核酸编码的多肽或蛋白的细胞。宿主细胞可以包含在天然(非重组)形式的细胞内不存在的基因、在其中基因经过修饰且通过人工方式重新引入细胞内的天然形式的细胞中存在的基因、或已经过人工修饰但并未将核酸从细胞中移出的细胞的内源核酸。宿主细胞可以为真核或原核的。细菌培养所必需的通用生长条件可以在诸如BERGEY′SMANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY，Vol.1，N.R.Krieg，ed.，Williams和ffilkins，Baltimore/London(1984)的教科书中查到。
“宿主细胞”还可以为一种细胞，其中内源性基因或启动子或者二者已经被修饰以生成本发明复合物中的一个或多个多肽组分。
“衍生物”是从天然化合物直接地、通过修饰、或通过部分取代而形成的组合物。
“类似物”是具有与天然化合物类似但并不相同的结构的核酸序列或氨基酸序列。
在多种实施方式中，本发明的核酸或蛋白的衍生物或类似物包括但不限于包含基本上同源于本发明核酸或蛋白的区域的分子，在相同大小的核酸或氨基酸序列上或当与所比对的序列相比时，通过至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％的同一性(优选的同一性为80-95％)，其中比对通过本领域中已知的计算机同源性程序完成，或者该比对序列编码的核酸能够在严格、中等严格、或低严格条件下杂交于编码本发明蛋白的序列的互补物。参见例如Ausubel，等，CURRENT PROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，N.Y.，1993。核酸衍生物和变体包括那些通过基因取代、位点特异性突变、缺失、插入、重组、修复、穿梭、内源性核酸酶消化、PCR、亚克隆和相关技术所获得的衍生物和变体。
“同系物”可以为天然存在的，或者可通过人工合成一种或多种具有相关序列的核酸或通过修饰一种或多种核酸以产生相关核酸而创 建。当核酸天然或人工地源自共同的祖先序列(例如，直系同源或旁系同源)时，核酸为同源的。如果未明确描述两个核酸之间的同源性，则可通过在两个或多个序列之间的核酸比较而推断同源性。如果序列表现出某种程度的序列类似性，例如在一级氨基酸结构水平上高于约30％、40％、50％、60％、70％、80％、或90％的类似性，则可推断其共有一个共同祖先。为了本发明的目的，如果核酸序列足够类似以允许在低严格条件下进行重组和/或杂交，则基因是同源的。
如本文中使用的“杂交”是指分子仅与特定核苷酸序列在低、中、或高严谨性条件下结合、双工(duplexing)、或杂交，包括当该序列存在于复杂的混合(例如，总细胞)DNA或RNA中时。
此外，本领域普通技术人员应当认识到“保守性突变”还包括改变、添加或缺失编码序列中单个氨基酸或少数氨基酸的核酸的取代、缺失或添加，其中核酸改变引起化学类似的氨基酸的取代。彼此可用作保守性取代的氨基酸包括以下：碱性：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；亲水性：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、撷氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；疏水性：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)。另外，通过保守性变异而区分的序列通常是同源的。
关于对本发明实施有用的分子生物学技术包括诱变、PCR、克隆等的描述包括Berger和Kimmel，GUIDE TO MOLECULAR CLONINGTECHNIQUES，METHODS IN ENZYMOLOGY，volume52，AcademicPress，Inc.，San Diego，Calif.(Berger)；Sambrook等，MOLECULARCLONING--A LABORATORY MANUAL(2nd Ed.)，Vol.1-3，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989，和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，F.M.Ausubel等，eds.，Current Protocols，ajoint venture between Greene PublishingAssociates，Inc.和John Wiley&Sons，Inc.；Berger，Sambrook，和Ausubel，以及Mullis等，美国专利号4,683,202(1987)；PCRPROTOCOLS A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS(Innis等编)，Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.(1990)(Innis)；Arnheim& Levinson(Oct.1，1990)C&EN36-47。
在又一个实施方式中，本发明的核酸利用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达。关于对原核细胞和真核细胞两者的适当的表达系统，参见例如Sambrook等人MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL.第二版16和17章，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989。
多核苷酸可以为DNA分子、cDNA分子、基因组DNA分子、或RNA分子。多核苷酸如DNA或RNA可以包括一种序列，其中T(胸腺嘧啶)还可以为U(尿嘧啶)。如果在多核苷酸的某个位置处的核苷酸能够以反向平行的DNA或RNA链与相同位置处的核苷酸形成Watson-Crick配对，则该多核苷酸与该DNA或RNA分子在该位置处彼此互补。当每个分子内足够量的对应位置被可以彼此杂交以便执行期望过程的核苷酸占据时，多核苷酸与DNA或RNA分子基本上彼此互补。
用重组DNA转化宿主细胞可以通过如本领域技术人员所熟知的常规技术而实施。“转化”是指掺入新DNA(即，外源于细胞的DNA)后在细胞内诱导的永久或瞬时遗传改变。
在另一个实施方式中，重组哺乳动物表达载体能够指导核酸优先在特定细胞类型中表达(例如，组织特异性调节元件用来表达核酸)。组织特异性调节元件在本领域中是已知的。适当的组织特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝特异性；Pinkert，等，1987.GenesDev.1：268-277)，淋巴特异性启动子(Calame和Eaton，1988.Adv.Immunol.43：235-275)，特别是T细胞受体(Winoto和Baltimore，1989.EMBO J.8：729-733)和免疫球蛋白(Banerji，等，1983.Cell33：729-740；Queen和Baltimore，1983.Cell33：741-748)的启动子、神经特异性启动子(例如，神经微丝启动子；Byrne和Ruddle，1989.Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：5473-5477)、胰腺特异性启动子(Edlund，等，1985.Science230：912-916)、以及乳腺特异性启动子(例如，乳清启动子；美国专利号4,873,316和欧洲申请公开号264，166)。还包括发育调节启动子，例如鼠同源盒基因(hox)启动子(Kessel和Gruss，1990. Science249：374-379)和甲胎蛋白启动子(Campes和Tilghman，1989.Genes Dev.3：537-546)。
在任何一个实施方式中，编码MG53多肽或MG53受体的核酸可以存在为：一个或多个裸DNA；一个或多个设置于适当的表达载体中并附加体地保持的核酸；一个或多个整合入宿主细胞基因组内的核酸；编码该复合物中组分的内源性基因的修饰形式；与一个或多个调节性核酸序列结合的一个或多个核酸；或其组合。该核酸可以可选地包括一个连接肽或融合蛋白组分例如His标签、FLAG标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签、荧光蛋白、GST、TAT、和抗体部分、信号肽等，位于5’端、3’端或位于ORF内的任何位置。
在一个优选的实施方式中，本发明的核酸包括编码MG53或MG53受体可溶性部分的多核苷酸。本文中描述的任何一个实施方式，均可以利用本领域普通技术人员熟知的标准分子生物学和遗传学方法来实现。
在宿主是原核生物如大肠杆菌的情况下，能够摄取DNA的感受态细胞可以从指数生长期之后收集的细胞来制备，随后利用本领域中熟知的步骤通过CaCl₂方法进行处理。可选地，可以采用MgCl₂、RbCl、脂质体、或脂质体-蛋白结合物。还可以在形成宿主细胞的原生质体后或通过电穿孔而实施转化。这些实例没有对本发明进行限制；存在多种用于转染宿主细胞的技术，其已为本领域技术人员所熟知，且认为在本发明的范围之内。
当宿主是真核细胞时，这些用DNA转染的方法包括磷酸钙共沉淀，可以采用常规机械操作如微注射、电穿孔、插入包裹于脂质体内的质粒或病毒载体、以及本领域中已知的其他方法。真核细胞可以为酵母细胞(例如酿酒酵母)或可以为哺乳动物细胞，包括人细胞。为了长期高产量地生成重组蛋白，优选稳定地表达。
干细胞应用
在另一个方面，本发明包括使用宿主细胞和根据本发明方法修饰的干细胞的治疗方法，该干细胞可用于移植和/或过继细胞治疗方法。在该方法的一个实施方式中，干细胞，例如，将肺干细胞从宿主分离，其中干细胞能够分化成肺细胞，并且其中分离的干细胞是修饰的使得 其显示调节的，例如，提高的，MG53活性、MG53基因表达、可调节的MG53信号级联放大。在优选的实施方式中，干细胞与试剂例如MG53多肽、MG53核苷酸或提高肺细胞中MG53信号级联的试剂接触。然后，修饰的干细胞可离体培养，并随后给予需要其的个体，例如，患有由于急性损伤或各种疾病状态引起的持续肺损伤的患者。
已知用于分离、培养和操纵能够分化成上皮细胞的干细胞的各种方法。参见，例如，Guo J.等Int J Exp Pathol.2009Jun；90(3)：355-64；Patel A.N.和Sherman W.，Cell Transplant.2009；18(3)：243-4；Murtuza B.等Tissue Eng Part B Rev.2009Jun24；Popescu L.M.等J Cell MolMed.2009May；13(5)：866-86.Epub2009Apr20；Chamuleau S.A.等Cardiovasc Res.2009Jun l；82(3)：385-7.Epub2009Apr8；出于所有目的将其全部内容通过引用并入文)。
抗体
如本文中使用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即包含特异性结合抗原(与抗原发生免疫反应)的抗原结合位点的分子，包括至少一个、优选两个重(H)链可变区(本文中缩写为VH)，以及至少一个优选两个轻(L)链可变区(本文中缩写为VL)。这些抗体包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、单链、Fab、Fab′和F(ab′)2片段、以及Fab表达库。VH和VL区可以进一步细分为超变区，称为“互补决定区”(“CDR”)，配置(intersperse)有更为保守的、称为“框架区”(FR)的区域。已精确地限定了框架区和CDR的范围(参见，Kabat，E.A.，等，(1991)Sequencesof Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department ofHealth and Human Services，NIH Publication No.91-3242，和Chothia，C.等，(1987)J.Mol.Biol.196：901-917，其通过引用并入本文)。每一个VH和VL均由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端至羧基末端按照以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。通常，从人获得的抗体分子涉及类别IgG、IgM、IgA、IgE和IgD中的任何一种，其通过分子中存在的重链性质而彼此区别。某些类别还具有亚类，如IgGp，IgG2等。此外，在人中，轻链可以为κ链或λ链。本文中提及抗体包括提及人抗体种属中的所有这种类别、亚类以 及类型。
抗体可从完整的多肽或包含感兴趣肽作为免疫剂(immunizingagent)的片段而制备。优选的抗原性多肽片段为MG53、或MG53受体蛋白中的15-100个连续的氨基酸。在一个实施方式中，肽位于多肽的非跨膜结构域中，例如位于细胞外或细胞内结构域中。一种示例性抗体或抗体片段结合于可从胞外环境接近并改变蛋白功能性的表位。在某些实施方式中，本发明包括的抗体可识别且特异于MG53、或MG53受体蛋白、变异体、其部分和/或组合中的一个或多个表位。在可选的实施方式中，本发明的抗体可以靶向并干扰MG53/MG53受体的相互作用以抑制信号传导。
单克隆抗体的制备在本领域中是众所周知的；参见例如，Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual，page726(Cold Spring HarborPub.1988)。单克隆抗体可以通过用包含抗原的组合物注射小鼠或兔、通过取出血清样品验证存在抗体的生成、取出脾脏以获得B淋巴细胞、将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤、克隆该杂交瘤、选择产生针对抗原的抗体的克隆、以及从杂交瘤培养物中分离抗体而获得。单克隆抗体可以通过本领域中熟知的技术从杂交瘤培养物中分离并纯化。
在其他实施方式中，抗体可以重组生成，例如通过噬菌体展示或通过组合的方法而生成。噬菌体展示和组合方法可以用来分离结合于多肽、MG53、膜修复多肽结合蛋白、MG53结合蛋白、膜修复多肽受体、和/或MG53受体蛋白或其片段的重组抗体(如在例如Ladner等美国专利号5,223,409；Fuchs等(1991)Bio/Technology9：1370-1372；Hay等(1992)Hum Antibod Hybridomas3：81-85；Huse等(1989)Science246：1275-1281；Clackson等(1991)Nature352：624-628；Gram等(1992)PNAS89：3576-3580中所描述的)。人单克隆抗体还可以利用携带人免疫球蛋白基因而不是小鼠系统的转基因小鼠而生成。用感兴趣抗原免疫的这些转基因小鼠的脾细胞用来生成分泌对来自人蛋白的表位具有特异亲和性的人mAb的杂交瘤(参见例如，Wood等国际申请WO91/00906；Lonberg，N.等1994Nature368：856-859；Green，L.L.等1994Nature Genet.7：13-21；Morrison，S.L.等1994Proc.Natl.Acad.Sci. USA81：6851-6855)。对本发明复合物中的组分或复合物本身的治疗有用抗体可以来源于“人源化(humanize)”单克隆抗体。人源化单克隆抗体可通过将小鼠的互补性决定区(CDR)从小鼠免疫球蛋白的重可变链和轻可变链转移入人可变结构域内然后将人残基替换在小鼠对应物(counterpart)的框架区内而生成。
采用来源于人源化单克隆抗体的抗体组分避免了与小鼠恒定区免疫原性相关的潜在问题。用于生成人源化单克隆抗体的技术可以在Jones等，Nature321：522，1986和Singer等，J.Immunol.150：2844，1993；Wu T.T.和Kabat，E.A.(1970)J.Exp.Med.，132：，211-250；以及Johnson G，Wu，T.T.和Kabat，E.A.(1995)In Paul，S.(ed.)，AntibodyEngineering Protocols.Humana Press，pp.1-15中查到，这些文献均通过引用并入本文。抗体还可以来源于从组合免疫球蛋白库中分离的人抗体片段；参见例如Barbas等，Methods：A Companion to Methods inEnzymology2,119,1991。另外，嵌合抗体可以通过剪接来自具有适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因以及来自具有适当生物学特异性的人抗体分子的基因而获得；参见例如Takeda等，Nature314：544-546，1985。嵌合抗体是其中不同部分来源于不同动物种属的一种抗体。
抗独特型技术可以用来生成模拟表位的单克隆抗体。针对第一单克隆抗体制备的抗独特型单克隆抗体具有在超变区内的结合结构域，其是通过第一单克隆抗体结合的表位的“映像”。可选地，用来生成单链抗体的技术可以用来生成单链抗体。单链抗体通过借助于氨基酸桥而连接Fv区的重链和轻链片段得到单链多肽而形成。识别特异性表位如细胞外表位的抗体片段可以通过本领域中熟知的技术而产生。这种片段包括通过蛋白裂解消化产生的Fab片段、以及通过还原二硫桥而生成的Fab片段。当用于免疫治疗时，单克隆抗体、其片段或二者均未标记或可用治疗试剂进行标记。这些试剂可以通过本领域中熟知的技术直接地或间接地耦联于单克隆抗体，并且包括诸如药物、放射性同位素、凝集素和毒素的试剂。
用于给予单克隆抗体的剂量范围应足够大以产生预期的效应，且将随着年龄、病症、体重、性别、年龄和待治疗病症的程度而变化，且可以易于由本领域技术人员确定。剂量可以为约0.1mg/kg至约 2000mg/kg。单克隆抗体可以经过静脉内、腹膜内、肌内和/或皮下而给予。
在本发明的某些实施方式中，抗原肽包含的至少一个表位是MG53、或MG53受体的位于蛋白表面上的区域例如亲水性区域。蛋白序列的疏水性分析将表明多肽中哪个区域特别亲水从而很可能编码对于靶向性抗体生成有用的表面残基。作为一种用于靶向性抗体生成的方式，可以通过本领域中熟知的任何方法生成显示出亲水性和疏水性区域的亲疏水图(hydropathy plot)，该方法包括例如Kyte Doolittle或Hopp Woods法，具有或不具有傅立叶(Fourier)转化。参见例如Hopp和Woods，1981，Proc.Nat.Acad.Sci.USA)78：3824-3828；Kyte和Doolittle1982，J.Mol.Biol.157：105-142，每个以其整体通过引用并入本文。本文中还提供了特异于抗原性蛋白、或者其衍生物、片段、类似物或同系物内的一个或多个结构域的抗体。本发明的蛋白、或者其衍生物、片段、类似物、同系物或直系同源物均可以用作免疫原，生成可免疫特异性结合这些蛋白组分的抗体。
人抗体
完全人抗体基本上涉及其中包括CDR的轻链和重链两者的完整序列均起因于人基因的抗体分子。本文中，这些抗体命名为“人抗体”或“完全人抗体”。人单克隆抗体可以通过三源杂交瘤技术；人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor，等，1983Immunol Today4：72)以及用来生成人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(参见Cole等，1985In：MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)而制备。人单克隆抗体可以用于实施本发明并且可以通过利用人杂交瘤(参见Cote等1983.Proc Natl Acad Sci USA80：2026-2030)或通过用Epstein Barr病毒(人疱疹病毒)体外转化人B细胞(，参见Cole等，1985In：MONOCLONAL ANTIBODIES ANDCANCER THERAPY，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)而制备。
另外，人抗体还可以利用另外的技术，包括噬菌体展示库(Hoogenboom和Winter，J.Mol.Biol.227：381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.，222：581(1991))而生成。类似地，人抗体可以通过将人免疫球蛋白基因座导入转基因动物如其中内源性免疫球蛋白基因已经部 分或全部灭活的小鼠内而制备。激发后，观察到人抗体生成，所有方面均非常类似于在人类中所看到的，包括基因重排、组装、以及抗体集合(antibody repertoire)。该途径例如在美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016以及在Marks等(Bio/Technology，10：779-783(1992))；Lonberg等(Nature，368：856-859(1994))；Morrison(Nature，368：812-13(1994))；Fishwild等，(Nature Biotechnology，14：845-51(1996))；Neuberger(NatureBiotechnology，14：826(1996))；和Lonberg和Huszar(Intem.Rev.Immunol.，13：65-93(1995))中进行了描述。
人抗体可以另外地利用转基因非人动物生成，该转基因非人动物经修饰以便响应于受抗原激发而生成完全人抗体而非动物的内源性抗体。已经使编码非人宿主体内重免疫球蛋白链和轻免疫球蛋白链的内源性基因失去功能，并将编码人重链和轻链免疫球蛋白的活性基因座插入该宿主的基因组内。人基因例如可利用包含需要的人DNA节段的酵母人工染色体进行整合。随后作为通过异系交配中间转基因动物(包含少于修饰的完全互补物的互补物)得到的子代而获得提供所有所需修饰的动物。这种非人动物的优选实施方式是小鼠，命名为Xenomouse^TM，如在PCT公开WO96/33735和WO96/34096中所公开的。
治疗有效量的本文所述治疗剂通常与实现治疗目标所需的量相关。如上文所指出的，这可能是抗体与其靶抗原之间的结合相互作用，其在某些情况下干扰靶发挥作用，并且在其他情况下促进生理反应。待给予的所需要的量此外将依赖于抗体与其特异性抗原的结合亲和性，且还将依赖于所给予抗体从给予的自由体积其他受治疗者消耗的速率。借助于非限制性实例，本发明抗体或抗体片段的治疗有效剂量的常用范围可以为约0.1mg/kg体重至约500mg/kg体重。常用剂量频率可从例如每天两次至一周一次变化。
可以药物组合物形式给予特异性结合本发明蛋白的抗体以及通过本文所公开的筛选实验鉴定的其他分子，用于治疗各种病症。例如，在Remington：The Science and Practice Of Pharmacy19thed.(Alfonso R.Gennaro等编)Mack Pub.Co.，Easton，Pa.：1995；Drug Absorption Enhancement：Concepts，Possibilities，Limitations，And Trends，HarwoodAcademic Publishers，Langhorne，Pa.，1994；和Peptide And Protein DrugDelivery(Advances In Parenteral Sciences，Vol.4)，1991，M.Dekker，NewYork中提供了制备这种组合物所涉及的原则和注意事项、以及选择组分时的准则。活性成分还可以封于例如通过凝聚法技术或通过界面聚合法分别例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳化液、纳米颗粒、和纳米胶囊)或在粗乳状液中制备的微胶囊中。用于体内给药的制剂必须是无菌的。易于穿过无菌滤膜通过过滤而实现。
可以制备缓释制剂。缓释制剂的适当的实例包括含有抗体的固态疏水聚合物的半通透性基质，该基质为成型制品例如薄膜或微胶囊的形式。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇)、聚乳酸(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸与Y-乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、非降解性乙烯-乙酸乙烯酯、降解性乳酸-羟基乙酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射性微球)、和聚D-(-)-3-羟基丁酸。尽管诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸的聚合物能够使分子释放达100天以上，但某些水凝胶释放蛋白的时间周期较短。
ELISA检测
用于检测被分析蛋白的试剂是能够结合于被分析蛋白的抗体，优选具有可检测标记的抗体。抗体可以为多克隆，或更优选单克隆。可以采用完整抗体、或其片段(例如Fab或F(ab)2)。提及探针或抗体时，术语“标记的”旨在包括通过将可检测的底物耦联(即，物理连接)于探针或抗体而直接标记探针或抗体、以及通过与另一种直接标记的试剂的反应性而间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括利用荧光标记的二抗和用生物素末端标记DNA探针使得其可以用荧光标记的抗生蛋白链菌素检测来检测一抗。术语“生物学样品”旨在包括从受治疗者分离的组织、细胞和生物学液体以及存在于受治疗者内的组织、细胞和液体。因此，血液以及包括血清、血浆或淋巴的血液成分或组分包括在术语“生物学样品”的使用范围内。也就是说，本发明的检测方法可以用来在体外以及体内检测生物学样品内的被分析mRNA、 蛋白、或基因组DNA。例如，用于被分析mRNA检测的体外技术包括Northern杂交和原位杂交。用于被分析蛋白检测的体外技术包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀、和免疫荧光。用于被分析基因组DNA检测的体外技术包括Southern杂交。用于实施免疫检测的步骤例如在和″ELISA：Theory and Practice：Methods inMolecular Biology″，Vol.42，J.R.Crowther(Ed.)Human Press，Totowa，N.J.，1995；″Immunoassay″，E.Diamandis和T.Christopoulus，AcademicPress，Inc.，San Diego，Calif.，1996；以及″Practice and Thory of EnzymeImmunoassays″，P.Tijssen，Elsevier Science Publishers，Amsterdam，1985.中进行了描述。而且，用于被分析蛋白检测的体内技术包括将标记的抗被分析蛋白抗体导入受治疗者内。例如，抗体可以标记有放射性标记物，其在受治疗者中的存在和定位可以单独地或与效应细胞一起通过标准成像技术在腔内或经皮来检测。
用于给予本发明的治疗剂的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液、和乳液。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、以及可注射性有机酯如油酸乙酯。含水载体包括水、含醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水以及缓冲介质。载体包括氯化钠溶液、Ringer(林格氏)右旋糖、右旋糖和氯化钠，乳酸Ringer静脉内载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂等。可以加入防腐剂和其他添加剂例如如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
本发明的化合物、核酸分子、多肽、和抗体(本文中也称为“活性化合物”)、及其衍生物、片段、类似物和同系物可以掺入适合于给药的药物组合物内。这些组合物通常包括核酸分子、蛋白、或抗体以及一种药学上可接受的载体。如本文中使用的，“药学上可接受的载体”旨在包括任何以及所有与药物给予相容的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等张和延缓吸收试剂等。适当的载体在最新版本的Remington′s Pharmaceutical Sciences(该领域中的标准参考教科书，其通过引用并入本文)中进行了描述。这些载体或稀释剂的优选实例包括但不限于水、盐水、指溶液(finger′s solutions)、右旋糖溶液、和5％人血清白蛋白。还可以采用脂质体和非水载体如不挥发油。这些介质和试剂用于药学活性物质的用途在本领域中是熟知的。除了在与活 性化合物不相容的任何常规介质或试剂范围内以外，还预期了其在组合物中的应用。还可以将补充活性化合物掺入组合物中。
可以将本发明的药物组合物配制成与其预期的给药途径相容。给药途径的实例包括肠外如静脉内、皮内、皮下、经口(例如，吸入)、经皮(即，局部)、经粘膜、腹膜内、和直肠给药。用于肠外、皮内或皮下施加的溶液或悬浮液可以包括下列组分：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成的溶剂；抗细菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液如乙酸盐)、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节紧张性的试剂如氯化钠或右旋糖。PH可以用酸或碱如盐酸或氢氧化钠进行调节。肠外制剂可以封于安瓿、一次性注射器或者由玻璃或塑料制成的倍剂量瓶中。
适合于可注射性使用的药物组合物包括无菌水溶液(其中，水溶性)或分散液和用于即时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉剂。为了静脉内给药，适当的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor^TM(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲液(PBS)。在所有情况中，组合物必须是无菌的，且应该为存在容易注射能力的意义上的液体。其在制造和存储条件下必须是稳定的，且必须可以抗微生物如细菌和真菌污染作用而保存。载体可以为包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘醇、丙二醇、和液态聚乙二醇等)、以及其适当的混合物的溶剂或分散介质。适当的流动性可以例如通过采用涂层如卵磷脂、通过在分散的情况下保持所需的颗粒大小以及通过采用表面活性剂而保持。预防微生物作用可通过多种抗细菌和抗真菌药如对羟基本甲酸酯(parabens)、三氯叔丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞等而实现。在多种情况下，组合物中优选包括等张试剂如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇、氯化钠。可注射性组合物的延时吸收可通过在组合物中包含延缓吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶而实现。
为了经口给药，药物组合物可以采取例如片剂或胶囊的形式，该片剂或胶囊与药学上可接受的赋形剂如粘合剂(例如，预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或硅石)； 崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如，十二烷基硫酸钠)一起通过常规方式进行制备。片剂可以通过本领域中熟知的方法进行包被。用于经口给药的液态制剂可以采取例如溶液、糖浆剂或悬浮液的形式，或者其可以在使用前作为用于用水或其他适当的载体溶解的干产物而存在。这种液态制剂可以与药学上可接受的添加剂如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆剂、纤维素衍生物或氢化食用脂)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水载体(例如，杏仁油、油性酯、乙醇或分馏的植物油)；和防腐剂(例如甲基或丙基对羟基苯甲酸盐或山梨酸)通过常规方式一起制备。如果适当的话，该制剂还可以包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。用于经口给药的制剂可以适当地配制以引起活性化合物的控释。为了含服给药，组合物可采取以常规方式配制的片剂或锭剂形式。为了通过吸入给药，按照本发明应用的化合物可以利用适当的推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适当的气体，以来自加压部件(pressurized pack)或喷雾器的气溶胶喷射显示的形式方便地递送。在加压的气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀以递送计量的量而确定。用于吸入器或吹入器中的例如明胶的胶囊和药包(cartridge)可以配制成包含化合物的粉末混合物以及一种适当的粉末基质(base)如乳糖或淀粉。化合物可以配制用于通过注射例如通过推注或连续灌注而肠外给药。用于注射的制剂可以与加入的防腐剂一起以单位剂型例如在安瓿或在倍剂量容器中存在。组合物可以采取如在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳液的这种形式，且可以包含配方剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可选地，活性成分可以在使用前以用于用适当的载体如无菌无热原的水溶解的粉末形式。化合物还可以配制于直肠组合物如栓剂或保留灌肠剂中，例如包含常规栓剂基质如可可脂或其他甘油酯。除了前述制剂，化合物还可以配制为一种长效制剂(depotpreparation)。这种长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射而给药。因此，例如，该化合物可以用适当的聚合或疏水性材料(例如，作为在可接受性油中的乳液)或离子交换树脂进行配制，或配制为略微可溶的衍生物如略微可溶的盐。
在一个实施方式中，可以使用保护化合物免于从机体内快速清除 的载体，例如控释制剂，包括植入物和微胶囊化递送系统，来制备活性化合物。可以采用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这些制剂的方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。这些材料还可以商业上获白Alza公司和Nova Pharmaceuticals公司的脂质体悬浮液(包括靶向于感染细胞的脂质体，其中单克隆抗体针对病毒抗原)还可以用作药学上可接受的载体。这些可以按照本领域技术人员已知的如在美国专利号4,522,811中所描述的方法进行制备。
将经口或肠外组合物配制成单位剂型以方便给药和均一的剂量是特别有利的。如本文中使用的，单位剂型是指物理上分离的单位，适合于作为给予待治疗的受治疗者的单位剂量；每一个单位均包含经计算以产生预期治疗效果的预定量的活性化合物、以及所需的药学载体。本发明的单位剂型的规格由下述规定并直接依赖于下述：活性化合物的独特特性和待实现的特定治疗效果、以及本领域中固有的混合这种活性化合物用于治疗个体的局限性。
本发明的核酸分子可以插入载体内并用作基因治疗载体。基因治疗载体可以通过例如静脉内注射、局部给药(参见例如美国专利号5,328,470)或通过立体定向注射(stereotactic injection)(参见例如Chen，等，1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：3054-3057)而递送至受治疗者。基因治疗载体的药物制剂可以包括在可接受稀释剂中的基因治疗载体，或可以包括基因递送载体包埋于其中的缓释基质。可选地，在可从重组细胞完全地生成完整基因递送载体，例如逆转录病毒载体的情况下，该药学制剂可以包括一种或多种生成该基因递送系统的细胞。药物组合物可以与给药说明书一起包含在容器、小包或分配器中。
根据现有描述以及优选实施方式的实施例，本领域中普通技术人员应当理解本发明另外的目标和优势，且很明显包括在本发明的范围之内。
说明性实施例
MG53，一种肌肉特异件TRIM家族蛋白的发现。MG53利用先前已建立的一种免疫蛋白质组方法而分离，该方法允许鉴定横纹肌细胞 中与肌形成、Ca信号传导和保持膜完整性相关的新蛋白。简单而言，该方法采用包含～6500个克隆的单克隆抗体库，其从用来自兔骨骼肌的富含三联体的膜免疫接种的小鼠而生成。基于免疫荧光显微镜下观察到的横纹肌断面的z线染色模式来选择感兴趣抗体。靶蛋白通过抗体亲和柱进行纯化，并获得了所纯化蛋白的部分氨基酸序列。基于该部分氨基酸序列，可以从骨骼肌cDNA库中分离编码靶基因的完整cDNA。随后采用同源基因筛选来搜索已鉴定基因的不同异构体在其他兴奋性组织中的存在。最后，产生转基因或敲除小鼠模型以研究感兴趣基因的体内生理功能。
筛选该免疫蛋白质组库中的肌肉特异性蛋白可以特别地利用横纹肌组织鉴定由mAb5259识别的分子大小为53千道尔顿(kDa)的抗原(图3B)。蛋白“MG53”通过mAb5259免疫亲和柱从兔骨骼肌中部分纯化，并进行氨基酸测序。骨骼肌cDNA库筛选和基因组数据库搜索在人16pll.2基因座上鉴定到了所预测的MG53氨基酸序列和相应的mg53基因。mg53mRNA的Nortern印迹证实了骨骼肌和心肌的特异性表达(图3C)。结构域同源性分析表明，MG53包含包括一个环(Ring)、B-盒和卷曲螺旋(RBCC)部分的原型的三联基序以及羧基末端的SPRY结构域(图1、2、和3A)。该SPRY结构域是首先在兴奋性细胞的肌浆网内的斯里兰卡肉桂碱(ryanodine)受体Ca²⁺释放通道内观察到的保守序列。迄今为止在不同哺乳动物基因组内鉴定到的大约60个TRIM家族成员中，15个成员在RBCC结构域之后携带一个类似的SPRY结构域，且MG53表现出与这些TRIM亚家族蛋白的保守性一级结构。
MG53介导肌肉细胞中的囊泡运输。尽管在其一级结构中不存在跨膜节段或脂质修饰基序，但MG53似乎主要限于骨骼肌中的膜结构。免疫组化分析揭示了MG53在肌纤维膜和细胞内囊泡中的特异性标记(图3D)。MG53是一种包含TRIM和SPRY基序的肌肉特异性蛋白。在之前的研究中，我们已经构建了一个单克隆抗体(mAb)库，其针对骨骼肌中与三联管(triad junction)有关的蛋白。筛选该免疫蛋白质组库中的肌肉特异性蛋白可以鉴定到一种分子大小为53千道尔顿(kDa)的命名为MG53的抗原，其可被mAb5259识别。MG53通过结合有 mAb5259的免疫亲和柱从兔骨骼肌中部分纯化，并进行氨基酸测序。基于所获得的部分氨基酸序列，从兔和小鼠骨骼肌库中分离编码MG53的cDNA。基因组库搜索在人16pll.2基因座上鉴定到相应的MG53基因。几个种属中所预测的MG53的氨基酸序列示于图1中。
结构域同源性分析表明，MG53包含RBCC中的原型TRIM特征序列(signature sequence)以及羧基末端的SPRY结构域，因此属于TRIM/RBCC家族(图1)。迄今为止在哺乳动物基因组内鉴定到的大约60个TRIM家族成员中，15个成员在RBCC结构域之后携带一个类似的SPRY结构域，且MG53表现出与这些TRIM亚家族蛋白的保守性一级结构(图2)。然而，令人吃惊且意外的是，我们的研究指出MG53是图2中唯一表现出膜修复功能的TRIM家族蛋白。
蛋白质印迹分析确证了MG53在小鼠组织中的肌肉特异性表达(图3B)。尽管在其一级结构中不存在跨膜节段或脂质修饰基序，但MG53似乎主要限于骨骼肌中的膜结构。用mAb5259进行免疫组化分析显示MG53在骨骼肌纤维的横截面中在肌纤维膜和TT膜中的特异性标记(图3C)。而且，横截面揭示了MG53在肌纤维膜附近的局部集中，比肌纤维膜中完整膜蛋白通常所观察到的具有更宽的染色模式。因此，MG53是一种肌肉特异性TRIM家族蛋白，其表现出TRIM家族蛋白的一种独特的亚细胞分布模式。
进一步的研究显示MG53的膜修复能力在其天然肌肉环境外的细胞中可以是活跃的。我们发现在各种培养的非肌肉细胞类型中的GFP-MG53过表达可完全概括其膜修复能力。我们发现在微电极针穿透(图4A)或暴露于皂角苷洗涤剂引起的膜损伤(图4B)之后GFP-MG53可转移到培养的人气道上皮细胞中的受损部位。为了测试膜重封是否可使用重组MG53蛋白促进，我们在通过滚动玻璃微珠损伤气道细胞之前将重组MG53蛋白应用于气道细胞。MG53可最小化玻璃珠机械分裂培养的气道细胞中的细胞膜(图4C)。
为了测试MG53的应用是否可在体内保护肺组织免受伤害，我们实施进一步的研究以检验MG53是否在通过将脂多糖(LPS)静脉注射到小鼠中内来引起肺伤害的小鼠模型中表现出治疗郊果。在LPS注射之后的MG53静脉应用之后，我们发现对肺结构和功能破坏的显著 保护效果。知道LPS暴露产生对气道上皮层的损伤、肺屏障功能的崩溃、炎症和肺泡结构的损害。为了测量损伤之后的肺屏障功能，在注射LPS24小时之后，收集支气管肺泡灌洗液(BALF)。多条数据线表明暴露于LPS使肺屏障功能崩溃而MG53可以剂量依赖性方式阻止该损伤。在注射LPS之后，看到BALF中细胞数目升高，主要为红血球。注射MG53可以剂量依赖性方式使BALF中细胞外观最小化(图5)。LPS暴露导致BALF中的总蛋白水平升高，这可用MG53蛋白治疗以剂量依赖性方式反转(图6)。BALF中的LDH水平在注射LPS之后显著增加，表明气道上皮的质膜被LPS损坏(图7)。然而，MG53的静脉应用以浓度依赖性方式使BALF中的LDH降低，而BSA蛋白对照没有效果，表明MG53可防止体内气道上皮的急性细胞损伤。
通过MG53防止对肺上皮细胞渗透性的膜损伤还可在该伤害之后保护肺免受结构和功能改变。在伤害之后促成肺病理状态的一个重要方面是炎性反应。我们发现MG53治疗可提供重要炎性细胞活素，白细胞介素-6(IL-6)释放的剂量依赖性提高，表明MG53应用可降低伤害之后的肺炎性反应(图8)。炎症的这种预防还可提高伤害之后肺内出现的水肿的程度(图9)，这表明MG53应该能够改善受损肺内的气体交换。这对于治疗威胁生命的肺损伤症状将是重要的。
经LPS处理的小鼠肺的组织学检查显示预期的空域扩大水平和分裂的肺泡隔。该病理状态由MG53治疗以剂量依赖性方式大大改善(图10)。结构改变的改善包括保护肺内黏膜厚度免于受损坏(图11)。以MG53应用改善肺结构提供了MG53具有对肺损伤的保护作用的直接证据。
示例性方法
如本领域的技术人员将会理解的，某些数量、量、和测量精确地服从理论和/或实际限制，这对于一些仪器和/或方法是固有的。因此，除非另外指出，考虑所要求保护的量涵盖合理的量变化。
MG53的鉴定和克隆-之前已经描述了兔骨骼肌微粒体蛋白的mAb库的制备和筛选。mAb5259(IgGl亚类)的制备和免疫亲和纯化如先前描述而实施(21)。将已纯化的MG53进行氨基酸序列分析，所测定的全部序列均编码于兔MG53cDNA中(数据未示出)。利用 兔的部分氨基酸序列在数据库中进行同源性搜索发现了小鼠和人MG53。从小鼠基因组DNA扩增小鼠MG53基因的外显子区，并利用32p标记的外显子片段筛选兔和小鼠骨骼肌库以得到全长cDNA。
免疫组化和免疫染色分析-免疫组化分析，如先前所描述利用mAb5259进行。如先前所描述利用结合有15nm金颗粒的二抗实施免疫电子-显微镜检查。
细胞培养-用于所有研究的C2C12鼠成肌细胞细胞系均购自American Type Culture Collection(美国标准培养收集所)(弗吉尼亚州马纳萨斯)。在37℃和5％CO₂的潮湿环境中生长细胞，对于C2C12细胞在DMEM培养基中，或者对于CHO细胞在Ham’s F12培养基中，均补充有10％胎牛血清、100单位/ml青霉素和100ug/ml链霉素。为了诱导肌管分化，使C2C12成肌细胞生长至汇合、并使培养基转变为包含2％马血清、青霉素(100U/ml)和链霉素(1OO yg/ml)的DMEM。为了瞬时转染，将C2C12成肌细胞或CHO细胞以70％汇合率铺种于玻璃底皿中。24小时后，利用Gene Jammer试剂(Stratagene)，用上面所描述的质粒转染细胞。对于单次实验而言，转染后24-48小时或在指定时间通过活细胞共焦成像观察细胞。在某些实验中，可在观察前的指定时间使C2C12成肌细胞分化为肌管。
质粒构建-利用在补充表1中描述的引物通过PCR生成全长小鼠MG53cDNA及相关截短突变体。为了构建PCMS-MG53，在用适当的限制性酶消化后，将PCR扩增的cDNA在Nhe I/Xba I位点插入pCMS-EGFP载体(Invitrogen)内。为了构建GFP-MG53、GFP-TRIM、GFP-SPRY，MG53-GFP、TRIM-GFP和SPRY-GFP，PCR产物在Xhol/Xbal位点插入pEGFP-C1中，或在Xhol/Kpnl位点插入pEGFP-N1中。
活细胞成像-为了监测GFP-MG53的细胞内运输，在玻璃底皿(Bioptechs公司)中培养CHO或C2C12细胞，并用上述质粒进行转染。利用BioRad2100Radiance激光扫描共焦显微镜，通过63X1.3NA油浸物镜以3.18s/帧采集荧光图像(512×512)。
肺损伤的小鼠模型-BALB/c小鼠随机分成5组。在实验开始时，这些动物大约18-20g大。将LPS(Sigma)溶解(9mg)在7ml0.9％ 的盐水中。按照以下剂量规程给予实验物品和参考药物：对于组3，在注射LPS之后2h、6h、12h和18h通过臀脉开始给予MG53(6mg/kg)。对于组4，小鼠在LPS激发之后6h接受静脉注射MG53(1.2mg/kg)。对于组5，小鼠在LPS激发之后6h接受静脉注射MG53(6mg/kg)。组2、3、4以及6通过臀脉接受LPS溶液(9mg/kg)注射。组1通过相同途径接受盐水(7ml/kg)。注射LPS24小时之后，以两种方式之一处理小鼠：8只小鼠用于BALF收集，且6只小鼠用于通过湿/干比的水肿测量。
BALF收集-用0.5ml的PBS经由气管插管灌洗肺。再重复进程并从每个肺获取约1.2mL液体(BALF)。通过Bradford试验测量BALF中的总蛋白。使用瑞氏-姬姆萨(Wright-Giemsa)染色来测量BALF中的总细胞和嗜中性细胞数目。使用市售比色试验试剂盒来测量BALF中的LDH和IL-6水平。
病理学分析-在收集BALF之后，从小鼠收集肺组织并用以下方式处理：固定于4％的甲醛溶液，嵌入石蜡，并在聚左旋赖氨酸涂布的载玻片上切片用于苏木精和曙红(H&E)染色。
湿/干重比的测定-立即切除肺、吸干并称重。在烘箱中于65℃下处理7天之后，记录肺干重。肺湿：干重比通过湿重除干重而测定。
应当理解，本文中描述的详细实例和实施方式仅出于示例性目的举例给出，决不能认为对本发明进行限制。可据此对本领域技术人员教导多种修改或变化，并且多种修改或变化包含在本申请的精神和范围之内，并认为在所附权利要求的范围之内。例如，可以改变成分的相对量以优化所需效果，可以加入另外的成分，和/或可以用类似成分替换所述成分中的一种或多种。根据所附权利要求，与本发明的系统、方法、和过程相关的另外有利的特征和功能性将是显而易见的。