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1、10申请公布号CN104066429A43申请公布日20140924CN104066429A21申请号201280056382922申请日20121022102011010752620111020KRA61K31/352200601A61K31/35200601A61P9/10200601A61P9/0020060171申请人韩国海洋科学技术院地址韩国京畿道安山市72发明人任挺汉金一赞金德圭韩世锺李亨锡吴贤哲表晳能74专利代理机构北京律诚同业知识产权代理有限公司11006代理人徐金国54发明名称含有源自拟金发藓的新化合物北美金发藓素F的用于预防或治疗动脉硬化症的组合物57摘要本发明提供一种含有。
2、源自拟金发藓提取物的用于预防或治疗动脉硬化症的组合物，更详细说是提供一种含有从南极苔藓类拟金发藓分离出的苯并萘并呫吨酮系化合物北美金发藓素F作为有效成分的用于预防或治疗动脉硬化症的药学组合物。本发明的含有源自拟金发藓POLYTRICHASTRUMALPINUM提取物的苯并萘并呫吨酮系化合物北美金发藓素F的组合物抑制被TNF诱导的细胞粘附分子的表达，从而能够有效用于治疗及预防动脉硬化症。30优先权数据85PCT国际申请进入国家阶段日2014051686PCT国际申请的申请数据PCT/KR2012/0086862012102287PCT国际申请的公布数据WO2013/058632KO2013042。
3、551INTCL权利要求书2页说明书14页序列表2页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书14页序列表2页附图4页10申请公布号CN104066429ACN104066429A1/2页21一种用于预防或治疗动脉硬化症的药学组合物，其含有由如下化学式I表示的苯并萘并呫吨酮系化合物北美金发藓素F作为有效成分。化学式12根据权利要求1所述的用于预防或治疗动脉硬化症的药学组合物，其特征在于，所述苯并萘并呫吨酮系化合物北美金发藓素F抑制被TNF诱导的细胞粘附分子的表达。3根据权利要求2所述的用于预防或治疗动脉硬化症的药学组合物，其特征在于，所述细胞粘附分子是ICAM。
4、1或VCAM1。4根据权利要求1所述的用于预防或治疗动脉硬化症的药学组合物，其特征在于，对于组合物100重量份，所述苯并萘并呫吨酮系化合物北美金发藓素F含有00110重量份。5一种用于预防或改善动脉硬化的功能性健康食品，其含有由如下化学式I表示的苯并萘并呫吨酮系化合物北美金发藓素F。化学式1权利要求书CN104066429A2/2页3权利要求书CN104066429A1/14页4含有源自拟金发藓的新化合物北美金发藓素F的用于预防或治疗动脉硬化症的组合物技术领域0001本发明涉及一种含有源自拟金发藓提取物的新化合物北美金发藓素F的用于预防或治疗动脉硬化症的组合物、含有源自拟金发藓的新化合物北美金。
5、发藓素F的用于预防或治疗炎症疾病的组合物。背景技术0002动脉粥样硬化症ATHEROSCLEROSIS是一种含有脂肪的粘性液体逐渐沉积在动脉内壁表面上，堵塞通往组织的血流导致组织坏死的血管疾病，如果该组织是脑或心肌，会引发脑卒中及心脏麻痹。动脉硬化症不是因某种特定原因所诱发的单一疾病，而是由年龄、性别、遗传环境、精神压力、肥胖、吸烟、饮酒、摄取不饱和脂肪、糖尿病、减肥等多种因素复合作用所诱发的疾病。0003在动脉硬化的病变中，将产生可称之为是炎症疾病的特异性细胞分子反应。基于这样的原因，最近动脉硬化被视为是一种炎症疾病。在动脉硬化症中，最先被观察到的反应是动脉内膜中存在的内皮细胞ENDOTHE。
6、LIALCELL损伤所引起的功能异常。内皮细胞的功能异常是指对周围刺激表现出可逆变化，其以内皮细胞中的血液中单核细胞MONOCYTE和血小板粘附增加的现象来呈现。引起内皮细胞损伤的诱发物质包括各种细胞激素CYTOKINE、细菌生成物、病毒补体及缺氧等。0004被损伤的内皮细胞中表达的作为细胞粘附分子CELLADHESIONMOLECULE的胞间粘附分子1INTRACELLULARADHESIONMOLECULE1；以下称为ICAM1、血管细胞粘附分子1VASCULARADHESIONMOLECULE1；以下称为VCAM1、E选择素ESELECTIN、P选择素PSELECTIN等粘附于单核细胞表。
7、面上，起到受体的作用。随后，与细胞粘附分子结合的单核细胞透过内皮细胞之间移动到动脉内膜并分化成巨噬细胞。有文献报告表明，由内皮细胞和巨噬细胞分泌的巨噬细胞集落刺激因子MACROPHAGECOLONYSTIMULATIONFACTOR；MCSF参与此分化过程，被分化的巨噬细胞中产生的细胞激素如肿瘤坏死因子TUMORNECROSISFACTOR；TNF等对病程起到重要的作用PETERLIBBY,NATURE,420,6917868874,2002。0005TNFTUMORNECROSISFACTOR是在免疫系统中引发炎症的主要细胞激素，其从免疫细胞中分泌，尤其是被刺激的巨噬细胞中大量分泌。而且，该。
8、细胞激素在刺激细胞时，会发出使细胞死灭的信号和通过核转录因子NFB活性抑制细胞死灭的信号这两个相互矛盾的信号。对于动脉硬化，其诱发新生血管生成、血栓生成增加及出血性坏死等，参与粥样硬化的进程，并且还诱导心肌的炎症反应。0006另外，细胞粘附分子参与多种血管疾病如高血压和动脉硬化等，通过在细胞表面上表达，起到粘附于其它细胞或细胞外基质的作用。其中，ICAM1和VCAM1是属于免疫球蛋白基因超家族IMMUNOGLOBULINGENESUPERFAMILY的膜透性糖蛋白，在诱发急性或慢性炎症状态或疾病的过程中，被如TNF等炎症性细胞激素所调节，在诱发早期动说明书CN104066429A2/14页5脉。
9、硬化的部位的内皮细胞中增加其表达，而在未诱发动脉硬化的部位上则不会被观察到，因此被认为其对动脉硬化发挥作用SHARONJHYDUKETAL,PROGRESSINFLAMMATIONRESEARCH,PART2,141174,2007。另外，ICAM1结合于白血球细胞LEUKOCYTES上表达的整合素INTEGRIN如淋巴细胞功能相关抗原LFA1，VCAM1结合于单核白细胞MONONUCLEARLEUKOCYTES、嗜曙红细胞及嗜碱粒细胞EOSINOPHILSANDBASOPHILS上表达的整合素VLA4INTEGRINVLA4，因此，能够使流入血管壁内的LEUKOCYTES容易蓄积。即，对于动。
10、脉硬化来说，ICAM1及VCAM1可被视为诱发炎症疾病的主要因子。因此，抑制所述ICAM1、VCAM1等细胞粘附分子的表达，将能够预防或治疗血管疾病。0007另外，所述VCAM1虽然在正常状态的血管内皮细胞中不会被表达，但在炎症反应过程中，所述VCAM1被诸多诱发炎症的细胞激素诱导其在血管内皮细胞中的表达，从而介导炎症反应。即，在诸多细胞粘附分子中，VCAM1也被认为是炎症反应中的最重要的介导因子。因此，抑制所述VCAM1细胞粘附分子的表达，将能够预防或治疗炎症疾病。0008另一方面，针对苔藓植物BRYPHYTES中的地钱LIVERWORTS，对于其化学特性的研究已有几十年，但对于在多样的栖息。
11、地中群集化的约10,000种以上的藓苔类，仍未展开有实质性的研究。苔藓类的特性不同于地钱，在地钱中共同发现的细胞内油体OILBODIES在苔藓类中则未被发现。于是，苔藓类被认为是用于开发相对未被开发的新的生物活性代谢物质的天然资源。尤其是，通过对拟金发藓POLYTRICHASTRUMALPINUM等南极苔藓类的研究，正在努力开发可用作为新的生物二次代谢产物的资源。0009为此，韩国授权专利第0957205号揭示了含有从阻碍蛋白质酪氨酸磷酸酶1B的拟金发藓分离的苯并萘并呫吨酮BENZONAPHTHOXANTHENONE系化合物北美金发藓素F作为有效成分的用于降低血糖的药学组合物，然而未进行有对用。
12、于调节细胞粘附分子表达的拟金发藓提取物的相关研究。0010于是，本发明人在探索用于抑制被对治疗动脉硬化症或炎症疾病有效的TNF诱导的细胞粘附分子的表达的物质的过程中发现，南极苔藓类中源自拟金发藓的苯并萘并呫吨酮系化合物北美金发藓素FOHIOENSINF能够抑制被TNF诱导的细胞粘附分子的表达，于是完成了本发明。发明内容0011本发明的目的在于提供一种含有从拟金发藓分离的苯并萘并呫吨酮系化合物北美金发藓素F作为有效成分的用于预防或治疗动脉硬化症的药学组合物。0012为了达到如上所述的目的，本发明提供一种用于预防或治疗动脉硬化症的药学组合物，其含有由如下化学式I表示的源自拟金发藓POLYTRICH。
13、ASTRUMALPINUM的苯并萘并呫吨酮BENZONAPHTHOXANTHENONE系化合物北美金发藓素F作为有效成分。0013化学式10014说明书CN104066429A3/14页60015并且，本发明提供一种用于预防或改善动脉硬化的功能性健康食品，其含有由所述化学式I表示的源自拟金发藓POLYTRICHASTRUMALPINUM的苯并萘并呫吨酮BENZONAPHTHOXANTHENONE系化合物北美金发藓素F作为有效成分。0016并且，本发明涉及一种源自拟金发藓POLYTRICHASTRUMALPINUM的苯并萘并呫吨酮BENZONAPHTHOXANTHENONE系化合物北美金发藓素F。
14、在预防或治疗动脉硬化症上的用途。0017并且，本发明涉及一种用于预防或治疗动脉硬化症的方法，其包括使用源自拟金发藓POLYTRICHASTRUMALPINUM的苯并萘并呫吨酮BENZONAPHTHOXANTHENONE系化合物北美金发藓素F的步骤。0018并且，本发明涉及一种用于预防或治疗炎症疾病的药学组合物，其含有源自拟金发藓POLYTRICHASTRUMALPINUM的苯并萘并呫吨酮BENZONAPHTHOXANTHENONE系化合物北美金发藓素F。0019并且，本发明涉及一种用于预防或改善炎症疾病的功能性健康食品，其含有源自拟金发藓POLYTRICHASTRUMALPINUM的苯并萘并呫。
15、吨酮BENZONAPHTHOXANTHENONE系化合物北美金发藓素F。0020并且，本发明涉及一种源自拟金发藓POLYTRICHASTRUMALPINUM的苯并萘并呫吨酮BENZONAPHTHOXANTHENONE系化合物北美金发藓素F在预防或治疗炎症疾病上的用途。0021并且，本发明涉及一种用于预防或治疗炎症疾病的方法，其包括使用源自拟金发藓POLYTRICHASTRUMALPINUM的苯并萘并呫吨酮BENZONAPHTHOXANTHENONE系化合物北美金发藓素F的步骤。0022根据本发明的含有源自拟金发藓POLYTRICHASTRUMALPINUM的苯并萘并呫吨酮BENZONAPHTH。
16、OXANTHENONE系化合物北美金发藓素F的组合物，通过抑制被TNF诱导的细胞粘附分子的表达，能够有效地用于治疗及预防动脉硬化症或炎症疾病。附图说明说明书CN104066429A4/14页70023图1是测定与北美金发藓素F化学式I的化合物浓度对应的粘附于VSMCS的THP1细胞的图A测定粘附于VSMCS的THP1细胞的图表；B用荧光显微镜测定的粘附于VSMCS的THP1细胞的100倍率照片。0024图2示出与北美金发藓素F化学式I的化合物浓度对应的被TNF处理的粘附分子的表达A通过ELISA测定的VCAM1及ICAM1的表达率图表；B利用WESTERNBLOTASSAY的表现出VCAM1及。
17、ICAM1的蛋白水平的图像。0025图3示出与北美金发藓素F化学式I的化合物浓度对应的被TNF诱导的VCAM1及ICAM1的MRNA的表达A通过RTPCR测定的图像；B测定对于GAPDH的VCAM1及ICAM1的表达的图表。0026图4是测定与北美金发藓素F化学式I的化合物浓度对应的NFB活性及IB降低的图A测定荧光素酶活性的图表；B利用蛋白印迹试验WESTERNBLOTASSAY的测定P65细胞核蛋白水平的图像；C利用蛋白印迹试验的测定IB抗体的图像。0027图5是测定与北美金发藓素F化学式I的化合物浓度对应的PP38、PJNK、PERK及AKT活性的图利用WESTERNBLOTASSAY的。
18、测定PP38、PJNK、PERK及AKT活性的图表；B测定PERK/ERK、PJNK/JNK、PP38/P38、PAKT/AKT比率的图表。0028图6是测定与北美金发藓素F化学式I的化合物浓度对应的ROS生成的结果图表。具体实施方式0029除非有以另外的方式进行定义，本说明书中使用的所有技术用语或科学用语，都具有与本发明所属的技术领域的技术人员通常所理解的含义相同的含义。一般来说，本说明书中使用的命名法是在本技术领域中是公知的，并且是通常使用的。0030在本发明的详细说明等中使用的主要用语的定义如下0031在本发明中，“有效成分”指的是作为主要的成分物质，对于被TNF而增加的细胞粘附分子的表。
19、达表现出抑制功能的主要成分。0032在本发明中，“预防或治疗”指的是包括治疗动脉硬化症，或是事先预防动脉硬化症，或是使因动脉硬化症被恶化的健康状态好转或改善的所有形态。0033在本发明中，“药学上可接受”指的是一种在生理学上可接受的、在给人体使用时通常不会引起如胃肠障碍、眩晕等过敏反应或与之类似的反应的组合物。0034本发明的目的在于提供一种用于预防或治疗动脉硬化症的药学组合物，其含有源自拟金发藓POLYTRICHASTRUMALPINUM的苯并萘并呫吨酮BENZONAPHTHOXANTHENONE系化合物北美金发藓素F作为有效成分。0035本发明的另一目的在于提供一种用于预防或改善动脉硬化的。
20、功能性健康食品，其含有源自拟金发藓POLYTRICHASTRUMALPINUM的苯并萘并呫吨酮BENZONAPHTHOXANTHENONE系化合物北美金发藓素F。0036本发明的另一目的在于提供一种源自拟金发藓POLYTRICHASTRUMALPINUM的苯并萘并呫吨酮BENZONAPHTHOXANTHENONE系化合物北美金发藓素F在预防或治疗动脉硬化症上的用途。说明书CN104066429A5/14页80037本发明的另一目的在于提供一种用于预防或治疗动脉硬化症的方法，其包括使用源自拟金发藓POLYTRICHASTRUMALPINUM的苯并萘并呫吨酮BENZONAPHTHOXANTHENO。
21、NE系化合物北美金发藓素F的步骤。0038本发明的另一目的在于提供一种用于预防或治疗炎症疾病的药学组合物，其含有源自拟金发藓POLYTRICHASTRUMALPINUM的苯并萘并呫吨酮BENZONAPHTHOXANTHENONE系化合物北美金发藓素F作为有效成分。0039本发明的另一目的在于提供一种用于预防或改善炎症疾病的功能性健康食品，其含有源自拟金发藓POLYTRICHASTRUMALPINUM的苯并萘并呫吨酮BENZONAPHTHOXANTHENONE系化合物北美金发藓素F。0040本发明的另一目的在于提供一种源自拟金发藓POLYTRICHASTRUMALPINUM的苯并萘并呫吨酮BEN。
22、ZONAPHTHOXANTHENONE系化合物北美金发藓素F在预防或治疗炎症疾病上的用途。0041本发明的另一目的在于提供一种用于预防或治疗炎症疾病的方法，其包括使用源自拟金发藓POLYTRICHASTRUMALPINUM的苯并萘并呫吨酮BENZONAPHTHOXANTHENONE系化合物北美金发藓素F的步骤。0042在一个方面，本发明涉及用于预防或治疗动脉硬化症的药学组合物，其含有由如下的化学式I表示的源自拟金发藓POLYTRICHASTRUMALPINUM的苯并萘并呫吨酮系化合物北美金发藓素F作为有效成分。0043化学式100440045本发明的源自拟金发藓POLYTRICHASTRUMA。
23、LPINUM的苯并萘并呫吨酮BENZONAPHTHOXANTHENONE系化合物北美金发藓素F通过抑制被TNF诱导的细胞粘附分子的表达，能够预防或治疗动脉硬化症。0046所述被TNF诱导的细胞粘附分子是ICAM1及VCAM1。所述ICAM1和VCAM1是属于免疫球蛋白基因超家族IMMUNOGLOBULINGENESUPERFAMILY的膜透性糖蛋白，在诱发急性或慢性炎症状态或疾病的过程中，被如TNF等炎症性细胞激素所调节，对于动说明书CN104066429A6/14页9脉硬化来说，ICAM1及VCAM1是诱发炎症疾病的主要因子。对此，根据本发明的源自拟金发藓POLYTRICHASTRUMALP。
24、INUM的苯并萘并呫吨酮BENZONAPHTHOXANTHENONE系化合物北美金发藓素F通过抑制被TNF诱导的ICAM1及VCAM1的表达，能够预防或治疗动脉硬化症。0047由所述化学式I表示的苯并萘并呫吨酮BENZONAPHTHOXANTHENONE系化合物北美金发藓素F是利用层析法从所述拟金发藓POLYTRICHASTRUMALPINUM提取物洗脱而分离出。0048由所述化学式I表示的苯并萘并呫吨酮BENZONAPHTHOXANTHENONE系化合物北美金发藓素F的分离方法包括使用选自碳个数为1至4的低级乙醇及其混合物构成的群中的溶剂萃取拟金发藓POLYTRICHASTRUMALPINU。
25、M，利用柱层析法将所述被萃取的拟金发藓POLYTRICHASTRUMALPINUM提取物在80V/V甲醇水溶液甲醇水8020中进行洗脱后，利用反相高效液相色谱法将被洗脱的分划物在4060V/V乙腈CH3CN水溶液CH3CN水40606040中分离出由化学式I表示的化合物。0049利用核磁共振NMR及高分辨电喷雾电离质谱HRESIMS数据对如前所述分离出的化学式I的化合物的结构进行分析的结果，确认其是一种可被分类为称为北美金发藓素OHIOENSINS的苯并萘并呫吨酮BENZONAPHTHOXANTHENONE系的新化合物。因此，本发明人在本发明之前的韩国授权专利第0957205号中将化学式I的化。
26、合物命名为北美金发藓素FOHIOENSINSF。0050在本发明中，对于组合物100重量份，优选地含有拟金发藓POLYTRICHASTRUMALPINUM苯并萘并呫吨酮系化合物北美金发藓素F00110重量份。0051在本发明的实施例中，为了确认利用化学式I的化合物北美金发藓素FOHIOENSINSF进行预处理对ICAM1及VCAM1的表达会产生何种影响，利用血管平滑肌细胞以下称为MOVAS1进行了酶联免疫吸附试验ELISA、细胞粘附试验CELLADHESIONASSAY、逆转录聚合酶链式反应RTPCR、蛋白印迹试验WESTERNBLOTANALYSIS等。其结果可以确认，利用TNF进行处理会增。
27、加的VCAM1的表达，在利用化学式I的化合物北美金发藓素FOHIOENSINSF进行处理后，以浓度依赖性地在MRNA和蛋白水平及细胞表面上减少其表达。另外，在对被多种精神压力诱导的、在细胞的信号传递通路上起重要作用的丝裂原活化蛋白激酶家族MAPKINASEFAMILY和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT的活性进行确认的结果，被TNF而增加的磷酸化PHOSPHORYLATION，在利用化学式I的化合物北美金发藓素FOHIOENSINSF进行处理后，其以浓度依赖性地被减少。0052另外，通过蛋白印迹试验WESTERNBLOTANALYSIS确认出，被认为是由MAPKINASE和AKT活化并对ICAM1及。
28、VCAM1的表达起主要影响的转录因子NFB，所述NFB的由细胞质至细胞核的移动和DNA结合活性，其随着化学式I的化合物北美金发藓素FOHIOENSINSF的浓度增加而被减少。此外，还对参与NFB的由细胞质至细胞核的移动的核因子抑制蛋白IB进行确认的结果，通过利用化学式I的化合物北美金发藓素FOHIOENSINSF进行处理，能够抑制被TNF分解。最后，为了确认化学式I的化合物北美金发藓素FOHIOENSINSF对基于TNF的活性氧ROS的生成会产生何种影响而进行测定的结果，随着化学式I的化合物北美金发藓素FOHIOENSINSF的浓度增加，ROS的生成被减少。说明书CN104066429A7/1。
29、4页100053因此，化学式I的化合物北美金发藓素FOHIOENSINSF抑制ROS生成，导致无法向MAPKINSE、AKT及NFB传递信号，从而使被TNF诱导的ICAM1及VCAM1的表达被抑制。如前所述，仅在诱发动脉硬化的部位上观察到的ICAM1和VCAM1，其被本发明的化学式I的化合物北美金发藓素FOHIOENSINSF所抑制，因此，所述化学式I的化合物能够有效地用于治疗及预防动脉硬化症。0054而且，VCAM1是在正常状态的血管内皮细胞中不会被表达，但在炎症反应期间在血管内皮细胞中被诸多诱发炎症的细胞激素显著地被表达，从而介导炎症反应的最重要的炎症反应介导因子，由于VCAM1也被本发明。
30、的化学式I的化合物北美金发藓素FOHIOENSINSF所抑制，所述化学式I的化合物能够有效地用于治疗及预防炎症疾病。0055根据本发明的用于预防或治疗动脉硬化症或炎症疾病的药学组合物，其除了有效成分以外，还包括药学上可接受的至少一种载体进行制备。在此，药学上可接受的载体包括食盐水、灭菌水、点滴液、缓冲食盐水、葡萄糖溶液、麦芽糖糊精溶液、丙三醇、乙醇及混合其中至少一种使用，根据需要可以添加通常的添加剂如抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂等。另外，也可以额外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂及润滑剂，以制备成水溶液、悬浮液、乳状液等注射用剂型、丸药、胶囊、颗粒或片剂。0056本发明的药学组合物根据所目的。
31、的方法，可以口服给药或非口服给药例如使用于静脉内、皮下、腹腔内或局部上，给药量根据患者的体重、年龄、性别、健康状态、饮食、给药时间、给药方法、排泄率及疾病的严重程度而具有多样的范围。0057本发明的源自拟金发藓POLYTRICHASTRUMALPINUM的苯并萘并呫吨酮BENZONAPHTHOXANTHENONE系化合物北美金发藓素F的一天给药量是约10500MG/KG体重，优选为是20300MG/KG体重，更优选地以一天分一次或多次给药。0058另外，为了预防或治疗动脉硬化或炎症疾病，本发明的药学组合物可以单独使用，或是与手术、放射线治疗、激素治疗、化学治疗及使用生物学反应调节剂的方法结合使。
32、用。0059在另一方面，本发明涉及一种用于预防或改善动脉硬化或炎症疾病的功能性健康食品，其含有由如下化学式I表示的拟金发藓POLYTRICHASTRUMALPINUM苯并萘并呫吨酮系化合物北美金发藓素F。0060化学式10061说明书CN104066429A108/14页110062根据本发明的源自拟金发藓POLYTRICHASTRUMALPINUM的苯并萘并呫吨酮BENZONAPHTHOXANTHENONE系化合物北美金发藓素F，其可以制备成食品形态，以用于预防或改善动脉硬化或炎症疾病。因此，本发明涉及一种作为食品组合物的健康功能食品，其含有源自拟金发藓POLYTRICHASTRUMALPI。
33、NUM的苯并萘并呫吨酮BENZONAPHTHOXANTHENONE系化合物北美金发藓素F作为有效成分。0063本发明的功能性健康食品是一种食品组合物，其包括所有形态如功能性食品FUNCTIONALFOOD、营养补充剂NUTRITIONALSUPPLEMENT、健康食品HEALTHFOOD及食品添加剂FOODADDITIVES等。所述类型的功能性健康食品可根据本领域所公知的常规方法制备成多种形态。例如，作为健康食品，可以将本发明的圆叶茑萝提取物本身制备成茶、果汁及饮料的形态来饮用，或是可以将其颗粒化、胶囊化及粉末化来摄取。另外，作为功能性食品，可以在饮料包括酒精饮料、果实及其加工食品例如水果罐头。
34、、瓶装食品、果酱、橘子酱等、鱼类、肉类及其加工食品例如火腿、香肠、腌牛肉等、面包及面类例如乌冬面、荞麦面、方便面、意大利面、通心面等、果汁、各种饮料、饼干、饴糖、乳制品例如奶油、乳酪等、食用植物油脂、人造黄油、植物性蛋白质、杀菌袋装食品、冷冻食品、各种调味料例如黄豆酱、酱油、调味汁等中添加本发明的拟金发藓POLYTRICHASTRUMALPINUM提取物及从中分离出的苯并萘并呫吨酮系化合物进行制备。0064另外，所述健康功能食品作为食品组合物包括功能性食品、营养补充剂、健康食品、食品添加剂等多种形态，根据本领域所公知的常规方法可以制备成多种形态，例如可以将如前所述的源自拟金发藓POLYTRIC。
35、HASTRUMALPINUM的苯并萘并呫吨酮BENZONAPHTHOXANTHENONE系化合物北美金发藓素F提取物本身制备成茶、果汁及饮料等形态，或是将其颗粒化、胶囊化、粉末化，或是将其提取物添加到饮料、果实及加工食品、鱼类、肉类及其加工食品、面包类、面类、调味料等各种制品中进行制备。0065实施例0066以下，通过实施例对本发明进行更为详细的说明。所述实施例仅是用于例示性地说明本发明，所述实施例并不会被解释为限定本发明的范围，这对于本技术领域的具有通常知识的技术人员来说是显而易见的。说明书CN104066429A119/14页120067实施例1制备拟金发藓POLYTRICHASTRUMA。
36、LPINUM提取物0068拟金发藓POLYTRICHASTRUMALPINUMHEDWGLSM是由本发明的发明人之一JHYIM于2003年1月亲自采集于南极乔治王岛KINGGEORGEISLAND的世宗基地S62133,W58470周边的巴顿半岛BARTONPENINSULAR上。0069将采集的POLYTRICHASTRUMALPINUMHEDWGLSM的干燥样品50G用甲醇1L2萃取24小时后，减压浓缩而取得甲醇粗提取物CRUDEMEOHEXTRACT47G。0070实施例2从拟金发藓分离出苯并萘并呫吨酮系化合物北美金发藓素F0071将所述实施例1中制备的拟金发藓的甲醇粗提取物47G载入于。
37、C18功能性闪式硅胶柱层析C18FUNCTIONALIZEDSILICAGELFLASHCOLUMNCHROMATOGRAPHY,3X15CM,ALDRICH后，按每400ML水中依次分别注入20、40、60、70、80、90及100V/V甲醇混合溶剂，分别获得了分划物。再将使用80甲醇水溶液洗脱的分划物注入于半制备型反相SEMIPREPARATIVEREVERSEPHASE高效液相层析仪HPLC后，将对于水01甲酸FORMICACID以40至60浓度使用乙腈CH3CN的混合溶剂使用约27分钟，分离出化学式I的化合物39MG；TR224分钟。如此分离的化学式I的化合物结构分析及属性记载于韩国授。
38、权专利第0957205号。0072实验例1细胞培养0073血管平滑肌细胞株MOVAS1从美国标准生物品收藏中心ATCCROCKVILLE,MD购得，在含有200MG/MLG418氨基糖苷类抗生素的一种、100IU/ML青霉素、100MG/ML链霉素及10胎牛血清FBSCARLSBAD,CA的DMEM培养基CARLSBAD,CA中，维持37、5CO2的条件进行了培养。在继代培养的情况下，细胞用含有001M乙二胺四乙酸EDTA的0125胰蛋白酶进行了分株，本实验中使用的细胞从第一次至第六次是继代，所有实验均以将MOVAS1相同地配置于单一供体来进行。单核巨噬细胞THP1ATCC、人类骨髓细胞株AH。
39、UMANMYELOMONOCYTICCELLLINE被用于MOVAS1的细胞粘附试验。这些细胞在含有2MML谷氨酰胺、100G/ML链霉素、100IU/ML青霉素、10FBS的RPMI1640培养基的一种中进行了培养。0074实验例2统计学分析0075所有实验结果由平均标准偏差表示，为了调查试验群之间的统计显著性，在P005水平进行了单因素方差分析ONEWAYANOVA和邦费罗尼BONFERRONI事后检验。0076实验例3测定对于被TNF而增加的血管细胞粘附分子表达及单核细胞粘附的抑制性能0077为了测定实施例2的化合物北美金发藓素F对于被TNF而增加的单核球THP1粘附的影响，利用了细胞粘。
40、附试验CELLADHESIONASSAY。细胞粘附试验CELLADHESIONASSAY使用了CHENC等所采用的方法CHENCETAL,CELLSIGNAL,1354353,2001。在细胞粘附试验中，在96孔板WELLPLATE上培养MOVAS1后，用实施例2的化合物北美金发藓素F0110G/ML预处理2小时，添加TNF10NG/ML6小时后，去除培养基并分株了BCECF标签化的THP1细胞25105细胞/孔CELLS/WELL。对于每个实验及对照群样品在各实验中反复实验了3次。在37下培养1小时后，将微孔MICROWELLS用02ML温暖的培养基清洗2次，然后使用CYTOFLOUR235。
41、0MILIPORE,BEDFORD,MA测定荧光强度，从而测定了粘附细胞数。说明书CN104066429A1210/14页130078其结果发现，如图1所示，THP1单核球的粘附与预处理的北美金发藓素F浓度依赖性地被减少。0079另外，为了确认实施例2的化合物北美金发藓素F对于被TNF诱导的粘附分子表达的影响，进行了ELISAENZYMELINKEDIMMUNOSORBENTASSAY测定。ELISA使用了MOSJ等所采用的方法MOSJETAL,JETHNOPHARMACOL,1097886,2007。即，将细胞2104CELL/WELL培养于涂覆有明胶的96孔板后，在37下用实施例2的化合物。
42、北美金发藓素F0110G/ML预处理2小时。为了测定VCAM1及ICAM1的表达，将所述预处理的细胞在含有TNF10NG/ML的新鲜的生长培养基培养了8小时。培养后将所述细胞用PH74的PBS清洗，然后在4下用10戊二醛GLUTARALDEHYDE使其固定化，在此放入牛血精清蛋白10INPBS并在常温下进行非特异性结合NONSPECICBINDING30分钟。所述细胞与ICAM1、VCAM1或标准对照群抗体025G/ML,封闭缓冲液中稀释DILUTEDINBLOCKINGBUFFER一同在4下培养一夜并用PBS清洗后，与碱性磷酸酶共轭羊抗小鼠第二抗体ALKALINEPHOSPHATASECON。
43、JUGATEDGOATANTIMOUSESECONDARYANTIBODY1G/ML,PBS中稀释DILUTEDINPBS一同进行了培养。所述培养的细胞用PBS清洗后，添加了过氧化物酶底物PEROXIDASESUBSTRATE对硝基苯磷酸酯PNITORPHENYLPHOSPHATE1MG/MLIN01M甘氨酸缓冲液GLYCINBUFFER,PH104CONTAINING1MM氯化镁MGCL2,AND1MM氯化锌ZNCL2。使用分子设备公司的酶标仪MOLECULARDEVICEMICROPLATEREADERMENLOPARK,CA在405NM下测定了吸光度。0080其结果发现，如图2A所示，I。
44、CAM1及VCAM1的细胞表面上的表达被TNF诱导。但是，利用北美金发藓素F预处理的样品对于北美金发藓素F的浓度表现出依赖性，并使被TNF诱导的ICAM1及VCAM1的表达显著性地被减少。另外，实施例2的北美金发藓素F使被TNF诱导的ICAM1及VCAM1的蛋白数值显著地被减少图2B所示。在将北美金发藓素F以10G/ML处理的情况下，观察到两个粘附分子表达的显著性减少。另外发现，北美金发藓素F对于肌动蛋白ACTIN的表达并不产生影响，可知对于ICAM1及VCAM1选择性地具有抑制效果。由此可以确认，北美金发藓素F能够抑制ICAM1及VCAM1的表达诱导，所述本发明的北美金发藓素F能够有效用于预。
45、防或治疗动脉硬化症或炎症疾病。0081实验例4测定血管细胞粘附分子MRNA诱导0082为了测定实施例2的化合物北美金发藓素F对被TNF诱导的ICAM1及VCAM1的MRNA表达的影响，使用了RTPCRREVERSTRANSCRIPTIONPOLYMERASECHAINREACTION。萃取的总RNA使用了硫氰酸胍苯酚氯仿一步法GUANIDINIUMTHIOCYANATEPHENOLCHLOROFORM。RNA的收率和纯度在260NM至280NM下以吸光度比率进行了测定。至于聚合酶链式反应PCR，为了识别相应的特定CDNA，使用了ICAM1或VCAM1的特定引物。0083ICAM1的特定引物被合。
46、成如下。0084SEQIDNO1上游引物SENSEPRIMER,5CCTGTTTCCTGCCTCTGAAG3；0085SEQIDNO2下游引物ANTISENSEPRIMER,5GTCTGCTGAGACCCCTCTTG3。0086而且，VCAM1的特定引物被合成如下。说明书CN104066429A1311/14页140087SEQIDNO3上游引物SENSEPRIMER,5CCCAAGGATCCAGAGATTCA3；0088SEQIDNO4下游引物ANTISENSEPRIMER,5TAAGGTGAGGGTGGCATTTC30089磷酸甘油醛脱氢酶聚合酶链式反应GAPDHPCR引物如下0090SE。
47、QIDNO55GGTCCTCAGTGTAGCCCAAG3上游SENSE；0091SEQIDNO65AATGTGTCCGTCGTGGATCT3下游ANTISENSE0092在没有添加引物的情况下，通过阴性对照群样品的RTPCRASSAY常规检查出污染物的不存在。总细胞RNASCELLULARRNAS从血管平滑肌细胞VSMCS分离得出，VCAM1或ICAM1则使用特定探针按RTPCR方法进行分析。VSMCS用多种浓度的北美金发藓素F预处理2小时后，用TNF处理4小时。0093其结果发现，如图3所示，用北美金发藓素F处理的VSMCS显著性地抑制被TNF诱导的VCAM1及ICAM1的表达，根据此结果可。
48、以确认，被TNF诱导的VCAM1及ICAM1的表达，将被北美金发藓素F在转录后阶段POSTTRANSCRIPTIONALLY得到调节。0094所述VCAM1及ICAM1是在未诱发动脉硬化的部位上观察不到的因子，其被认为在动脉硬化中起作用SHARONJHYDUKETAL,PROGRESSINFLAMMATIONRESEARCH,PART2,141174,2007，由所述结果可知，本发明的北美金发藓素F可用于预防或治疗动脉硬化症。并且，VCAM1是炎症反应的重要介导因子，由此可知，抑制VCAM1表达的本发明的北美金发藓素F可用于预防或治疗炎症疾病。0095实验例5测定被TNF诱导的NFB活性抑制0。
49、096NFB是对粘附分子的表达起决定性作用的泛在转录因子UBIQUITOUSTRANSCRIPTIONFACTOR。于此，测定了实施例2的北美金发藓素F对NFB的转录活性的影响。所述细胞用实施例2的北美金发藓素F处理了2小时后，用TNF处理了4小时。为了测定北美金发藓素F对NFB独立转录的影响，使用了转录活化试验TRANSCRIPTIONALACTIVATIONASSAYS。所述TRANSCRIPTIONALACTIVATIONASSAYS按照如下进行将细胞5105CELL/ML分株到6孔板6WELLPLATE上的每个孔WELL。被分株的细胞按照制造商协议MANUFACTURERSPROTOCOL使用从LIFETECHNOLOGIES公司CARLSBAD,CA购得的LIPOFECTAMINEPLUS，并以质体PLASMIDS、PGL3NFBPROMEGA,MADISON,WI及PCMVGALLONZA,WALKERSVILLE,MD进行注入。即，含有PGL3NFB05G及PCMVGAL02G的形质转换混合物混合于LIPOFECTAMINEPLUS试。