快速检测出检疫性杂草长芒苋的环介导等温扩增的引物及其扩增方法和用途.pdf

本发明公开了一种快速检测检疫性杂草长芒苋Amaranthus palmeri的环介导等温扩增的引物及其扩增方法和用途，涉及四条引物，即外引物P-F3，外引物P-B3，内引物P-FIP和内引物P-BIP。四条引物的组合可实现链置换反应，实现针对长芒苋的特异性扩增。反应产物加入显色液，通过颜色变化，肉眼即可判定反应结果。长芒苋环介导等温扩增的特异性引物及其扩增方法可用于检疫性杂草长芒苋基因组DNA的特异快速检测。

权利要求书
1.  一种快速检测出检疫性杂草长芒苋Amaranthus palmeri的环介导等温扩增引物，实现了特异、快速地检测长芒苋A. palmeri，引物序列如下：
长芒苋环介导等温扩增外引物P-F3:
ACAGTGTTTAACTAAAGGCAATA;
长芒苋环介导等温扩增外引物P-B3:
CTGAAATCAACCCGATGAC；
长芒苋环介导等温扩增内引物P-FIP:
CGACCAAGATTTGATGGTCTCAAGAAATCTCCTTCCTATAAATACACC；
长芒苋环介导等温扩增内引物P-BIP:
TCCCTAGGATTAACTTTACCACTCCAATTGAACACCTCTATGAACC；
所述外引物P-F3，外引物P-B3，内引物P-FIP和内引物P-BIP扩增终产物为茎环DNA组成的混合物,即含有若干倍茎长度茎环结构和类似花椰菜的结构，这套特异引物用于从众多苋属植物基因组DNA中特异地、快速地检测出检疫性杂草长芒苋。

2.  一种权利要求1所述的快速检测出检疫性杂草长芒苋Amaranthus palmeri的环介导等温扩增引物及其扩增方法，其特征在于，包括下述的扩增体系，扩增程序：
（1）扩增体系
建立20μL的扩增体系为，包括2×RM Buffer 10.0μL；20 mmol/L P-FIP 1.6μL；20 mmol/L P-BIP 1.6μL；20 mmol/L P-F3 0.2μL；20 mmol/L P-B3 0.2μL；8 U/μL Bst DNA Polymerase 0.8μL；DNA模板4.0μL（约为40ng )；加双蒸水至20μL；
（2）反应程序
设立反应程序：64℃ 保温80 min；80℃灭活10 min，冷却至室温。

3.  如权利要求1所述的快速检测出检疫性杂草长芒苋Amaranthus palmeri的环介导等温扩增引物及其扩增方法在检测长芒苋A. palmeri方面的应用。

说明书快速检测出检疫性杂草长芒苋的环介导等温扩增的引物及其扩增方法和用途
技术领域
本发明设计的快速检测出检疫性杂草长芒苋的环介导等温扩增引物及其扩增方法和用途，属于检疫性草种检测领域。
背景技术
苋属（Amaranthus）隶属苋科（Amaranthaceae），为一年或两年生雌雄同株或异株草本植物，将栽培品种计算在内，世界上共约70种。苋属植物为单性花，按雌、雄单性花是否着生于同一植株，分为雌雄同株和雌雄异株。苋属杂草因其庞大的生物量成为世界各地农田常见的重要杂草。苋属（AmaranthusL.）异株苋亚属(Subgen Acnida L.)植物（即雌雄异株）原产自北美洲，共约10种，其中有5种是危害非常大的杂草，具有检疫意义。其中长芒苋（Amaranthus palmeri S. Wats.）作为代表性种类是美国农田最主要的危害性杂草之一。异株苋亚属杂草已经成为我国禁止进境的检疫性杂草，因此也是口岸杂草检疫关注的重点。自2010年至2013年，口岸截获异株苋杂草种类和次数增长明显，由2010年的1种15次增加到2013年的3种852次，尤其是长芒苋截获增速最为迅猛。截获异株苋亚属杂草长芒苋的货物统计分析表明，美国大豆、美国玉米、美国小麦、美国高粱、美国烤烟、巴西大豆、阿根廷大豆、加拿大大豆、加拿大油菜、乌拉圭大豆等多种来源的货物中都有携带长芒苋杂草。长芒苋杂草作为目前进境最主要的异株苋亚属杂草，由于其自身的生理特点，对我国生态可造成极大的威胁。首先长芒苋杂草适生性较强，其种子温湿度条件适宜时即可萌发，为世界各地农田常见重要杂草之一。一方面，其田间竞争力强，其生长速度极快，生物量庞大，可大量挤占农田光、水、肥等资源，严重限制田间作物生长；另一方面，已知草甘膦为美国孟山都公司于20世纪70年代开发的广谱灭生性传导型除草剂，且草甘膦在我国广为使用，而长芒苋杂草可具备抗草甘膦抗性，不易清除，且易导致作物农药残留超标。更重要的是，长芒苋杂草传入我国的风险很大。由于该杂草结实量巨大，种子细小，可通过大豆、玉米、菜籽等作物贸易进入我国，并在我国大部分地区定殖扩散的可能性极高。其植株较高，在作物收获过程中，常常同作物一起收割。此外，长芒苋亦可通过河流、风力、人类活动、粮谷调运扩散而传播。值得关注的是，长芒苋作为苋属雌雄异株杂草适生性广。若传入我国，极易定殖并扩散危害。其光合作用适宜的温度范围为30~40℃，大多分布在较温暖的地区。而且徐晗等通过气候匹配方法分析，发现我国也是长芒苋适生区。该类杂草耐热，喜湿或中湿，喜阳或半喜阳，在旷野荒地、沼泽地、池塘、河流边、耕地、村落边、仓库周围、加工厂、工地、铁路与公路边、港口、垃圾场和家禽家畜饲养场周围等地均可生长，但在湿润地或水浇地中植株生长得更为茂盛。特别是如今“温室效应”增强，全球气候变暖，若传入我国，长芒苋杂草必将加速扩散。加之原本对草甘膦敏感的长芒苋植株可以通过花粉扩散而获得抗草甘膦长芒苋植株的抗性特征，一旦在新的环境中得以繁衍扩散，将很难根除。而目前异株苋亚属植物的鉴定还主要依据花序形态和着生位置、苞片的形状和大小、花被片的数目和形态、苞片与花被片的比例等形态特征，虽然种子形状和大小，可作为苋属植物的形态学分类依据，但这些性状会在同种或不同居群里发生变化，而且苋属种子细小，不到1mm，苋属栽培种之间以及栽培种和野生种之间存在着广泛的自然杂交，并且属内具有较大的变异范围和可能的渐渗现象，形态上的差异多为并不能截然区分的数量性状，难于准确鉴定到种。总之，长芒苋作为目前进境的最主要的异株苋亚属杂草，其传入我国的风险高，防控难度大，可对农业生产和生态环境构成严重威胁。因此建立一种特异地、快速地检测出检疫性杂草长芒苋的方法，对于严防重要检疫性杂草长芒苋的传入、转出，具有十分重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：设计检测出检疫性杂草长芒苋的一组引物，建立一种快速检测出检疫性杂草长芒苋的扩增引物及其扩增方法和用途。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
1、快速检测出检疫性杂草长芒苋的环介导等温扩增的引物，实现检疫性杂草长芒苋快速检测的特异性引物序列如下：
长芒苋环介导等温扩增外引物P-F3:
ACAGTGTTTAACTAAAGGCAATA;
长芒苋环介导等温扩增外引物P-B3:
CTGAAATCAACCCGATGAC;
长芒苋环介导等温扩增内引物P-FIP:
CGACCAAGATTTGATGGTCTCAAGAAATCTCCTTCCTATAAATACACC;
长芒苋环介导等温扩增内引物P-BIP:
TCCCTAGGATTAACTTTACCACTCCAATTGAACACCTCTATGAACC;
所述引物用于检疫性杂草长芒苋单颗种子基因组DNA的扩增；
2、一种快速检测出检疫性杂草长芒苋的环介导等温扩增的引物扩增方法，包括下述的扩增体系和扩增程序：
（1）扩增体系
建立20μL的扩增体系为，包括2×RM Buffer 10.0μL； 20 mmol/L P-FIP 1.6μL；20 mmol/L P-BIP 1.6μL；20 mmol/L P-F3 0.2μL；20 mmol/L P-B3 0.2μL；8 U/μL Bst DNA Polymerase 0.8μL；DNA模板4.0μL（约为40ng )；加双蒸水至20μL；
（2）扩增程序
设立反应程序：64℃ 保温80 min；80℃灭活10 min，冷却至室温；
3、上述快速检测出检疫性杂草长芒苋的环介导等温扩增的引物及其扩增方法在检测检疫性杂草长芒苋方面的应用。本发明的有益效果是：建立了一种特异、快速地检测检疫性杂草长芒苋Amaranthus palmeri的引物及其扩增方法，能将疫性杂草长芒苋A. palmeri基因组DNA与其他20种苋属植物基因组DNA区别开来，结果判定可肉眼识别，实现了从众多苋属植物中快速检测出检疫性杂草长芒苋。该环介导等温扩增检测体系的建立，简化和方便了对疫性杂草长芒苋A. palmeri的检测，检测快速、简单、可靠，可有效在口岸检测中推广应用。附图说明：
图1是本发明苋属种子基因组DNA环介导等温扩增检测结果图；
具体实施方式：
本发明的检测检疫性杂草长芒苋A.palmeri的环介导等温扩增引物，实现从众多苋属植物中快速检测出检疫性杂草长芒苋A.palmeri。                                                            
设计检疫性杂草长芒苋A.palmeri的环介导等温扩增特异性引物,引物序列如下：
长芒苋环介导等温扩增外引物P-F3:
ACAGTGTTTAACTAAAGGCAATA;
长芒苋环介导等温扩增外引物P-B3:
CTGAAATCAACCCGATGAC;
长芒苋环介导等温扩增内引物P-FIP:
CGACCAAGATTTGATGGTCTCAAGAAATCTCCTTCCTATAAATACACC;
长芒苋环介导等温扩增内引物P-BIP:
TCCCTAGGATTAACTTTACCACTCCAATTGAACACCTCTATGAACC;
本发明建立检测检疫性杂草长芒苋A.palmeri的引物及其扩增方法，包括扩增体系的建立及扩增程序的设立：
（1）扩增体系
建立20μL的扩增体系为，包括2×RM Buffer 10.0μL； 20 mmol/L P-FIP 1.6μL；20 mmol/L P-BIP 1.6μL；20 mmol/L P-F3 0.2μL；20 mmol/L P-B3 0.2μL；8 U/μL Bst DNA Polymerase 0.8μL；DNA模板4.0μL（约为40ng )；加双蒸水至20μL；
（2）扩增程序
设立反应程序：64℃ 保温80 min；80℃灭活10 min，冷却至室温；
本发明设计合成了一套引物，包括长芒苋A.palmeri环介导等温扩增外引物P-F3 /P-B3，长芒苋A.palmeri环介导等温扩增内引物P-FIP /P-BIP，对所有实验材料种子基因组DNA进行环介导等温扩增。                                                                                                  
所述快速检测出检疫性杂草长芒苋的环介导等温扩增的引物及其扩增方法在检测检疫性杂草长芒苋方面的应用。      
本发明建立了简便快速、特异性强、灵敏度高、准确可靠的检疫性杂草长芒苋A.palmeri的环介导等温扩增检测方法，能将A.palmeri与20种苋属植物种子区别开来。该方法的建立为检疫性杂草长芒苋的分子检测提供了特异可行的方法，节约了时间，降低了设备成本，检测快速、结果判定肉眼即可识别，整个过程在3小时内完成，可有效在口岸检测中推广应用。          
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
实施例1：苋属种子基因组DNA的提取
本实验供试种子为A.palmeri同属种子，共计21个种，供试材料的相关信息见表1。采用美国QIAGEN公司的DNeasy Plant Mini Kit提取种子基因组DNA，提取的种子基因组DNA溶于100μL 1×TE缓冲液中，-20℃保存；                                                       
表1 供试材料

 实施例2：苋属种子基因组DNA的环介导等温扩增检测
 环介导等温扩增相关试剂为广州迪澳生物科技有限公司产品；
2.1反应混合液的配置
建立20μL的扩增体系为，包括2×RM Buffer 10.0μL； 20 mmol/L P-FIP 1.6μL；20 mmol/L P-BIP 1.6μL；20 mmol/L P-F3 0.2μL；20 mmol/L P-B3 0.2μL；8 U/μL Bst DNA Polymerase 0.8μL；DNA模板4.0μL（约为40ng )；加双蒸水至20μL；
2.2扩增程序：
设立反应程序：64℃ 保温80 min；80℃灭活10 min，冷却至室温；
2.3结果分析：
向每管扩增产物中加入钙黄绿素显色液1.0μL混匀，观察颜色变化。若颜色由橙色变成绿色，判定为阳性，若颜色保持不变仍为橙色，判定为阴性。如图1所示，样品1至样品21，分别对应实验材料种子基因组DNA (A. palmeri, A. aernicola, A. tuberculatus, A. rudis, A. greggii, A. fimbriatus, A. deflexus, A. standleyanus, A. tamaulipensis, A. paniculatus, A. crispus, A. polygonoides, A. powellii, A. quitensis, A. hybridus, A. retroflexus, A. viridis, A. albus, A. blitoides, A. blitum, A. wrightii ), 22为阴性对照(双蒸水)。显然，阴性对照样品为橙色，表明体系无阳性污染；只有1号长芒苋A. palmeri样品颜色由橙色变成绿色，表明样品在所述引物和扩增程序下得到有效扩增；而苋属其他种的种子基因组DNA样品的产物加入显色剂后，仍然为橙色，表明包括4种异株苋亚属（A. aernicola, A. tuberculatus, A. rudis, A. greggii）在内的共计20种苋属植物种子基因组DNA在所述引物和扩增程序下没有得到扩增。（图1）。综上，所述环介导等温扩增的引物及其扩增方法和用途，可实现从众多苋属植物中快速、特异地检测出检疫性杂草长芒苋A. palmeri。                                                         
以上所述的实施例仅用于本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所做的同等变化和修饰，仍落在本发明的专利范围内。
                                        SEQUENCE LISTING 
 
<110>  天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心
 
<120>  快速检测出检疫性杂草长芒苋的环介导等温扩增的引物及其扩增方法和用途
 
<130>  201501
<160>  4   
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  23
<212>  DNA
<213>  人工合成
<400>  1
ACAGTGTTTAACTAAAGGCAATA                                                              23
<210>  2
<211>  19
<212>  DNA
<213>  人工合成
<400>  2
CTGAAATCAACCCGATGAC                                                                      19                    
<210>  3
<211>  48
<212>  DNA
<213>  人工合成
<400>  3
CGACCAAGATTTGATGGTCTCAAGAAATCTCCTTCCTATAAATACACC   48
<210>  4
<211>  46
<212>  DNA
<213>  人工合成
<400>  4
TCCCTAGGATTAACTTTACCACTCCAATTGAACACCTCTATGAACC        46