一种银杏内酯单体的分离纯化方法 一、技术领域
本发明涉及一种自植物提取物中分离纯化各种单体活性成分的方法，确切地说是自银杏叶提取物中分离纯化银杏内酯类单体的方法。
二、背景技术
银杏叶的成分组成极其复杂，内含多种活性成分，主要有黄酮、萜内酯，此外还有有机酸、烷基酚和烷基酚酸、甾体化合物、微量元素等。银杏叶中的药用成分主要是银杏黄酮类和银杏内酯类物质。
银杏叶提取物(GBE)已列入中华人民共和国药典(2000年版、增补本)。目前按该标准生产的药用GBE，银杏总黄酮含量≥24％、银杏总内酯含量≥6％。
银杏总内酯包括银杏内酯A、B、C、J、M与白果内酯等，属银杏特有成分。在本申请中称其为银杏内酯类单体。据文献报道，银杏总内酯中各单体的药物功能有一定差异。银杏内酯A、B对治疗心脑血管疾病具有显著疗效。而白果内酯对治疗神经系统疾病则药效独特。为提高治疗效果，控制药品质量，开发新型制剂，有时必须将各单体分离纯化。
白果内酯是倍半萜、银杏内酯A、B、C、J、M是二萜类物质。各单体的分子结构较为相似，极性差异很小，致使银杏内酯单体的提取与分离比较困难。
见诸于文献报道的银杏内酯单体主要有醇类提取—萃取—柱色谱分离法、醇类提取—萃取—反相色谱分离法、超临界流体萃取法(SCFE)等。
日本公开特许公报，平3-24084(1991)介绍了溶剂萃取—乙酸铅沉淀—硅胶吸附—重结晶法。其银杏内酯提取工艺流程如下：
萃取除去脂溶性物质，萃余相用低级烷基乙酸酯(或低级酮、苯)萃取，将有机相脱溶干燥，水相酸化后用乙醚(或氯仿、二氯甲烷)萃取，脱水干燥有机相，所得干燥物与前面有机相干燥所得的粉末合并。用低级醇溶解粉末，在溶液中加入乙酸铅，除去沉淀后浓缩滤液，得到银杏内酯粗品。将粗品银杏内酯溶解在有机溶剂中后，通过活性炭、硅胶吸附柱、浓缩流出液，用醇或酮溶解后进行低温重结晶，得到纯品银杏内酯。
日本公开特许公报，平3-264533(1991)介绍了溶剂渗漉—萃取—结晶—柱色谱分离法。其提取银杏内酯工艺流程如下：
银杏叶——60％丙酮——渗滤——过滤——提取物——浓缩——稀释液——离心——滤液——乙酸乙酯/正己烷——萃取——取有机相——活性炭——搅拌——过滤——浓缩——残渣——50％乙醇——溶液——冷却——结晶——柱色谱分离——银杏内酯。
在该工艺中不使用毒性较大的氯仿、四氯化碳等溶剂萃取方法除去脂溶性有害杂质，而是先馏出提取液中的提取溶剂(残留溶剂量不超过10％)，加水稀释并冷却后，使叶绿素、脂肪酸衍生物、双黄酮等难溶于水的物质沉淀出来，通过离心方法予以除去。
还有其它一些溶剂萃取或柱色谱分离方法，原理类似不再赘述。
ZL98111546.2公开了一种《物质成分的超临界流体结晶分离方法》，使用超临界CO2可以分离得到高纯的银杏总内酯。该方法系申请人等首创并获得了中国发明专利。
超临界流体既有近似液体的密度和溶解能力，又具近似气体的扩散系数和粘度，被称为“超级溶剂”。超临界流体的溶解能力随压力、温度、以及所含夹带剂的不同而产生显著性差异。压力、温度及夹带剂的小幅变化可引起溶质溶解度的强烈变化。该发明就是利用超临界流体的这一特性，在萃取釜中设置结晶器，在合理选择夹带剂的基础上，通过控制工作系统的温度与压力等来改变溶质的溶解度，让萃取物流中可结晶成分与非结晶成分分离，实现银杏总内酯的纯化，其工艺流程见附图1。
该法与传统溶剂萃取法相比，具有操作简单，溶剂消耗小，环境友好，生产效率高等优点。
比较上述各分离方法，显然：
在溶剂萃取—乙酸铅沉淀—硅胶吸附—重结晶法中，因使用铅盐，易引起产品中重金属超标，其后处理复杂，得到地仅是银杏总内酯，且产品纯度不高，不便在原料药品生产中采用。
溶剂渗漉—萃取—结晶—柱色谱分离法，其渗漉操作不利于工业化生产，效率较低，柱色谱分离后缺乏进一步纯化措施，故流份收集要求极严，否则难以获得较纯产品。
超临界CO2萃取结晶法可用于分离多种产品。例如，可根据厂家的生产目的和要求，实现银杏叶→优质GBE；GBE粗品→银杏内酯、白果内酯及总内酯；GBE粗品→合格GBE产品的工业化生产。但若用该法生产银杏内酯单体，尚需配套精制纯化工艺及装备。
在现有关于银杏内酯分离纯化的各方法中都未确保所得单体的晶型单一，而不同晶型的单体其理化性能和功效也常有差别。
三、发明内容
申请人发明了自银杏总内酯中分离纯化银杏内酯类单体的方法，这就是使用柱色谱分离—重结晶—超临界CO2精制纯化和晶型整理组合工艺，以制取含量≥90％的银杏内酯类单体。
本发明的特征在于将银杏总内酯加载于柱色谱，混合溶剂梯度洗脱，分别收集各单体较高浓度流份，浓缩，重结晶，最后将粗晶用超临界CO2进行精制纯化和晶型整理。
由于银杏叶提取物(GBE)的制备工艺已较成熟，且市场上已有大量的GBE供应。以GBE(按2000年版中国药典规定的标准)为初始原料，采用超临界流体萃取结晶法或者溶剂萃取法可制得银杏总内酯。本发明的工艺以银杏总内酯为起始原料，生产高纯(含量≥90％)银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C、银杏内酯J、银杏内酯M和白果内酯。其工艺路线见附图2。
本发明所用柱色谱其固定相包括但不限于正相硅胶、反相硅胶、氧化铝、金属螯合树脂、配位色谱填料等。
柱色谱分离采用梯度洗脱。梯度洗脱溶剂包括但不限于水、乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、异丙醇、醋酸、石油醚等。混合溶剂中各溶剂变化范围从1～99％。
粗晶的超临界CO2精制纯化和晶型整理使用申请人发明的ZL98111546.2所公开的结晶分离方法。超临界CO2精制纯化和晶型整理工艺条件为压力≤100MPa，温度≤150℃，夹带剂为乙醇或乙酸乙酯等。
本法的优点是工艺简捷、生产高效、晶型一致、无溶剂残留的多种高纯银杏内酯单体。
例如：利用本发明方法生产银杏内酯A、B、白果内酯，总回收率≥90％，单体最高含量达99.8％，可满足中药化学成分标准对照品的质量要求。
四、附图说明
图1所示是超临界流体萃取结晶工艺流程图。
图2所示是本方法工艺路线图。
五、具体实施方式
现以自银杏总内酯中分离纯化银杏内酯A、银杏内酯B和白果内酯为例，非限定实施例叙述如下：
实施例一：
取含量≥97％的银杏总内酯100g干燥后加到硅胶柱色谱中，以石油醚-乙酸乙酯混合溶剂为流动相(混合比为90∶10～10∶90)，梯度洗脱，收取纯度≥50％的银杏内酯B(GB)流份；真空浓缩GB流份至干，得GB粗品；用乙醇水重结晶；再用超临界CO2精制纯化(操作温度32～100℃，压力10～100MPa，萃取结晶)，以除去微量杂质和溶剂、并调控晶型；干燥；得含量大于99％的GB15～25g(随银杏总内酯原料中GB的含量不同，得率有所变化)；总收率≥90％。
实施例二：
取含量≥97％的银杏总内酯100g。干燥后加到硅胶柱色谱中，以石油醚-乙酸乙酯混合溶剂为流动相(混合比为90∶10～10∶90)，梯度洗脱，收取纯度≥50％的银杏内酯A(GA)流份。真空浓缩GA流份至干，得GA粗品。用乙醇-醋酸-水重结晶，再用超临界CO2精制纯化(操作温度32～150℃，压力10～100MPa)，以除去微量杂质和溶剂，并调控晶型；干燥；可得最高含量为99.8％的GA20～25g(随银杏总内酯原料中GA的含量不同，得率有所变化)；总收率≥85％。
实施例三：
取含量≥97％的银杏总内酯100g。干燥后加到反相硅胶柱色谱上，以甲醇-水混合溶剂为流动相(混合比为95∶5～5∶95)，梯度洗脱，收取纯度≥50％的银杏内酯B(GB)流份。真空浓缩GB流份至干，得GB粗品。用甲醇和水重结晶，再用超临界CO2精制纯化(操作温度32～150℃，压力10～100MPa)，以除去微量杂质和溶剂，并调控晶型；干燥；得含量大于99％的GB25～35g(随银杏总内酯原料中GB的含量不同，得率有所变化)；总收率≥90％。
实施例四：
取含量≥97％的银杏总内酯100g。干燥后加到反相硅胶柱色谱上，以甲醇-水混合溶剂为流动相(混合比为95∶5～5∶95)，梯度洗脱，收取纯度≥50％的银杏内酯A(GA)流份。真空浓缩GA流份至干，得GA粗品。用甲醇和水重结晶，再用超临界CO2精制纯化(操作温度32～150℃，压力10～100MPa)，以除去微量杂质和溶剂，并调控晶型；；干燥；得含量大于99％的GA20～35g(随银杏总内酯原料中GA的含量不同，得率有所变化)；总收率≥90％。
实施例五：
取含量≥97％的银杏总内酯100g。干燥后加到反相硅胶柱色谱上，以乙醇-水混合溶剂为流动相(混合比为95∶5～5∶95)，梯度洗脱，收取纯度≥50％的白果内酯(BB)流份。真空浓缩BB流份至于，得BB粗品。用甲醇和水重结晶，再用超临界CO2精制纯化(操作温度32～150℃，压力10～100MPa)，以除去微量杂质和溶剂，并调控晶型；干燥；得含量大于97％的BB 30～50g(随银杏总内酯原料中BB的含量不同，得率有所变化)，总收率≥90％。