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1、10申请公布号CN104119433A43申请公布日20141029CN104119433A21申请号201410352718722申请日20140723C07K14/415200601C07K1/36200601C07K1/30200601C07K1/18200601A61K38/16200601A61P35/0020060171申请人山西大学地址030006山西省太原市小店区坞城路92号72发明人宋莉常姣李卓玉李汉卿晋晓婷74专利代理机构山西五维专利事务所有限公司14105代理人张福增54发明名称一种栝楼抗肿瘤活性蛋白及其制备方法和应用57摘要本发明提供了一种栝楼抗肿瘤活性蛋白及其制备方法。
2、，以及该蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。其制备方法是将全栝楼粉碎，加入蛋白提取液4搅拌过夜，随后加入预冷的丙酮低温沉淀蛋白，离心后用蛋白提取液溶解得到栝楼粗蛋白；采用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换色谱和凝胶过滤色谱对栝楼粗蛋白中抗肿瘤活性组分进行筛选、分离及纯化，得到栝楼抗肿瘤活性蛋白。该蛋白可明显抑制大肠癌DLD1细胞、乳腺癌MCF7细胞、膀胱癌T24细胞和宫颈癌HELA细胞的存活，可以在制备抗肿瘤药物中应用。51INTCL权利要求书1页说明书3页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页附图2页10申请公布号CN104119433ACN104119433A1。
3、/1页21一种栝楼抗肿瘤活性蛋白，其特征在于，通过包括如下步骤的方法制得第一步取全栝楼，研磨粉碎后，加入蛋白提取液，4下浸泡并搅拌过夜，离心后取上清液，即为栝楼蛋白粗提液；所述的蛋白提取液为磷酸缓冲液；所述的全栝楼和蛋白提取液的质量比为147；第二步在栝楼蛋白粗提取液中加入152倍体积的20预冷的丙酮，沉淀蛋白051小时，4离心，收集沉淀，在20下放置，使丙酮完全挥发，冷冻干燥，得到栝楼粗蛋白；第三步将栝楼粗蛋白用磷酸缓冲液冰上溶解，离心后取上清液，上清液中加入固体硫酸铵，至饱和度为30，再搅拌20分钟，然后离心20分钟，弃去上清液收集沉淀，沉淀加少量磷酸缓冲液溶解，然后将其装入透析袋中，置于。
4、4去离子水中透析48小时，浓缩后冷冻干燥即得到抗肿瘤粗蛋白；第四步将上述抗肿瘤粗蛋白溶解于磷酸盐缓冲液中，离心后取上清液，加入到Q阴离子交换层析柱，收集穿透峰；第五步将上述穿透液浓缩加入到SEPHACRYLS100凝胶过滤柱中，然后用磷酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰，冷冻干燥，纯化得到抗肿瘤活性蛋白。2如权利要求1所述的一种栝楼抗肿瘤活性蛋白，其特征在于，第一步中所述的全栝楼和蛋白提取液的质量比为15。3如权利要求1所述的一种栝楼抗肿瘤活性蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。权利要求书CN104119433A1/3页3一种栝楼抗肿瘤活性蛋白及其制备方法和应用技术领域0001本发明涉及植物蛋白的制备和应。
5、用，具体属于一种栝楼抗肿瘤活性蛋白及其制备方法，以及该蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。背景技术0002栝楼TRICHOSANTHESKIRILOWIIMAXIM为葫芦科植物栝楼属多年生藤本植物。别名瓜篓、药瓜、吊瓜。栝楼适应性强，易成活，较耐寒，在我国主要分布于山东，河南，山西等省区。主要以果实和根部入药，在我国是历史悠久的常用中药材。0003栝楼的药用部位主要包括瓜蒌、瓜蒌子和天花粉。瓜蒌为栝楼的干燥果实，属于常用中药材，始载于神农本草经，性甘、微苦，寒，归肺、胃、大肠经；瓜蒌具有清肺润燥、涤痰宽胸、利气开郁、涤痰散结、甘润解渴、润燥滑肠、清热消肿散结等功效。瓜蒌子又名瓜蒌仁，为栝楼的干燥成熟。
6、种子。瓜蒌子单用药最早见于本草经集注，性甘、寒，归肺、胃、大肠经。具有润肺化痰，滑肠通便之功效。天花粉为栝楼的块根，始载于神农本草经，性甘、微苦、微寒。归肺、胃经。具有清热生津，消肿派脓之功效。栝楼具有多种药理作用，且资源丰富，价格低廉。栝楼的深度开发和有效利用将会带来很高的经济和社会价值。0004对现有技术的文献检索发现，目前国内外关于栝楼抗肿瘤活性蛋白的研究报道较少。报道的主要是以天花粉蛋白为代表的核糖体失活蛋白，但由于天花粉蛋白在临床上应用易引起过敏，发热等不良反应，因此其在临床上的应用逐渐减少。发明内容0005本发明的目的在于提供一种栝楼抗肿瘤活性蛋白及其制备方法，以及该蛋白在制备抗肿。
7、瘤药物中的应用。0006本发明提供的一种栝楼抗肿瘤活性蛋白，通过包括如下步骤的方法制得0007第一步取全栝楼，研磨粉碎后，加入蛋白提取液，4下浸泡并搅拌过夜，离心20分钟后取上清液，即为栝楼蛋白粗提液；离心后的滤渣可重复提取12次；所述的蛋白提取液为磷酸缓冲液1升的磷酸缓冲液体系里含8GNACL，02GKCL，363GNA2HPO412H2O,024GKH2PO4,PH74；所述全栝楼和蛋白提取液的质量比为147，优选为15；0008第二步在栝楼蛋白提取液中加入152倍体积的20预冷的丙酮，沉淀蛋白051小时，4离心，收集沉淀，在20下放置约3040MIN，使丙酮完全挥发，冷冻干燥，得到栝楼粗。
8、蛋白；0009第三步将栝楼粗蛋白用PH74的磷酸缓冲液冰上溶解，离心后取上清液，按硫酸铵溶液饱和度计算表0先加入30饱和度的硫酸铵粉末，充分搅拌溶解后，静置30MIN，离心，收集上清液，再向上清液中加入60饱和度的硫酸铵粉末，充分搅拌溶解后，静置，离心，收集沉淀，用PH74的磷酸缓冲液溶解、透析、浓缩即得到栝楼抗肿瘤粗蛋白；0010第四步将栝楼抗肿瘤粗蛋白用PH74的磷酸缓冲液溶解，过Q阴离子交换层析柱，收集穿透峰。说明书CN104119433A2/3页40011第五步将上述穿透液过SEPHACRYLS100凝胶凝胶层析柱，用PH74的磷酸缓冲液洗脱，收集得到栝楼抗肿瘤活性蛋白。0012第一步。
9、、第三步、第四步、第五步均在04条件下进行。0013采用SDSPAGE凝胶电泳技术，通过与标准分子量对比，栝楼抗肿瘤活性蛋白的分子量约为60KDA。0014经体外抗肿瘤活性检测显示，该栝楼蛋白可明显的抑制大肠癌DLD1细胞、乳腺癌MCF7细胞、膀胱癌T24细胞和宫颈癌HELA细胞的存活，且对正常细胞没有明显影响。该蛋白可以在制备抗肿瘤药物中应用。0015与现有技术相比，本发明获得的抗肿瘤活性的栝楼蛋白经体外抗肿瘤活性检测，该蛋白具有良好的抗肿瘤细胞的活性，而对正常细胞没有明显毒副作用。附图说明0016图1栝楼抗肿瘤活性蛋白SDSPAGE电泳图经SEPHACRYLS100凝胶层析柱纯化后所得纯蛋。
10、白样品，上样量为5G；图中G，目的蛋白；M，标准分子量0017图2栝楼抗肿瘤活性蛋白对细胞存活的影响0018图3栝楼抗肿瘤活性蛋白的质谱鉴定具体实施方式0019实施例1栝楼抗肿瘤活性蛋白的制备00201取20G全栝楼，研磨粉碎后，加入100ML蛋白提取液PH74的磷酸缓冲液，1L缓冲液中含8GNACL,02GKCL,363GNA2HPO412H2O,024GKH2PO4，放在搅拌器上搅拌，于4冰箱中浸泡并搅拌1216小时，4,11000RPM离心10MIN后取上清液，即为栝楼蛋白粗提液。00212将1中获得的栝楼蛋白粗提液中缓慢加入200ML的20下预冷的丙酮，边加边搅拌，将其置于4冰箱放置4。
11、0MIN沉淀，4，11000RPM离心10MIN，弃上清，收集沉淀，将沉淀置于20中1H，使丙酮完全挥发，将沉淀冷冻干燥，获得栝楼粗蛋白。00223将2得到的栝楼粗蛋白用10MLPH74的磷酸缓冲液冰上溶解，离心同上后取上清液，向溶液中逐量缓慢加入164G硫酸铵粉末，饱和度达到30度的静置30MIN，离心同上，收集上清液，再向上清液中缓慢加入181G硫酸铵粉末，饱和度达到60，静置30MIN，离心同上，收集沉淀，用PH74的磷酸缓冲液溶解、透析、浓缩即得到栝楼抗肿瘤粗蛋白；00234将3中的栝楼抗肿瘤粗蛋白用PH74的磷酸缓冲液溶解，进行Q阴离子交换层析，用磷酸缓冲液洗脱，收集穿透峰。0024。
12、5将4穿透液过SEPHACRYLS100凝胶凝胶层析柱，用PH74的磷酸缓冲液洗脱,收集洗脱峰，浓缩得到栝楼抗肿瘤活性蛋白见图1。0025步骤1、3、4、5均在04条件下进行。0026实施例2栝楼抗肿瘤活性蛋白对肿瘤细胞存活的影响0027将对数生长期的DLD1、T24、MCF7、HELA、NCM460细胞，以3103个/孔传入96孔培养板。37，含5的CO2培养箱孵育24H后，分别加入实施例1的栝楼抗肿瘤活性蛋白,说明书CN104119433A3/3页5终浓度分别为5G/ML，10G/ML、20G/ML、40G/ML、60G/ML，设六个复孔，并用含相同体积磷酸缓冲液的培养基作为对照。孵育24。
13、H后，每孔加入MTT溶液5MG/ML20L，继续孵育4H后终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150LDMSO，振荡10MIN,使结晶物充分融解。在酶标仪上570NM波长处，测定各孔光吸收值。0028本发明所得的栝楼抗肿瘤活性纯蛋白，对人几种癌细胞进行上述体外抗肿瘤活性检测，结果表明该蛋白可明显抑制大肠癌DLD1细胞、乳腺癌MCF7细胞、膀胱癌T24细胞和宫颈癌HELA细胞的存活，而对人正常肠上皮细胞NCM460生长基本无影响如图2所示。0029实施例3栝楼抗肿瘤活性蛋白的鉴定0030将纯化出的栝楼抗肿瘤活性纯蛋白送往中国科学院上海生命科学研究院进行质谱鉴定。鉴定结果显示，该栝楼抗肿瘤蛋白跟罗汉果属中的黄瓜素同源性为100如图3所示。说明书CN104119433A1/2页6图1图2说明书附图CN104119433A2/2页7图3说明书附图CN104119433A。