流感病毒胞膜蛋白M2的中和表位及其变异表位与应用 【技术领域】
本发明涉及抗原的表位及其应用，特别涉及流感病毒胞膜蛋白M2的中和表位及其变异表位与应用。
背景技术
流感是一种由病毒引起的常见、多发性传染疾病，对人类特别是老人、儿童以及身体较弱的人有很大的威胁。现有的流感疫苗有以下三种：(1)流感病毒灭活疫苗，该疫苗目前在成人中广泛使用，是利用流感病毒灭活后的病原体制成的。但是该疫苗株需要随流感病毒株抗原性变异而及时更换，否则免疫效果就无保证，甚至无效。由于流感病毒的变异性很强，所以这种疫苗很难确保其预防效果。(2)流感病毒减毒活疫苗，该疫苗于1960年开始大量用于人体，也是利用流感病毒减毒后的病原体制成的。该疫苗株也需要随流感病毒株抗原性变异而及时更换，目前，国内外正在进行新疫苗株地筛选实验。(3)流感病毒亚单位疫苗，该疫苗是目前国外儿童正在使用的流感疫苗，是利用基因重组的病毒表面抗原诱导免疫防护，病毒表面抗原也需要随流感毒株抗原性变异而及时更换，否则免疫效果就无保证，甚至无效。
上述3种正在使用的流感疫苗总的特点是不能对付流感病毒毒株的抗原性变异。流感病毒的变异性很强，抗原性变异不断发生。上述流感疫苗不能对付流感病毒的变异，根本原因是因为上述流感疫苗的设计基本都是基于流感病毒的两个表面胞膜蛋白HA(血凝素)和NA(神经苷酸酶)，国外的大量研究表明，HA和NA的不断变异造成了流感病毒的免疫逃逸，HA和NA的突变率分别为6.7×10-3和3.2×10-3(Annu RevGenet 2002 36 305-332)。
目前，比较多的研究转移到流感病毒的第三种表面胞膜蛋白M2，并且已经有大量的工作是将以M2蛋白的整个胞外区序列(aa1-24)，作为流感病毒新型疫苗的设计靶点。这主要是因为M2蛋白相比HA和NA有突出的保守性，并且大量的研究表明M2蛋白的胞外区序列能够诱导非常有效的防护性免疫反应(Nature Medicine 1999，5：1157-1163；Vaccine 2003，21：2616-2626；Vaccine 1995，13：1339-1342)。
发明创造内容
本发明的目的是提供流感病毒胞膜蛋白M2的中和表位及其变异表位。
本发明所提供的流感病毒胞膜蛋白M2的中和表位是具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的八肽，名称为LM2；流感病毒胞膜蛋白M2的变异表位选自具有下述氨基酸残基序列的八肽之一：
(1)序列表中序列2的氨基酸残基序列；
(2)序列表中序列3的氨基酸残基序列；
(3)序列表中序列4的氨基酸残基序列。
其中，85％人流感病毒具有序列表中序列1的中和表位；7.5％人流感病毒具有序列表中序列2的变异表位；7.5％人流感病毒具有序列表中序列3的变异表位；部分能够感染人类的禽流感病毒具有序列表中序列4的变异表位。
本发明的发明人研究发现流感病毒M2蛋白的胞外区氨基酸序列的N端多肽诱导的抗体能够部分的抑制病毒在MDCK细胞中的繁殖(FEMS Immunol Med Micro 2003 35141-146)，被这个N端多肽中的一段八肽EVETPIRN(aa6-13)与载体的耦联物免疫的小鼠中，有50％的小鼠能够防护免受致死剂量病毒的攻击。
本发明的流感病毒胞膜蛋白M2的中和表位(流感病毒胞膜蛋白M2胞外区的一段氨基酸序列(aa6-13：EVETPIRN))，在所有的人类流感病毒中非常保守(85％的人类流感病毒具备这样的序列)，即使在禽流感中也有突出的保守性，针对流感病毒M2蛋白的序列分析的结果表明，流感病毒胞膜蛋白M2的中和表位((aa6-13：EVETPIRN))序列的变异具有明显的限定性。本发明应用杂交瘤技术得到了针对流感病毒M2蛋白胞外区的中和表位EVETPIRN(aa6-13)的单克隆抗体8C6(亚型IgG2a)。实验证明，经单克隆抗体8C6被动免疫的Balb/C小鼠，可以抵抗流感病毒的攻击，单克隆抗体8C6具有良好的防护性效果；同时，本发明的流感病毒胞膜蛋白M2的中和表位及其变异表位与载体蛋白偶联后还可以作为流感疫苗，在流感的防治中发挥重要作用。
【附图说明】
图1A为单克隆抗体8C6和流感病毒M2蛋白胞外区的氨基酸序列多肽的ELISA测定曲线
图1B为单克隆抗体8C6与流感病毒天然M2蛋白的流式细胞检测识别曲线
图2A为连续覆盖流感病毒M2蛋白胞外区24个氨基酸序列的三段多肽与8C6，以及中和表位八肽EVETPIRN(aa6-13)与8C6的ELISA测定曲线
图2B为流感病毒M2蛋白胞外区包含或者缺失中和表位八肽EVETPIRN(aa6-13)的GST融合蛋白与8C6的免疫印迹图谱
图3为针对图2A和图2B结果的图例式说明
图4为8C6被动免疫小鼠血清中针对流感病毒M2蛋白胞外区M2e序列的抗体滴度曲线及柱状图
图5为攻毒后小鼠的体重随攻毒时间的变化曲线
图6为攻毒后小鼠的存活率随攻毒时间的变化曲线
【具体实施方式】
实施例1、针对流感病毒胞膜蛋白M2的中和表位的单克隆抗体8C6的制备
1、制备具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的中和表位八肽
中和表位八肽EVETPIRN(aa6-13)由上海申能博彩生物科技有限公司采用日本岛津PSSM-8型多肽自动合成仪器合成，采用HP 1050型全自动高压液相色谱分析鉴定。
2、单克隆抗体8C6的制备
动物免疫程序 采用BALB/c小鼠作为免疫动物，以用戊二醛耦联的方法将步骤1中得到的中和表位八肽耦联到BSA上作为免疫原，免疫剂量为50μg(0.1mL)免疫原加等体积完全福氏佐剂乳化，进行首次皮下多点(4点)注射免疫，每点皮下注射50μL。一月后，取同样量免疫抗原加等量不完全福氏佐剂，乳化，进行加强免疫，再过一月后，取同样量免疫抗原不加佐剂腹腔注射进行加强免疫，之后5天采血，测定抗体效价，取脾细胞。
细胞融合与克隆化 取免疫BALB/c小鼠脾细胞，按4∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株。
细胞冻存和复苏 取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成1×106-5×106个/mL的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
单克隆抗体的制备与纯化 采用体内诱生法，将BALB/c小鼠(8周龄)腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7-14天后腹腔注射杂交瘤细胞5×105-106个/只，7-10天后采集腹水。用流感病毒M2蛋白胞外区的氨基酸序列多肽(M2e)特异性的亲和层析柱(Sepharose 4B，Pharmacia Biotech)纯化8C6杂交瘤腹水中(Balb/c)的特异性单克隆抗体，得到单克隆抗体8C6，小瓶分装，-20℃保存。
实施例2、鉴定单克隆抗体8C6识别具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的中和表位八肽的特异性
1、酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定8C6单抗对流感病毒M2蛋白的识别
筛选用的抗原M2e多肽(由美国Genemed Synthesis公司合成，San Francisco，CA，USA)，其氨基酸序列为MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD，将M2e多肽包被在固相的聚苯乙烯ELISA板上(购自Costar)，以实施例1的杂交瘤上清做为第一反应物与抗原室温反应1小时；PBS-Tween(0.05％Tween，购自Sigma)洗涤，不结合的抗体被洗掉；共价耦联辣根过氧化物酶的兔抗鼠Ig-HRP做为显色二抗(购自DAKO)；PBS-Tween洗涤后，加入生色底物邻笨二胺(OPD，购自Sigma)；最后用酶标仪(购自Bio-Rad，model550)测量450nm下的吸光度。结果如图1A所示，表明单克隆抗体8C6能够识别流感病毒M2蛋白胞外区的氨基酸序列。图1A中，M2e为流感病毒M2蛋白胞外区的氨基酸序列多肽。
接着用流式细胞标记检测法(FACS)检测8C6单克隆抗体对流感病毒天然M2蛋白的识别。在107-108个MDCK细胞(购自美国菌种保藏中心，ATCC)中接种105-106的流感病毒A/wuhan/359/95，34摄氏度培养18小时；而后将流感病毒感染后的在细胞表面大量表达M2蛋白的MDCK细胞分成平行的三份(Nature Medicine 1999，5：1157-1163)，与PBS，8C6，114D6分别室温共浴1小时；使用FITC标记的兔抗鼠Ig-FITC(购自DAKO，Danmark)作为发光二抗，用FACSCalibur(购自BD Biosciences，Pharmingen)检测识别情况。如图1B所示，表明单克隆抗体8C6能够识别天然的流感病毒M2蛋白。图1B中，曲线1是PBS与流感病毒天然M2蛋白的识别结果，曲线2是亚型一致的无关单抗114D6(针对猪瘟病毒E2蛋白的单抗，是以猪瘟病毒E2蛋白为免疫原，按照实施例1步骤2中的方法制备)与流感病毒天然M2蛋白的识别结果，曲线3是8C6与流感病毒天然M2蛋白的识别结果。
2、交叉多肽覆盖法(peptide-mapping ELISA)和免疫印迹法(Immunoblottingassay)进一步鉴定8C6单抗识别中和表位八肽的特异性
由Genemed Synthesis公司(San Francisco，CA，USA)合成了能够交叉覆盖流感病毒M2蛋白胞外区氨基酸序列的三段多肽NM2(其氨基酸残基序列为：SLLTEVETPIR)，MM2(其氨基酸残基序列为：ETPIRNEWGCR)和CM2(其氨基酸残基序列为：NEWGCRCNDSSD)。用ELISA方法(除包被抗原为NM2，MM2，CM2和LM2同本实施例的步骤1)初步检测8C6与NM2，MM2和CM2的特异性识别，更进一步，通过检测8C6单抗与中和表位八肽LM2的识别情况，用ELISA的方法基本确定8C6针对EVETPIRN(aa6-13)序列的特异性识别。结果如图2A所示，表明单克隆抗体8C6能够识别包含中和表位八肽主要核心序列的2×NM2(含有2个串联的NM2，其氨基酸序列如图3所示)和2×MM2(含有2个串联的MM2，其氨基酸序列如图3所示)，由于图2A中的2×NM2和2×MM2是重复两次的多肽，因此在ELISA中捕捉抗体的能力强于LM2，吸光度较高；虽然CM2氨基酸序列在流感病毒M2蛋白胞外区氨基酸序列中紧邻中和表位八肽，但是单克隆抗体8C6不能识别没有中和表位八肽的2×CM2(含有2个串联的CM2，其氨基酸序列如图3所示)；同时也表明8C6单抗能够特异性的识别中和表位八肽的LM2(具体的氨基酸序列参见图3)。其中抗体浓度或者抗原浓度分别为10、1、0.1、0.01ug/ml。
用免疫印记的实验方法进一步证明8C6单抗针对中和表位八肽的特异性。应用参考文献(Immunology letters 2004，93：131-136)的方法构建了带有流感病毒M2蛋白胞外区氨基酸序列M2e的GST融合蛋白GST-M2e以及缺失中和表位序列EVETPIRN(aa6-13)的融合蛋白GST-dM2e。将表达GST-M2e和GST-dM2e的106个E.coli细胞在12.5％的SDS-PAGE的条件下进行电泳，而后将电泳后的蛋白条带转移到硝酸纤维素膜(NC)上；对GST-M2e和GST-dM2e的NC膜共同与8C6或者抗GST的抗体(以GST为免疫原按常规方法制备)分别室温共浴1小时；用共价耦联辣根过氧化物酶的兔抗鼠Ig-HRP做为显色二抗(购自DAKO)；最后用原位显色试剂二氨基联苯胺(DAB，购自Sigama)显色。结果如图2B所示，表明8C6单抗能够特异性的识别流感病毒M2蛋白胞外区的中和表位八肽的氨基酸序列。图2B中，泳道1为蛋白marker；泳道2和4为GST-M2e(其氨基酸残基序列如图3)；3和5为GST-dM2e(其氨基酸残基序列如图3)；其中，2和3使用GST抗体标记；4和5使用8C6标记。针对包含或者缺失中和表位八肽的GST融合蛋白的免疫印记实验结果如图2B所示，表明必须有中和表位八肽EVETPIRN序列存在的蛋白才能被8C6识别，而仅仅缺失中和表位八肽EVETPIRN的融合蛋白GST-dM2e不能被8C6识别。图2A和图2B的综合结果如图3所示，图3中，“+”表示能被8C6识别，“-”表示不能被8C6识别。
实施例4、8C6单抗对小鼠的保护效果
用M2e多肽特异性的亲和柱纯化的8C6杂交瘤腹水中(Balb/c)的8C6特异性单克隆抗体，在PBS pH7.2中透析，然后用8C6单克隆抗体被动免疫小鼠。按照100ug-300ug每只每次的数量，免疫10只Balb/C小鼠；对照组被动免疫同样亚型IgG2a的针对其他蛋白序列的单克隆抗体114D6(针对猪瘟病毒E2蛋白的单抗，是以猪瘟病毒E2蛋白为免疫原，按照实施例1步骤2中的方法制备)，同样按照50ug每只每次的数量，免疫10只Balb/C小鼠；另外的阴性对照组被动免疫同样体积的PBS，免疫10只Balb/C小鼠。在被动免疫前的一小时，在被动免疫后的12小时和24小时用ELISA的方法检测所有小鼠血清中针对流感病毒M2蛋白胞外区M2e序列的抗体滴度，结果表明在被动免疫前，小鼠血清中不存在识别M2e氨基酸序列的抗体，在被动免疫后，12小时内，小鼠血清中的识别M2e氨基酸序列的抗体滴度达到了1∶6400(图4)。本实验说明了被动免疫的成功。
在被动免疫后的30小时，对实验组和对照组的所有小鼠以致死量(约10000个活病毒粒子)的小鼠致死型流感病毒(A/PR/8/34)(A/PR/8/34是人甲型流感病毒(H1N1亚型)的代表毒株之一，常为球型，直径80-120nm；负链RNA病毒，基因组全长为13.6Kb，在病毒复制周期中明确的蛋白产物有10个。)进行病毒攻击。在攻击后的30天内每天记录所有小鼠的体重变化，和死亡小鼠的数目。结果如图5和图6所示，表明PBS对照组和同亚型单抗对照组的所有小鼠在攻毒后，体重明显减轻，并且在攻毒后10天内完全死亡，而8C6单克隆抗体被动免疫的小鼠体重减轻不明显，而且在30天内能够恢复体重，75％的小鼠成功抵御致死性流感病毒(A/PR/8/34)的攻击。
序列表
<160>4
<210>1
<211>8
<212>PRT
<213>流感病毒属人流感病毒(Orthomyxoviridae)
<400>1
Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn
1 5
<210>2
<211>8
<212>PRT
<213>流感病毒属人流感病毒(Orthomyxoviridae)
<400>2
Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn
1 5
<210>3
<211>8
<212>PRT
<213>流感病毒属人流感病毒(Orthomyxoviridae)
<400>3
Glu Val Glu Thr Leu Ile Arg Asn
1 5
<210>4
<211>8
<212>PRT
<213>流感病毒属禽流感病毒(Orthomyxoviridae)
<400>4
Glu Val Glu Thr Leu Thr Arg Asn
1 5