免疫学单纯疱疹病毒抗原及其使用方法 本申请要求1998年8月7日提交的美国临时专利申请60/095,723和60/095,724的权利，这两份临时专利申请的全部内容以参考文献方式并入本文。
本文公开的发明获得国立健康研究院(National Institute ofHealth)提供的基金号为AI34616的政府资助。政府在本发明中享有一定的权利。
在整个本申请中参考了各种出版物。这些出版物的公开在此以参考文献方式完整地并入本申请，以更全面地描述本发明相关领域的现状。
本发明的技术领域
本发明涉及可用于治疗和预防单纯疱疹病毒(HSV)感染的分子、组合物和方法。更具体地，本发明鉴定可用于开发刺激或提高HSV特异性免疫的方法、分子和组合物的HSV蛋白表位。
本发明的背景
1型和2型HSV的完整已知DNA序列有大约160kb，编码约85个基因，每个基因编码至少一种蛋白。这些蛋白中的免疫学表位是未知的，每个表位应长约9-12个氨基酸并能引起对病毒感染的有效T细胞免疫应答。
在人体中需要细胞免疫应答来限制复发性HSV感染的严重性。HSV特异性CD4T细胞可对病毒感染细胞具有细胞毒性(M.Yasukawa等，1991，免疫学杂志(J.Immunol.)，146：1341-1347；M.Yasukawa等，1984，免疫学杂志，133：2736-42)。HSV特异性T细胞还可降低HSV感染地HLA匹配细胞中HSV复制的滴度，产生具有抗病毒或免疫调节活性的淋巴因子，或提供特异性B细胞辅助提高抗病毒抗体应答。涉及HSV特异性T细胞的抗原特异性的文献包括：A.G.Langenberg等，1995，Ann.Int.Med.122：889-898；A.Mikloska等，1998，J.Gen.Virol.，79：353-361；J.W.Torseth等，1987，病毒学杂志(J.Virol.)，61：1532-1539；M.Yasukawa等，1985，免疫学杂志，134：2679-2687。
但仍然需要鉴定能够对HSV感染引起有效免疫应答的特异性表位。这些信息可导致鉴定出对HSV感染的防止和治疗有用的更为有效的免疫原性抗原。
本发明概要
本发明提供HSV抗原、含有HSV抗原的多肽、编码这些多肽的多核苷酸、含有这些多核苷酸的载体和重组病毒、呈递这些多肽的抗原呈递细胞(APC)、抗HSV的免疫细胞、以及药物组合物。这些药物组合物既可用于预防也可用于治疗。本发明的抗原可被从疱疹损伤回收的T细胞识别。本发明还提供方法，包括用于防止和治疗HSV感染、杀伤HSV感染细胞、抑制病毒复制、增强抗病毒和/或免疫调节性淋巴因子的分泌以及增强HSV特异性抗体产生的方法。用于防止和治疗HSV感染、增强抗病毒和/或免疫调节性淋巴因子的分泌、增强HSV特异性抗体产生和广义地讲用于刺激和/或提高HSV特异性免疫的方法，包括给对象施用本发明的多肽、多核苷酸、重组病毒、APC、免疫细胞或组合物。用于杀死HSV感染细胞和抑制病毒复制的方法包括用本发明的免疫细胞接触HSV感染细胞。本发明的免疫细胞是经本发明的抗原或呈递本发明抗原的APC刺激的免疫细胞。本发明还提供了产生这些免疫细胞的方法。该方法包括用经修饰呈递本发明抗原的APC，优选树突细胞，接触免疫细胞。在优选实施方案中，该免疫细胞是T细胞如CD4+或CD8+T细胞。
在一个实施方案中，本发明提供含有HSV多肽的组合物。该多肽可包含UL19、UL21、UL49或UL50蛋白或它们的片段，或选自如下序列的多肽：UL19的第1078-1319位氨基酸；UL21的第148-181位氨基酸；UL49的第105-190或177-220位氨基酸；UL50的第118-312位氨基酸；糖蛋白E(gE；US8)的第1-273位氨基酸；VP16的第185-197、209-221或430-449位氨基酸；以及上述多肽的替代变体。本发明还提供编码本发明多肽的分离的多核苷酸和含有该多核苷酸的组合物。此外，本发明提供经遗传修饰表达本发明多核苷酸的重组病毒和含有该重组病毒的组合物。在优选实施方案中，该病毒是牛痘病毒、金丝雀痘病毒、HSV、慢病毒、逆转录病毒或腺病毒。本发明的组合物可是药物组合物。该组合物可选择性地含有药物学上可接受的载体和/或佐剂。
本发明还提供鉴定感染性生物如病毒、细菌或寄生虫的免疫原性表位的方法。在一个实施方案中，该方法包括制备所述生物基因组的随机片段的集合。该方法还包括表达由该集合的片段编码的多肽，并回收表达的多肽。优选地，该多肽表达为不溶性包涵体。在一个实施方案中，该多肽以融合蛋白形式表达，例如采用pUEX载体表达不溶性β-半乳糖苷酶融合蛋白。然后分析表达的多肽引起细胞免疫应答的能力。引起细胞免疫应答的能力指示存在免疫原性表位。
可用基因组片段的亚片段重复以上步骤。该方法可进一步包括基因组片段的测序。在一个实施方案中，所述分析包括进行T细胞增殖测定。该分析可采用来自己暴露于感染性生物的对象的免疫细胞来进行。在优选实施方案中，该细胞来源于主动侵染部位，如皮肤或子宫颈，或来源于感染对象的血液。
本发明还提供通过本发明方法鉴定的免疫原性表位、含有这些表位的多肽、以及编码这些多肽的多核苷酸。适合的感染性生物包括细菌、寄生虫和病毒。病毒的例子包括双链和单链的DNA和RNA病毒。因为不需要生物的核酸序列信息，所以本发明的方法提供了对抗多种感染性生物包括那些表现出极大变异性的感染性生物的策略。
附图简要说明
图1A是表示0.67-0.73图距单位区间的HSV基因组结构的示意图。边界是近似的。图中还显示了HSV-1×HSV-2杂交类型重组病毒(intertypic recombinant viruse，IRV)。HSV-2 DNA用实线表示；HSV-1 DNA用虚线表示，不确定区域用多线条表示。还显示了用于表达克隆的HSV-2 BamH I w片段。
图1B是显示T细胞克隆(TCC)对所标明IRV的增殖应答的柱形图。数据表示为与单纯培养基相比的[3H]胸苷掺入的Δcpm，每种情况中培养基[3H]胸苷掺入的cpm量均少于500cpm。
图2是免疫印迹图，其显示了IRV DX32的UL49基因产物(VP22)的HSV病毒表型的确定。模拟感染细胞和病毒株DX32、HSV-1或HSV-2感染细胞的裂解物经SDS-PAGE分离后，进行印迹，然后用VP22特异性单克隆抗体(mAb)进行探测。蛋白分子量标准(kD)显示于右侧。
图3A显示了采用TCC 4.2E1由HSV-2的VP22中的不同肽表位引起的T细胞增殖的柱形图。抗原呈递细胞(APC)是自体EBV-LCL。抗原包括10ug/ml的β-半乳糖苷酶和融合蛋白以及3uM的肽。数据表示为与单纯培养基相比的[3H]胸苷掺入的Δcpm，每种情况中培养基的[3H]胸苷掺入cpm均少于500cpm。
图3B显示了采用TCC 1.L3D5.10.8由HSV-2的VP22中的不同肽表位引起的T细胞增殖的柱形图。APC是自体PBMC。抗原包括10ug/ml的β-半乳糖苷酶和融合蛋白以及1uM的肽。数据表示为与单纯培养基相比的[3H]胸苷掺入的Δcpm，每种情况下培养基的[3H]胸苷掺入的cpm均少于500cpm。
图3C显示了采用TCC ESL4.9由HSV-2的VP22中不同的肽表位引起的T细胞增殖的柱形图。APC是自体PBMC。抗原包括10ug/ml的β-半乳糖苷酶和融合蛋白以及1uM的肽。数据表示为与单纯培养基相比的[3H]胸苷掺入的Δcpm，每种情况下培养基的[3H]胸苷掺入的cpm均少于500cpm。
图4是显示T细胞克隆BM.17应答HSV-2 VP16的437-449肽的HLA限制成分的线形图。增殖应答对病毒肽浓度作图。抗原呈递细胞是自体的(实心圆)、HLA DQB1*0501纯合的(空心三角)、或HLA DQB1*0201纯合的(正方形)EBV-LCL。
本发明的详细描述
本发明提供对防止和治疗HSV感染有用的HSV抗原。本文公开了经证实可被疱疹损伤来源的T细胞识别的抗原和/或其组成表位。在一些实施方案中，对本发明抗原具有特异性的T细胞显示出对病毒感染细胞的细胞毒活性。负责T细胞特异性的免疫原性抗原的鉴定有利于开发改善的抗病毒治疗和预防策略。含有本发明的抗原或编码该抗原的多核苷酸的组合物提供了用于防止和治疗HSV感染的有效定向疫苗。定义
本申请中使用的所有科学和技术术语除非特别规定否则具有本领域通用的意义。当在本申请中使用时，以下词或词汇具有规定的意义。
本文中，“多肽”包括从天然原料中分离的、通过重组技术产生的或化学合成的蛋白、蛋白片段、和肽。本发明的多肽典型地含有至少约8个氨基酸。
本文中，“HSV多肽”除非另作说明否则包括HSV-1和HSV-2。对HSV蛋白或多肽的氨基酸的引述基于A.Dolan等(A.Dolan等，1998，病毒学杂志，72(3)：2010-2021)所述的关于HSV-2的基因组序列信息。
本文中，“替代变体”是指在指明的氨基酸序列中有一或多个氨基酸替换或缺失的分子，该分子仍保持了被免疫细胞识别的能力。测定分子是否可被免疫细胞识别的一种方法是增殖分析，其描述于D.M.Koelle等，1994，病毒学杂志，68(5)：2803-2810。
本文中，“载体”是指能向宿主细胞递送并优选表达一或多个目的基因或序列的结构。载体的例子包括但不限于病毒载体、裸DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合试剂结合的DNA或RNA表达载体、包在脂质体中的DNA或RNA表达载体，以及某些真核细胞例如生产细胞。
本文中，“表达控制序列”是指指导核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子例如组成型或诱导型启动子或增强子。该表达控制序列可操作地与待转录的核酸序列连接。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚体，并且除非另行限定，包括可以以类似天然存在核苷酸的方式与核酸杂交的天然核苷酸的已知类似物。
本文中，“抗原呈递细胞”或“APC”是指能处理抗原并将抗原呈递给淋巴细胞的细胞。APC的例子包括但不限于巨噬细胞、Langerhans树突细胞、小结树突细胞、B细胞、单核细胞、纤维原细胞和纤维细胞。树突细胞是抗原呈递细胞的优选类型。在许多非淋巴组织中发现树突细胞，但其可通过输入淋巴或血流迁移至淋巴器官的T依赖性区域。在非淋巴器官中，树突细胞包括Langerhans细胞和间质树突细胞。在淋巴和血液中，它们分别包括输入淋巴面纱细胞和血液树突细胞。在淋巴器官中，它们包括淋巴树突细胞和交错突细胞。本文中，除非另行说明，这些细胞类型和其祖细胞均被称作“树突细胞”。
本文中，“经修饰”以呈递表位是指通过天然或重组方法操作以呈递表位的抗原呈递细胞(APC)。例如，该APC可通过暴露于单独的或作为携带肽的混合物一部分的分离抗原来修饰，或通过遗传修饰以表达包含一或多个表位的多肽。
本文中，“药物学上可接受的盐”是指维持母体化合物所期望的生物活性并且不会赋予任何不期望的毒性效果的盐。这样的盐的例子包括但不限于，(a)与无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等形成的酸加成盐；和与有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯甲酸、鞣酸、3-羟-2-萘甲酸、褐藻酸、多聚谷氨酸、萘磺酸、萘二磺酸、多聚半乳糖醛酸形成的盐；(b)含有多价金属阳离子如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等的盐；或(c)与由N，N’-二-苯甲基乙二胺或乙二胺形成的有机阳离子构成的盐；或(d)(a)和(b)或(c)的组合，例如单宁酸锌盐；等。优选的酸加成盐是三氟乙酸盐水和乙酸盐水。
本文中，“药物学上可接受载体”包括任何与活性成分结合时可保持该成分的生物活性并且不与对象的免疫系统反应的物质。例子包括但不限于任何标准药用载体例如磷酸缓冲盐溶液、水、乳剂如油/水乳剂、和各种类型的润湿剂。对于气溶胶或非肠道注射优选的稀释剂是磷酸缓冲盐水或生理(0.9％)盐水。
含有这些载体的组合物的配制可采用熟知的常规方法(见例如Remington制药科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第43章，第14版，Mack出版公司，Easton PA 18042，美国)。
本文中，“佐剂”包括有利于刺激免疫应答的本领域常用佐剂。佐剂的例子包括但不限于辅助肽；铝盐，例如氢氧化铝胶体(明矾)或磷酸铝；Freund氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco实验室，Detroit，MI)；Merck佐剂65(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ)；AS-2(Smith-Kline Beecham)；QS-21(Aquilla)；MPL或3d-MPL(RibiImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，MT)；LEIF；钙盐、铁盐或锌盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生多糖；聚磷腈；生物可降解微球体；单磷酰脂A和quil A；胞壁酰三肽磷脂酰乙醇胺或免疫刺激复合物，包括细胞因子(例如GM-CSF或白介素-2，-7或-12)以及免疫刺激性DNA序列。在一些实施方案中，例如与多核苷酸疫苗一起使用时，佐剂如辅助肽或细胞因子可通过编码佐剂的多核苷酸来提供。
本文中，“一”(不定冠词)除非明确另行指出否则是指至少一个。HSV多肽
在一个实施方案中，本发明提供分离的单纯疱疹病毒(HSV)多肽，其中该多肽包含UL19(主要衣壳抗原，VP5)、UL21、UL49(VP22)或UL50蛋白或它们的片段。在另一个实施方案中，本发明提供选自如下多肽的分离的HSV多肽：UL19的第1078-1319位氨基酸；UL21的第148-181位氨基酸；UL49的第105-190或177-220位氨基酸；UL50的第118-312位氨基酸；糖蛋白E(gE；US8)的第1-273位氨基酸；VP16的第185-197、209-221或430-449位氨基酸；以及以上多肽的替代变体。氨基酸残基参考A.Dolan等，1998，病毒学杂志，72(3)：2010-2021中所述的HSV-2基因组的蛋白质。
该多肽可是融合蛋白。在一个实施方案中，该融合蛋白是可溶的。本发明的可溶性融合蛋白可适于向对象注射和引起免疫应答。在某些实施方案中，多肽可是含有多个本文所述多肽的融合蛋白，或是含有至少一个本文所述多肽和非相关序列的融合蛋白。例如，融合伴侣可参与提供T辅助表位(免疫学融合伴侣)，优选人识别的T辅助表位，或有助于以高于原来重组蛋白的产量表达蛋白质(表达增强子)。某些优选的融合伴侣既是免疫学融合伴侣又是表达增强性融合伴侣。可选择其它融合伴侣以增加蛋白的可溶性或使蛋白能导向所期望的细胞内区室。更进一步地，融合伴侣包括有利于蛋白纯化的亲和标签。
一般可采用标准技术包括化学偶联制备融合蛋白。优选地，融合蛋白在表达系统中以重组蛋白的形式表达，以允许产生相对非融合蛋白更高水平的产量。简单地说，编码多肽成分的DNA序列可独立地组装，然后连入合适的表达载体。编码一个多肽成分的DNA序列的3’端在有或无肽接头的情况下与编码第二个多肽成分的DNA序列的5’端连接，以便这些序列的阅读框相符合。这就允许翻译成保留了两个组成多肽的生物学活性的单一融合蛋白质。
可采用肽接头序列将第一和第二个多肽成份分开足够长的距离，以保证每个多肽都折叠成它的二级和三级结构。这样的肽接头序列可采用本领域熟知的标准技术并入融合蛋白。合适的肽接头序列可根据如下因素选择：(1)能采取柔性伸展构象；(2)不能形成可影响第一和第二多肽的功能性表位的二级结构；以及(3)缺乏可与多肽功能性表位反应的疏水或带电荷残基。优选的肽接头序列含有Gly，Asn和Ser残基。其它接近中性的氨基酸例如Thr和Ala也可在接头序列中使用。可有效地用作接头的氨基酸序列包括那些在如下文献中公开的序列：Maratea等，1985，基因(Gene)40：39-46；Murphy等，1986，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)83：8258-8262；美国专利4,935,233和美国专利4,751,180。该接头序列一般可长1到约50个氨基酸。当第一个和第二个多肽含有可用来分开功能性结构域和防止立体干扰的非必需N端氨基酸区域时，则不需要接头序列。
该连接的DNA序列可操作地连接到适合的转录或翻译调控元件上。负责DNA表达的调控元件位于编码第一个多肽的DNA序列的5’端。同样地，终止翻译所需的终止密码子和转录终止信号存在于编码第二个多肽的DNA序列的3’端。
本发明还提供含有本发明多肽和非相关免疫原性蛋白的融合蛋白。优选地，该免疫原性蛋白能引起记忆应答。这样的蛋白例子包括破伤风、结核和肝炎蛋白(见例如Stoute等，1997，New Engl.J.Med.，336：869)。
在优选实施方案中，免疫学融合伴侣来源于蛋白D，一种革兰氏阴性细菌流感嗜血杆菌B(Haemophilus influenza B)的表面蛋白(WO91/18926)。优选地，蛋白D衍生物含有该蛋白的约头三分之一(例如最初的100-110个N端氨基酸)，而且蛋白D衍生物可以是脂化的。在某些优选实施方案中，在N端包括脂蛋白D融合伴侣的头109个残基，以给多肽提供另外的外源性T细胞表位并增加在大肠杆菌中的表达水平(因此其起到表达增强子的作用)。脂类尾保证抗原最好地呈递给抗原呈递细胞。其它融合伴侣包括流感病毒的非结构蛋白NS1(血球凝集素)。尽管可采用包括T辅助表位的不同片段，但典型地采用N端的81个氨基酸。
在另一个实施方案中，免疫学融合伴侣是被称作LYTA的蛋白或其部分(优选C端部分)。LYTA来源于肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)，该菌合成称作酰胺酶LYTA的N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因编码；基因43：265-292，1986)。LYTA是一种自溶素，其专一降解肽聚糖主链中的特定化学键。LYTA蛋白的C端结构域可亲合胆碱或一些胆碱类似物如DEAE。该性质已被用来开发用于表达融合蛋白的大肠杆菌C-LYTA表达质粒。在氨基端含有C-LYTA片段的杂合蛋白的纯化已有描述(见生物技术(Biotechnology)10：795-798，1992)。在一个优选实施方案中，可将LYTA的重复部分并入融合蛋白。发现在C末端区域从第178个残基开始有一个重复部位。尤其优选的重复部分包括第188-305位残基。
在一些实施方案中，可能希望将治疗试剂和本发明的多肽连接起来，或将本发明的一个以上多肽连接起来。例如，可将一种以上的试剂或多肽直接与本发明的第一个多肽连接，或者采用提供多个附着位点的接头。另外可使用载体。一些分子尤其适合用于细胞间的运输和蛋白的运送，这样的分子包括但不限于VP22(Elliott和O’Hare，1997，细胞(cell)88：223-233；也见Kim等，1997，免疫学杂志(J.Immunol.)159：1666-1668；Rojas等，1998，自然生物技术(NatureBiotechnology)16：370；Kato等，1998，FEBS Lett.427(2)：203-208；Vives等，1997，生物化学杂志(J.Bio.Chem.)272(25)：16010-7；Nagahara等，1998，Nature Med.4(12)：1449-1452)。
载体可以多种方式携带试剂或多肽，包括直接共价连接或通过接头基团进行共价连接。适合的载体包括蛋白质例如白蛋白(例如Kato等的美国专利4,507,234)、肽和多糖例如氨基葡聚糖(例如Shih等的美国专利4,699,784)。载体还可通过非共价结合或包在例如脂质体小泡中来携带试剂(例如美国专利4,429,008和4,873,008)。
一般地，本文所述的多肽(包括融合蛋白)和多核苷酸是分离的。“分离的”多肽或多核苷酸是指从其原始环境中分离出来的多肽或多核苷酸。例如，如果一种天然存在的蛋白与天然系统中的一些或全部共存物分离开，则该蛋白是分离的。优选地，该多肽有至少约90％的纯度，更优选有至少约95％的纯度，最优选有至少约99％的纯度。如果例如一个多核苷酸被克隆至非天然环境一部分的载体中，则该多核苷酸被认为是分离的。
该多肽可从其天然存在的形式中分离、通过重组方式产生或化学合成。本文所述DNA序列编码的重组多肽可采用本领域普通技术人员已知的多种表达载体中的任意一种容易地从DNA序列制备。表达可在任何已转化或转染了表达载体的适合宿主细胞中实现，其中该表达载体含有编码重组多肽的DNA分子。适合的宿主细胞包括原核生物、酵母和高等真核细胞。优选地，所用的宿主细胞是大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞系如COS或CHO。分泌重组蛋白或多肽至培养基的可溶性宿主/载体系统的上清可首先采用商业上可获得的过滤器进行浓缩。浓缩后，浓缩物可在合适的纯化基质例如亲和基质或离子交换树脂上进行纯化。最后，可使用一个或多个反相HPLC步骤进一步纯化重组多肽。
具有少于约100个氨基酸(一般少于约50个氨基酸)的片段或其它变体也可通过合成方式采用本领域普通技术人员熟知的技术产生。例如，这种多肽可采用任何商业上可获得的固相技术如Merrifield固相合成法合成，其中氨基酸被顺序地添加到生长的氨基酸链上(Merrifield，1963，J.Am.Chem.Soc.85：2146-2149)。多肽自动合成仪可从供应商如Perkin Elmer/Applied Biosystems Division(Foster City，CA)购得，并可按厂家说明进行操作。
根据本发明使用的多肽变体可在指明的氨基酸序列中含有一个或多个氨基酸替换、缺失、添加和/或插入，并使由此获得的多肽保持对HSV或HSV感染细胞引起免疫应答的能力。一般可通过修饰本文所述的一个多肽序列，然后采用已知的分析方法如本文所述的T细胞分析方法评价该修饰多肽的反应性来识别这种变体。多肽变体与已知多肽间优选有至少约70％的一致性，更优选有约90％的一致性，最优选有约95％的一致性。这些氨基酸替代包括但并不必然限于本领域称作“保守”的氨基酸替代。
“保守”替代是指一种氨基酸被另一种具有相似性质的氨基酸替代，以致肽化学领域的技术人员可预期该多肽的二级结构和亲水性质没有显著改变。氨基酸替代一般可根据残基的极性、电荷、可溶性、疏水性质、亲水性质和/或双亲性质的相似性来进行。例如带负电荷的氨基酸包括天门冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；亲水值相似的有不带电极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天门冬酰胺和谷氨酰胺；以及丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。其它可表现出保守改变的氨基酸组合包括：(1)ala，pro，gly，glu，asp，gln，asn，ser，thr；(2)cys，ser，tyr，thr；(3)val，ile，leu，met，ala，phe；(4)lys，arg，his；和(5)phe，tyr，trp，his。变体也可或替代性地含有非保守变换。在一个优选实施方案中，变体多肽通过5个或更少氨基酸的替换、缺失或添加而不同于天然序列。变体也可(或作为替代)通过例如缺失或添加对多肽的免疫原性、二级结构和亲水性质影响极微的氨基酸来修饰。多核苷酸、载体、宿主细胞和重组病毒
本发明提供编码本发明一个或多个多肽的多核苷酸。该多核苷酸可包含在载体中。该载体还可含有可操作地与本发明多核苷酸连接的表达控制序列。在一些实施方案中，该载体包括一个或多个编码其它目的分子的多核苷酸。在一个实施方案中，可将本发明的多核苷酸与另外的多核苷酸连接起来以编码一个融合蛋白。
在某些实施方案中，可配制多核苷酸以允许其进入哺乳动物细胞并在其中表达。正如下文描述的，该制剂对于治疗目的尤其有用。本领域普通技术人员将理解有许多方式可实现多核苷酸在靶细胞中的表达，而且可使用任何合适的方法。例如，可将多核苷酸插入病毒载体，所述载体例如但不限于腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒或牛痘或其它痘病毒(如鸟痘病毒)。用于将DNA插入这些载体的技术是本领域普通技术人员所熟知的。逆转录病毒还可转移或包含筛选标记基因(以帮助转导细胞的鉴定或筛选)和/或使载体靶标特异的靶向成分，例如编码特定靶细胞受体的配体的基因。靶向还可通过本领域普通技术人员已知的方法采用抗体来实现。
本发明还提供用本发明载体转化了的宿主细胞。该转化的宿主细胞可在生产本发明多肽的方法中使用。该方法包括培养宿主细胞并回收所产生的多肽。回收的多肽可从培养物上清中纯化。
本发明的载体可用于体内、离体或体外遗传修饰细胞。遗传修饰细胞的几种方法是已知的，其包括直接或通过逆转录病毒生产细胞用病毒载体进行转导或感染、磷酸钙沉淀、受体细胞与含有DNA的细菌原生质体融合、用含有DNA的脂质体或微球体处理受体细胞、DEAE葡聚糖法、受体介导的内吞、电穿孔、微注射以及许多技术人员已知的其它技术。见例如Sambrook等，分子克隆实验手册(Molecular cloning-A Laboratory Manual)(第二版)1-3，1989；和当代分子生物学方法(Current Protocols in Molecular Biology)，F.M.Ausubel等编，Green Publishing Associates公司和John Wiley&Sons公司(1994增补)。
病毒载体的例子包括但不限于基于例如HIV、SIV、鼠源逆转录病毒、长臂猿的猿白血病病毒的逆转录病毒，以及其它病毒例如腺伴随病毒(AAV)和腺病毒(Miller等，1990，分子细胞生物学(Mol.Cell.Bio.)10：4239；J.Kolberg 1992，NIH Res.4：43，和Cornetta等1991，Hum Gene Ther.2：215)。广泛使用的逆转录病毒包括基于如下病毒和其组合的病毒：鼠源白血病病毒(MuLV)、长臂猿的猿白血病病毒(GaLV)、亲嗜性逆转录病毒、猴免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)。见例如Buchscher等1992，病毒学杂志66(5)：2731-2739；Johann等1992，病毒学杂志，66(5)：1653-1640；Sommerfelt等1990，病毒学176：58-59；Wilson等1989，病毒学杂志63：2374-2378；Miller等1991，病毒学杂志65：2220-2224；和Rosenberg和Fauci 1993，基础免疫学(Fundamental Immunology)，第三版，W.E.Paul(编)，Raven Press，Ltd.，New York，及其中的参考文献；Miller等1990，分子细胞生物学10：4239；R.Kolberg 1992，J.NIH Res.4：43；和Cornetta等1991，Hum Gene Ther.2：215。
适于扩增序列以便将其亚克隆至表达载体的体外扩增技术是已知的。该体外扩增方法的例子包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、Qβ复制酶扩增以及其它RNA聚合酶介导的技术(如NASBA)，可参见Sambrook等1989，分子克隆实验手册(第二版)1-3；以及美国专利4,683,202；PCR手册：方法和应用指南(PCR Protolols：A Guide to Methods and Applications)(Innis等编)Academic Press公司，San Diego，CA 1990。克隆体外扩增核酸的改进方法在美国专利5,426,039中有描述。
本发明还提供经遗传修饰表达本发明多核苷酸的重组微生物。该重组微生物可用作疫苗，并可采用本领域已知的减毒活疫苗制备技术制备。用作活疫苗的微生物的例子包括但不限于病毒和细菌。在一个优选实施方案中，该重组微生物是病毒。适合的病毒的例子包括但不限于牛痘病毒、金丝雀痘病毒、逆转录病毒、慢病毒、HSV和腺病毒。组合物
本发明提供对治疗和防止HSV感染有用的组合物。该组合物可用于抑制病毒复制和杀死病毒感染细胞。在一个实施方案中，该组合物是药物组合物。该组合物可包含治疗或预防上有效量的本发明多肽、多核苷酸、重组病毒、APC或免疫细胞。有效量是指足以通过例如激活T细胞引起或提高免疫应答的量。T细胞激活的一种测量方法是增殖分析，其描述于D.M.Koelle等，1994，病毒学杂志，65(5)：2803-2810。在一些实施方案中，该组合物是疫苗。
该组合物可选择地包括载体，例如药物学上可接受的载体。药物学上可接受载体部分地是由施用的特定组合物以及施用该组合物的特定方法决定的。因此，本发明药物组合物的适合制剂有非常多的种类。适用于非肠道施用例如通过关节内(关节中)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和皮下途径施用的制剂和载体包括等渗无菌注射水溶液以及水和非水无菌悬液，其中等渗无菌注射水溶液可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使该制剂与预期接受者的血液等渗的溶质，水和非水无菌悬液可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、防腐剂、脂质体、微球体和乳化剂。
本发明的组合物可进一步含有一种或多种佐剂。佐剂的例子包括但不限于辅助肽、明矾、Freund氏佐剂、胞壁酰三肽磷脂酰乙醇胺或免疫刺激复合物，包括细胞因子。在一些实施方案中，例如和多核苷酸疫苗一起使用时，佐剂如辅助肽或细胞因子可通过编码该佐剂的多核苷酸来提供。疫苗制备一般可参见例如M.F.Powell和M.J.Newman编“疫苗设计(亚单位和佐剂方法)(Vaccine Design(the subunit andadjuvant approach))”Plenum Press(NY，1995)。属于本发明范畴的药物组合物和疫苗还可含有其它成分，这些成分可以是有生物活性的也可是没有活性的。例如，其它病毒抗原的一个或多个免疫原性部分可通过并入融合肽或作为独立成分存在于该组合物或疫苗中。
药物组合物或疫苗可含有编码一个或多个本发明多肽的DNA，以便该多肽可原位产生。如上所述，该DNA可存在于本领域普通技术人员已知的多种递送系统的任意一种中，包括核酸表达系统、细菌和病毒表达系统。许多基因递送技术是本发明领域所熟知的，例如描述于Rolland，1998，Crit. Rev. Therap.Drug Carrier Systems15：143-198及其引用的参考文献中的基因递送技术。合适的核酸表达系统含有为在患者中表达所必需的DNA序列(例如合适的启动子和终止信号)。细菌递送系统涉及施用在其细胞表面表达多肽的免疫原性部分或分泌这种表位的细菌(例如Bacillus-Calmette-Guerrin)。在一个优选实施方案中，该DNA可采用病毒表达系统(例如牛痘或其它痘病毒、逆转录病毒、或腺病毒)导入，该病毒表达系统可涉及使用非致病性(缺陷型)可复制病毒。适合的系统公开于例如Fisher-Hoch等，1989，美国科学院院刊86：317-321；Flexner等，1989，Ann.My Acad.Sci.569：86-103；Flexner等，1990，疫苗(Vaccine)8：17-21；美国专利4,603,112，4,769,330和5,017,487；WO 89/01973；美国专利4,777,127；GB 2,200,651；EP 0,345,242；WO 91102805；Berkner，1988，生物技术(Biotechniques)6：616-627；Rosenfeld等，1991，科学(Science)252：431-434；Kolls等，1994，美国科学院院刊91：215-219；Kass-Eisler等，1993，美国科学院院刊90：11498-11502；Guzman等，1993，Circulation 88：2838-2848；和Guzman等，1993，Cir.Res.73：1202-1207。将DNA插入这些表达系统的技术是本领域普通技术人员所熟知的。该DNA还可以是“裸露的”，见例如Ulmer等，1993，科学259：1745-1749中所述以及Cohen，1993，科学259：1691-1692的综述。裸DNA的摄取可通过将该DNA包被在可有效转运进入细胞的生物可降解珠上来增加。
尽管在本发明的药物组合物中可采用任何本领域普通技术人员已知的适合载体，但载体的类型将根据施用方式改变。本发明的组合物可配制成适于任何合适的施用方式，包括例如局部、口服、鼻腔、静脉内、颅骨内、腹膜内、皮下或肌肉内施用。对于非肠道施用例如皮下注射，载体优选包括水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲剂。对于口服施用，可采用以上任意一种载体或固体载体例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。也可将生物可降解微球体(例如聚(乳酸-乙醇酸))作为载体用于本发明药物组合物。适合的生物可降解微球体公开于例如美国专利4,897,268和5,075,109。
这些组合物还可含有缓冲物(例如中性缓冲盐水或磷酸缓冲盐水)、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸例如甘氨酸、抗氧化剂、螯合剂例如EDTA或谷胱甘肽、佐剂(例如氢氧化铝)和/或防腐剂。作为替代，本发明组合物可制备成冻干物。也可采用熟知的技术将组合物的成分装入脂质体。
在本发明疫苗中可使用任何各种佐剂。大多数佐剂含有设计用于防止抗原快速代谢的物质例如氢氧化铝或矿物油，以及免疫应答刺激物例如脂质A、百日咳博德特氏菌(Bortadella pertussis)或结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)来源的蛋白。多种适合的佐剂可通过商业途径获得，例如Freund氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco实验室，Detroit，MI)；Merk佐剂65(Merk and Company，Inc.，Rahway，NJ)；铝盐如氢氧化铝胶体(明矾)或磷酸铝；钙盐、铁盐或锌盐；酰化酪氨酸的不溶性悬液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生化多糖；聚磷腈生物可降解微球体；单磷酰基脂A和quilA。细胞因子如GM CSF或白介素-2、-7和-12也可用作佐剂。
在本文提供的疫苗中，佐剂组合物优选设计成诱导主要是Th1型的免疫应答。高水平的Th1型细胞因子(例如IFN-γ、IL-2和IL-12)倾向于促进诱导对施用抗原的细胞介导免疫应答。相反，高水平的Th2型细胞因子(例如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和TNF-β)倾向于促进诱导体液免疫应答。在使用本文提供的疫苗后，患者将维持包括Th1-和Th2-型应答的免疫应答。在应答主要是Th1-型应答的一个优选实施方案中，Th1-型细胞因子的水平将比Th-2型细胞因子的水平有更大程度的增加。采用标准实验可容易地估计这些细胞因子的水平。关于细胞因子家族的综述参见Mosmann和Coffman，1989，Ann.Rev.Immunol.7：145-173。
用于引起主要是Th-1型的应答的优选佐剂包括例如单磷酰脂A(优选3-去-O-酰化单磷酰脂A(3D-MPL))和铝盐的组合。MPL佐剂可获自Ribi ImmunoChem Research公司(Hamilton，MT)(见美国专利4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094)。含有CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸未甲基化)也可诱导主要是Th1型的应答。这样的寡核苷酸是人们熟知的，并描述于例如WO 96/02555中。另一种优选佐剂是皂角苷，优选QS21，其可单独使用或和其它佐剂联合使用。例如，一种增强系统包含单磷酰脂A和皂角苷衍生物的组合，例如WO 94/00153中所描述的QS21和3D-MPL的组合，或WO 96/33739中所描述的较小反应原性组合物(其中QS21被胆固醇抑制)。其它优选制剂包括水包油乳剂和维生素E。一种尤其有效的佐剂制剂涉及溶于水包油乳剂的QS21、3D-MPL和维生素E，其描述于WO 95/17210。另一种可用佐剂是AS-2(Smith-Kline Beecham)。本文提供的任何疫苗均可采用联合抗原、免疫应答增强剂与适合载体或赋形剂的熟知技术来制备。
本文所述组合物可作为持续释放制剂(即可在施用后实现组成成分的缓慢释放的制剂如胶囊或海绵)的一部分来施用。该制剂一般可采用熟知技术制备，并通过例如口服、直肠或皮下植入，或在需要的靶位置植入的方式施用。持续释放制剂可含有多肽、多核苷酸或抗体，这些物质分散在载体基质中和/或包含在限速膜包裹的贮藏室中。在这些制剂中使用的载体是生物适合的，并且还可以是生物可降解的；优选地，该制剂提供相对恒定的活性成分释放水平。包在持续释放制剂中的活性成分的量取决于植入位点、释放的速率和期望的持续时间以及待治疗或防止的疾病的性质。
在药用组合物和疫苗中可使用任意各种递送载体以利于产生靶向HSV感染细胞的抗原特异性免疫应答。递送载体包括抗原呈递细胞(APC)如树突细胞、巨噬细胞、B细胞、单核细胞和其它可改造成有效APC的细胞。这些细胞可以但不必定进行遗传修饰以增强呈递抗原的能力，改善T细胞应答的激活和/或维持，使其本身具有抗病毒作用和/或与受者在免疫学上相容(即匹配的HLA单倍体型)。APC一般可分离自多种生物液体和器官，包括肿瘤和肿瘤周围组织，而且其可以是自体的、同种异体的、同种的或异种的细胞。
本发明的某些优选实施方案采用树突细胞或其祖细胞作为抗原呈递细胞。树突细胞是高效的APC(Banchereau和Steinman，自然(Nature)392：245-251，1998)，并且已证明该细胞作为生理学佐剂可有效地引起预防性或治疗性免疫(见Timmerman和Levy，Ann.Rev.Med.50：507-529，1999)。通常，树突细胞可根据其典型形状(在原位置为星性，在体外具有可见的显著细胞质突起(树突))和按标准分析确定的B细胞(CD19和CD20)、T细胞(CD3)、单核细胞(CD14)和自然杀伤细胞(CD56)分化标记的缺乏来鉴定。当然，树突细胞可进行改造以表达通常不出现在体内或离体树突细胞上的特异性细胞表面受体或配体，而且本发明也包括该修饰的树突细胞。作为树突细胞的替代物，可在疫苗中使用携带分泌小泡抗原的树突细胞(称作外来体)(Zitvogel等，1998，Nature Med.4：594-600)。
树突细胞和祖细胞可获自外周血、骨髓、肿瘤浸润细胞、肿瘤周围组织浸润细胞、淋巴结、脾、皮肤、脐带血或任何其它适合的组织或体液。例如，树突细胞可通过向获自外周血的单核细胞培养物中加入细胞因子组合例如GM-CSF、IL-4、IL-3和/或TNF-α进行离体分化。此外，可通过向培养基添加GM-CSF、IL-3、TNFα、CD40配体、LPS、flt3配体和/或其它诱导树突细胞成熟和增殖的化合物的组合来分化获自外周血、脐带血或骨髓的CD34阳性细胞。
树突细胞可方便地划分为“未成熟”和“成熟”细胞，这样就允许以一种简单的方式区分两种极为特征化的表型。然而，该命名不应理解为排除了所有可能的中间分化阶段。未成熟树突细胞的特征是，它是具有高抗原摄取和加工能力的APC，并与Fcγ受体、甘露糖受体和DEC-205标记的高表达相关联。成熟表型的典型特征是这些标记表达较低，而负责T细胞激活的细胞表面分子如MHC I类和II类分子、粘连分子(如CD54和CD11)和共刺激分子(如CD40、CD80和CD86)则高表达。一般可用编码多肽(或其部分或其它变体)的多核苷酸转染APC，以便该多肽或其免疫原性部分在该细胞表面表达。该转染可离体进行，然后如本文所述，含有该转染细胞的组合物和疫苗可用于治疗目的。另外，可给患者施用靶向树突或其它抗原呈递细胞的基因递送载体，导致转染在体内发生。例如，一般可采用本领域已知的任何方法进行树突细胞的体内和离体转染，如WO 92/24447中所述的方法或Mahvi等，1997，免疫学和细胞生物学(Immunology and CellBiology)75：456-460中所描述的基因枪法。树突细胞的抗原装载可通过树突细胞或祖细胞与肿瘤多肽、DNA(裸露的或在质粒载体中)或RNA；或与表达抗原的重组细菌或病毒(例如牛痘病毒、禽痘病毒、腺病毒或慢病毒载体)一起孵育来实现。在装载之前，多肽可与提供T细胞辅助的免疫学伴侣(例如载体分子)共价连接。此外，可单独或在该多肽存在时用非连接的免疫学伴侣刺激树突细胞。组合物的施用
处理包括预防和治疗。可通过在一个时间点或多个时间点一次直接注射来实行预防或治疗。也可在多个部位几乎同时施用。
患者或对象包括哺乳动物如人、牛、马、犬、猫、猪和羊类动物。
典型地，组合物通过如下途径进行体内施用：非肠道途径(如静脉内、皮下和肌肉内)或其它传统直接途径例如口腔/舌下、直肠、口、鼻、局部(如透皮或眼内)、阴道、肺、动脉内、腹膜内、眼内、或鼻内途径，或直接进入特定组织。
组合物的施用可采用任何合适的方式，并常常和药物学上可接受载体一起施用。给患者施用本发明所述细胞的适合方法是现成的，而且尽管有不止一种途径可用来施用特定的细胞组合物，但通常某个特定途径会比其它途径提供更快速和更有效的反应。
根据本发明，施用给患者的剂量应足以在一段时间内为该患者引起有益的治疗反应，或抑制感染或感染导致的疾病。因此，给患者施用的该组合物的量应足以引起针对特异抗原的有效免疫应答和/或减轻、降低、治愈或至少部分缓解疾病或感染引起的症状和/或并发症。足以实现该目的的量定义为“治疗有效剂量”。
该剂量将取决于生产的组合物的活性和患者的疾病，以及待治疗患者的体重或表面面积。剂量的大小还取决于特定病人中伴随特定组合物施用的不良副作用的存在与否、性质和程度。在决定疾病如HSV感染的治疗和预防中待施用组合物的有效量时，医师需要评价抗病毒免疫应答的产生、疾病的进程和任何治疗相关的毒性。
例如，含有HSV蛋白亚基的疫苗或其它组合物可每剂量包含1-10,000微克HSV蛋白。在一个优选的实施方案中每剂量包含10-1000微克HSV蛋白，在一个更优选的实施方案中每剂量包含10-100微克HSV蛋白。优选地，可这样选择剂量：一个单独剂量就足够，或者是在几个月疗程中施用几个剂量。对于含有HSV多核苷酸或肽的组合物，每剂施用相似的量。
在一个实施方案中，可在52周内施用1至10个剂量。优选地，按1个月的间隔施用6个剂量，之后可周期性地给予加强疫苗接种。不同的方式可能适合不同的病人。适当剂量是指当按上述方式施用时可提高抗病毒免疫应答并且超过基础(即未处理)水平至少10-50％的组合物的量。该疫苗还应该能够引起可导致接种患者比未接种患者有改善的临床表现的免疫应答。一般地，对于含有一种或多种多肽的药物组合物和疫苗，每种多肽在剂量中的量的范围是从每kg宿主体重约100ug到5mg。优选地，该量的范围是从每剂量约10ug到约1000ug。施用的适当体积将随患者的身体大小、年龄和免疫状态的不同而改变，但典型地在约0.1ml到约5ml之间，最通常的是体积小于约1ml。
含有免疫细胞的组合物优选从获自组合物待施用对象的免疫细胞制备。或者可从HLA相容性供体制备该免疫细胞。采用本领域已知常规技术从对象或供体获得该免疫细胞，将其暴露于经修饰呈递本发明表位的APC，离体增殖，然后施用给对象。离体治疗的方法描述于Rosenberg等，1990，New England J.Med.9：570-578。此外，组合物可含有经修饰呈递本发明表位的APC。
正如本文所述，免疫细胞一般可通过体外生长获得足够用于过继免疫治疗的量。将单个抗原特异性效应细胞扩增至几十亿个细胞并保留其体内抗原识别的培养条件是本领域所熟知的。典型地，这种体外培养条件是采取抗原进行间歇式刺激，通常该刺激在细胞因子(如IL-2)和非分裂饲养细胞存在下进行。如上所述，可使用本文提供的免疫反应性多肽富集和快速扩增抗原特异性T细胞培养物，以便产生足够量的细胞用于免疫治疗。具体地，抗原呈递细胞如树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、纤维原细胞和/或B细胞可采用本领域的标准技术用免疫反应性多肽刺激(pulse)，或用一种或多种多核苷酸转染。例如，可用含有适合在重组病毒或其它表达系统中增加表达的启动子的多核苷酸转染抗原呈递细胞。治疗中使用的培养效应细胞必须能够广泛地生长和分布，并且能够在体内长期存活。研究显示通过用添加IL-2的抗原重复刺激可诱导培养效应细胞体内生长并以相当大的数量长期存活(见，例如Cheever等，1997，免疫学评论(Immunological Reviews)157：177)。
通过本文所述或其它本领域已知的许多途径进行的用药可简单地采用注射针、导液管或相关装置在一个单一的时间点或多个时间点通过直接施用来完成。被鉴定抗原的体外测试
可使用常规技术来证实鉴定的HSV抗原的体内效力。例如，一种技术使用小鼠攻击模型。然而，本领域技术人员将明白这些方法均是常规的，而且可使用其它模型。
当待测化合物或组合物制备好后，通过一系列注射免疫小鼠或其它对象。例如，可在几个月的疗程内进行多达10次的注射，典型地剂量间间隔1到4周。在该系列注射的最后一次后，用已建立的通用致死病毒剂量攻击该对象。对照组接受安慰剂，而实验组进行主动接种。此外，研究可设计采用亚致死剂量。可选择包括剂量-应答研究。本研究中待测量的终点包括死亡和经例如脊髓步态(spinal cord gait)证实的严重神经学损伤。也可将存活者杀死以进行关键器官的定量病毒培养，这些器官包括脊髓、脑和注射位置。可测量碾碎的组织样品中存在的病毒量。也可在原先感染的动物中测试组合物降低疾病复发的能力以证实其作为治疗疫苗的效力。
可通过计算IC50确定效力，该值显示了为防止50％的对象死亡每千克体重所需要的疫苗微克数。IC50取决于使用的攻击剂量。此外，可计算LD50，它反映了杀死一半接受了特定剂量疫苗的对象所需要的感染单位数。死亡后病毒滴度的测定证实免疫系统限制了病毒复制。
测试的下一阶段可是阴道接种攻击。对于急性保护研究，可采用小鼠进行。由于豚鼠既可用于急性保护研究又可用于疾病复发防止研究，所以提供了一种用于外推至人的生理学上更为相关的对象。在这种类型的攻击中，施用非致死剂量，豚鼠对象产生愈合和复发的损伤。测量可包括急性疾病改善和损伤复发。依据希望研究防止还是治疗，可在接种前或后用疫苗或其它组合物进行干涉。方法
本发明提供治疗和/或防止对象HSV感染的方法。该方法包括给对象施用本发明的组合物。该组合物可用作治疗或预防性疫苗。在一个实施方案中，HSV是HSV-2。作为替代，HSV是HSV-1。本发明还提供用于抑制HSV复制、杀伤HSV感染细胞、增加具有抗病毒和/或免疫调节活性的淋巴因子的分泌以及增强疱疹特异性抗体产生的方法。该方法包括用针对本发明抗原的免疫细胞接触HSV感染细胞，例如按本文给出的实施例中所描述进行。该接触可在体外或体内进行。在一个优选实施方案中，免疫细胞是T细胞。T细胞包括CD4和CD8 T细胞。本发明的组合物还可用作抗免疫病理疾病例如眼病(如疱疹性角膜炎)的致耐受剂(tolerizing agent)。
此外，本发明提供制备抗HSV的免疫细胞的方法。该方法包括用抗原呈递细胞接触免疫细胞，其中该抗原呈递细胞经修饰呈递本发明多肽所包含的抗原。优选地，该抗原呈递细胞是树突细胞。该细胞可通过例如肽装载或用编码该多肽的核酸序列进行的遗传修饰来修饰。在一个实施方案中，该免疫细胞是T细胞。T细胞包括CD4和CD8 T细胞。此外还提供通过该方法制备的免疫细胞。该免疫细胞可用于体外或体内抑制HSV复制、杀伤HSV感染细胞、增加具有抗病毒和/或免疫调节活性的淋巴因子的分泌、增强疱疹特异性抗体的产生，或用于治疗或防止对象的HSV感染。
本发明提供鉴定与感染性生物相关的免疫原性表位的方法。在一个实施方案中，该方法包括制备该生物基因组随机片段的集合。该制备可包括消化该全基因组，尽管以完整基因组开始并不是必须的。该消化优选包括用一种或多种限制酶接触该基因组以获得具有所需长度范围的随机片段集合。作为替代方法，可将含有目的基因组的材料超声破碎、雾化或其它处理，然后从合适大小的凝胶片段中分离。
设计该消化和限制酶的选择，以获得比T细胞表位平均长度更长的基因组片段，即长度大于约30个核苷酸。优选地，该片段足够小以至于遗传终止位点稀少，例如长约200到约500碱基对。在目的生物的基因组序列或限制性图谱已知时，可分析基因组以鉴定限制性位点，如果用合适的限制酶消化，则可获得期望数目的适当长度片段。还可选择限制酶以使其位点与所用克隆载体中的位点相容。
然后该随机片段可用于表达该片段所编码的多肽。该片段可单个地表达，或优选作为多肽库单独或以融合蛋白的形式表达。本领域技术人员将理解可从作为起始物的DNA或RNA表达多肽。例如，可通过首先从RNA片段制备cDNA，然后用此cDNA表达多肽，实现从RNA病毒表达多肽。优选地，多肽表达成不溶性包涵体。以不溶性包涵体形式表达多肽允许多肽以APC容易加工和呈递的形式大量表达。表达成包涵体的蛋白易于纯化，提供了一种表达和加工的高度有效的方法，而且有利于该方法在未测序生物中应用。
可从含有基因组片段的载体表达多肽。在一个优选实施方案中，该载体是质粒例如pUEX载体。本领域技术人员将理解可使用其它能从插入片段表达多肽的载体。优选地，多肽表达为融合蛋白。一个优选的融合蛋白例子是不溶性β-半乳糖苷酶融合蛋白。在一个实施方案中，该表达包括培养转化了含有基因组片段的载体的宿主细胞。在本方法的优选实施方案中，片段以两个方向三种不同的阅读框方式连入表达载体。
该方法还包括回收表达的多肽。例如，可通过收集培养宿主细胞的上清回收培养宿主细胞表达的多肽。回收的多肽可进一步采用标准技术从上清中纯化。表达为不溶性包涵体的多肽的回收可采用例如不溶性包涵体的超声处理、溶菌酶裂解和去污剂辅助分离，参见Neophytou等，1996，美国科学院院刊，93：2014-2018。
该方法还包括分析表达多肽引起免疫应答的能力。引起免疫应答的能力反映了多肽中免疫原性表位的存在。在一个实施方案中，该免疫应答是细胞免疫应答。该分析可包括进行测量T细胞刺激或激活的实验。T细胞的例子包括CD4和CD8 T细胞。
T细胞刺激实验的一个例子是T细胞增殖实验，参见例如以下实施例1或D.M.Koelle等，1994，病毒学杂志68(5)：2803-2810。该T细胞增殖实验可包括例如用抗原呈递细胞和针对该病毒的T细胞接触表达多肽，然后测量T细胞的增殖。可通过测量3H-胸苷的掺入或其它增殖标记确定T细胞增殖。与响应对照抗原的T细胞增殖相比，如果在暴露于测试抗原的T细胞中检测到增殖增加，则该增殖分析反映了T细胞刺激。增殖增加的一个示例性标准是，与对照细胞培养物相比，测试物的沉淀核酸制备物中掺入的3H-胸苷的液体闪烁计数每分钟计数值(cpm)在统计学上显著增加。另一个T细胞刺激或激活实验的例子是细胞溶解实验。以下的实施例1中提供细胞溶解实验的一个例子。
可对多肽库进行该分析以鉴定含有活性成分的库。然后可进一步分析逐渐缩小的原库子集以分离目标多肽。可纯化含有目标片段的物质如含有病毒插入片段的质粒，并对该病毒片段测序。根据获得的序列信息，可制备合成多肽用于进一步测试和验证鉴定的抗原。片段的测序还可导致新基因的识别。
可重复上述方法步骤，其中制备基因组片段的亚片段。可对逐渐缩小的片段进行表达和测试以确定最小表位。
可将本发明方法应用于多种感染性微生物，包括细菌、寄生虫和病毒。优选的病毒含有无内含子的DNA或大多为编码序列的DNA。病毒的例子包括双链DNA病毒、单链DNA病毒、双链RNA病毒和单链RNA病毒。双链DNA病毒的例子包括但不限于Epstein-Barr病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒-1(HSV-1)、HSV-2、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、人疱疹病毒6(HHV-6)、HHV-7、HHV-8、痘病毒和腺病毒。单链DNA病毒的例子包括但不限于细小病毒。双链RNA病毒的例子包括但不限于逆转录病毒和呼肠弧病毒。单链RNA病毒的例子包括但不限于副粘病毒、粘病毒和黄病毒。
因为该方法不需要生物的核酸序列信息，所以它提供了一种对抗表现出极大生物学变异性的感染性生物(如HIV和HCV)的策略。对于显示出高变异性的病毒，利用特定病人特定部位(如血、皮肤、子宫颈)来源的病毒核酸物质资源，或在特定地理学区域或病人群体中传播的代表性病毒株是有利的，这些病毒可能与已知核酸序列的原型株不同。
本发明还提供一种诊断方法。该诊断方法可用于鉴定怀疑患有疱疹感染的病人的免疫学反应性，以及预测对象对特定治疗过程的反应性。该方法包括将对象的T细胞在存在适当APC的情况下暴露于本发明的抗原，并通过例如测量IFNγ、增殖或细胞毒性来检测免疫反应性。适当的方法详见实施例。
实施例
以下实施例用于阐述本发明并帮助普通技术人员操作和使用本发明。这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。实施例1：HSV-2内膜(tegument)蛋白中病毒表位的鉴定
该实施例显示采用全长病毒DNA的表达克隆鉴定T细胞抗原的方法。本文描述了通过表达克隆发现的可被损伤浸润T细胞识别的5种HSV表位。还描述了通过表达克隆以外的其它方法发现的VP16中的几个表位。病毒和细胞
在Vero细胞(D.M.Kollele等，1993，J.Clin.Invest.，91：961-968)中生长和滴定HSV-1的E115株(S.L.Spruance和F.S.Chow，1980，J.Infect.Dis.，142：671-675.)、HSV-2的333株(S.Kit等，1983，Biochim.Biophys.Acta.，741：158-170)、杂交型重组病毒RS1G31(M.F.Para等，1983，病毒学杂志，45：1223-1227)、DX32(V.G.Preston等，1978，病毒学杂志，28：499-517)和RP-2(D.M.Koelle等，1994，病毒学杂志，68：2803-2810)。Epstein-Barr病毒转化的淋巴细胞传代细胞系(EBV-LCL)(D.M.Kollele等，1993，见上)包括来源于患生殖器疱疹的供体的自体细胞系、HLA DPB1*0402纯合的AMAI、HLA DQB10501纯合的HOM2、HLA DQB1*0201纯合的MAT以及HLA DPB1*2001纯合的ARENT(J.G.Bodmer等，1996，组织抗原(Tissue Antigens)49：297-321)。
经Institutional Review Board同意后获取HSV特异性T细胞。大多数克隆的获得未经抗原的第二次体外刺激。供体1、2和4的编号同以前所述(D.M.Kollele等，1994，病毒学杂志，68：2803-2810)，并分别是损伤来源克隆1.L3D5.10.8、2.3和4.2E1的来源；克隆2.3和4.2E1以前已有描述(D.M.Kollele等，1994，见上)。另外的损伤来源克隆来自供体ES以及供体RH和KM，其中克隆ESL2.20、ESL3.335、ESL4.34和ESL4.9获自ES供体的第二、第三、第四个损伤样品(相互之间间隔一年)。克隆2.3、4.2E1、ESL2.20、RH.13、和KM.17直接来源于疱疹小泡液体(D.M.Kollele等，1994，J.Infect.Dis.169：956-961)。为了获得CD4 TCC ESL4.9，进行了复发性生殖器HSV-2损伤的活组织检查，并按前人所述(D.M.Kollele等，1998，J.Clin.Invest.，101：1500-09)在存在无环鸟苷时用PHA和IL-2(Schiaperelli Biosystems，Columbia，MD)扩增大量损伤浸润细胞。16天后，按1细胞/孔的密度克隆细胞(D.M.Kollele等，1994，J.Infect.Dis.169：956-961)。以前描述的VP-16特异性克隆1A.B.25、ESL3.334和ESL4.34(D.G.Doherty等，1996，人类免疫学(HumanImmunol.)47：149；K.R.Jerome等，1998，病毒学杂志，72：436-441；D.M.Kollele等，1997，人类免疫学，53：195-205)同样来源于粗培养物。
一些克隆采用抗原第二次体外刺激获得。为从供体1获得另外的TCC(D.M.Kollele等，1994，病毒学杂志，68：2803-2810)，从克隆1A.B.25(见上)取样时的复发6年后得到的(症状第5天)4个2mm活检组织的每一个制备PHS处理的粗培养物。16天后，在2ml T细胞培养基中用10ug/ml HSV-2 VP22 105-190(见下)和等量辐射(3300rad)过的自体PBMC刺激来自一个活检培养物的1.5×106个粗淋巴细胞(D.M.Kollele等，1994，J.Infect.Dis.169：956-961)。从第6天开始加入IL-2(32U/ml)。按前人所述(D.M.Kollele等，1994，见上)在第12天从该细胞系分离TCC 1.L3D5.10.8。为产生PBMC来源的TCCSB.17和BM.17，在25孔板中用4ug/ml杆状病毒来源的全长VP16，刺激HSV-2血清反应阳性供体SB和BM的1.5×106PBMC 12天；以1细胞/孔克隆应答细胞。最后一次刺激后10-14天使用TCC和细胞系。
除了ARENT外所有的细胞系均是支原体阴性。DNA探针测试(Genprobe，San Diego，CA)显示ARENT最初为支原体阳性，在使用前用10ug/ml环丙沙星(S.M.Gignac等，1991，Leukemia 5：162-165)处理两周，测试反应转变为阴性。流式细胞计数
鼠mAb与人CD4(克隆SRCI 12T4D11)和CD8(识别人CD8α链的克隆SFC 21Thy2D3)(Coulter，Hialeah，FL)结合用于流式细胞计数。免疫印迹
按前人所述方法(R.A.Ashley等，1988，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.26：662-667)制备HSV感染的Vero细胞裂解物，10％SDS-PAGE电泳后，转移至硝酸纤维素膜上。用PBS-0.05％Tween20-1％脱脂干奶粉封闭印迹。依次与1∶100稀释的UL49基因产物VP22特异mAb P43(G.D.Elliott等，1992，J.Gen.Viol.，73：723-736)、亲和纯化的羊抗鼠IgM-过氧化物酶偶联(Sigma，St.Louis.，MO)、以及TMB底物系统(Kirkegaard和Perry，Gaithersberg，MD)一起孵育，并且每步间在PBS-Tween中洗涤(3次×5分钟)，以检测抗原。病毒DNA文库和克隆
对于亚基因组DNA，从Bgl II i片段中亚克隆HSV-2的HG-52株的BamH I w片段，并凝胶纯化。病毒DNA用Sma I消化，然后用KlenowDNA聚合酶补平BamH I末端，并且通过酚抽提和乙醇沉淀纯化DNA片段。对于整个病毒DNA，用HSV-2的HG52株感染汇合成片的Vero细胞。通过蛋白酶K消化、酚-氯仿抽提和异丙醇沉淀从3个150cm2细胞培养物中制备总核酸。获得的物质用Range H处理，并重复抽提和沉淀。部分(1ug)HG52的DNA用Sma I或Alu I消化，按如上所述合并和回收80％的消化产物用于创建表达文库。
采用pUEX载体进行表达克隆(G.M.Bressan等，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，15：10056)。用Sma I线形化pUEX-1、-2和-3 DNA，以小牛肠磷酸酶去磷酸化，并凝胶纯化。将大约100ng载体与500ng DNA片段连接，取10％的乙醇沉淀的反应混合物在1mm小玻璃管中通过电穿孔(BTX，San Diego，CA)转化大肠杆菌DH10Electromas株(GIBCO)。在1ml SOC培养基中复苏1小时后，一部分(每个100ul)冻存为甘油储存物，一部分(250ul)在氨苄青霉素平板上30℃滴定，一部分(250ul)直接用于蛋白诱导产生融合蛋白文库。每个转化分离出数千个氨苄青霉素抗性克隆。为扩增基因组文库，甘油储存物在2YT-氨苄青霉素中30℃生长过夜，之后重新冻存。
通过分离UL49的262碱基对Sma I-Stu I片段、UL50的583碱基对Sma I片段、或UL50的397碱基对Sma I-Stu I片段，分别进行VP22105-190、UL50 118-312、和UL50 118-250的验证性亚克隆。将片段克隆入合适的线形化凝胶纯化的pUEX载体中，在大肠杆菌DH5I中表达蛋白。通过测序证实构建物。抗原
108-109pfu/ml的全病毒制备物用UV失活30分钟(A.Mikloska和A.L.Cunningham，1998，J.Gen.Virol.，79：353-361)，按1∶100的最终稀释度使用。按已有方法(D.M.Kollele等，1997，人类免疫学，53：195-205)合成VP22肽，以2mg/ml储存在DMSO中。均在杆状病毒中表达的UL48肽和全长VP16肽获自Chiron公司(ChironCorporation，Emeryville，CA)，UL48肽长13个氨基酸，并与HSV-2的VP16第1-416位氨基酸有4个氨基酸重叠。
在2YT氨苄青霉素液体培养基中30℃生长至对数期(OD6000.4-0.6)的细胞中，42℃诱导细菌来源的蛋白抗原表达2小时。按已有方法(P.I.Neophytou等，1996，美国科学院院刊，93：2014-2018)，但省去凝胶纯化步骤，进行蛋白纯化。50ml细菌培养物(文库)或5-10ml培养物(库和克隆)在200-400ul PBS(无Ca无Mg)中产生细颗粒悬液。在1％SDS中60℃溶解蛋白10分钟后，通过BCA(Pierce，Rockford，IL)测定蛋白浓度。在一些实验中，用PBS和PBS/10mM EDTA洗涤热诱导细菌，加热至56℃ 10分钟，在用作抗原之前用PBS洗涤。
在鉴定了病毒DNA的活性文库之后，对于亚基因组病毒DNA片段，抗原鉴定采用了30-60个克隆，而对于全长病毒DNA则使用了2,000-3,000个克隆。对于较不复杂的文库，将每个克隆的1ml培养物加工成6-8个克隆的库。活性库中的每一个克隆以及含有已知病毒DNA片段的验证性亚克隆均制备成5ml培养物。采用组合方法(P.I.Neophytou等，1996，美国科学院院刊，93：2014-2018)筛选全病毒DNA的文库。将转化细菌的扩增文库甘油储存物在氨苄青霉素平板上滴定；在96孔板中加入20-30克隆/孔，于旋转振荡器上30℃培养过夜。按1∶100将培养物稀释至1ml，并按上述方法诱导融合蛋白的合成。按排和列将培养物部分(每份400ul)收集在一起用于蛋白纯化并在淋巴增殖实验中进行评价。如果一排和一列以上的评价结果是阳性，则采用阳性排和一个阳性列交叉的孔从5-10ml培养物中制备蛋白以明确地鉴定阳性孔。用阳性孔的稀释培养液接种氨苄青霉素平板，获得细菌的培养物(n＝96个克隆)。按(12个细菌克隆的)库的形式评价这些克隆，然后评价单个克隆。淋巴细胞功能性分析实验
在96孔U型底平板中进行三个重复增殖分析实验，实验孔中加入200ul T细胞培养基，其中含有104个克隆的T细胞、作为抗原呈递细胞的105个辐射过的(3300rad)PBMC或2.5×104个辐射过的(8000rad)EBV-LCL以及抗原(D.M.Kollele等，1997，人类免疫学，53：195-205)。当将加热杀死的细菌作为抗原时，每孔加入相当于(失活前)105 cfu的细菌以及庆大霉素(20ug/ml)。72小时后，每孔加入1uCi[3H]胸苷，18小时后收获细胞，并通过液体闪烁计数计算胸苷的掺入量。标准偏差小于平均值的10％。结果以平均cpm或Δcpm(Δcpm等于测试抗原的平均cpm减去对照抗原的平均cpm)的形式给出。对于全病毒抗原，对照抗原是模拟感染细胞裂解物，而对于重组蛋白制备物则是pUEX2来源的β-半乳糖苷酶。为测定粗培养的损伤来源T细胞的反应性，融合蛋白或对照β-半乳糖苷酶的使用量是10ug/ml。 HSV-2的糖蛋白B和D以及VP16的使用量是1ug/ml，并且实验按已有方法(D.M.Kollele等，1998，J.Clin.Invest.，101：1500-09)进行。为测定HLA限制性座位，按已有方法(D.M.Kollele等，1994，病毒学杂志，68：2803-2810)使用HLA DR特异性mAb L243(V.G.Preston等1978，病毒学杂志，28：499-517)、HLA DP特异性mAb B7.21(A.J.Watson等，1983，自然(Nature)，304：358-360)、或HLA DQ特异性mAb SpV-L3(H.Spits等，1984，Eur.J.Immunol.，14：299-304)。
按已有方法(D.M.Kollele等，1993，J.Clin.Invest.，91：961-968)采用4小时51Cr释放进行三个重复细胞溶解分析。按已有方法(W.W.Kwok等，1996，J.Exp.Med.，183：1253-1258)，在洗涤之前将靶EBV-LCL用HSV-3以30的感染复数感染18小时，或用1.0uM肽刺激90分钟。效应物与靶细胞的比为20∶1。自发释放少于28％。DNA测序
对在细菌中产生活性蛋白的质粒中病毒插入片段进行两个方向的完全测序(Taq DyeDeoxy FS试剂盒，Perkin-Elmer ABI，Foster City，CA)，起始引物是CATGGCTGAATATCGACGGT(SEQ ID NO：1；插入片段的5’末端)和CTAGAGCCGGATCGATCCGGTC(SEQ ID NO：2；插入片段的3’末端)，然后按需要设计内部引物。HLA分型
按血清学方法或在DNA水平上通过反向点印迹杂交，对II类等位基因进行HLA DR和DQ分型(E.Mickelson等，1993，组织抗原，41：86-93)。HLA DP分型通过测序进行(HLA DP试剂盒，Perkin ElmerABI)。结果T细胞表位的精确定位
为减少用于表达克隆的文库复杂性，选择已用HSV-1×HSV-2杂交型重组病毒(IRV)进行了部分作图的TCC识别抗原。除VP16之外，0.7图距单位附近的HSV DNA编码T细胞抗原。用IRV DX32改善TCC4.2E1和2.3的表位作图(D.M.Kollele等，1994，病毒学杂志，68：2803-2810)(图1A)。该基于HSV-2的病毒在0.7图距单位附近含有一个HSV-1 DNA块(V.G.Preston等，1978，病毒学杂志，28：499-517)。通过与HSV-2型特异的和VP-16特异的(D.M.Kollele等，1994，病毒学杂志，68：2803-2810)T细胞克隆1A.B.25反应显示，UL48基因产物具有HSV-2表型。UL49(图2)和UL50基因产物(M.V.Williams，1987，病毒学(Virology)，156：282-292；F.Wohlrab，1982，病毒学杂志，43：935-942)也具有HSV-2表型。因此，IRV DX32中存在的HSV-2 DNA包括UL48、UL49、UL50，并很可能包括居间的UL49.5。因为TCC 4.2E1和2.3与RS1G31和DX32反应，而不与RP2反应(图1B)，所以最有可能识别UL49、UL49.5或UL50。通过表达克隆确定T细胞抗原
选择HSV-2的Bamm HI w片段用于表达克隆，因为其含有UL49、UL49.5和大部分UL50的编码序列(A.Cress和S.J.Triezenberg，1991，基因(Gene)，103：235-238；G.D.Elliott和D.M.Meredith，1992，J.Gen.Virol.，73：723-736；N.J.Maitland等，1982，Infect.Immun.，38：834-842)。70％-90％的随机克隆含有插入片段；它们均是病毒来源的。筛选对每一种TCC最有效的文库(pUEX1对TCC 4.2E1，pUEX3对TCC 2.3)(表1)，并通过库和单个克隆的随后测试，检测单个反应性细菌克隆(表2)。克隆1.1.3编码引起TCC 4.2E1增殖的融合蛋白。该克隆含有UL49的反向80bp Sma I片段，对于β-半乳糖苷酶而言正向并符合阅读框的预测编码第105-190位氨基酸的HSV-2 UL49DNA的262bp Sma I片段，以及UL49的246bp Sma I片段(该片段正向但不符合阅读框，这是由于在262bp Sma I片段与242bp Sma I片段的接头处有一个C残基的缺失)。克隆3.19含有编码UL50的118-312位氨基酸的583 bp Sma I片段，该片段之后是UL49的反向80和96bpSma I片段。
表1.鉴定引起HSV特异的TCC增殖([3H]胸苷掺入的平均cpm)的蛋白文库。自体EBV-LCL(克隆4.2E1和2.3)或PBMC作为APC，并且文库来源的融合蛋白抗原按1∶300稀释。数据为[3H]胸苷掺入的平均cpm。 TCC 4.2E1 2.3 ESL4.9 ESL2.20 文库1 对照刺激物2 pUEX1-BamH pUEX2-BamH pUEX3-BamH 培养基 HSV-2 I“w”-Sma I I“w”-Sma I I“w”-Sma I 10,105 4,150 1,903 286 21,591 418 785 2,279 102 11,014 pUEX1- pUEX2-HG52- pUEX3- HG52-Sma I- Sma I- AluI HG52-Sma I- Alu I Alu I -52 -25 16,235 146 66,013 1 768 5,427 123 13,3591文库名称列出了表达载体、HSV-2限制性片段的名称或全长病毒DNA的株系、以及用以消化病毒DNA的限制性酶。2105辐射过的(3300rad)自体PBMC与模拟感染细胞裂解物或UV-处理的HSV-2抗原。
T细胞抗原的鉴定通过定向亚克隆和重叠的肽来证实。将编码HSV-2 UL49第105-190位氨基酸的262bp Sma I片段亚克隆至pUEX3中，产生质粒49.262.12。该蛋白刺激TCC 4.2E1(表2)。只有HSV-2VP22的肽105-126(GGPVGAGGRSHAPPARTPKMTR；SEQ ID NO：3)具有刺激作用(图3)。将编码UL50的第118-312和118-250位氨基酸的DNA片段亚克隆至pUEX3中。这些片段表达的融合蛋白是有活性的(表2)。表2.HSV-2反应性TCC的抗原特异性。使用1∶900稀释的细菌来源的重组融合蛋白抗原。使用自体EBV-LCL(克隆4.2E1)或PBMC作为APC。数据是与培养基比较获得的[3H]胸苷掺入的Δcpm，在所有情况下培养基的cpm均少于500cpm。 TCC 4.2E1 2.3 ESL4.9 ESL2.20 重组抗原 对照抗原 克隆 病毒序列1 cpm pUEX2 HSV-1 HSV-2 名称 β-gal 1.13 VP22 105-190 4,875 93 nd nd 49.262.122 VP22 105-190 6,898 3.19 UL50 118-312 43,971 231 543 53,032 50.583.443 UL50 118-312 34,453 50.3973 UL50 118-250 66,501 C11 VP22 177-220 59,400 166 112,803 64,685 C9D10 UL21 148-181 23,543 173 0 37,9891从序列数据上预测与β-半乳糖苷酶同向并符合阅读框的氨基酸。2验证性亚克隆1.1.3，其仅含有与pUEX3同向并符合阅读框的UL49 DNA的262bp Sma I片段。3验证性亚克隆3.19，其含有与pUEX3同向并符合阅读框的UL50的583bp Sma I片段或UL50 DNA的397bp Sma I-Stu I片段。
对全长HSV-2 DNA文库的随机克隆的评价显示，80-100％的克隆包含具有插入片段的质粒；80-100％的插入片段是病毒来源的。对于TCCESL4.9和ESL2.20，均仅有pUEX3蛋白文库引起淋巴增生(表1)。由于这些文库比从BamH I w片段制备的文库复杂，所以用组合方法筛选2,000-3,000个细菌转化子。在初步实验中，发现在库(5-12个细菌克隆)和最终分析阶段热杀死并经洗涤的细菌在淋巴细胞增殖实验中可替代蛋白的包涵体制备物。
阳性细菌的质粒的测序显示，TCC ESL4.9识别UL49基因产物VP22的44个氨基酸的片段(第177-220位氨基酸)，而TCC ESL2.20识别UL21的34个氨基酸的片段(第148-181位氨基酸)(表2)。在两种情况下，HSV-2 DNA的单个Alu I片段的插入均符合阅读框并且是正向的。肽作图说明第187-206位氨基酸(图3C)刺激TCC ESL4.9。融合蛋白作为粗损伤浸润T细胞的探针
在用于探测损伤浸润T细胞的粗培养物的HSV抗原组中增加了新发现的T细胞抗原。首先获得的标本是获自患者1臀部HSV-2复发第5天(病毒培养物阳性)的一组四个活检标本(每个2mm)(D.M.Kollele等，1998，J.Clin.Invest.，101：1500-09；D.M.Kollele等，1994，病毒学杂志，68：2803-2810)。所有四个活检标本显示了与VP22105-190的反应性，但不与β-半乳糖苷酶、糖蛋白B或D、或VP16反应。用VP22 105-190融合蛋白重复刺激原初粗培养物一个周期后获得TCC。TCC 1.L3D5.10.8(图3B)对VP22(105-190)和组成肽的增殖应答说明在VP22中存在第三个T细胞表位，其包含在第125-146位氨基酸中。在内膜蛋白VP16中鉴定另外的T细胞表位
VP16中的三个表位(表3)均是HSV-2型特异的，它们以前已获得了鉴定(K.R.Jerome等，1998，病毒学杂志，72：436-441)，并且从7个患者中的4个(57％)的生殖器HSV-2损伤浸润淋巴细胞的粗培养物中检测到对全长VP16的增殖应答(D.M.Kollele等，1998，J.Clin.Invest.，101：1500-09)。采用了两个策略在VP16中搜寻其它肽表位。第一个策略涉及筛选与HSV-2的重组VP16反应的从损伤小泡液体回收的克隆组，随后用肽进行表位作图。含有第185-197位氨基酸的肽以及含有重叠的209-221和213-225的肽分别对TCC RH.13和KM.7具有刺激作用(表3)。所有其它的VP16肽均是阴性的(＜500cpm)。第二个策略涉及使用PBMC作为起始物和用重组杆状病毒来源的VP16进行第二次体外刺激。来自于两个个体的克隆(BM.17和SB.17)识别同一个肽(第437-493位氨基酸)以及β-gal-VP16融合蛋白和全病毒。按序列数据推测，所有这三个新鉴定的VP16表位均是不同类型共有的，HSV-1和HSV-2全病毒制备物均具有该表位(A.Cress和S.J.Triezenberg，1991，基因(Gene)，103：235-238)。表3.HSV-2 VP16中损伤或PBMC来源的CD4 TCC识别的表位。数据是与培养基比较获得的[3H]胸苷掺入的Δcpm，在所有情况中培养基的cpm均少于500cpm。 TCC 名称 来源 新报道的 表位 RH.13 损伤 KM.7 损伤 BM.17 PBMC SB.17 PBMC 以前报道 的表位 ESL4.34 损伤 ESL3.334 损伤 1A.B.25 损伤 全病毒抗原 重组HSV-2蛋白1 HSV-2 VP16肽 HSV-1 HSV-2 VP16 β 氨基酸 Δcpm 1-492 -gal-VP16 180-492 3,340 3,407 32,991 nd 185-197 55,614 6,093 5,847 5,627 nd 209-221 10,075 30,784 13,777 nd 45,958 437-449 79,723 2,207 4,187 nd 12,178 437-449 36,442 256 8,780 17,302 nd 389-401 12,968 393-405 95,942 253 14,232 22,754 16,434 430-444 27,283 414 33,493 24,919 41,123 431-440 38,6641 VP16 1-492(来自杆状病毒)的使用量是1ug/ml。β-gal-VP16180-492按1∶1,000稀释使用。2肽的使用量是1uM。na＝未获得nd＝未做HLA限制
对识别0.7图距单位附近编码的抗原的TCC进行HLA限制的详细测定。VP22 105-126特异的TCC 4.2E1的增殖可被抗DP的mAb抑制84％，而抗DR或抗DQ mAb的抑制少于20％。TCC 4.2E1来自于DPB1*2001/DPB1*0402杂合供体。携带DPB1*2001而不是携带DPB1*0402的同种异体EBV-LCL呈递抗原(表4)，说明为DPB1*2001所限制。UL50特异的TCC 2.3的增殖被抗DR的mAb抑制，而不被抗DP或抗DQ的mAb抑制。该克隆来自DRB1*0301/BRB1*0701杂合供体。来自DRB1*0301供体的同种异体PBMC呈递抗原，这与抗原性肽与该等位基因产物的结合一致。然而，并不能排除通过连锁的DR基因产物DRw52或DRw53进行的呈递。其它HLA限制研究总结在表5中。表4.损伤来源的CD4 TCC 4.2E1和2.3的限制性HLA等位基因的确定。抗原是以1∶900稀释的β-gal融合蛋白(表2)。数据是与培养基比较获得的[3H]胸苷掺入Δcpm，在所有情况中培养基的cpm均少于500cpm。T细胞克隆 4.2E1 2.3抗原 1.1.3 50.583.44APC自体EBV-LCLAMAI EBV-LCLARENT EBV-LCL自体PBMC同种异体PBMC A同种异体PBMC B HLA型1 DPB1*0402，2001 DPB1*0402 DPB1*2001 DRB1*0301，0701 DRB1*0701，1001 DRB1*0301，1301 Δcpm2 30,719 2,732 26,218 8,964 45 19,2231通过mAb的抑制确定的II类HLA座位的HLA型。2与使用相同APC的pUEX2对照蛋白(1∶1000稀释)比较，该对照蛋白在每种情况中均产生少于500cpm的[3H]胸苷掺入。表5.损伤来源的内膜特异性CD4 TCC的溶细胞活性，及确切特异性和HLA限制的总结。结果是特异释放百分比，其中效应物与靶之比除ESL4.34(10∶1)外为20∶1。Auto＝自体EBV-LCL作为靶细胞；allo＝同种异体EBV-LCL，其在相关HLA座位(如已知)或HLA DR和DQ不匹配。 TCC 新报道 的表位 4.2E1 ESL4.9 ESL2.20 1.L3D5.10.8 1.L3D5.10.12 RH.13 KM.7 BM.17 SB.17 2.3 以前报道 的表位 ESL4.34 ESL3.334 1.A.B.25 细胞溶解分析目标 特异性1 HLA限制2 auto auto auto allo allo allo HSV-2 肽 模拟 HSV-2 肽 模拟VP22 105-126 DPB1*2001 20.7 44.2 -4.1 -2.9 -1.7 4.6VP22 187-206 DR3 -0.6 20.2 1.3 0 0 0UL21 148-181 DR3 2.7 na 0.9 0 na 0VP22 125-146 DR4 1.1 61.1 -0.3 -0.4 -0.6 -0.4VP22 125 146 DR4 2.5 57.6 1.6 -0.1 -2.5 -1.4VP16 185-197 DR4 62.5 55.2 -0.9 9.6 0.3 1.8VP16 209-221 DR4 38.7 43.6 2.7 2.2 4.3 -1.1VP16 437-449 DQB1*0501 10.1 28.5 -0.3 nd nd ndVP16 437-449 DQB1*0501 48.7 60.6 5.4 nd nd ndUL50118 250 DRB1*0301 0.8 na 0 1.1 na 0VP16 393-405 DRB1*0402 2.1 10.4 10 0.5 0.6 0.3VP16 430 444 DQB1*0302 12.3 33.6 0.7 1.4 0.3 2.2VP16 431-440 DQB1*0201 24.3 42.2 1.9 1.7 2.1 -0.4auto＝自体allo＝同种异体na＝由于未进行表位作图和制备合成抗原肽所以未获得nd＝未做1显示CTL分析中用于携带所选TCC的靶标的肽(1uM)。2HLA限制性座位和/或等位基因的最大程度鉴定。对象RH和KM进行血清学分型；而其它对象在DNA水平上分型。3对于HLA DRB1*0402和DRBl*1301而言对象是杂合的，而且限制性等位基因还未确定。4对于HLA DRB1*0301和DRB1*1102而言对象是杂合的，而且限制性等位基因还未确定。
我们详细研究了TCC BM.17的HLA限制。TCC BM.17和相似克隆SB.17的增殖被抗DQ的mAb的抑制90％，而仅被抗DR或抗DP的mAb抑制不足25％。供体BM和SB是HLA DQB1*0201/0501杂合的。在高浓度肽存在的情况下，DQB1*0201和DQB1*0501纯合的EBV-LCL表现出向TCC BM.17呈递抗原。然而，DQB1*0501的纯合细胞比DQB1*0201的纯合细胞呈递肽的效率要高得多(图4)。因此，VP16 431-449中的三个不同的但相互重叠的表位由HLA DQB1*0302、DQB1*0201和DQB1*0501呈递。内膜特异性CD4 T细胞克隆的CTL活性
用EBV-LCL靶细胞测试具有新近和以前鉴定的特异性的CD4 TCC的细胞毒活性(表5)。测试的所有克隆表现出对装载肽的靶细胞的细胞溶解活性。对感染HSV-2的靶细胞的细胞溶解活性表现出较大的变异性。VP22特异的TCC 4.2E1有细胞溶解活性，而来自其它供体的VP22特异TCC则无。在测试的7个VP16特异T细胞克隆中，6个显示出对HSV-2感染靶细胞的大于10％的细胞毒性。单个UL21和UL50特异的TCC对于病毒感染的靶细胞没有细胞溶解活性。讨论
HSV特异性T细胞选择性地浸润复发的生殖器HSV-2损伤(D.M.Kollele等，1994，J.Infect.Dis.169：956-961)。有CD4和CD8介导的成分参与的局部CTL活性与病毒的清除相关(D.M.Kollele等，1998，J.Clin.Invest.，101：1500-09)。局部HSV特异性T细胞识别的抗原是多样的，而且在许多情况中是未知的(D.M.Kollele等，1994，病毒学杂志，68：2803-2810)。该实施例阐明了内膜蛋白VP22和UL21以及病毒的dUTPase的识别，并提供了关于内膜蛋白VP16的新信息。
本文描述的表达克隆系统对HSV是有效的。由于HSV基因组中内含子很少，故可直接使用基因组双链DNA。使用同样的HSV-2株HG52(A.Dolan等，1998，病毒学杂志，72；2010-2021)筛选候选损伤来源的TCC和制备蛋白文库。供体中的HSV-2株系和HG52之间相对低程度的株系变异性很少导致体内识别表位的遗漏；自体分离物的使用将利于在具有较高株系变异性的病毒中应用。
值得注意的是，用来自两个供体的损伤浸润TCC在两个独立的表达克隆实验中均检测到与VP22的反应性。在对第一套获得的损伤浸润淋巴细胞粗培养物的筛选过程中也检测到VP22的反应性。来自三个患者的其它10个克隆对于公开的UL49、UL21和UL50片段的反应性是阴性的。
对于损伤浸润CD4 T细胞，内膜抗原可能是合适的靶标，因为这些抗原很丰富。VP16和VP22大量存在：在HSV-1中每个病毒粒体包含大约1.6×103个分子的VP16(Y.Zhang和J.L.C.McKnight，1993，病毒学杂志，67：1482-1492)和2.5-2.8×103个分子的VP22(J.Leslie等，1996，病毒学，220：60-68)。对于UL21可获得的信息较少(J.D.Baines等，1994，病毒学杂志68：2929-2936；J.A.Blaho等，1994，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)269：17401-17410)。病毒dUTPase是报道为HSV特异性CD4 T细胞应答靶标的第一个非病毒颗粒成分。和VP16及VP22一样，该酶位于HSV-2(而非HSV-1)感染细胞的细胞核(F.Wohlrab等，1982，病毒学杂志，43：935-942)。体内抗原呈递可在感染细胞中dUTPase的内源合成后或感染细胞碎片的dUTPase抗原清除之后发生。dUTPase特异性TCC 4.2E1对HSV感染细胞的裂解说明至少在体外可发生内源抗原的呈递。
因为C端与VP22融合表达的多肽可被共转运进入细胞，所以以VP22融合形式表达蛋白作为佐剂制备物的一种形式可能是有意义的。这可通过VP22中异源表位的表达来测试。正如免疫共沉淀所显示的那样，HSV-1的VP16和VP22在感染细胞中以强的非共价形式结合。这些蛋白共定位于细胞的核周区域(G.Elliott等，1995，病毒学杂志，69：7932-7941；G.D.Elliott等，1992，J.Gen.Virol.，73：723-736)。这种结合可能在刺激CD4 T细胞对VP16的明显高水平的应答中起作用。
总之，表达克隆允许发现新的HSV T细胞抗原。抗原特异性CD4 T细胞在损伤处的原位富集，允许通过抗原的第二次体外刺激无偏差地研究抗原库。HSV基因组的有利特点允许直接使用全病毒DNA文库。内膜蛋白可与膜糖蛋白一起用作人类HSV疫苗候选者。实施例2：其它HSV-2病毒表位的鉴定
采用以上实施例1所述的表达克隆方法鉴定其它的HSV-2 T细胞抗原。结果揭示了两个其它抗原。一个位于UL19的第1078-1319位氨基酸。UL19也被称为主要衣壳抗原或VP5。另一个抗原是US8的第1-273位氨基酸，US8也称为糖蛋白E。该US8抗原经来源于子宫颈样品的T细胞鉴定。实施例3：全长UL49和UL50的效力
该实施例显示了全长UL49和UL50蛋白可有效刺激T细胞增殖。数据说明了大肠杆菌和Cos-7细胞中表达的全长UL49的抗原性，和Cos-7细胞中表达的全长UL50的抗原性。这些结果证实了上文描述的抗原是准确鉴定的。
为了在原核系统中表达HSV-2的全长UL49蛋白，通过PCR从制备的HSV-2的HG52株DNA克隆该基因，使用的引物是该基因5’端的GGAAGATCTACCTCTCGCCGCTCCGTCA(SEQ ID NO：4)和该基因3’端的CCGGAATTCTTGTCTGTCGTCTGAACGCG(SEQ ID NO：5)。PCR产物经Bgl II和EcoR I消化后克隆在TA克隆载体pcR2.1-Topo(Invitrogen)的Bgl II和EcoR I位点中。然后将该基因亚克隆至载体pTrcHisB(Invitrogen)，之后亚克隆至pGEX-2T(Pharmacia)。与发表的序列(Dolan 1998)比较，HSV-2 UL49克隆的序列有一个编码突变：第244位氨基酸由丝氨酸突变成脯氨酸。该表达蛋白的预测氨基酸序列还缺失起始甲硫氨酸。UL49含有来源于载体pGEX2T的N端融合域。该质粒命名为pGEX2T-UL49HSV2。
为产生原核表达的全长USV-2 UL49，用pGEX2T-UL49HSV2或对照空质粒转化大肠杆菌BL21。对数生长期的细菌在LB氨苄青霉素培养基中调节至OD600为0.4。向一些试管加入β-D-硫代吡喃半乳糖异丙苷(IPTG)至0.3mM。细菌在37℃振荡培养1.5小时。离心收集细菌并用含1mM EDTA的PBS洗涤3次，加热至65℃10分钟，再用PBS洗涤两次以上，然后以大约1×109细菌/ml重悬在T细胞培养基中。使用热杀死细菌悬液作为测试抗原。
为了在真核系统中表达HSV-2的全长UL49蛋白，采用具有阅读校对功能的高保真DNA聚合酶通过聚合酶链式反应单独重新扩增该基因。采用相同的引物和模板。该基因直接克隆至pEGFP-C1(Clontech)的Bgl II和EcoR I位点。对整个UL49基因测序，结果与发表的序列一致。表达蛋白的预测氨基酸序列与病毒UL49的预测序列除了第1位氨基酸起始甲硫氨酸缺失外均一致。而且来源于载体pEGFP-C1的N端融合域预测也将表达。该质粒命名为pEGFP-C1-UL49HSV2。
为了制备真核表达的HSV-2的全长UL49，用pEGFP-C1-UL49HSV2质粒DNA或pEGFP-C1载体对照DNA通过脂转染法转染Cos-7细胞。48小时后，刮下细胞并超声破碎，然后分离上清和沉淀相。使用9.4cm2培养皿的细胞产生300微升上清。将由一个9.4cm2培养皿产生的沉淀重悬在300微升培养基中。上清和沉淀制备物用作测试抗原。
为了在真核系统中表达HSV-2的全长UL50蛋白，采用具有阅读校对功能的高保真热稳定DNA聚合酶通过PCR从HSV-2的HG52株DNA制备的DNA克隆该基因，所用引物是该基因5’端的TAAGGTACCTATGAGTCAGTGGGGGCCC(SEQ ID NO：6)和该基因3’端的AAACTGCAGGAGGCGCGGTCTAGATGC(SEQ ID NO：7)。该靶DNA作为BglII i片段的克隆，克隆至pUC9中。该PCR产物经KpnI和PstI消化后，克隆至同样消化的pcDNA3.1-myc-his-B(Invitrogen)中。对载体和插入片段的接头处序列进行证实。该质粒命名为pcDNA3.1-myc-his-B-UL50HSV2。该表达蛋白的预测氨基酸序列与病毒UL50的预测序列一致。来源于载体pcDNA3.1-myc-his-B的N端融合域也预测表达。为了将真核表达的HSV-2的全长UL50制备为测试抗原，完全按上述针对UL49的方法使用Cos-7系统。UL50的对照抗原通过pcDNA3.1-myc-his-B转染Cos-7细胞制备。
将这些测试抗原加入含有200微升T细胞培养基的分析孔(96孔，U型底)中，每孔含有1×105个辐射过的自体外周血单核细胞(PBMC)，以及1×104损伤来源的CD4+T细胞克隆，其中对UL49该T细胞克隆是ESL 4.9，而对UL50是克隆2.3(Kollele等，1994和1998以及最初的专利申请文献)。进行两次或三次重复分析。三天后，按实施例1中所述测量3H胸苷掺入量。
结果用刺激指数(测试抗原的3H胸苷掺入平均cpm/培养基对照的3H胸苷掺入平均cpm)以及Δcpm(测试抗原的3H胸苷掺入平均cpm-培养基对照的3H胸苷掺入平均cpm)来表示。按实施例1的描述和标示，进行阳性和阴性对照抗原操作。表6.在大肠杆菌BL21中原核表达的全长HSV-2 UL49的抗原性抗原 最终稀释 Δcpm 刺激指数UV HSV-2 1∶100 26,823 386热杀死pGEX2 1∶4 -11 0.84热杀死pGEX2 1∶40 -25 0.64热杀死pGEX2 1∶400 -8 0.89热杀死pGEX2-UL49HSV2 1∶4 9,413 135热杀死pGEX2-UL49HSV2 1∶40 10,526 152热杀死pGEX2-UL49HSV2 1∶400 5,021 73
表7.在CoS-7细胞中真核表达的全长HSV-2 UL49的抗原性 抗原 最终稀释 Δcpm 刺激指数 UV模拟病毒 1∶100 -4 0.96 UV HSV-2 1∶100 46,510 470 对照感染细胞的上清 1∶4 8 1.08 对照感染细胞的沉淀 1∶4 131 2.32 UL49感染细胞的上清 1∶4 1,512 16.3 UL49感染细胞的沉淀 1∶4 84,951 859 UL49感染细胞的沉淀 1∶40 35,753 362 UL49感染细胞的沉淀 1∶400 29,854 302表8在CoS-7细胞中真核表达的全长HSV-2 UL50的抗原性 抗原 最终稀释 Δcpm 刺激指数 UV-模拟病毒 1∶100 -43 0.89 UV HSV-2 1∶100 52,990 135 对照感染细胞的上清 1∶5 302 1.86 对照感染细胞的沉淀 1∶5 34 1.09 UL50感染细胞的上清 1∶5 26,910 77.7 UL50感染细胞的上清 1∶20 33,063 95.2 UL50感染细胞的上清 1∶100 20,438 59.2 UL50感染细胞的上清 1∶500 2,346 7.7 UL50感染细胞的沉淀 1∶5 42,820 123.0 UL50感染细胞的沉淀 1∶20 18,487 53.7 UL50感染细胞的沉淀 1∶100 8,947 26.5 UL50感染细胞的沉淀 1∶500 864 3.5这些结果显示HSV-2蛋白UL49和UL50当以全长蛋白形式表达时保留了它们的免疫原性。在原核和真核系统中均进行了UL49的研究，在真核系统中进行了UL50的研究。实施例4：全长UL21的效力
为了在真核系统中表达HSV-2的全长UL21蛋白，采用具有阅读校对功能的高保真热稳定DNA聚合酶，通过PCR从制备自HSV 2型HG52株DNA的DNA克隆该基因，所用引物在该基因5’端是CTGGGATCCATGGAGCTCAGCTATGCCACC(SEQ ID NO：8)，和在该基因3’端是CGCGAATTCTCACACAGACTGGCCGTGCTG(SEQ ID NO：9)。该PCR产物经BamHI和EcoRI消化后，克隆至同样消化的pGEX-5T中。从该质粒，用BamHI和XhoI将其切下，并克隆至同样消化的pcDNA3.1-myc-his-C(Invitrogen)。对载体和插入片段的接头处序列进行了证实。该质粒命名为pcDNA3.1-myc-his-C-UL21HSV2。该表达蛋白的预测氨基酸序列与病毒UL21的预测序列一致。预测来源于载体pcDNA3.1-myc-his-B的N端融合域也将表达。为了将真核表达的HSV-2全长UL21制备为测试抗原，完全按针对UL49的所述方法使用Cos-7系统。UL21的对照抗原通过pcDNA3.1-myc-his-B转染Cos-7细胞制备。
将UL21测试抗原加入含有200微升T细胞培养基的分析孔(96孔，U型底)中，每孔含有1×105个辐射过的自体外周血单核细胞(PBMC)，以及1×104损伤来源的携带CD4的T细胞克隆ESL 2.20(Kollele等，1994和1998以及上面的实施例1)。分析进行三次重复。三天后，按实施例1中所述测量3H胸苷掺入量。结果用刺激指数(测试抗原3H胸苷掺入的平均cpm/培养基对照3H胸苷掺入的平均cpm)以及Δcpm(测试抗原3H胸苷掺入的平均cpm-培养基对照3H胸苷掺入的平均cpm)来表示。按所示方法进行阳性和阴性对照抗原操作；细节可参见实施例1。结果陈述于表9。
表9.在Cos-7细胞中真核表达的全长HSV-2 UL21的抗原性 抗原 最终稀释 Δcpm 刺激指数 UV模拟病毒 1∶100 43 1.75 UV HSV-2 1∶100 5620 97.9 对照感染细胞的上清 1∶20 -9 0.83 对照感染细胞的沉淀 1∶20 -9 0.83 UL21感染细胞的上清 1∶20 1870 33.25 UL21感染细胞的上清 1∶100 3242 56.9 UL21感染细胞的上清 1∶500 4472 78.11 UL21感染细胞的上清 1∶2000 2526 46.79 UL21感染细胞的沉淀 1∶20 3606 63.24实施例4：群体中抗原的普遍性
本实施例通过说明群体中对这些抗原应答的普遍性来支持本发明抗原的防止和治疗用途的实用性。为达到该目的，调查了7个通过型特异性血清学证明为HSV-2感染的个体。这些个体与HSV-2损伤处回收的指标T细胞克隆的来源个体不同。
对于每个测试对象，分离PBMC并在24孔板中以2×106细胞/孔接种于2ml T细胞培养基中，然后用1∶500稀释的UV灭活HSV-2 333株体外刺激5天。此时加入40单位/ml重组人IL-2，再作用5至6天，产生短期HSV特异性细胞系，称作B1细胞系。
按如下方法评价对每种HSV-2蛋白的反应性。在96孔圆型底微量滴定板上进行增殖分析，每种情况重复三次。每孔中加入1×105辐射过(3300 rad)的自体PBMC作为抗原呈递细胞。每孔还加入1×104B1细胞。然后加入下列对照物质：培养基、1∶500稀释的UV处理模拟病毒制备物、1∶500稀释的UV处理HSV-2 333株、终浓度达到每ml 4微克的HSV-2糖蛋白B或D或VP16蛋白(纯化的)。对UV处理HSV-2的应答预期为阳性，用作细胞变异性和总体特异性的阳性对照。以前显示糖蛋白B和D以及VP16是HSV特异性T细胞的靶位点(D.M.Kollele等，1994，病毒学杂志，68(5)：2803-2810)。
对于新发现的抗原UL21、UL49、UL50，其全长基因的克隆和在真核Cos-7系统中的表达上面均已描述过，同样基于空载体的对照抗原的制备上面也已描述过。对于新发现的抗原gE2(US8)，采用具有阅读校对功能的高保真热稳定DNA聚合酶，通过PCR从制备自HSV2型HG52株DNA的DNA克隆该全长基因，所用引物在该基因5’端是CGGGGTACCTGCTCGCGGGGCCGGGTTGGTG(SEQ ID NO：10)，在3’端是TGCTCTAGAGCCTTACCAGCGGACGGACGG(SEQ ID NO：11)。该PCR产物经ACC65I和XhaI消化后，克隆至同样消化的pcDNA3.1-myc-his-B(Invitrogen)中。该质粒命名为pcDNA3.1-myc-his-B-US8。对载体和插入片段的接头处序列进行了证实。该表达蛋白的预测氨基酸序列与病毒US8的预测序列一致。预测来源于载体pcDNA3.1-myc-his-B的N端融合域也将表达。为了制备真核表达的全长HSV-2 US8，按以上所述使用Cos-7系统。对于4种新抗原(UL21、UL49、UL50和US8)的每一种以及对照，在三个重复增殖分析中按1∶20的最终稀释度使用感染的Cos-7细胞超声破碎后的上清和沉淀。
如果刺激指数(测试抗原3H胸苷掺入的平均cpm/培养基对照3H胸苷掺入的平均cpm)大于或等于4.0，则记为阳性反应。对于UV HSV-2抗原，相关的对照抗原是UV模拟病毒。对于gB2、gD2和VP16，对照是培养基。对于在Cos-7细胞中表达的新抗原，对照抗原是用对照空载体转染的Cos-7细胞的上清或沉淀。结果显示于表10。已证明每一种新发现的抗原与至少一个研究对象有反应性。大体上说，观察到与UL49的反应性具有更高频率，而且类似于对已知抗原gB2和gD2的反应性。这些数据支持，除了最初在其中描述该T细胞反应性的指标对象外，其他人类个体能够与这些HSV来源的抗原蛋白发生反应。
表10.在一组7个随机挑选的HSV-2感染的有免疫能力的成人中已知和新发现的HSV-2抗原的抗原性。 抗原 HSV-2 gB2 gD2 HSV-2的 HSV-2的 HSV-2的 HSV-2的 HSV-2的US8 VP16 UL49 UL50 UL21n 7 5 5 0 5 1 1 2％ 100 71 71 0 71 14 14 28
本领域技术人员将理解，在前面的描述中公开的概念和具体的实施方案可以容易地作为修饰或设计其它实施方案以执行本发明相同目的的基础。本领域技术人员也将理解，这些相当的实施方案并不偏离在所附权利要求中给出的本发明的精神和范围。
序列表<110>华盛顿大学(申请人/受让人)
David M.Koelle(仅为发明人)
Lawrence Corey(仅为发明人)<120>免疫学单纯疱疹病毒抗原及其使用方法<130>30967.3 WOU1<150>60/095,724<151>1998-08-07<160>11<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>20<212>DNA<213>单纯疱疹病毒<400>1catggctgaa tatcgacggt<210>2<211>22<212>DNA<213>单纯疱疹病毒<400>2ctagagccgg atcgatccgg tc<210>3<211>22<212>PRT<213>单纯疱疹病毒<400>3Gly Gly Pro Val Gly Ala Gly Gly Arg Ser His Ala Pro Pro Ala Arg1 5 10 15Thr Pro Lys Met Thr Arg
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