对KDR特异的抗体及其应用 【发明背景】
血管发生是生成新的血管的过程。该过程涉及原先存在的血管的毛细管上皮细胞(capillary endothelial cell)的增殖、迁移和组织浸润(tissue infiltration)。血管发生在正常的生理过程中，包括胚胎发育、卵泡生长和伤口愈合，以及在涉及肿瘤的生长和转移的病理条件下是很重要的(Folkman，J.and Klagsbrun，M.Science235：442-447(1987))。
在成人中，血管内皮通常是静息的，并且它在血管发生中的激活受到严紧的控制。几个因子被认为可能是体内血管发生的调节者。这些包括转化生长因子(TGFb)，酸性和碱性纤维原细胞生长因子(aFGF和bFGF)，血小板生长因子(PDGF)和血管内皮生长因子(VEGF)(Klagsbrun，M.and D’Amore，P.(1991)，Annual rev.Physiol.53：217-239)。VEGF，一种内皮细胞特异地分裂原，显然是这些因子中的一种，因为它通过特异性地促进内皮细胞的增殖而作为血管发生诱导因子发挥作用。
VEGF是由两个结构上与PDGF类似的23KD亚基组成的同二聚体糖蛋白。由于mRNA的不同剪接(alternative splicing)，存在四种不同的VEGF单体亚型。这些亚型包括两种膜结合形式亚型(VEGF206和VEGF189)和两种可溶形式亚型(VEGF165和VEGF121)。在除了胎盘外的所有人类组织中，VEGF165是最丰富的亚型。
VEGF在胚胎组织中(Breier et al.，Development(Camb.)114：521(1992))、巨噬细胞中、伤口愈合中的增殖的上皮角化细胞中(Brown et al.，J.Exp.Med.，176：1375(1992))表达，并可能对与炎症相关的组织水肿负责(Ferrara et al.，Endocr.Rev.13：18(1992))。原位杂交表明，在许多人类肿瘤系中，包括多形性成胶质细胞瘤(glioblastoma multiforme)，成血管细胞瘤，中枢神经系统瘤和AIDS相关的Kaposi’s肉瘤中，VEGF大量表达(Plate，K.et al.(1992)Nature 359：845-848；Plate，K.et al.，(1993)Cancer Res.53：5822-5827；Berkman，R.et al.(1993)J.Clin.Invest.91：153-159；Nakarmura，S et al.(1992)AIDS Weekly，13(1))。在组织缺氧诱导的血管发生中也观察到了高水平的VEGF(Shweiki，D et al.(1992)Nature 359：843-845)。
VEGF的生物学应答是通过高亲和性的VEGF受体介导的，该受体在胚胎发生(Millauer，B.，et al.，(1993)Cell 72：83-846)和肿瘤形成过程中选择性地在内皮细胞上表达。VEGF受体通常为III类受体类型的酪氨酸激酶，其特征为在它们的氨基端细胞外受体-配基结合区域具有几个，通常为5或7个，类似免疫球蛋白的环(Kaipainen et al.，J.Exp.Med.178：2077-2088(1993))。另外两个区域包括跨膜区域和羧基端的细胞内催化结构域，催化结构域被一段不同长度的，被称为激酶插入结构域的亲水性激酶内序列(interkinase sequence)的插入所中断(Terman et al.，Oncogene6：1677-1683(1991))。VEGF受体包括FLT-1(由Shibuya M.etal.Oncogene 5，519-524(1990)所测序)；KDR(含激酶插入结构域的受体，kinase insert domain-containg receptor)，在1992年2月20日归档的PCT/US92/01300中和在Terman et al.，Oncogene 6：1677-1683(1991)中描述；和FLK-1，由Matthews W.et al.Proc.Acad.Sci.USA，88：9026-9030(1991)测序。KDR是小鼠FLK-1的人类同源物。KDR和FLK-1也被称为VEGFR2。
具有同源氨基酸序列的对等受体，如上文所定义，存在于所有的哺乳动物中，例如，人类，小鼠。与一种VEGF受体结合的抗体并不一定意味着和另一种VEGF受体结合，与一种哺乳动物中的一种VEGF受体结合并不一定意味着和另一种哺乳动物中的对等受体结合。
有人提出KDR通路在人类肿瘤的血管发生中起着重要作用。VEGF受体主要在内皮细胞和造血细胞上表达。当肿瘤细胞合成和分泌VEGF后，VEGF与VEGFR2受体结合并刺激新的血管的生长。已经发现除非有专门的血液供应，否则肿瘤的生长不能超过一定的大小。
在PCT申请US95/01678中描述了通过杂交瘤技术生产抗鼠VEGF受体FLK-1的单克隆抗体。这些单克隆抗体被认为通过干扰VEGF和它的受体的相互作用而抑制受体的激活。这些抗体被证明能特异性地抑制VEGF对转染的3T3细胞上表达的FLI-1受体的激活。在体内，它被表明能够通过抑制与肿瘤相关的血管发生而强烈抑制人类成胶质细胞瘤异种移植物在裸鼠中的生长。
但是，不是所有与鼠受体FLK-1结合的抗体都能够以足够的亲和性与其人类同源物，KDR，反应，以成为可用于人类治疗用的，商业上可行的产品。因此，需要比现有技术中已知的抗体具有更高亲和性的抗KDR抗体。
本发明的目标为提供能够中和VEGF和其人类受体，KDR，之间的相互作用的高效力抗体，上述抗体的亲和性比现有技术中已知的抗体要高。发明概述
通过提供与KDR结合的，亲和性与人类VEGF可比的并且能够中和KDR的激活的免疫球蛋白，已经达到了这些和其它目标，这对于本领域具有普通技术的人员将是显而易见的。
免疫球蛋白分子包括单价单链抗体，多价单链抗体，双体(diabody)，三体(triabody)，抗体，人源化抗体和嵌合抗体。
本发明进而提供了编码这些免疫球蛋白分子的核酸分子。
本发明还提供了制备上述免疫球蛋白的方法。本发明进而提供了用这样的免疫球蛋白分子，中和KDR激活的方法，在哺乳动物中抑制血管发生的方法和在哺乳动物中抑制肿瘤生长的方法。缩写
VEGF，血管内皮细胞生长因子；bFGF，碱性成纤维细胞生长因子；KDR，含激酶插入结构域的受体(也称为VEGF受体2)；FLK-1，胎肝激酶1；scFv，单链Fv；HUVEC，人脐静脉内皮细胞；PBS，0.01M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)；PBST，含有0.1％吐温20的PBS；AP，碱性磷酸酶；EGF，上皮细胞生长因子；VH和VL，分别为免疫球蛋白重链和轻链的可变区。附图描述
图1是显示不同的scFv抗体(p1C11，p1F12，p2A6，和p2A7)与固定的KDR直接结合的图。
图2是显示不同的scFv抗体(p1C11，p1F12，p2A6，和p2A7)对KDR与固定的VEGF165的结合的抑制作用的图。
图3是显示scFv抗体(p2A6和p1C11)对VEGF诱导的HUVEC增殖的抑制作用的图。
图4是c-p1C11的VH和VL链的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。
图5是显示抗体(c-p1C11，p1C11，p2A6)与固定的KDR直接结合的图。
图6是显示c-p1C11与表达KDR的HUVEC细胞结合的FACS分析的图。
图7是显示不同的scFv抗体(c-p1C11，p1C11，p2A6)对KDR受体与固定的VEGF165结合的抑制作用的图。
图8是显示c-p1C11和未标记VEGF165对放射性标记的VEGF165与固定的KDR受体结合的抑制作用的图。
图9是显示抗KDR抗体(c-p1C11，p1C11)对VEGF诱导的HUVEC增殖的抑制作用的图。发明详述
本发明提供了与KDR的细胞外结构域特异结合的免疫球蛋白，其亲和性可以与VEGF相比。这种结合的结果是，与先前描述的免疫球蛋白分子相比，该免疫球蛋白可以更有效地中和对受体的激活。VEGF受体的细胞外结构域在本文定义为在该受体的细胞外区域的配基结合结构域。
免疫球蛋白分子是识别并结合特定抗原或物质的蛋白。免疫球蛋白分子包括天然存在的抗体，单价单链抗体，多价单链抗体，双体，三体，嵌合抗体，人源化抗体和其它与抗原特异结合的分子。
本发明的免疫球蛋白分子与KDR结合的亲和性可以和天然配基相比。亲和性，由抗原和免疫球蛋白分子结合的平衡常数(K)表示，度量了抗原决定簇和免疫球蛋白分子结合的强度，而与结合位点的数量无关。抗原决定簇，也被称为表位，是在抗原上的特定免疫球蛋白分子结合的位点。通常K值为105到1011升/mol。任何小于104升/mol的K值被认为是意味着非特异结合。K的倒数被指定为Kd(Kd也可以被称为解离常数)。Kd越小，抗原决定簇与抗体结合位点之间的结合力越强。
KDR的天然配基是人VEGF。VEGF以0.93nM的亲和性(Kd)结合KDR。为了抑制VEGF与KDR的结合，抗KDR抗体必需以与VEGF可比的亲和性与KDR结合。也就是说，抗KDR抗体必需成功地在与KDR的结合上与VEGF竞争。Kd至多为5nM的抗体，其与KDR结合的亲和性被认为是与天然配基可以相比的。优选地，本发明的抗体结合KDR的亲和性至多为约4nM，更优选地，亲和性至多为约3nM，最优选地，亲和性为至多约2nM，最佳亲和性为约1nM。
本发明的抗体中和KDR(参见实施例)。在本说明书中，中和受体的意思是减小和/或失活该受体转导信号的内源激酶活性。KDR中和的一种可靠的检测方法是对受体磷酸化的抑制。
本发明不受任何特定的KDR中和机制的限制。在提出本申请时，抗体中和KDR的机制尚未被很好地了解，并且一种抗体所遵循的机制不一定与另一种抗体相同。一些可能的机制包括防止VEGF配基与KDR细胞外结合结构域结合，并且防止受体的二聚体化或寡聚体化。但是，不能排除其它机制。
优选的免疫球蛋白分子是称为单价单链抗体(scFv)的抗体片段。单价单链抗体包括一个抗体重链可变片段(VH)通过肽接头与一个抗体轻链可变片段(VL)连接，上述肽接头允许两个片段结合形成功能性的抗原结合位点(参见，例如U.S.Pat.No.4,946,778，Ladner et al.，(Genex)；WO88/09344，CreativeBiomolecules，Inc/Huston et al.)。WO 92/01047 CambridgeAntibody Technology et al./McCafferty et al.，描述了scFv在可溶的重组基因展示包装(soluble recombinant genetic displaypackage)，如噬菌体，表面上的展示。带有接头的单链抗体可以被表示为VL-L-VH或VH-L-VL。
价(Valency)是指一个免疫球蛋白分子上所具有的对特定表位的结合位点数。例如，单价抗体具有一个特定表位的结合位点。抗体亲抗源性(avidity)是对免疫球蛋白分子和其抗原之间结合强度的度量。抗体亲抗源性同时涉及表位与其免疫球蛋白分子上的抗原结合位点之间的亲和性以及免疫球蛋白的价。
单链抗体缺少它们所源自的完整抗体的部分或全部恒定结构域。因此，它们可能克服与完整抗体的使用相关的一些问题。例如，单链抗体倾向于避免重链恒定区和生物分子之间的不合乎需要的相互作用，或其它不需要的生物学活性。此外，单链抗体要比完整抗体小很多，因此可能具有比完整抗体更大的毛细管渗透性，从而允许单链抗体更有效地定位并更有效地与目的抗原结合位点结合。同时，单链抗体可以在原核细胞中较大量地产生，从而便利于它们的生产。进而，单链抗体相对较小的大小使得它们在接受者(recipient)中引起不合乎需要的免疫应答的可能性比完整抗体更小。
用来产生单链抗体的肽接头可以是柔性的肽，柔性肽的选择确保VL和VH连接后形成正确的三维折叠，以便使其保持全长的抗KDR抗体的目标分子结合活性。通常，VL或VH序列的羧基端被这样的肽接头连接到互补VH或VL序列的氨基端。该接头通常为10-50个氨基酸残基。优选地，该接头为10-30个氨基酸残基。更优选地，该接头为12-30个氨基酸残基。最优选地，该接头为15-25个氨基酸残基。这样的接头肽的一个例子为(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3。
单链抗体，每个具有通过一个第一肽接头共价连接的一个VH和一个VL，可以至少被另一个肽接头共价连接以形成多价单链抗体。多价单链使得具有完整抗体的特异性和抗体亲抗源性，但是缺少全长抗体的恒定区的抗体片段的构建成为可能。
多价免疫球蛋白抗体可以是单特异性的或多特异性的。术语特异性指特定免疫球蛋白分子能够结合的不同抗原决定簇的数目。如果免疫球蛋白分子只能结合一种抗原决定簇，该免疫球蛋白分子就是单特异性的。如果免疫球蛋白分子能结合不同的抗原决定簇，那么该免疫球蛋白分子就是多特异性的。
例如双特异性多价抗原允许其识别两个不同的表位。上述表位可以都在KDR上。替代地，一个表位可以是在KDR上，而另一个表位可以在其它抗原上。
多价单链抗体的每一条链包含一个轻链可变片段和一个重链可变片段，并且通过肽接头和至少一个其它链连接。上述肽接头至少由15个氨基酸残基组成。最大氨基酸残基数大约为100。在一个优选的实施方案中，VL和VH结构域的数目是相等的。优选地，肽接头(L1)将VH和VL结构域连接在一起形成一条链，肽接头(L2)将两条或多条链连接在一起形成具有基本上相同氨基酸序列的多价scFv。
例如，两价单链抗体可以如下表示：VL-L1-VH-L2-VL-L1-VH，或VL-L1-VH-L2-VH-L1-VL，或VH-L1-VL-L2-VH-L1-VL，或VH-L1-VL-L2-VL-L1-VH。
三价或更高价的多价单链抗体具有通过其它肽连接序列连接到两价单链抗体上的肽片段。三价单链抗体的一个例子为：
VL-L1-VH-L2-VL-L1-VH-L2-VL-L1-VH
两个单链抗体可以被组合成二体，也称为二价二聚体。二体具有两条链，二体的每条链含有一个与VL结构域连接的VH结构域。连接结构域的接头足够短，以防止同一条链上的结构域之间配对，因而促使不同链上的互补结构域配对，从而再现两个抗原结合位点。上述肽接头包括至少5个氨基酸残基和不多于10个氨基酸残基，例如，(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)，(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2。上述二体的结构是刚性而紧密的。抗原结合位点位于该分子相对的两端。二体可以是单特异性的或双特异性的。
三个单链抗体可以被组合成三体，也称为三价三聚体。三体是通过VL或VH结构域的氨基端直接与VH或VL结构域的羧基端融合而构建的，即，无任何接头序列。三体含有三个Fv头部，其多肽是以环状的，头尾相接的方式排列的。三体分子的可能构象是平面的，三个结合位点位于一个平面上，彼此之间的角度为120度。三体可以是单特异性的，双特异性的或三特异性的。
优选地，本发明的抗体含有完整抗体的所有6个互补决定区，虽然含有少于所有的这些区域，例如3个，4个或5个CDR，的抗体也是具有功能的。
为了将鼠源抗体的免疫原性最小化，本发明还提供了与KDR的细胞外结构域特异性结合并中和受体的激活的，嵌合的和人源化的抗体。嵌合抗体含有源自小鼠抗体的可变区和源自人类抗体的恒定区。嵌合抗体保持了它的结合特异性，但是更接近天然的人抗体。人源化抗体含有小鼠氨基酸的部份仅仅为那些识别KDR所必需的部分，即，CDR。
可以通过结合基本上或完全编码人类恒定区的DNA和编码可变区的DNA而制备得到编码嵌合抗体的DNA，上述可变区基本上或完全源自除了人类以外的哺乳动物的可变区序列。
可以通过结合编码恒定区和除了CDR外的可变区的DNA和编码CDR的DNA而制备编码人源化抗体的DNA，上述恒定区和除了CDR外的可变区基本上或完全源自相应的人类抗体，上述CDR基本上或完全源自人类以外的哺乳动物。
除了人类以外的适当的哺乳动物包括任何可以从其制备单克隆抗体的哺乳动物。这样的哺乳动物的例子包括兔子、大鼠、小鼠、马、山羊或灵长类。小鼠是优选的。
编码抗体片段的DNA分子的适当来源包括任何表达全长抗体的细胞，如杂交瘤和脾细胞。另一来源是本领域中已知的，从噬菌体展示文库产生的单链抗体。
本发明的抗体可以是任何类型的免疫球蛋白，如IgG，IgM，IgA，IgD，或IgE，和它们的亚类的成员，或者由这些成员结合而成。
用于制备免疫球蛋白分子的KDR通常是与细胞，如内皮细胞，结合的。上述KDR也可以是与非内皮细胞，如肿瘤细胞，结合。替代地，KDR可以是不与细胞结合的，优选地为可溶形式。
在以下的实施例中，封闭VEGF和KDR结合的高亲和性抗KDR scFv抗体分离自噬菌体展示文库，上述文库是从用可溶形式的人类VEGF受体免疫的小鼠构建得到的。经过两轮筛选后回收的克隆的90％以上对KDR具有特异性。KDR与这些scFv结合的亲和性是在nM的范围内，这与几种通过杂交瘤技术制备的抗KDR二价单克隆抗体的亲和性一样高。
人类噬菌体文库也可以被用来产生这样的高亲和性抗KDR scFv抗体。
上述scFv抗体，p1C11(图4)，是从分离自噬菌体展示文库的单链抗体(scFv)制备得到的。(参见下文的实施例)。p1C11被显示能够封闭VEGF-KDR相互作用，抑制VEGF刺激的受体磷酸化和HUVEC有丝分裂。该scFv同时结合可溶性的KDR和在HUVEC细胞表面表达的KDR。p1C11是本发明的一种优选的scFv。它和KDR以高亲和性结合(Kd＝2.1nM)。
本发明抗体的每个结构域都可以是完整的免疫球蛋白重链或轻链可变结构域，或者它可以是天然存在的结构域的功能对等物或突变体或衍生物，或者是利用，例如，诸如WO93/11236(Medical ResearchCouncil et al./Griffiths et al.)中描述的技术体外构建的合成结构域。例如，可以将相应于抗体可变结构域的，缺少至少一个氨基酸的结构域连接在一起。最重要的特征是每个结构域与互补结构域连接形成抗原结合位点的能力。因此，术语“重链/轻链可变片段”不应当被解释为将对本发明发挥作用无实质性影响的变体排除在外。
本发明的功能对等物包括氨基酸序列和全长KDR抗体的可变区或高变区的氨基酸序列基本上相同的多肽。“基本上相同”的氨基酸序列在本文中被定义为一段氨基酸序列和另一氨基酸序列的同源性至少为70％，优选地至少为约80％，更优选地至少为约90％，上述同源性是通过根据Pearson and Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.UsA 85，2444-2448(1988)的FASTA搜索方法确定的。
本发明的抗体可以与另外的氨基酸残基融合。这样的残基可以是一段肽标记(peptide tag)，也许是为了便于分离，或者它们可以是在合成时从宿主细胞分泌的信号序列。可以适当地使用分泌引导序列，引导序列是与多肽的N-末端连接的将该多肽导出细胞质的氨基酸序列。
本发明还提供了含有根据本发明的多肽的编码序列的核酸分子，以及这样的核酸的各种库。
可以通过已知的技术，如PCT申请WO93/21319，WO89/09622，欧洲专利申请239,400，338,745和332,424中所描述的技术和/或其它常规的重组DNA技术进行上文描述的DNA的缺失和重组，如下文所述。
在下文描述的实施例中从p1c11产生了嵌合的抗KDR抗体，c-p1C11。嵌合-p1C11与可溶的以及细胞表面表达的KDR的细胞外结构域特异性地结合。c-p1C11的结合亲和性为0.82nM。它有效地中和了人类内皮细胞的KDR和MAP激酶p44/p42的激活。另外，c-p1C11有效地中和了VEGF诱导的人类内皮细胞有生分裂。
c-p1C11与KDR的结合比其母体scFv，p1C11，更为有效，并且在中和KDR相互作用的活性上和在抑制VEGF刺激的HUVEC有丝分裂上更为强有力。c-p1C11结合KDR的亲和性大约为其母体scFv的2.5倍，这主要是由于二价c-p1C11的较低的解离速率(见表2)。实施例
下文列出的实施例是用来帮助对本发明的理解，而不是用来，并不应被理解为用来，在任何方面限制本发明的范围。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码多肽的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.，fritsch，E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press.实施例I.单链抗体的产生实施例I(a)细胞系和蛋白
原代培养的HUVEC细胞在EBM-2培养基中，在37℃，5％ CO2的条件下维持。所有分析中使用的细胞都在2-5代之间。VEGF165蛋白在杆状病毒中表达并纯化。编码KDR细胞外结构域的cDNA是通过RT-PCR从人胎肾mRNA中分离得到的，并且被亚克隆到AP-Tag载体的Bg1 II和BspE I位点之间。在上述质粒中，KDR的细胞外结构域与人胎盘AP cDNA在读码框架内融合。上述质粒与新霉素表达载体pSV-Neo一起被通过电穿孔法导入NIH3T3细胞，并用G418选择稳定的细胞克隆。利用固定的针对AP的单克隆抗体通过亲和层析从细胞培养物的上清中纯化融合蛋白KDR-AP。实施例I(b).小鼠的免疫和单链抗体噬菌体展示文库的构建
在雌性BALB/C小鼠的腹膜内(i.p.)两次注射10μg在200μlRIBI佐剂系统中的KDR-AP，并且在两个月后进行一次无RIBI佐剂的i.p.注射。在第一次免疫同时，也在上述小鼠的皮下(s.c.)注射10μg在200μlRIBI佐剂系统中的KDR-AP。在进行安乐死的三天之前，对上述小鼠腹膜内进行20μg KDR-AP的加强注射。取出供体小鼠的脾脏并且分离细胞。提取RNA，并从脾细胞的总RNA中纯化mRNA。利用上述mRNA构建scFv噬菌体展示文库，该mRNA被展示在丝状噬菌体M13的表面。
在丝状噬菌体表面展示scFv时，抗体VH和VL结构域通过15个氨基酸长的接头(GGGGS)3被连接在一起并且与噬菌体蛋白III的N末端融合。在VL的C末端和蛋白III之间插入一个15氨基酸长的E标记物，其后紧接琥珀密码子(TAG)，以便用于检测和其它分析目的。位于E标记物和蛋白III之间的琥珀密码子使得当构建体被转入到抑制宿主时(如TGI细胞)，构建体以表面展示的形式制造scFv，当构建体被转入到非抑制宿主时(如HB2151)，构建体以可溶的形式制造scFv。
装配的scFv DNA被连接到PCANTAB 5E载体。转化后的TG1细胞被涂布到2YTAG平板上并温育。将菌落刮取到10ml 2YT培养基中，与5ml 50％的甘油混合并储存在-70 C作为文库的储存物。实施例I(c)生物淘选(Biopanning)
文库的储存物被生长到对数生长期，用M13K07辅助噬菌体援救(resecue)并在2YTAK培养基含有(100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的2YT培养基)中30C扩增过夜。噬菌体制备物用4％PEG/0.5M NaCl沉淀，重悬浮于含有500μg/mlAP蛋白的3％脱脂牛奶/PBS中，并在37C温育1小时以捕获展示抗AP scFv的噬菌体并封闭其它非特异性结合。
将用KDR-AP(10μg/ml)包被的Maxisorp Star管(Nunc，Denmark)首先用3％牛奶/PBS在37C封闭1小时，然后与噬菌体制备物在室温温育1小时。将该管用PBST洗10次后，用PBS洗10次(含0.1％吐温20的PBS)。将结合的噬菌体在室温用新鲜制备的100mM三乙胺洗脱10分钟。将洗脱的噬菌体与10ml对数中期的TG1细胞37C静置温育30分钟和摇晃温育30分钟。将感染的TG1细胞涂布到2YTAG平板上并30C温育过夜。
经过3轮筛选后，百分之九十九(185/186)的克隆都被发现是KDR的特异性结合者。但是，这些结合者中只有15个(8％)能够封闭KDR与固定的VEGF的结合。这15个克隆的BstN I指纹图谱表明存在两种不同的消化图谱；而21种随机挑取的VEGF非封闭克隆(non-blocker)产生4种不同的方式。在第二轮淘选后鉴定的克隆中也见到了所有的消化图谱。
从第二轮淘选后的克隆中挑出每种消化图谱的代表克隆并进行DNA测序。在15个测序的克隆中，鉴定出了2个独特的VEGF封闭克隆(blocker)和3个非封闭克隆。一种既不结合KDR也不封闭VEGF和KDR的结合的scFv，p2A7，被选出作为所有研究的阴性对照。实施例I(d)噬菌体ELISA
在96孔板中37℃生长单个克隆，并如上文所述用M13K07辅助噬菌体进行援救。扩增的噬菌体制备物用1/6体积的18％牛奶/PBS室温封闭1小时，并加入到用KDR-AP或AP(1μg/ml×100μl)包被的Maxi-sorp 96孔微量滴定板(Nunc)。室温温育1小时后，将滴定板用PBST洗3次，并与兔抗M13噬菌体-HRP交联物温育。将滴定板洗5次，加入TMB过氧化物酶底物，用读板机读取450nm的OD，鉴定scFv抗体并测序。实施例I(e)可溶性scFv的制备
用单个克隆的噬菌体感染非抑制(non-suppressor)E.coli宿主HB2151，并在2YTAG-N平板上筛选被感染的宿主。通过在含有1mM异丙基β-D硫代半乳糖苷的2YTA培养基中30C培养细胞而诱导scFv在HB2151细胞中的表达。细胞周质抽提物的制备如下：将细胞沉淀悬浮于含有20％(w/v)20％蔗糖，200mM NaCl，1mM EDTA和0.1mMPMSF的25mM Tris(pH7.5)中，然后在4C温育并轻柔搅拌1小时。15,000rpm离心15分钟后，利用RPAS Purification Module(Pharmacia Biotech)通过亲和层析从上清中纯化可溶性的scFv。实施例II分析检测实施例II(a)定量KDR结合分析
两种分析方法被用来定量检验纯化的可溶scFv与KDR的结合。
用非抑制宿主E.coli HB 2151细胞在摇床烧瓶中表达4个不同的克隆，包括两个VEGF封闭克隆，p1C11和p1F12，一个非封闭克隆，显性克隆p2A6和一个不结合的克隆，p2A7。通过抗-E-标记的亲和层析从E.coli的周质抽提物中纯化可溶的scFv。这些克隆的纯化scFv的产量在100-400μg/升培养物之间。
在直接结合分析中，不同量的可溶scFv被加入到KDR包被的96孔Maxi-sorp微量滴定板中并在室温温育1小时，然后用PBST洗板3次。然后将滴定板在室温与100μl小鼠抗-E-标记抗体温育1小时，接着与100pl兔抗鼠抗体-HRP交联物温育。按照上文噬菌体ELISA实验中描述的方法将滴定板洗涤和显色。
在另一个分析检测中，即，竞争性VEGF封闭检测中，不同量的scFv与固定量的KDR-AP(50ng)混合并在室温温育1个小时。将混合物转移到用VEGF165(200ng/孔)包被的96孔微量滴定板并在室温继续温育2小时，然后将滴定板洗5次，加入AP的底物以对结合的KDR-AP分子定量。然后计算IC50，即，50％抑制KDR与VEGF结合所需要的scFv浓度。
图1示通过直接结合ELISA测定的，scFv和固定的KDR的剂量依赖型结合。如图2中所示，克隆p1C11和克隆p1F12也能封闭KDR与固定的VEGF的结合，但是克隆p2A6不能。图2中所示的数据是3次重复实验的平均数±SD。阴性对照克隆，p2A7既不能结合KDR也不能封闭KDR与VEGF的结合(图1和2)。克隆p1C11，每次淘选后的显性克隆，表现出最高的KDR结合能力和最大的封闭VEGF与KDR结合的强度(表1)。与KDR 50％最大结合所需要的和50％抑制KDR与VEGF结合所需要的克隆p1C11的抗体浓度分别为0.3nM和3nM(见表1)。FACS分析表明p1C11，p1F12和p2A6也能与HUVEC细胞表面表达的受体结合。实施例II(b)可溶scFv的BIAcore分析
用BIAcore生物感应器(Pharmacia Biosensor)测量了可溶性scFv与KDR结合的动力学。KDR-AP融合蛋白被固定到感应器的芯片上，被注射的可溶性scFv的浓度在62.5nM到1000nM之间。在每个浓度得到感应器谱图(Sensorgram)，并用一个程序，BIA Evaluation2.0对其进行评估，以确定速率常数kon和koff。从速率常数kon/koff的比率计算得到Kd。
表1示在BIAcore仪器上的表面等离子体共振的结果。VEGF-封闭性的scFv，p1C11和p1F12，分别和固定的KDR以Kd 2.1和5.9nM结合。非封闭性的scFv，p2A6，与KDR结合的亲和性比最好的结合克隆p1C11大约弱6倍(Kd，11.2nM)，主要是由于其解离速率要快很多。如所预期的那样，p2A7不与固定在BIAcore上的KDR结合。实施例II(c)磷酸化分析
磷酸化分析是利用HUVEC的早期传代细胞按照先前描述的方法进行的。简言之，将HUVEC与补充了0.5％牛血清白蛋白的，无血清的EBM-2基础培养基在有或无5μg/ml scFv抗体的情况下室温温育10分钟，然后用20ng/ml的VEGF165在室温继续刺激15分钟。裂解细胞，用偶联了兔抗KDR多克隆抗体(ImClone Systems Incorporated)的蛋白A Sepharose小珠从细胞裂解液中免疫沉淀KDR受体。洗涤小珠，与SDS上样缓冲液混合，将上清进行Western印迹分析。为了检测KDR的磷酸化，印迹用抗磷酸化酪氨酸的Mab，4G10检测。对于MAP激酶活性分析，将细胞裂解液用SDS-PAGE进行解析后利用磷特异的MAP激酶抗体进行Western印迹分析。所有的信号都用FCL探测。
结果表明VEGF-封闭性的scFv p1C11能够抑制VEGF刺激的KDR受体的磷酸化，而非封闭性的scFv p2A6不能。进而，p1C11也有效地抑制了VEGF刺激对MAP激酶p44/p42的激活。相反，p1C11和p2A6都不能抑制FGF刺激对MAP激酶p44/p42的激活。实施例II(d)抗有丝分裂原分析
将HUVEC(5×103细胞/孔)加入到96孔组织培养板(Wallach，Inc.，Gaithersburg，MD)的200μl无VEGF，bFGF或EGF的EBM-2培养基中并在37C温育72小时。往一式两份的平行孔(duplicate wells)中加入不同量的抗体并在37C预温育1小时，然后加入终浓度16ng/ml的VEGF165。温育18小时后往每个孔中加入0.25μCi的[3H]-TdR(Amersham)并继续温育4小时。将细胞置于冰上，用无血清的培养基洗两次，然后与10％TCA在4C温育10分钟。然后将细胞用水洗一次，并用25μl2％的SDS溶解。加入闪烁液(150μl/孔)并在液闪计数器(Wallach，Model 1450 MicrobetaScintillation Counter)上测定掺入DNA的放射性活性。
scFv抗体封闭HUVEC上VEGF刺激的有丝分裂原活性的结果在图3显示。VEGF-封闭性的scFv p1C11强有力地抑制了HUVEC中VEGF诱导的DNA合成，其EC50，即对VEGF刺激的HUVEC有丝分裂50％抑制所需要的抗体浓度，为大约5nM。非封闭性的scFv p2A6对VEGF的有丝分裂原活性表现为无抑制效应。p1C11和p2A6都不能抑制HUVEC中bFGF诱导的DNA合成(数据未示出)。图3中显示的数据为至少3次单独实验的代表。()只有VEGF；()无VEGF。实施例IV.嵌合抗体的产生实施例IV(a)细胞系和蛋白
原代培养的人脐静脉细胞(HUVEC)在EBM-2培养基中，在37℃，5％CO2的条件下维持。所有分析中使用的细胞都在2-5代之间。VEGF165和KDR-碱性磷酸酶融合蛋白(KDR-AP)分别在杆状病毒中和NIH 3T3细胞中表达，并按照上文描述的方法纯化。抗KDR的scFvp1C11和scFv p2A6，一种与KDR结合但是不封闭KDR-VEGF相互作用的抗体，是从噬菌体展示文库分离得到的，上述噬菌体展示文库是从用KDR免疫的小鼠构建得到的，如上文所述。C225是针对上皮生长因子(EGF)受体的一种嵌合IgG1抗体。实施例(b)scFv p1C11可变结构域的克隆
p1C11的轻链(VL)和重链(VH)可变结构域是分别利用引物1和2，以及引物3和4，通过PCR从scFv表达载体克隆得到的。分别利用引物5和2，以及引物5和4，通过PCR，将用于在哺乳动物细胞中负责蛋白分泌的引导肽序列加入到VL和VH的5’端。引物1：5′CTA GTA GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA GAC ATC
GAG CTC3′引物2：5′TCG ATC TAG AAG GAT CCA CTC ACG TTT TAT TTC CAG3′
BamHI引物3：5′CTA GTA GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA CAG GTC
AAG CTG3′引物4：5′TCG AAG GAT CCA CTC ACC TGA GGA GAC GGT3′
BamHI引物5：5′GGT CAA AAG CTT ATG GGA TGG TCA TGT ATC ATC CTT TTT
HindIII
CTA GTA GCA ACT3′实施例IV(e)嵌合p1C11 IgG表达载体的构建
分别构建了用于表达嵌合IgG轻链和重链的载体。克隆的VL基因用Hind III和BamHI水解，并与含有人κ轻链恒定区(CL)的载体pKN100连接以产生表达嵌合p1C11轻链，c-p1C11-L，的载体。克隆的VH基因用HindIII和BamH I水解，并与含有人IgG1(γ)重链恒定区(CH)的载体pGID105连接以产生表达嵌合p1C11重链，c-p1C11-H，的表达载体。通过限制性内切酶水解检测上述两种构建体，并通过脱氧核酸测序确认。
如图4中所见，VH和VL结构域都在其5’端精确地和编码导肽序列的基因片段融合，如所标明的那样。VH和VL结构域通过HindIII和BamH I水解位点分别被连接到载体pG1D105和pKN100上，上述质粒pG1D105含有cDNA形式的人γ1恒定区基因，质粒pKN100含有cDNA形式的人κ链恒定区基因。在每种情况下，表达都是在HCMVi启动子的控制之下，并且由人工终止序列终止。根据Kabat et al.等人的关于高变序列的描述定义的轻链和重链互补决定区(CDR)用下划线表示并且分别标明CDR-H1到H3和CDR-L1到L3。实施例IV(d)IgG的表达和纯化
用等量的c-p1C11-L和c-p1C11-H质粒共转染COS细胞以进行IgG的瞬时表达。在含有DMEM/10％FCS的150mm培养皿中生长的分会合(subconfluent)COS细胞用20ml含有40mM Tris(pH7.4)的DMEM洗涤一次，然后与4ml的DMEM/DEAE-Dextran/DNA混合物(含有40mM Tris，0.4mg/ml的DEAE-Dextran(Sigma)，以及c-p1C11-L和c-p1C11-H质粒各20μg的DEME)在37C一起温育4.5小时。上述细胞与4ml含有100nM氯喹(Sigma)的DMEM/2％FCS在37℃温育1小时，然后与1.5ml 20％的甘油/PBS在室温温育1min。上述细胞用DMEM/5％FCS洗涤两次并在20ml同样的培养基中37℃温育过夜。用普通的DMEM洗涤两次后，将上述细胞转入无血清的DMEM/HEPES培养基中。在转染后48小时和120小时收集细胞培养物的上清。按照厂商(Pharmacia Biotech)所描述的方法利用Protein G柱通过亲和层析从收集的上清中纯化嵌合的IgG。收集含有IgG的级分，将缓冲液换成PBS，并用Centricon 10浓缩器浓缩(Amicon Corp.，Beverly，MA)。IgG的纯度用SDS-PAGE进行分析。用羊抗人y链特异的抗体作为捕捉剂，用HRP交联的羊抗人k链抗体作为检测试剂，通过ELISA确定纯化的抗体的浓度。利用临床级别的抗体，C225，校准标准曲线。
Protein G亲和纯化后，在SDS-PAGE中看到一条～150KD的单一蛋白条带。用HRP交联的抗人IgG1 Fc特异的抗体进行的Western印迹分析确认了纯化的蛋白中存在人IgG Fc部分(未显示)。
ELISA结果表明c-p1C11与固定的KDR的结合比母体scFv更有效(图5)。实施例V.检测和分析实施例V(a).FACS分析
将早期传代(early passage)的HUVEC细胞在无生长因子的EBM-2培养基生长过夜，以诱导KDR的表达。收集上述细胞并用PBS洗涤三次，与c-p1C11 IgG(5μg/ml)在4C温育1小时，然后与FITC标记的兔抗人Fc抗体(Capper，Organon Teknika Corp.，WestChester，PA)继续温育60min。洗涤上述细胞并用流式细胞仪(ModelEPICS，CoulterCorp.，Edison，NJ)分析。
图6是显示c-p1C11与表达KDR的HUVEC结合的FACS分析图。与先前在母体scFv中所见到的那样，c-p1C11与在早期传代HUVEC上表达的KDR特异结合。实施例V(b).定量KDR结合分析
将不同量的抗体加入到KDR包被的96孔Maxi-sorp微滴定量板(Nunc.Danmark)并在室温温育1小时，然后用含有0.1％吐温-20的PBS将上述滴定板洗涤三次。然后，对于scFv，将上述滴定板与100μl的小鼠抗-E标记的抗体-HRP交联物(Pharmacia Biotech)室温温育1小时，或对于嵌合IgG，将滴定板与100μl兔抗人IgG特异的抗体-HRP交联物(Cappel，Organon Teknika Corp.)室温温育1小时。将滴定板洗涤5次，加入TMB过氧化物酶底物(KPL，Gaithersburg，MD)，用读板机(Molecular Device，Sunnyvale，CA)读取450nm的OD值。
图5是显示抗体与固定的KDR直接结合的图。显示的结果表明C-p1C11与固定的KDR受体的结合比其母体scFv更有效实施例V(c)BIAcore分析
用BIAcore生物感应器(Pharmacia Biosensor)测量了抗体与KDR结合的动力学。KDR-AP融合蛋白被固定到感应器芯片上，浓度在25nM到200nM之间的抗体或VEGF被注射入。在每个浓度得到感应器谱图(Sensorgram)，并用一个程序，BIA Evaluation 2.0对其进行评估，以确定速率常数kon和koff。从速率常数kon/koff的比率计算得到Kd。
BIAcore分析结果表明c-p1C11与KDR的结合比其母体scFv的亲和性更高(表2)。c-p1C11的Kd是0.82nM，而scFv的是2.1nM。c-p1C11亲和性的升高主要是由于二价的嵌合IgG的解离速率(koff)较低。值得注意的是c-p1C11和KDR结合的亲和性(Kd)与天然配基VEGF结合KDR的亲和性，根据BIAcore分析的测定为0.93nM(表2)，相似。实施例V(d)竞争性VEGF结合实验
在第一个分析实验中，将不同量的抗体与固定量的KDR-AP(50ng)混合并在室温温育1小时。然后将混合物转移到VEGF165(200ng/孔)包被的96孔微量滴定板并在室温继续温育2小时，之后将滴定板洗5次，加入AP的底物(p-硝基酚磷酸(p-nitrophenyl phosphate)，Sigma)以对结合的KDR-AP分子进行定量。然后计算EC50，即50％抑制KDR与VEGF结合所需要的抗体浓度。
图7显示c-p1C11以剂量依赖的方式封闭了KDR受体与固定的VEGF的结合。在封闭VEGF-KDR相互作用上嵌合抗体更为强有力，其IC50为0.8nM，而scFv的为2.0nM。作为对照的scFv p2A6也与KDR结合，但是不能封闭VEGF-KDR相互作用(图7)。
在第二个分析实验中，将不同量的c-p1C11抗体或无同位素标记的VEGF165蛋白与固定量的125I标记的VEGF165混合并加入到KDR受体包被的96孔微量滴定板。滴定板在室温温育2小时，洗涤5次后计数与固定的KDR受体结合的放射性标记的VEGF165。确定50％封闭放射性VEGF与固定的KDR受体结合所需要的c-p1C11和未标记VEGF165的浓度。
对放射性标记的VEGF165结合的抑制的结果在图8显示。显示的数据是三次重复测量的平均值。显示结果表明c-p1C11能以剂量依赖的方式有效地与125I标记的VEGF竞争结合固定的KDR受体。如所预期的那样，C225，针对EGF受体的的嵌合抗体不与KDR受体结合或封闭VEGF-KDR相互作用(结果未显示)。实施例V(e)磷酸化分析
实验前将接近汇合(subconfluent)的HUVEC细胞在无生长因子的EBM-2培养基中生长24到48小时。用50nM正钒酸钠预处理30分钟后，细胞在有或无抗体的条件下温育15分钟，然后用20ng/ml的VEGF165或10ng/ml的EGF继续刺激15分钟。然后在裂解缓冲液(50nM Tris，150mM NaCl，1％NP-40，2mM EDTA，0.25％脱氧胆酸钠，1mM PMSF，1μg/ml亮肽素(Leupeptin)，1μg/ml抑肽素(pepstatin)，10μg/ml抑肽酶(aprotinin)，pH7.5)中裂解细胞，将细胞裂解液用于KDR和MAP激酶磷酸化分析。用偶联了抗KDR抗体，Mab 4.13(ImClone Systems)的蛋白A Sepharose小珠(SantaCrutz Biotechnology，Inc.CA)从细胞裂解液中免疫沉淀KDR受体。用SDS-PAGE解析蛋白并进行Western印迹分析。为了检测KDR磷酸化，用抗磷酸酪氨酸Mab，PY20(ICN Biomedicals，Inc.Aurora，OH)对印迹进行探测。对于MAP激酶活性分析，细胞裂解液用SDS-PAGE解析，然后用磷酸特异的MAP激酶抗体(New England BioLabs，Beverly，MA)进行Western印迹分析。用ECL(Amersham，ArlingtonHeights，IL)检测所有的信号。在两种分析实验中，用多克隆抗KDR抗体(ImClone Systems)重新检测印迹以保证在每个SDS-PAGE凝胶道中上样了等量蛋白。
C-p1C11有效地抑制了VEGF刺激的KDR受体的磷酸化以及p44/p42 MAP激酶的激活。相反，C225未显示出任何对VEGF刺激的KDR受体和MAP激酶的激活的抑制。单独的c-p1C11和单独的C225对KDR受体和p44/p42 MAP激酶的活性都无任何的作用。与先前在scFv p1C11中所见到的那样，c-p1C11不抑制FGF刺激的p44/p42 MAP激酶的激活(未显示)。此外，scFv p2A6和p2A6的嵌合IgG形式(c-p2A6)都不抑制VEGF刺激的KDR受体和MAP激酶的激活(未显示)。实施例V(f).抗有丝分裂分析
通过[3H]-TdR DNA掺入分析，用HUVEC确定了抗KDR抗体对VEGF刺激的人内皮细胞有丝分裂的作用。将HUVEC(5×103细胞/孔)加入到96孔组织培养板的200μl无VEGF，bFGF或EGF的EBM-2培养基中，并在37C温育72小时。将不同量的抗体加入微孔，一式两份并在37C预温育1小时，然后加入最终浓度为16ng/ml的VEGF165。温育18小时后，在每孔中加入0.25μCi的[3H]-TdR并继续温育4小时。用闪烁计数器确定掺入的DNA的放射性。图9中所示的数据是至少三个单独实验的代表。
c-p1C11和scFv p1C11都有效地抑制了VEGF刺激的HUVEC有丝分裂(图9)。C-p1C11对VEGF诱导的HUVEC有丝分裂的抑制比母体scFv更强。对于c-p1C11和scFv，50％抑制VEGF诱导的HUVEC有丝分裂所需要的抗体浓度分别是0.8nM和6nM。如所预期的那样，scFv p2A26未显示出任何对VEGF刺激的内皮细胞增殖的抑制作用。