光化学基因识别材料及其制备方法和用途 本发明涉及一种特殊材料，具体地说是一种光化学-基因识别材料。
目前用于防伪技术的化学材料很多，如热敏变色材料、光致变色材料、激光材料及荧光材料等，虽然它们能起到一定的防伪作用，但伪造者终能较快地将它们复制，从而降低了防伪的可靠性。对于未知编码的基因，就现今的科技水平而言是很难复制的，如果采用尝试法合成复制它，其成功的可能性仅为4300-400分之一。因此，有人提出过将基因用于防伪技术的设想。然而，由于基因的检测方法(生物化学的分子配对法或PCR扩增法)非常繁琐，只能作为专家进行基因检测时使用，而对于既需要准确，又需要快速方便检测真伪的防伪技术应用领域来说，这些方法就不实用了，故上述设想一直未能付诸实施。经过天津市科学技术信息研究所的查新检索(报告编号97-162)，至今尚未见到有关光化学基因识别材料、制备及将基因和光化学-基因识别材料用于防伪技术领域的文献报道。
本发明的目的是提供一种既可快速方便进行检测识别，又比基因更难以破译、很难加以复制的光化学-基因识别材料，以及该材料的制备方法和在防伪技术领域中的应用。
本发明的目地是这样实现的：本发明的光化学-基因识别材料是一种组成为[B]-[L]-[A]-[G]或[B]-[L]-[G]的化合物，其中[B]为荧光类或光致变色类化学功能基团，[L]为能够连接[B]和[A]或[G]的连接臂，[A]为能连接基因的基团，[G]为基因。
[B]可以采用噁唑类、苯并噁唑类、或稀土配位化合物等荧光类光化学基团，也可以采用螺吡喃、螺噁嗪、俘精酸酐、或二杂芳基乙烯等光致变色类光化学基团；[L]可以采用直链多胺、寡聚酰胺、聚乙二醇或稀土金属离子(如：铕、钆、铽)；[A]为：
本发明的光化学-基因识别材料采用以下A法或B法中的一种方法进行制备：A法：
第一步，光化学识别材料的合成制备，可以选用以下三种合成路线中的一种：以上三种合成路线反应的温度均为室温，反应时间在8～48小时。此处L为直链多胺、寡聚酰胺、或聚乙二醇。
第二步，光化学-基因识别材料的合成制备，按以下反应式进行：
将第一步操作中制得的光化学识别材料[A]-[L]-[B]溶于C1～C2的醇类、丙酮、DMSO、或DMF有机溶剂中，直至饱和，再按重量比10～100∶1的比例与基因缓冲溶液混合(其比值大小取决于所用基因的种类)，在365nm紫外光下照射10分钟，经沉降分离即制得光化学-基因识别材料。B法：
基因G+L+B——→光化学-基因识别材料[B]-[L]-[G]
此处L为稀土金属离子，如：铕、钆、铽。
将光化学识别化合物B溶于乙醇、或环己烷、或苯、或石油醚有机溶剂中，浓度0.01～0.5mol/l，将其与稀土金属离子水溶液(浓度为0.1～0.4mol/l)及基因以1∶4～7∶4～6(溶质重量比)的比例混合，可得具备荧光和/或光致变色性能的光化学-基因识别材料。
光化学-基因识别材料的检测：其方法是将上述制得的光化学-基因识别材料经电泳分离后，在紫外光或太阳光照射下可观察到红色、蓝色或紫色斑点或在紫外光照射下可观察到荧光斑点。
本发明的光化学-基因识别材料被应用于防伪技术领域中，具体的应用方法是这样的：将用上述方法制得的光化学-基因识别材料，按重量比4～25∶75～96的比例混配到油墨或印油连结料中，制成光化学-基因防伪油墨或印油，再用印刷机将防伪油墨印制成隐形光化学-基因防伪标记；或将防伪印油注入渗透型原子印章中，盖出隐形(无色)印迹。用紫外灯可以检测出它的荧光防伪性能，或用日光或在紫外灯照射下可以检测出它的光致变色防伪性能，进一步用PCR仪可以对特定基因进行检测。
本发明与现有技术相比，具有的优点是：由于在防伪标记的印制或盖印中采用了特定编码的光化学-基因识别材料，伪造者几乎不可能仿制出这种特定编码的光化学-基因识别材料(仿制成功的可能性小于4300-400分之一)，这就杜绝了假冒的防伪标记的产生。另一方面由于在基因上连接了特定的光化学功能基团，不仅使本材料具有了双重防伪功能，而且使防伪标记的检测识别变得快速方便和准确，即只需将用本材料印制的防伪标记在日光或紫外光照射下就可观察到它的光致变色效应，或在紫外灯照射下可观察到它的荧光效应。
实施例1：
第一步，合成光化学识别材料SPGGP。
1-(2-(N-氧丁二酰亚胺基)羧乙基)-3’，3’-二甲基-6-硝基-螺[吲哚啉-2，2’[2H-1]苯并吡喃](SPCOONHS)的合成
将1-羧乙基-3’，3’-二甲基-6-硝基-螺[吲哚啉-2，2’[2H-1]苯并吡喃]SPCOOH0.76g(2mmole)溶于20mlDMF中，冷却后，加入0.29g N-羟基丁二酰亚胺(2.5mmole)和0.52gDCC(2.5mmole)，在室温下搅拌24h。滤除固体，减压除去溶剂，残留物用乙酸乙酯溶解，用饱和Na2CO3水溶液洗涤，水洗后，用无水MgSO4干燥，放置得淡黄色固体产物0.9g。MP：140～141℃。
1-(2-(甘氨酸甘氨酰)羰乙基)-3’，3’-二甲基-6-硝基-螺[吲哚啉-2，2’[2H-1]苯并吡喃]的合成
将478mg(1mmole)SPCOONHS溶于30ml干燥DMF中，滴加溶有132mg(1mmole)甘氨酰甘氨酸的1M NaHCO3溶液(40ml)。然后，室温搅拌24h.，减压蒸除溶剂，残留物中加入20ml 10％的柠檬酸水溶液，析出浅粉色固体，沉淀过滤，用水洗涤，真空干燥，得494mg产物。
1-(2-(N-(8-(1-氨乙基)-4，5’二甲基补骨脂素)甘氨酰甘氨酰)羰乙基)-3’，3’-二甲基-6-硝基-螺]吲哚啉-2，2’[2H-1]苯并吡喃]SPGGP的合成
将247mg(0.5mmole)SPGGOH、125mg(0.5mmole)8-(1-氨乙基)-4，5’-二甲基补骨质素、150mg(0.75mmole)DCC溶于15mlCH2Cl2中，室温搅拌24h.，滤出生成的脲，溶液用饱和Na2CO3水溶液洗涤，无水Na2SO4干燥，经硅胶柱色谱分离(丙酮-石油醚)，得330mg浅粉色固体产物(89.9％)，MP：166℃。1HNMR：1.18，1.21(2s，6H)，1.50，1.54(d，J＝8.0，3H)，2.47(s，6H)，2.50～2.60(m，2H)，3.43～3.73(m，6H)，5.79～6.01(m，1H)，6.14(s，1H)，6.41(s，1H)，6.65～7.42(m，7H)，7.57(s，1H)，7.90(s，br，2H)。元素分析(计算值)：C 65.12(65.48)，H 5.40(5.36)，N 9.66(9.54)。UV(丙酮)λmax：光照前339nm，光(365nm)照后571nm；丙酮溶液光照前为无色，紫外光或太阳光照射后均呈紫红色。第二步，合成光化学-基因识别材料DNA-SPGGP
取待标记DNA(大肠杆菌质粒153 DNA)(1μg/μl)5μl于1.5ml EP管中，加入Tris缓冲液(10mM Tris-HCl，PH＝8.0，0.1mM EDTA)，再加入10μl(10μg/μl)SPGGP溶液，混合均匀，EP管不加盖，垂直于365nm紫外灯下照射20min.，样品与紫外灯的距离小于5cm。然后，加入乙醇沉降DNA，洗除未反应的小分子，得光化学-基因识别物质。第三步，检测
光化学-基因材料DNA-SPGGP经电泳分离后，在紫外光或太阳光照射下可直接观察到紫红色斑点。实施例2：
第一步，合成光化学识别材料SPGGA
用前二步反应与实施例1相同的方法合成1-(2-(N-(4’-胺甲基-4，5’二甲基异补骨脂素)甘氨酰甘氨酰)羰乙基)-3’，3’-二甲基-6-硝基-螺[吲哚啉-2，2’[2H-1]苯并吡喃]SPGGA，其第三步反应过程为：
将247mg(0.5mmole)SPGGOH、122mg(0.5mmole)4’-胺甲基-4，5’二甲基异补骨脂素、150mg(0.75mmole)DCC溶于15mlCH2Cl2中，室温搅拌24h.，滤出生成的脲，溶液用饱和Na2CO3水溶液洗涤，无水Na2SO4干燥，经硅胶柱色谱分离(丙酮-石油醚)，得251mg浅黄色固体产物，产率70％。MP：159～160℃。1HNMR：1.18，1.23(2s，6H)，2.50，2.56(2s，6H)，3.50～3.92(m，8H)，4.44～4.52(d，2H)，5.84，5.95(2s，1H)，6.15(s，1H)，6.60～7.42(m，8H)，7.86～8.00(m，2H)。元素分析(计算值)：C 64.97(65.08)，H 5.32(5.18)，N 9.88(9.73)。UV(丙酮)λmax：光照前337nm，光(365nm)照后566.5nm；丙酮溶液光照前为无色，紫外光或太阳光照射后为紫红色。第二步，合成光化学-基因识别材料DNA-SPGGA。
除所加入的待标记DNA为大肠杆菌质粒P11 DNA(0.5μg/μl)10μl、光化学识别材料为10μL(10μg/μl)SPGGA溶液之外，其他均与实施例1中的第二步相同。
第三步，检测
光化学-基因识别材料DNA-SPGGA经电泳分离后，在紫外光或太阳光照射下可直接观察到紫红色斑点。实施例3
第一步，合成光化学识别材料OZGGP。
1-(2-(N-丁二酰亚胺基)羧乙基)-3，3-二甲基螺[吲哚啉-萘并恶嗪]OZCOONHS的合成
将1-(羧乙基)-3，3-二甲基螺[吲哚啉-萘并噁嗪]OZCOOH 0.77g(2mmole)溶于20mlDMF中，冷却后，加入0.29g N-羟基丁二酰亚胺(2.5mmole)和0.52g DCC(2.5mmole)，在室温下搅拌24h.。滤除固体，减压除去溶剂，残留物用乙酸乙酯溶解，用饱和Na2CO3水溶液洗涤，水洗后，用无水MgSO4干燥，放置析出固体产物0.9g(93.2％)。MP：184～185℃。
1-(2-(甘氨酸甘氨酰)羰乙基)-3’，3’-二甲基螺[吲哚啉-萘并噁嗪]OZGGOH的合成
将483mg(1mmole)OZCOONHS溶于30mlDMF中，搅拌下滴加溶有132mg(1mmole)甘氨酰甘氨酸的1M NaHCO3溶液(40ml)。然后，室温下搅拌24h.，减压蒸除溶剂，残留物中加入20ml 10％的柠檬酸水溶液，析出固体，滤出沉淀，用水洗涤，真空干燥，得496mg产物(99％)。MP：100～101℃，
1-(2-(N-(8-(1-氨乙基)-4，5’二甲基补骨脂素)甘氨酰甘氨酰)羰乙基)-3’，3’-二基-螺[吲哚啉-萘并噁嗪]OZGGP的合成
将240mg(0.48mmole)OZGGOH、126mg(0.49mmole)8-(1-氨乙基)-4，5’-二甲基补骨质素、150mg(0.75mmole)DCC溶于15mlCH2Cl2中，室温搅拌24h.，滤出生成的脲，溶液用饱和Na2CO3水溶液洗涤，无水Na2SO4干燥，经硅胶柱色谱分离(丙酮-石油醚)，得360mg浅天蓝色固体产物(94.7％)，MP：177～178℃。1HNMR：1.21，1.25(2s，6H)，1.50，1.54(d，J＝8.0，3H)，2.44，2.48(2s，6H)，2.58～2.63(m，2H)，3.33～4.11(m，6H)，5.85～6.05(m，1H)，6.10～6.12(d，1H)，6.40(s，1H)，6.57～7.78(m，11H)，8.45(m，1H)。元素分析(计算值)：C69.90(69.81)，H 5.70(5.59)，N 9.32(9.47)。UV(丙酮)λmax：光照前339nm，光照后576nm；丙酮溶液光照前为无色，紫外光或太阳光照射后呈蓝紫色。
第二步，合成光化学-基因识别材料DNA-OZGGP。
除所加入的待标记DNA为枯草芽孢杆菌载体质粒PNQ402 DNA(0.1μg/μl)10μl、光化学识别材料为10μL(10μg/μl)OZGGP溶液之外，其他均与实施例1中的第二步相同。
第三步，检测。
光化学-基因识别材料DNA-OZGGP经电泳分离后，在紫外光或太阳光照射下可直接观察到蓝紫色斑点。实施例4
第一步，合成光化学识别材料OZGGA。
用前二步反应与实施例3相同的方法合成1-(2-(N-(4’-胺甲基-4，5’二甲基异补骨脂素)甘氨酰甘氨酰)羰乙基)-3’，3’-二甲螺[吲哚-萘并噁嗪]OZGGA，其第三步反应过程为：
将240mg(0.48mmole)OZGGOH、119mg(0.49mmole)4’-胺甲基-4，5’二甲基异补骨脂素、150mg(0.75mmole)DCC溶于15mlCH2Cl2中，室温搅拌24h.，滤出生成的脲，溶液用饱和Na2CO3水溶液洗涤，无水Na2SO4干燥，经硅胶柱色谱分离(丙酮-石油醚)，得244mg淡蓝色固体，产率70％。MP：168～170℃。1HNMR：1.16，1.21(2s，6H)，2.46，2.50(2s，6H)，3.48～3.96(m，8H)，4.46～4.51(d，2H)，5.90～6.02(m，1H)，6.17(s，1H)，6.68～7.76(m，11H)，8.50(m，1H)。元素分析(计算值)：C 69.21(69.50)，H 5.61(5.42)，N 9.70(9.65)。UV(丙酮)λmax：光照前344.5nm，光照后578nm；丙酮溶液光照前无色，紫外光或太阳光照射后为蓝紫色。第二步，合成光化学-基因识别材料DNA-OZGGA。
除所加入的DNA为枯草芽孢杆菌载体质粒PNQ219 DNA(0.1μg/μl)10μl、光化学识别材料为10μL(10μg/μl)OZGGA溶液之外，其他均与实施例1中的第二步相同。第三步，检测
光化学-基因识别材料DNA-OZGGA经电泳分离后，在紫外光或太阳光照射下可直接观察到蓝紫色斑点。实施例5第一步，光化学识别材料I的合成。
向溶有0.5g(2.22mmole)的5-羟基-6-亚硝基-1，10-菲罗啉的20ml乙醇溶液中加入溶有0.39g(2.22mmole)的1，3，3-三甲基-2-亚甲叉基吲哚啉的15ml乙醇液，在氮气保护下回流2小时，待冷却后减压除去溶剂，残留物用柱层析分离(丙酮-石油醚1∶3)得0.20g产物(I)，MP：175℃。反应过程如下：第二步，合成光化学-基因识别材料II。
向4ml EuCl3水溶液(0.2M)中，加入0.8ml NaAc-HAc缓冲溶液(pH＝5～6)，然后加入0.566g(I)、0.456g的小牛胸腺DNA(G)，8ml环己烷，搅拌3～4小时，即得光化学-基因识别材料(II)。反应过程如下：第三步，检测。
用UV照射前，(II)的丙酮溶液为无色，用UV照射时，则呈红色荧光，并且变为紫色。实施例6
将上述实施例1所得光化学-基因识别物质DNA-SPGGP 25份与75份胶印墨连结料相混合，在三辊研磨机上研磨，得均匀的光化学-基因胶印防伪油墨。将该油墨在胶印机上，印制到发票专用纸上，得隐形防伪标记。在紫外光或太阳光照射时呈紫红色，避光时颜色复原；用PCR扩增仪检测出其特定的基因。实施例7
将上述实施例2所得的光化学-基因识别物质DNA-SPGGA 4份溶于96份丝网墨连结料中，溶解分散均匀，得光化学-基因丝网防伪油墨。将该油墨在丝网印刷机上，印制到不干胶铜版纸上，得隐形防伪标记。在紫外光或太阳光照射时呈紫红色，避光时颜色复原；用PCR扩增仪检测出其特定的基因。实施例8
将上述实施例3所得光化学-基因识别物质DNA-OZGGP 8份溶于92份凹印墨连结料中，溶解分散均匀，得光化学-基因凹印防伪油墨。将该油墨在凹印机上，印制到BOPP塑料薄膜上，得隐形防伪标记。在太阳光照射时呈蓝紫色，避光时颜色复原；用PCR扩增仪检测出其特定的基因。实施例9
将上述实施例4所得的光化学-基因识别物质DNA-OZGGA 6份与渗透型原子印章的印油连结料94份相混合，经研磨、搅拌，得均匀的光化学-基因防伪印油。将该印油注入贮墨垫中，制得新型防伪印章。盖在公文纸上的印鉴在自然状态下为隐形(无色)。在太阳光照射时呈蓝紫色，避光时，颜色复原；用PCR扩增仪检测出其特定的基因。实施例10
将上述实施例5所得的光化学-基因识别材料II6份按与实施例9类同的方式制成光化学-基因防伪印油，并用此印油注入印章中，盖出隐形(无色)印迹，在紫外光照射下，产生鲜艳红色荧光，同时变为紫色；避光后荧光消失，紫色变为无色。用PCR扩增仪检测出其特定的基因。