使用多个温度区域的核酸扩增技术领域
本发明涉及一种用于进行核酸序列扩增的过程并涉及一种用于实施本发明的方
法的装置。本发明尤其适于对样品（例如生物样品）中存在的核酸进行同时识别和定量。此
外，本发明涉及一种在包括彼此热去耦的至少两种区域的反应容器中的扩增溶液中，对扩
增反应中特别是聚合酶链式反应（PCR）中的目标核酸序列进行扩增和定量实时检测的装
置，其中一个区域为具有允许寡核苷酸探针杂交到核酸序列的基本恒定生成温度的表面杂
交区域，其中表面杂交区域的内表面包括用于目标核酸序列的捕获探针。
背景技术
可以使用各种扩增反应来执行核酸序列的扩增，其中且最突出的是聚合酶链式反
应（PCR）。PCR是一种用于扩增特定核酸序列的方法。PCR为主要在溶液中进行的酶反应。当
扩增过程被实时监测时，PCR可以用于定量分析。实时PCR通常使用荧光报告分子，诸如插入
染料、TaqMan探针、蝎形引物、分子信标。当需要分析多于一种核酸目标序列时，可以采用两
种方法。第一种方法是使反应平行进行，即，在分离隔室中运行每种反应。第二种方法是对
反应进行复用，即，在同一隔室中运行反应并针对每种反应使用不同的荧光团报告分子。这
种方法受可以被有效区分的荧光团的数目限制。当前的技术发展水平是可以复用六种反
应。附图1说明当前的单室多重PCR以及阵列PCR构思。
PCR过程和表面杂交过程的热要求大不相同。PCR扩增过程要求（快速）温度循环，
其中在循环的一部分中，样品是在dsDNA熔化温度之上。另一方面，表面杂交需要在低于核
酸熔点的温度进行，且为了得到最优性能，应避免捕获探针部位之上的扩增子的漫射限制
局部耗尽。
本发明的多个区域构思允许对这两种过程即扩增和表面杂交的去耦优化。
发明内容
本发明涉及一种使用不同温度区域扩增和检测目标核酸序列的方法和装置。特别
是，本发明涉及用于扩增和检测反应容器中的扩增溶液（其有可能包括具有目标核酸序列
的核酸）中的目标核酸序列的方法，包括下述步骤：（a）提供反应容器，该反应容器包括在表
面上固定捕获探针的至少一个表面杂交区域，其中所述捕获探针与所述目标核酸序列上的
区域基本互补；（b）向所述反应容器添加扩增溶液；（c）生成具有至少两种热去耦区域的反
应容器中的温度区域分布图，其中一种区域与表面杂交区域相同或至少交叠，其中表面杂
交区域具有允许捕获探针杂交到目标核酸序列的生成温度；（d）在反应容器中执行目标核
酸序列的扩增；以及（e）在扩增期间和/或之后定期地或以限定的时间间隔检测经扩增的核
酸序列，其中经扩增的核酸序列通过在所述表面杂交区域中捕获探针与所述经扩增的核酸
序列的杂交而检测。在该方法的特别优选实施例中，或者是（a）每个表面杂交区域用于仅在
整个扩增过程的特定阶段杂交和检测经扩增的目标核酸序列，或者是（b）至少一个表面杂
交区域用于在整个扩增过程的多个阶段杂交和检测经扩增的目标核酸序列。优选地，扩增
在聚合酶链式反应（PCR）中执行并且扩增溶液包括核酸聚合酶以及与所述目标核酸基本互
补的引物。
本发明还涉及一种用于扩增和检测反应容器中的扩增溶液中的目标核酸序列的
装置，包括：（a）反应容器，其包括彼此热去耦的至少两种区域，其中一种区域为具有允许捕
获探针杂交到互补目标核酸序列的基本恒定生成温度的表面杂交区域，其中表面杂交区域
的内表面涂布有用于目标核酸序列的捕获探针，（b）检测系统，其检测结合到所述捕获探针
的目标，（c）一个或多个温度控制器和一个或多个温度调节器，用于控制、调节和维持各区
域中的温度，以及（d）传输系统，用于在各区域之间传输扩增溶液。优选地，检测系统基本不
检测未结合到所述捕获探针的目标。
本发明还涉及一种用于扩增和检测反应容器中的扩增溶液中的目标核酸序列的
试剂盒（cartridge），包括：用于接收包含所述目标核酸序列的扩增溶液的反应容器，其中
反应容器包括在表面上固定捕获探针的至少一个表面杂交区域，其中所述捕获探针与所述
目标核酸序列上的区域基本互补。优选地，反应容器包括在表面上固定捕获探针的至少两
个表面杂交区域，其中所述捕获探针与所述目标核酸序列上的区域基本互补。在试剂盒作
为本发明装置的部件的上下文中，已经在上文中讨论了试剂盒的一些说明性实施例的特
征。这种试剂盒的具体实施例在附图14中说明。当插入该装置时，试剂盒中的表面杂交区域
优选地与该装置中生成允许杂交的温度的那个区域交叠。
因而，本发明还涉及一种用于接收本发明的试剂盒的装置，其中该装置包括：
一个或多个温度控制器和/或温度调节器用于生成所述试剂盒中包括的反应容器中的
至少两种温度区域的温度分布图，其中一种区域具有允许捕获探针杂交到互补目标核酸序
列的基本恒定生成温度且其中温度控制器和/或温度调节器控制、调节和维持各区域中的
温度；
检测系统，该检测系统检测结合到所述捕获探针的目标，但是基本不检测未结合到所
述捕获探针的目标；
传输系统，用于在各区域之间传输扩增溶液；以及
用于所述试剂盒的接收元件。
优选的是，当试剂盒插入该装置时，试剂盒的表面杂交区域与该装置中生成允许
杂交的温度的那个区域交叠。
优选的是，反应容器包括在可交换试剂盒中。
将本发明的方法、试剂盒和装置用于定量分析目标核酸序列，用于同时定量分析
多个目标核酸序列，或者用于分析样品以确定目标核酸的存在，这些也在本发明的范围之
内。优选地，此处描述的方法和装置用于临床诊断、定点照护诊断、生物分子诊断、基因或蛋
白质表达阵列、环境传感器、食品质量传感器或法医应用。本发明还涉及本发明的方法、试
剂盒和装置在实时PCR或实时多重PCR中的用途。
附图说明
图1：说明在实时阵列PCR期间的步骤，该实时阵列PCR与实时PCR相似，每个循环包
括3个温度步骤。图1的说明性实例中说明的实时阵列PCR与一般的实时PCR之间的差别在
于，在实时阵列PCR中，退火步骤与杂交步骤组合。
图2：说明唯一样品体积中具有热隔离区域的区域构思。
图3：具有分离室的区域构思的可能实施例。理想地但不限于，表面杂交区域的温
度接近PCR循环的退火温度的温度。
图4：具有分离室的区域构思的可能实施例，其中样品可以在室周围传输。理想地
但不限于，表面杂交区域的温度接近PCR循环的退火温度的温度。
图5：具有三个恒定温度区域的可能实施例，样品在该三个恒定温度区域之间循
环。
图6：具有两个恒定温度区域的可能实施例，样品在该两个恒定温度区域之间循
环。短长度的扩增子的优选实施例。
图7：两个恒定温度区域，样品在其周围循环。一个区域呈通道的形式，该通道具有
用于表面杂交的捕获探针部位。
图8：PCR产物的快速表面杂交的支持实验证据。
图9：扩增子浓度和杂交信号之间的关联。
图10：根据本发明的实施例的示意性布局。具有：用于变性（1）、杂交和引物退火
（2）以及伸长（3）的（1，2，3）温度区域。（10）迂回流动（通道），使得对于每个循环（N，N+1，N+
2，…），PCR缓冲液经过该温度区域；其中在该温度区域从左到右迂回行进。（20）用于每个循
环的专用杂交区域（原则上可以在某一循环跳过杂交）。（21）捕获探针部位。
图11：根据本发明另一实施例的示意性布局。具有：用于循环（N+2）的用于变性
（1）、杂交和引物退火（2）以及伸长（3）的（1，2，3）单独可寻址温度区域。（11）单向的非循环
流动（通道），使得对于每个循环（N，N+1，N+2，…），对于该特定循环PCR流体经过单独可寻址
温度区域，在该温度区域从左到右流动行进。（20）用于每个循环的专用杂交区域（原则上可
以在某一循环跳过杂交）。（21）捕获探针部位。
图12：使用迂回流动（10）从而使PCR循环的杂交区域之间距离尽可能小的优选备
选实施例的示意性布局，从检测考虑角度这是有利的；相邻PCR循环的杂交区域之间距离越
大，则需要更快的扫描（对于扫描光学读取器的情形）或者更大的视场（对于成像光学读取
器的情形）。
图13：温度区域（p，q）的2D矩阵。温度区域的设置与试剂盒的流体通道（12）、（13）
的形状相适应。
图14：根据本发明的试剂盒的俯视图和截面图（沿着A-A），具有：
（50）试剂盒
（51）试剂盒的外壳，该外壳包括至少部分透明材料从而能进行光学检测。试剂盒优选
地由（但不限于）塑料和类似材料或玻璃制成。试剂盒也可以是具有捕获探针的透明衬底与
含有流体通道的盒的组件。
（20）具有与目标核酸序列基本互补的捕获探针的部位（典型地为斑点）。典型地但
绝不是限制，捕获探针部位是直径为0.1mm的斑点。（20-I）捕获探针部位，其在沿着线A-A的
截面图中也可看到。
（40）流体入口。
（41）对于该特定实例具有迂回布局的流体通道，流体通道的典型尺寸为：高度为
0.05-1mm且宽度为0.1-1mm。
（42）流体出口
图15：根据本发明的装置（100），不具有包括反应室的试剂盒。装置准备接收具有反应
室的（一次性）试剂盒。该装置包括：
（70）用于试剂盒（50）的样品支持器
（80）用于限定试剂盒的区域（1）-（3）中的温度的加热器，对于该特定情形，将具有三个
加热器（80）来限定区域（1）、（2）、（3）中的温度。
（90）用于检测杂交到捕获探针（20）的目标核酸的检测系统（“读取器”）。示出了用
于共焦检测的扫描单元的简化示意说明图。其中扫描单元包括照射/收集（荧光）透镜/物镜
（92）和二向色镜（91），该二向色镜反射激励光（图16中的101），导致激励光被引导向试剂
盒。同一透镜（92）收集由标记目标分子生成的荧光（图16中的201）并经由透射荧光的二向
色镜（91）将该荧光引导向检测器（此处未示出）。
图16：具有包括反应室的试剂盒（50）的图15装置。编号与图15的编号相同。
具体实施方式
本发明涉及一种用于扩增和检测反应容器中的扩增溶液中的目标核酸序列的方
法，包括下述步骤
提供反应容器，该反应容器包括在表面上固定捕获探针的至少一个表面杂交区域，其
中所述捕获探针与所述目标核酸序列上的区域基本互补；
向所述反应容器添加扩增溶液；
生成具有至少两种热去耦区域的反应容器中的温度区域分布图，其中一种区域与表面
杂交区域相同或至少交叠，其中表面杂交区域具有允许捕获探针杂交到目标核酸序列的生
成温度；
在反应容器中执行目标核酸序列的扩增；以及
在扩增期间和/或之后定期地或以限定的时间间隔检测经扩增的核酸序列，其中经扩
增的核酸序列通过在所述表面杂交区域中捕获探针与所述经扩增的核酸序列的杂交而检
测。
在一个优选实施例中，每种区域中的温度是单独可调节的。在另一优选实施例中，
每种区域中的温度由单独温度控制器和/或调节器控制。
优选地，表面杂交区域具有基本恒定生成温度。在一个优选实施例中，反应容器可
包括一个或一个以上的表面杂交区域。术语“至少一个表面杂交区域”和“一个或一个以上
的表面杂交区域”在此可以互换使用。
在优选实施例中，反应容器例如可以包括至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少
6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、
至少18、至少19、至少20或多于20个表面杂交区域。在一些实施例中，反应容器可包括至多
60、至多70、至多80、至多90或至多100个表面杂交区域。在一些实施例中，反应容器例如可
以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、介于1和15、介于1和20、
介于1和30、介于1和40、介于1和50、介于1和60、介于1和70、介于1和80、介于1和90或介于1
和100个表面杂交区域之间，或者例如至少1且至多60、至少1且至多70、至少1且至多80、至
少1且至多90或者至少1且至多100个表面杂交区域。
在一个优选实施例中，所述至少两种热去耦区域的另一种区域为温度循环器区
域、变性区域、退火区域或延伸区域。
在一些优选实施例中，可以在具有多于两种热去耦区域的反应容器中生成温度区
域分布图。例如，在一些实施例中，可以在具有多于两种热去耦区域的反应容器中生成温度
分布图，其中一种区域与表面杂交区域相同或至少交叠，其中表面杂交区域具有允许捕获
探针杂交到目标核酸序列的生成温度，以及其中另一种区域为变性区域、退火区域和/或延
伸区域。在特别优选实施例中，在具有至少两种热去耦区域的反应容器中生成温度区域分
布图，其中一种区域与表面杂交区域相同或至少交叠，其中表面杂交区域具有允许捕获探
针杂交到目标核酸序列的生成温度且一种其它类型的区域为温度循环器区域、变性区域、
退火区域或延伸区域。
在一些优选实施例中，在所述至少两种热去耦区域其中之一中，优选地在温度循
环器区域中执行目标核酸序列的扩增，或者备选地，可以通过使扩增溶液经过反应容器中
的至少两种或所有类型的热去耦区域来执行目标核酸的扩增。在一些优选实施例中，使扩
增溶液经过全部区域以进行目标核酸的扩增。
“生成温度区域分布图”在此是指由温度控制器和/或调节器（例如包括加热器、冷
却器、热传递装置等等）在反应容器中引起不同区域的局部或空间温度模式或分布图。区域
或温度区域在此是指反应容器中的限定面积或体积。区域可以优选地为热去耦区域。区域
优选地由它们的温度限定且温度区域在此是指限定温度的区域，该限定温度可以是基本恒
定生成温度或在本发明方法的过程中变化的温度，然而，这依赖于区域的类型并依赖于如
此处下文讨论的具体实施例。
在另外方面，本发明涉及用于扩增和检测反应容器中的扩增溶液中的目标核酸序
列的方法，包括下述步骤：
提供反应容器，该反应容器包括所述扩增溶液且进一步包括至少两种热去耦区域，其
中一种区域为表面杂交区域；
在反应容器中执行目标核酸序列的扩增；以及
在扩增期间和/或之后定期地或以限定的时间间隔检测经扩增的核酸序列，其中经扩
增的核酸序列通过捕获探针与所述经扩增的核酸序列的杂交而检测，以及其中所述杂交在
所述表面杂交区域中进行并且所述捕获探针固定在表面上并与所述目标核酸序列上的区
域基本互补。
在本发明的方法的一些实施例中，在扩增期间定期地或以限定的时间间隔检测经
扩增的核酸序列。
在本发明的上下文中“反应容器”是包括反应溶液的任何容器的总和。作为对于各
种实施例的在此实例性所讨论的，在本发明的不同实施例中，反应容器可包括不同数目的
区域和隔室且可具有不同的形式和尺寸。措词“反应容器”不限于反应管、毛细管、试管、孔
板等等，且根据具体实施例还包括具有两个或更多个隔室和/或互连的管、隔室、通道和/或
毛细管等等的系统的更复杂布置。反应容器为包括用于含有扩增溶液的至少一个隔室的容
器。可选地，反应容器附加地包括流体元件，诸如用于在所述隔室之间传输扩增流体的流体
通道，或者用于限定经过所述流体通道的流动的泵。
在该方法的优选实施例中，在扩增和检测期间使所述扩增溶液经过所述至少两个
热去耦区域。
在本发明的上下文中，核酸扩增可以通过本领域中已知的各种核酸扩增方法中的
任一种来实现，该核算扩增方法包括但不限于聚合酶链式反应（PCR）、连接酶链反应（LCR）、
转录依赖的扩增系统（TAS）以及Qβ扩增。这些方法的变型（例如逆转录PCR、实时PCR、不对称
PCR或热启动PCR）的应用也可根据本发明的方法或者在根据本发明的装置中执行。
优选地，扩增是在聚合酶链式反应（PCR）中执行且扩增溶液包括核酸聚合酶以及
与所述目标核酸基本互补的引物。
在该方法的特别优选实施例中，或者
每个表面杂交区域用于仅在整个扩增过程的特定阶段杂交和检测经扩增的目标核酸
序列，或者
至少一个表面杂交区域用于在整个扩增过程的多个阶段杂交和检测经扩增的目标核
酸序列。
“特定阶段”在此例如可以表示在扩增反应的特定循环（例如特定PCR循环）期间
和/或之后。换言之，在这些实施例中，多个扩增循环可以共享公共表面杂交区域。
在具体实施例中，在反应容器中仅仅存在一个表面杂交区域用于检测经扩增的目
标核酸。在此实施例中，对于每个PCR循环或对于其中希望对经扩增的目标核酸进行检测的
每个PCR循环，该检测是在同一表面杂交区域中进行，即仅仅存在一个表面杂交区域。
在另一实施例中，“多个阶段”例如可以涉及这样的事实，在每个扩增循环期间和/
或之后杂交区域被用于杂交和检测。
在具体实施例中，对于每个检测步骤，在反应容器中存在专用的表面杂交区域。
即，对于每个扩增循环或对于其中希望对经扩增的目标核酸进行检测的每个扩增循环，检
测在不同表面杂交区域中进行，即表面杂交区域的数目代表检测步骤的数目，或者在非常
具体实施例中，代表在聚合酶链式反应的每个循环期间或之后进行检测时的扩增循环的数
目。这意味着：对于至少一个扩增循环，存在专用的表面杂交区域。
根据具体实施例，优选地至少一个表面杂交区域在整个扩增过程的多个阶段用于
杂交和检测，并且所述至少两个热去耦区域的两个或更多个包括在反应容器的同一隔室或
体积中。
优选地在这种实施例中，反应容器的尺寸的纵横比为使得可以在一个隔室或体积
中维持至少两个热去耦区域，例如两个相邻区域在至少一个维度上分隔合适的距离。例如，
在具体实施例中反应容器的隔室可具有毫米/厘米范围尺寸并且在一个或两个其它维度上
具有微米范围尺寸（导致这些尺寸之间高的纵横比），并且两个相邻区域相互分隔若干毫米
或厘米。
在又一实施例中，优选的是，至少一个表面杂交区域在整个扩增过程的多个阶段
用于杂交和检测，且所述至少两个热去耦区域包括在反应容器的分离隔室或体积中。
优选地，反应容器包括具有基本恒定生成温度的至少一个表面杂交区域以及具有
在从扩增溶液的熔点（熔化或冻结温度）到沸点（沸腾温度）（优选地在约0℃至100℃的范围
内）范围内的可变温度的至少一个温度循环器区域，其中扩增溶液从温度循环器区域传递
到表面杂交区域以用于检测经扩增的目标核酸，并且反过来用于进一步的扩增。
术语“温度循环器区域”和“PCR扩增区域”在此处同义地使用。在附图2至4中说明
包括温度循环器区域的根据本发明方法的实施例的特定布局，其中图2说明两个区域共享
同一体积的实施例，且图3和4演示具有分割体积，即用于杂交区域和温度循环器区域的分
离隔室的实施例。
在反应容器的优选实施例中，反应容器优选地可以包括至少一个温度循环器区域
和至少一个表面杂交区域且扩增反应为聚合酶链式反应（PCR），并且聚合酶链式反应的至
少变性和引物延伸在温度循环器区域中执行，且温度循环器区域中的温度至少在变性温度
和延伸温度之间循环。
优选的是，在温度循环器区域中执行对所述目标核酸的引物退火且温度循环器区
域中的温度在变性温度、退火温度和延伸温度之间循环。
备选地，还优选的是，表面杂交区域中的温度适合于所述目标核酸的引物退火且
在表面杂交区域中执行所述目标核酸的引物退火。
扩增溶液例如可以在（多个）温度循环器区域和（多个）表面杂交区域之间双向或
者单向且循环（circular）地传递，反之亦然。
因而，在一些实施例中，扩增溶液可以以循环方式（单向的）（图4和图7）或者以来
回往复的方式（双向的）（图3）在温度循环器区域和表面杂交区域之间传递。对于两个或更
多个区域共享体积/隔室的情形，区域之间的传递可以借助对流来进行。
在该方法的具体实施例中，反应容器包括具有基本恒定生成温度的至少一个表面
杂交区域以及具有基本恒定生成温度的至少一个另一区域，其中所述另一区域的温度在从
扩增溶液的熔点（熔化或冻结温度）到沸点（沸腾温度）（优选地在约0℃至100℃的范围内）
的范围内是可调节的，并且其中扩增溶液在表面杂交区域和另一区域之间传递用于检测，
反之亦然。
优选地，该另一区域为变性区域且变性区域的温度适合于目标核酸的变性或者可
以调节到所述温度。
这种实施例例如在附图6和7中说明。
可选地，反应容器还包括具有适合于引物延伸的基本恒定生成温度的延伸区域，
其中目标核酸用作模板且其中在表面杂交区域中执行引物退火，并且其中扩增溶液循环通
过所有区域，使得聚合酶链式反应和检测可以进行。
这种实施例例如在附图5中说明。
优选地，反应容器还包括具有适合于引物延伸的基本恒定生成温度的延伸区域以
及具有适合于引物退火的基本恒定生成温度的退火区域，其中在退火区域中执行引物退
火，并且其中扩增溶液循环通过所有区域，使得聚合酶链式反应和检测可以进行。
在另一实施例中，本发明涉及一种用于扩增和检测目标核酸序列的方法，
其中在反应容器中生成两种或更多种热去耦区域，
其中每个区域具有基本恒定生成温度，以及
其中第一种区域为表面杂交区域且第二种和另一种区域为扩增区域，
其中使扩增溶液经过全部区域，使得对于每个扩增循环经过至少一个扩增区域，且对
于其中附加地期望进行杂交和检测的每个扩增循环，经过表面杂交区域，使得每个表面杂
交区域仅用于在整个扩增过程的特定阶段杂交和检测经扩增的目标核酸序列，
并且其中传输是单向的且非循环的。
此上下文中的扩增区域为可以进行核酸序列的扩增的至少一个步骤的区域。这例
如可以为变性区域或延伸区域或退火区域。然而，如果PCR用于扩增，对于这种实施例中的
每个循环，存在变性区域和延伸区域和退火区域。在一些实施例中，退火区域可以与表面杂
交区域相同。经过这些区域的顺序类似于扩增反应的阶段，例如PCR循环的阶段。
在优选实施例中，反应容器包括三种或更多种热去耦区域，其中每个区域具有基
本恒定生成温度，并且其中第一种区域为表面杂交区域，第二种为变性区域，且第三种为延
伸区域，其中对于每个扩增循环，存在一个表面杂交区域，且表面杂交区域的数目等于变性
区域和延伸区域的数目，其中使扩增溶液经过全部区域，使得对于每个扩增循环，首先经过
变性区域，其次经过表面杂交区域且再次经过延伸区域，其中该传输是单向的且非循环的，
且其中变性区域具有允许目标核酸序列变性的温度，表面杂交区域具有允许引物退火和寡
核苷酸探针（即捕获探针）杂交的温度且延伸区域具有允许引物延伸的温度。
在这种具体方法的非常具体实施例中，可存在第四种区域（“退火区域”），使得引
物退火和表面杂交在不同类型区域中进行。在此实施例中，表面杂交区域中的温度可以等
于或不等于退火区域的温度，即表面杂交区域的温度可以允许或不允许引物退火。
在具体实施例中，扩增溶液例如通过流动传输通过全部区域，且具体区域中扩增
溶液的部分类似于扩增过程中的特定阶段。在一些实施例中，该流动例如可以是恒定流动
或者在其它实施例中可以是步进的。
在一个实施例中，一种类型的所有区域中的温度相等且被一致地调节或者所有区
域中的温度被分别调节。
在本发明的一些实施例中，例如可以使扩增溶液经过在第一变性区域之前或在最
后延伸区域之后或在最后表面杂交区域之后的附加区域。
在本发明的具体实施例中，扩增溶液经过的区域布置成使得后续区域布置成相互
相邻，例如布置成线性布置或迂回状布置或矩阵布置。迂回状布置例如在附图10和12中说
明，线性布置例如示于附图11，而类似矩阵的布置在附图13中演示。不同布置的组合也是可
能的。迂回布置为节约空间的布置。特别是在所有区域或至少一种类型的所有区域的温度
相互独立地调节和维持的那些实施例中，区域的布置可以针对具体应用来定制。一些实施
例也涉及区域的布置，其中仅仅一种区域（例如表面杂交区域）的所有区域的温度被一致地
控制、调节和维持。对温度的一致的控制、调节或维持例如通过将同一类型的所有区域相互
相邻地布置而不使它们相互热去耦来实现。在一些实施例中，温度区域的布置是可配置的；
在其它实施例中它可以是固定的。特别是在矩阵布局中，温度区域的布置可以是可配置的。
在一些实施例中加热器和/或冷却器的布置也是可配置的。特别地，加热电极的布局可以固
定或者是可配置的。
优选地，在根据本发明的方法中，通过与每种待检测目标核酸序列互补的至少一
种捕获探针检测多种核酸序列。
捕获探针例如可以为寡核苷酸探针。
在本发明的上下文中多个目标核酸可以是同时或并行可检测的任何数目的不同
目标核酸，特别是但不限于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、
22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、40、45、48、50、52、56、55、60、64、65、
70、72、75、80、85、90、95、96、100或384个目标核酸。杂交到捕获探针的多个目标核酸可以被
同时或者并行地检测。
捕获探针可以例如固定在所述表面杂交区域的内表面上或者固定在珠的表面上。
珠例如可以是磁性珠。
在一些具体实施例中，对于每种不同目标核酸序列，至少一对引物用于扩增，其中
该对引物的至少一个引物例如用荧光染料标记。在这些情形中，在表面杂交区域的表面上
检测荧光。在其它实施例中，通用引物（也称为共有引物）用于扩增不同目标。
优选地，表面杂交区域具有允许所述捕获探针杂交到经扩增的目标核酸序列的温
度。优选地所述温度基本恒定。
在具体实施例中，表面杂交区域的温度在杂交之后增大以测量熔化和/或熔化曲
线。
在该方法的一些实施例中，在每个扩增循环期间和/或之后或者在各第N个扩增循
环期间和/或之后执行表面杂交和/或检测，其中N为2、3、4、5、6、7、8、9或10。
特别地，可以在每个扩增循环期间和/或之后执行检测，然而不是在前1、2、3、4、5、
6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、
33、34、35、优选地前20、更优选地前30个扩增循环期间执行。
优选地，表面杂交区域具有允许捕获探针，特别是寡核苷酸探针杂交到经扩增的
目标核酸序列的温度。优选地所述温度基本恒定。
捕获探针优选地为与所述目标核酸序列互补的表面固定的寡核苷酸探针。
甚至更优选地，捕获探针为与所述目标核酸序列互补的表面固定的寡核苷酸探
针，且捕获到捕获部位的经扩增的目标核酸序列的检测利用接近表面检测信号的表面特异
检测方法来执行。
备选地，例如对于具有如上所概述且例如在图10和12中说明的迂回结构的实施例
的情形，也可能包括可选的清洗步骤以清洗掉未杂交核酸和引物且在此之后执行检测。按
此方式，获得在限定杂交时间之后杂交核酸的浓度（其对于每个循环可以是唯一的）与扩增
循环的数目（q=1..N）的曲线。
在一些实施例中，表面杂交区域中的温度约为允许引物退火到核酸序列的温度。
待扩增和检测的核酸序列可以优选地选自ssDNA、dsDNA、RNA。然而在本发明的上
下文中，可以扩增所有类型的原则上可扩增的核酸。
根据本发明的核酸聚合酶例如可以是来自适温生物的热稳定的核酸聚合酶。该核
酸聚合酶优选地可以为DNA聚合酶。该聚合酶可以是重组体。也可使用针对热启动PCR而调
适的聚合酶。
热稳定的核酸聚合酶例如可以选自：嗜热栖热菌（Tth）DNA聚合酶、水生栖热菌
（Taq）DNA聚合酶、海栖热袍菌（Tma）DNA聚合酶、海滨热球菌（Thermococcuslitoralis）
（Tli）DNA聚合酶、激烈热球菌（Pfu）DNA聚合酶、沃氏热球菌（Pwo）DNA聚合酶、
kodakaraensis热球菌KODDNA聚合酶、丝状栖热菌（Tfi）DNA聚合酶、硫磺矿硫化叶菌Dpo4
DNA聚合酶、太平洋栖热菌（Tpac）DNA聚合酶、eggertsonii栖热菌（Teg）DNA聚合酶以及黄栖
热菌（Tfl）DNA聚合酶。
一个非常具体实施例涉及一种用于扩增和检测目标核酸序列的方法，其中目标核
酸为双链DNA序列（dsDNA），其中一对引物用于扩增dsDNA，其中一个引物与dsDNA的一个链
上的区域基本互补且另一个引物与dsDNA的另一个链上的区域基本互补，
并且其中一个引物相对于另一引物过量使用，且其中过量使用的引物的熔点比另一引
物的熔点低至少5℃。
在一些实施例中，该聚合酶链式反应（PCR）为不对称PCR或者为指数后线性扩增
PCR（LATE-PCR）。
此上下文中的不对称PCR为这样的PCR，其中扩增溶液中正向引物的浓度不同于反
向引物的浓度，即一个引物相对于另一引物极其过量使用。这导致与常规的对称PCR相比更
大数量的单链经扩增的DNA，因为更多引物被退火的那个链被择优地扩增。更大数量的单链
DNA可导致更高的检测效率。
指数后线性扩增PCR（LATE-PCR）使用比过量引物具有更高熔化温度的限制引物以
维持反应效率，因为限制引物浓度在反应中期减小。
技术人员知晓允许诸如PCR的扩增反应的扩增溶液的成分。
此处，允许目标核酸的变性的温度优选地在约85至100℃的范围；允许引物退火到
所述目标核酸的温度优选地在约40至65℃的范围且允许引物延伸的温度优选地在约60至
75℃的范围。
扩增溶液可以是均匀的溶液（例如PCR预混合液）或者可包括两种或更多成分：例
如PCR预混合液与/油或空气。
根据本发明的一些实施例，反应容器可包括至少在所述表面杂交区域中的微阵
列，其中所述捕获探针（例如寡核苷酸探针）固定在所述微阵列的内表面。
在一些实施例中，本发明的方法可包括，在最后扩增步骤之后（例如在最后PCR循
环之后），将扩增溶液冷却到低于杂交温度的温度的步骤，优选地冷却温度在约0℃至10℃
的范围，更优选地在约0℃至4℃的范围，最优选地约3℃至4℃。在一些实施例中，可以在温
度循环器区域中执行冷却，在其它实施例中，可以在与其它区域热去耦的指定冷却区域中
执行冷却。
本发明的方法尤其适合于检测所述扩增溶液中包括目标核酸序列的核酸。因而，
扩增溶液可以是疑是包括含有所述目标核酸序列的核酸的溶液。
根据本发明的方法的具体实施例也反映在本发明的装置的具体实施例中，即本发
明还涉及一种用于执行根据本发明的方法的装置。此处针对本发明的方法所描述的特定术
语的限定也适用于本发明的装置。对于区域和多种类型区域的构思，以及对于捕获探针、反
应容器、目标核酸（序列）等，尤其是如此。
本发明还涉及一种用于扩增和检测反应容器中的扩增溶液中的目标核酸序列的
装置，包括
反应容器，用于接收包括所述目标核酸序列的扩增溶液，其中反应容器包括在表面上
固定捕获探针的至少一个表面杂交区域，其中所述捕获探针与所述目标核酸序列上的区域
基本互补，其中所述反应容器包括至少一个其它类型的区域；
一个或多个温度控制器和/或温度调节器，用于生成所述反应容器中至少两种温度区
域的温度分布图，其中一种区域与所述表面杂交区域基本相同或基本交叠，且其中表面杂
交区域具有允许捕获探针杂交到互补目标核酸序列的基本恒定生成温度且其中温度控制
器和/或温度调节器控制、调节和维持各区域中的温度；
检测系统，该检测系统检测结合到所述捕获探针的目标核酸序列但是基本不检测未结
合到所述捕获探针的目标核酸序列；以及
传输系统，用于在各区域之间传输扩增溶液。
在一个优选实施例中，反应容器可包括一个或一个以上的表面杂交区域。
反应容器例如可以包括至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、
至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、
至少20或多于20个表面杂交区域。在一些实施例中，反应容器可包括至多60、至多70、至多
80、至多90或至多100个表面杂交区域。在一些实施例中，反应容器例如可以包括1、2、3、4、
5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、介于1和15、介于1和20、介于1和30、介于
1和40、介于1和50、介于1和60、介于1和70、介于1和80、介于1和90或者介于1和100之间个表
面杂交区域或者例如至少1且至多60、至少1且至多70、至少1且至多80、至少1且至多90或者
至少1且至多100个表面杂交区域。
反应容器包括至少一种其它区域，该其他区域可具有与表面杂交区域不同的生成
温度。优选地，所述至少一种其它区域为热去耦区域。
至少一种其它区域例如可以为温度循环器区域、变性区域、退火区域或延伸区域。
在另一方面，本发明还涉及一种用于扩增和检测反应容器中的扩增溶液中的目标
核酸序列的装置，包括
反应容器，包括彼此热去耦的至少两种区域，其中一种区域为表面杂交区域，其具有允
许捕获探针杂交到互补目标核酸序列的基本恒定生成温度，其中表面杂交区域的内表面涂
布有用于目标核酸序列的捕获探针；
检测系统，该检测系统检测结合到所述捕获探针的目标；
一个或多个温度控制器以及一个或多个温度调节器，用于控制、调节和维持各区域中
的温度；以及
传输系统，用于在各区域之间传输扩增溶液。
反应容器包括用于含有扩增溶液的至少一个隔室。可选地，反应容器附加地包括
流体元件，诸如用于在所述隔室之间传输扩增流体的流体通道或者用于限定经过所述流体
通道的流动的泵。
在本发明的装置的优选实施例中，反应容器包括在试剂盒中，该试剂盒可以可互
换地附连到装置其余部分。这种试剂盒可以是用于在温度循环器或根据本发明的装置中使
用的试剂盒。在优选实施例中，试剂盒可以是一次性（单向的）试剂盒。温度控制器和调节
器，例如加热器和/或冷却器优选地不是这种试剂盒（特别是一次性试剂盒）的一部分。在备
选实施例中，加热器和/或冷却器可以是试剂盒的一部分。试剂盒可包括附加隔室，例如用
于制备扩增溶液（即制备样品）。在一些实施例中，这种试剂盒中还可包括传输系统或传输
系统的部分，例如微流体系统。反应室的区域的结构或模式可以反映在温度控制和调节系
统的加热器和/或冷却器的结构或模式中。试剂盒也可具有热传导和/或绝缘表面的模式。
优选的是，反应容器包括在可交换试剂盒中。如上所述，温度控制器和/或调节器
或者其部分在一些实施例中包括在试剂盒中，或者在其它实施例中不包括在试剂盒中。这
同样独立地适用于传输系统。传输系统或其部分包括在试剂盒中或者不包括在试剂盒中。
反应容器的温度区域为温度控制和调节系统的布局的产物，即加热器、冷却器、热
传递装置等等的布置的产物。如果存在试剂盒，则区域的布局依赖于试剂盒的设计以及加
热器、冷却器和热传递装置的布置。因而，在一些实施例中，试剂盒中的区域布局由试剂盒
外部的温度控制器和调节器的布局限定。
优选地，检测系统检测结合到所述捕获探针的目标，但是基本不检测未结合到所
述捕获探针的目标。
取决于传输的类型，传输系统可以是有源或无源系统。此上下文中，例如在传输完
全是基于诸如对流或扩散的物理效应的情形中，传输系统例如可以为固有地包括在所述反
应容器中的无源系统。在一些实施例中，传输系统可包括微机电系统（MEMS）、一个或多个毛
细管、一个或多个泵等或其组合。
本发明的装置优选地可以为用于扩增和检测聚合酶链式反应（PCR）中的目标核酸
序列的装置。
优选地，所述检测系统为表面特异检测系统，其检测结合到所述表面的目标但是
基本不检测溶液中的目标。
可选地，所述装置可包括清洗装置以清洗掉未结合或未特异结合的核酸序列，特
别是未结合到捕获探针或未特异结合的核酸序列。清洗装置例如可以是将清洗缓冲液泵浦
或传递经过反应容器或者表面杂交区域或其部分的可能性。因此可以存在包括所述清洗缓
冲液的附加容器。
优选地，该检测为实时检测且该PCR为实时PCR。更优选地，该PCR为定量PCR且经扩
增的目标核酸序列被定量。此上下文中的实时检测意味着可以在扩增期间，例如在每个扩
增循环期间和/或之后或者在限定或预定扩增循环期间和/或之后，检测经扩增的核酸序
列。
温度控制器和调节器例如可以为优选地具有温度检测器和/或反馈调节系统的加
热器和/或冷却器。在一些实施例中，加热器例如可以为珀耳帖元件、加热电极、热/冷空气
装置、水浴等等。然而，本发明不限于这些加热器/冷却器且所有类型的加热和冷却装置可
用于控制、调节和维持区域的温度。也可使用不同加热器和/或冷却器的组合。温度控制器
和调节器还可包括例如从加热器向反应室传递或传导热的装置。
在该装置的一个实施例中，至少一个表面杂交区域在整个扩增过程的一个以上的
阶段用于杂交和检测经扩增的目标核酸序列。
在该装置的此具体实施例的上下文中，优选地，在反应容器中仅仅存在一个表面
杂交区域用于检测经扩增的目标核酸。
至少两个热去耦区域中的两个或更多个可以包括在反应容器的同一隔室或体积
中，或者至少两个热去耦区域可以包括在反应容器的分离隔室或体积中。
在具体实施例中，存在至少一个表面杂交区域和至少一个温度循环器区域，该温
度循环器区域中的温度可以在从扩增溶液的熔点（熔化或冻结温度）到沸点（沸腾温度）（优
选地在约0℃至100℃的范围内）的范围内循环。在附图2至4中说明了包括温度循环器区域
的根据本发明装置的实施例的特定布局。温度循环器区域反映在温度控制和调节系统的设
计中，在此实施例中该温度控制和调节系统为允许使反应容器中的温度循环器区域的温度
循环的系统。
在另一实施例中，装置的反应容器包括至少一个表面杂交区域和至少一个变性区
域。这种实施例例如在附图6和7中说明。
在又一实施例中，装置的反应容器包括至少一个表面杂交区域、至少一个生成变
性区域和至少一个生成延伸区域。这种实施例例如在附图5中说明。
扩增溶液可以在区域之间单向或双向传输。
因而，在该装置的一些实施例中，扩增溶液可以在温度循环器区域和表面杂交区
域之间以循环方式（单向）传递（图4和图7）或者以来回往复的方式（双向）传递（图3）。
在一些实施例中，所述区域或一种类型的区域（例如表面杂交区域）可以呈类似通
道的形式。
优选地，取决于反应体积和具体应用，该区域可以具有大约（但不限于）如下范围
内的尺寸：区域之上体积的高度约为1-500μm，并且区域的宽度和长度介于约100μm至1cm。
在另一实施例中，本发明涉及一种装置，其中反应容器中存在多个表面杂交区域，
使得在使用时，可以在整个扩增过程的两个或更多个阶段进行表面杂交。
此上下文中，优选地在多个不同或限定的扩增循环期间和/或之后，最优选地在每
个扩增循环期间和/或之后，可以进行杂交和检测。
再者，本发明还涉及一种用于扩增和检测反应容器中的扩增溶液中的目标核酸序
列的装置，
其中反应容器包括三种热去耦区域，
其中在每个区域中生成的温度可以保持基本恒定，
并且其中第一种区域为退火区域，第二种为变性区域以及第三种为延伸区域，
并且其中对于期望进行检测的每个扩增循环，存在一个表面杂交区域，或者退火区域
与表面杂交区域基本交叠，
其中使扩增溶液经过全部区域，使得对于每个扩增循环首先经过变性区域，其次经过
退火区域以及再次经过延伸区域，
其中该传输是单向的且非循环的，
并且其中变性区域具有允许目标核酸序列变性的生成温度，退火区域具有允许引物退
火的温度，表面杂交区域具有允许引物退火和捕获探针杂交的生成温度，且延伸区域具有
允许引物延伸的生成温度。
在该装置的具体实施例中，对于每个扩增循环，存在一个杂交区域，且表面杂交区
域的数目等于变性区域和延伸区域的数目。这种装置的具体实施例在附图10至13中说明。
在该装置的一个实施例中，对于一种区域的每个成员，一致地控制反应容器的温
度（见例如附图10）。
在该装置的另一实施例中，对于每个区域，分别控制反应容器的温度（见例如附图
11至13）。
图11示出根据本发明的装置的具体实施例的示意性布局，其包括用于变性（1）、杂
交和引物退火（2）和伸长（3）的单独可寻址温度区域；单向的非循环流动通道（11），使得对
于每个循环（N，N+1，N+2，…），对于该特定循环，PCR流体经过单独可寻址温度区域，在该温
度区域从左到右流动行进；用于具有捕获探针（21）的每个循环的专用杂交区域（20）（原则
上对于一个或多个具体循环也可以跳过杂交）。
作为备选，见例如图10、图12和图14，还可以使用迂回流动（10），从而使PCR循环的
杂交区域之间的距离尽可能小，这从检测考虑角度是有利的；相邻PCR循环的杂交区域之间
距离越大，越需要更快的扫描（对于扫描光学读取器的情形）或更大的视场（对于成像光学
读取器的情形）。在图12中，温度区域的顺序为（1）、（2）、（3），但是可以使用其中变性就在退
火和杂交区域之前执行的3个温度区域的任意组合（从底部到顶部）：（1），（2），（3）；（3），
（1），（2）；（3），（2），（1）；（2），（1），（3）。为了调适变性、杂交和退火时间，当然可能改变迂回
的形状（例如在流动被引导向伸长区域之前，在杂交区域之上多次经过）。除了确定流体经
历温度台阶的次数，流动通道本身的形状对于操作不是相关的。原则上不需要使流动通道
铺设在单一平面内。每个循环不需要均具有杂交区域，作为说明性实例，对于在25微升的体
积中100000个开始拷贝数目（6.6fM的摩尔浓度）的情形，对于0.1nM的阈值浓度（鉴于可获
得的灵敏度和测量时间），要求14个PCR循环（假设100%PCR效率）具有高于阈值的信号。对于
开始拷贝数目低于100000的情形，对于头14个循环不需要杂交区域。然而，上述实例性考虑
不限制本发明的范围。为了使该装置适合试剂盒（流体通道）的任何布局，可以将加热器布
局延伸到2D矩阵，例如如图13中所说明。
图11至13中的温度区域可以由多个加热器组成从而创建沿着流体通道的温度分
布图。
在附图14至16中说明的优选实施例中，反应室包括在试剂盒（50）中且温度区域布
置成迂回状模式。试剂盒的外壳（51）优选地包括至少部分透明的材料从而能进行光学检
测。试剂盒优选地由（但不限于）塑料和类似材料或玻璃制成。试剂盒也可以是具有捕获探
针的透明衬底和含有流体通道的盒的组件。与目标核酸序列基本互补的捕获探针（20）固定
在杂交区域中。典型地但绝不是限制，捕获探针部位是直径为0.1mm的斑点。此实施例的试
剂盒优选地还包括流体入口（40）、具有迂回布局（41）的流体通道以及流体出口（42）。流体
通道的典型优选尺寸为：高度是在约0.05-1mm的范围以及宽度是在约0.1-1mm的范围。如上
所述，此优选实施例中的试剂盒可以是可交换的。在图15中说明不具有试剂盒的该装置，且
在图16中说明具有试剂盒的该装置。图15的装置准备接收具有反应室的（一次性）试剂盒。
该装置包括用于接收试剂盒（50）的样品支持器（70），用于限定试剂盒的温度区域（1）-（3）
中的温度的加热器（80）（或冷却器或其它温度调节器）。在具体情形中，存在三个加热器
（80）以限定各区域（1，变性区域）、（2，退火/杂交区域）、（3，延伸区域）中的温度。还存在用
于检测杂交到捕获探针（20）的目标核酸的检测系统（“读取器”）。用于共焦检测的扫描单元
的简化示意图示于图15和16。在特别优选情形中，扫描单元包括照射/收集（荧光）透镜/物
镜（92）和二向色镜（91），该二向色镜反射激励光（图16中的101），导致激励光被引导向试剂
盒。在此情形中，同一透镜（92）收集由标记目标分子生成的荧光（图16中的201）并经由透射
荧光的二向色镜（91）将该荧光引导向检测器（未示于图中）。当然对于本领域技术人员直观
的是，用根据本发明的另一配置替代此实例性实施例的迂回配置。
在一些实施例中，根据本发明的装置的区域可以通过阀或类似阀的结构或者通过
分接头而相互连接。
该装置还可包括用于开启和闭合分接头或阀的控制器以及用于分接头或阀的开
启或闭合构件。通过开启和闭合分接头或阀以及通过开启阀或分接头的时间，可以控制扩
增溶液在所述区域之间的传递，特别是温度循环器区域和表面杂交区域之间、变性区域和
表面杂交区域之间、表面杂交区域和延伸区域之间以及延伸区域和变性区域之间的传递。
该装置的传输系统优选地选自：泵、加热元件和微机电系统（MEMS）。
该传输可以是例如通过使用泵施加压力的有源传输，或者可以是例如扩散或由毛
细管力驱动传输的无源传输。因而，当使扩增溶液经过区域时，这可意味着有源以及无源传
输经过该区域。
通过控制传输系统，例如传输速率和/或传输系统激活的周期，可以进一步控制扩
增和检测。可以根据具体应用来控制和调节传输速率，例如经过区域的流速（例如单位为单
位时间上的体积）或者扩增溶液停留在特定区域中的时间。技术人员例如知道PCR循环的时
序和每个循环的阶段。
该装置的检测系统可以优选地为共焦或渐逝检测系统和/或选自：荧光检测系统、
CCD芯片、等离子体激光（plasmonic）（例如表面等离子体激光共振系统）、全内反射系统和
线栅生物传感器系统。
在一些实施例中，该装置包括至少所述表面杂交区域中的微阵列且所述捕获探针
固定在所述微阵列的内表面上。
在装置的优选实施例中，该装置包括与多个目标核酸序列基本互补的多种不同捕
获探针以及用于同时检测多种不同目标的检测系统。
该装置可以附加地包括冷却区域，用于将扩增溶液冷却到低于杂交温度的温度，
优选地在约0℃至10℃范围内的温度，更优选地在约0℃至4℃范围内的温度，最优选地在3
℃至4℃附近。扩增溶液可以例如在最后的PCR循环之后被传递到冷却区域。
本发明还涉及一种用于扩增和检测反应容器中的扩增溶液中的目标核酸序列的
试剂盒，包括：反应容器，用于接收包括所述目标核酸序列的扩增溶液，其中反应容器包括
在表面上固定捕获探针的至少一个表面杂交区域，其中所述捕获探针与所述目标核酸序列
上的区域基本互补且其中反应容器还包括至少一个其它类型的区域。试剂盒可以是一次性
试剂盒。优选地，反应容器包括在表面上固定捕获探针的至少两个表面杂交区域，其中所述
捕获探针与所述目标核酸序列上的区域基本互补。在试剂盒作为本发明装置的部件的上下
文中，已经在上文中讨论了试剂盒的一些说明性实施例的特征。这种试剂盒的具体实施例
在附图14中说明。当插入该装置时，试剂盒中的表面杂交区域优选地与该装置中生成允许
杂交的温度的那个区域交叠。
因而，本发明还涉及一种用于接收本发明的试剂盒的装置，其中该装置包括：
一个或多个温度控制器和/或温度调节器用于生成所述试剂盒中包括的反应容器中的
至少两种温度区域的温度分布图，其中一种区域具有允许捕获探针杂交到互补目标核酸序
列的基本恒定生成温度且其中温度控制器和/或温度调节器控制、调节和维持各区域中的
温度；
检测系统，该检测系统检测结合到所述捕获探针的目标，但是基本不检测未结合到所
述捕获探针的目标；
传输系统，用于在各区域之间传输扩增溶液；以及
用于所述试剂盒的接收元件。
优选的是，当试剂盒插入装置时，试剂盒的表面杂交区域与该装置中生成允许杂
交的温度的那个区域交叠。
本发明还涉及本发明的方法、试剂盒和装置的下述用途：用于定量分析目标核酸
序列、用于同时定量分析多个目标核酸序列、或者用于分析样品以确定目标核酸的存在。
优选地，此处描述的方法、试剂盒和装置被用于临床诊断、定点照护诊断、生物分
子诊断、基因或蛋白质表达阵列、环境传感器、食品质量传感器或法医应用。
本发明还涉及本发明的方法、试剂盒和装置在下述中的用途：PCR、定量PCR、多重
PCR、实时PCR或实时多重PCR、特别是定量实时PCR或定量实时多重PCR。
下述说明进一步更详细指明本发明的一些方面：
扩增可以通过各种酶催方法执行，包括PCR（聚合酶链式反应）、NASBA（基于核酸序列的
扩增）、TMA（转录介导扩增）和滚环扩增。本领域技术人员知晓适合于本发明的酶催扩增方
法。
根据本发明的目标核酸序列的扩增在扩增溶液中执行。在本发明的上下文中，扩
增溶液例如为含有样品或者疑是含有包括目标核酸序列的核酸。技术人员知晓如何制备样
品以用于在其中执行扩增反应，或者知晓必需添加到样品中从而在样品中执行扩增反应的
附加成分（例如缓冲液、酶、核苷酸、盐等）。此处的扩增溶液还涉及包括核苷酸（例如dNTPs）
和允许目标核酸的扩增的其它物质（例如缓冲剂、诸如镁盐的盐、比如BSA的惰性蛋白质）的
反应缓冲液。技术人员知晓用于扩增反应，特别是聚合酶链式反应（PCR）的合适溶液（以及
这种溶液的成分的特别合适的浓度）。PCR包括包含下述循环的重复：在远高于目标核酸序
列的熔化温度的高温度的待扩增核酸（此处称为“目标核酸”或“目标核酸序列”）的变性阶
段，在允许核酸引物退火到所述目标核酸的温度的退火阶段，以及在允许引物延伸的温度
利用核酸聚合酶的引物延伸阶段（伸长阶段）（在该阶段中，退火的引物被延伸且目标核酸
用作模板）。技术人员知道，对于聚合酶链式反应，在扩增期间在扩增溶液中存在合适的引
物或引物对，并且知晓如何设计这种引物从而扩增目标核酸序列。
引物为核酸链或者作为用于核酸复制的起始点的相关分子。措词“核酸聚合酶”指
从核糖核苷三磷酸或脱氧核糖核苷三磷酸合成核酸链（例如RNA或DNA）的酶。
在本发明上下文中，热去耦区域涉及反应容器的区域或隔室，在该区域或隔室中，
温度可以基本独立于反应容器的其它区域或隔室或者其它类型的区域或隔室而被控制、调
节和维持。同一类型的区域可以优选地相互热去耦。然而，如此处下文更详细描述，在一些
实施例中，同一类型区域的区域可以热耦合或者备选地在其它实施例中相互热去耦，即同
一类型的区域的温度可以一致地或相互独立地控制、调节和维持。在一些实施例中，这可以
表示同一类型的区域具有大约相同的温度，在其它实施例中，这可以表示温度可以在同一
类型的区域之间变化。根据本发明，不同类型的区域的温度独立于其它类型的区域而被控
制、调节和维持，使得不同类型的区域热去耦。在一些实施例中，热去耦区域为物理上分离
和/或隔离的隔室，即它们的体积被分割。在其它实施例中，两个或更多个热去耦区域可以
包括在同一隔室中和/或可以共享同一体积，只要同一体积或隔室中的区域的温度例如可
以通过分离的加热器或冷却器而被分别调节和维持。
一种类型的区域为用于相同目的的一类区域。根据本发明，各类型的区域例如为
表面杂交区域、温度循环器区域、变性区域、延伸区域和/或退火区域。在本发明的优选实施
例中，在扩增和/或检测期间，杂交区域、延伸区域、退火区域和变性区域的温度基本保持恒
定。温度循环器区域的温度被改变，例如在扩增反应期间以可编程方式在两种、三种、四种
或更多种不同温度之间循环。技术人员知晓如何选择和/或编程例如聚合酶链式反应的热
循环，例如如何选择阶段的时间和温度以及循环的数目。优选地，温度循环器区域中的温度
在变性温度、退火温度和延伸温度之间循环。在一些实施例中，例如对于热启动PCR，附加的
温度阶段和/或循环可以包括在热循环中，例如在第一循环之前或在最后循环之后。（多个）
变性区域中的温度为变性温度，即允许目标核酸序列变性的温度。（多个）退火区域中的温
度为退火温度，即允许对目标核酸序列执行引物退火的温度。（多个）延伸区域中的温度为
延伸温度，即允许通过核酸聚合酶的引物延伸的温度，其中目标核酸序列用作模板。（多个）
表面杂交区域中的温度为杂交温度，即允许捕获探针（寡核苷酸探针）杂交到目标核酸序列
的温度。这些温度取决于目标核酸、引物、聚合酶和寡核苷酸探针（捕获探针）的属性（例如
长度或GC含量）且技术人员知晓如何选择、确定或计算这些温度。典型的变性温度是在约90
至99℃的范围，优选地在约94至98℃的范围。典型的退火温度是在约50至70℃的范围，优选
地在约55至68℃的范围。典型的延伸温度是在约70至80℃的范围，优选地在约72至75℃的
范围。典型的杂交温度是在约40至70℃的范围，优选地在约45至68℃的范围。
根据本发明，通过表面特异检测系统和/或通过表面特异生成待检测信号获得表
面特异检测。
下述限定适用于本发明的这个以及其它实施例：
表面特异检测意味着不被捕获的扩增子（例如在具有捕获探针的表面顶部上的流体中
漂浮）对检测信号的贡献基本被抑制，优选地抑制至少50倍，更优选地至少100倍，以及甚至
更优选地至少1000倍，而捕获扩增子对检测信号的贡献（基本）不被抑制。
对于快速杂交，下述边界条件可以应用于含有捕获探针的PCR室的部分：通道的宽
度与斑点横向尺寸成比例且通道的高度小（优选地约为100-300μm）。
这些边界条件确保整个样品沿着捕获探针经过，并且与通道的小高度结合提供了
扩增子快速杂交到捕获探针。
在每个PCR循环之后扩增子的数量基本上翻倍且因此杂交扩增子的数量成比例增
大。根据下述公知公式，结合扩增子的数量与溶液中其浓度成比例
![]()
其中：
h为捕获部位的杂交复合物的表面浓度，单位为mol/m2，
cA为分析物浓度（mol/m3）
CP为捕获探针表面浓度（mol/m2）
以及kf和kr为on和off结合率。
如所解释，图9说明在杂交曲线开始时，扩增子浓度与杂交曲线的斜率成比例，且
因此在每个PCR循环期间通过测量杂交信号，可以实现对扩增子的杂交的定量和实时检测。
作为实例，考虑高度为500微米且含有浓度为1微摩尔的标记引物的流体单元的情
形：
1）不利用表面特异检测，标记引物产生相当于每平方微米~300000个标记的检测信号。
对于每平方微米10000个捕获探针的捕获探针密度，在最佳情形中这将导致1/30的信背比
（signaloverbackgroundratio）。对于典型杂交实验，不是所有捕获探针都结合到标记
扩增子且信背比将甚至更小，例如对于每平方微米1000个捕获扩增子，信背比为1/300。
2）利用表面特异检测，溶液中的标记引物产生明显更低的检测信号；例如，对于
1000的背景抑制因子，检测信号相当于每平方微米~300个标记引物。利用表面特异检测，对
于每平方微米1000个捕获的标记扩增子，信背比明显地提高到约3。
描述表面特异检测的另一种方式是描述这样的表面特异检测方法或装置：其检测
结合到表面的那些标记但是基本不检测在溶液中的标记。这意味着针对表面特异检测给出
的上述限定同样适用于措词“表面特异检测器，其检测结合到表面的那些标记但是基本不
检测在溶液中的标记”
捕获探针分子可以是DNA、RNA、PNA（肽核酸）、LNA（锁核酸）、ANA（阿拉伯核酸）或HNA（己
糖醇核酸）寡核苷酸。RNA、PNA、LNA和HNA能够与DNA形成比DNA:DNA同质双链更稳定的异源
双链。这保证了增强的对于序列不匹配的区分能力（更特异的杂交）。异源双链更高的稳定
性也允许在给定温度使用更短的寡核苷酸探针，降低了非特异结合的可能性。PNA:DNA双链
独立于杂交缓冲液的离子强度而形成。这可以提高低盐PCR缓冲液中的杂交效率。
一部分扩增子的杂交意味着：可以从由于扩增子到捕获探针的杂交而测量到的信
号强度直接计算扩增子浓度。如果测量信号和扩增子浓度之间的关系不是线性的，则可以
应用关联算法或校准曲线来导出扩增子浓度。
捕获探针的捕获部分可含有对于在扩增反应期间产生的扩增子是特异的10至200
个核苷酸，优选地15至50个核苷酸，更优选地20至35个核苷酸。捕获探针还可含有附加核苷
酸序列，该附加核苷酸序列可以用作捕获部分和表面之间的间隔区或者可以具有可以在0
至200个核苷酸优选地0至50个核苷酸变化的稳定化基团（function）。这些未捕获核苷酸序
列可以包括正常核苷酸或碱性核苷酸。
捕获分子可以通过其5’端基或通过其3’端基固定。
为了复用，捕获分子以至少每μm24个捕获分子、优选地至少每μm21000个捕获分子、
更优选地至少每μm210000个捕获分子以及甚至更优选地每μm2100000个捕获分子的微阵列
形式被固定在固体支撑物的特定局域化区域。
在特定实施例中，捕获分子包括与扩增子的特定序列互补的10至100个核苷酸的
捕获部分，使得所述捕获部分限定扩增子的两个不互补端基，且具有至少20个核苷酸的间
隔区部分，并且其中扩增子的两个不互补端基分别包括间隔区端基和非间隔区端基，使得
间隔区端基与捕获分子的间隔区部分不互补，且所述间隔区端基比所述非间隔区端基多至
少50个碱基。
措词“核酸、寡核苷酸、阵列、核苷酸序列、目标核酸、基本结合、特异地杂交到、背
景、定量”为通过引用结合于此的在国际专利申请WO97/27317中描述的措词。措词聚核苷酸
是指通常由DNA或RNA序列组成的核苷酸或类似核苷酸的序列。
措词“核苷酸三磷酸、核苷酸、引物序列”为在通过引用结合于此的文献WO00/
72018和WO01/31055中描述的另外措词。
对（多种）核苷酸、（多种）聚核苷酸等的引用包括其中糖磷酸骨架被改性和/或替
代的相似物，只要其杂交属性不被破坏即可。举例而言，该骨架可以被等价合成肽（称为肽
核酸（PNA））替代。
根据优选实施例，捕获探针固定在图案化阵列中的杂交表面上。根据优选实施例，
捕获探针固定在微阵列的表面上。
“微阵列”指多种捕获分子固定在其上从而能够结合给定特定目标分子的支撑物。
微阵列优先由存在于表面上的特定局域化区域处或在支撑物之内或在覆盖支撑物的衬底
上的捕获分子组成。特定局域化区域为含有对于所确定的目标分子是特异的结合捕获分子
的表面区域。特定局域化区域或者通过建立微阵列的方法而知晓，或者在检测期间或之后
限定。斑点为其中特异目标分子固定在它们的捕获分子上并且可以通过检测器可视化的区
域。在本发明的一个具体应用中，捕获分子的微阵列也可以被提供在不同或分离的支撑物
上，只要不同支撑物含有特异捕获分子且可以相互区分从而能够对特异目标分子进行定
量。这可以通过使用珠的混合物来实现，所述珠的混合物具有特定特征且能够相互区分从
而对结合分子进行定量。一个珠或一群珠于是被认为是具有对于一种目标分子是特异的捕
获分子的斑点。
微阵列优先通过在衬底上沉积捕获分子来获得，这是通过诸如钉或“钉和环”接触
表面的物理手段或者利用诸如压电－或纳米分送器的方法通过释放溶液微滴来完成的。
备选地，以诸如US5,744,305和US6,346,413所提供的在预定位置合成寡核苷酸
或聚核苷酸的光空间分辨率，在本发明实施例的衬底上原位合成捕获分子。
可以优选的是，借助不对称PCR（或LATEPCR：指数后线性扩增）可以使单链扩增子
富含PCR混合物。在不对称PCR中，使用正向和反向PCR引物不相等的浓度。当标记引物的浓
度高于未标记引物的浓度时，标记链将以低于未标记链速率的速率扩增。这不仅导致标记
链的累积，而且直接有利于标记链杂交到捕获探针。
措词“实时PCR”是指允许在PCR循环期间检测和/或定量扩增子的存在的方法。在
实时PCR中，在扩增循环的至少之一中检测和/或定量扩增子的存在。与在PCR循环期间形成
的扩增子的数量有关的扩增子或信号的增加被用于检测和/或定量PCR溶液中给定的核苷
酸序列。在优选实施例中，在每个循环中检测和/或定量扩增子的存在。
本发明中的措词“扩增子”涉及酶催核酸扩增的产物的目标核苷酸序列的拷贝。
替代标记PCR引物，可以使用具有标记dNTPs的内部标记。
有许多标记关联检测方法。在WO97/27317中给出对不同标记分子的述评。它们或
者使用已经标记的引物来获得，或者通过在拷贝或扩增步骤期间标记核苷酸（WO97/27329）
的酶催合并来获得。
可能的标记为使用荧光检测器高灵敏度地检测的荧色物。荧色物包括但不限于通
过使用可购得的阵列扫描器（可从例如GeneralScanning,GeneticMicrosystem获得）适
合用于分析阵列的花青染料（Cy3、Cy5和Cy7）。FAM（羧基荧光素）也是作为标记的可能备选。
本领域技术人员知晓可以在本发明的上下文中使用的合适标记。
在本发明的优选实施例中，与溶液中的荧光相比，检测到与捕获分子上存在扩增
子有关阵列的荧光信号的信号增加。
在具体实施例中，阵列上存在的荧光团的检测的差异是基于，与和溶液自由移动
分子关联的荧光相比，与杂交在捕获分子上作为DNA双螺旋的结合分子关联的荧光各向异
性差异。各向异性取决于荧光团的迁移性和与待检测荧光团关联的荧光的寿命。用于阵列
上各向异性的方法测定现在可以从BlueshiftBiotechnologiesInc.,38East
CaribbeanDrive,Sunnyvale,CA94089（http://www.blueshiftbiotech.com/
dynamicfl.html）获得。
在具体实施例中，优选地以时间分辨方式获得对荧光团分子的检测。荧光分子具
有与发射过程关联的荧光寿命。典型地，小的荧光团（诸如荧光素和若丹明）的寿命是在2至
10纳秒的范围。时间分辨荧光（TRF）测定使用长寿命（>1000ns）荧光团从而区分测定信号和
诸如几乎总是具有远小于10ns寿命的矩阵或荧光样品的自发荧光的短寿命干扰。寿命优选
地被另一荧光团或一猝灭剂（利用其发生共振能量传递）的相邻存在所调制。用于TRF的仪
器简单地延迟对发射的测量，直到在短寿命的荧光已经消失且长寿命的报告分子荧光仍然
存在。可以按两种基本方式确定荧光寿命。时间域技术使用非常短脉冲（皮秒）的激励且随
后监测在纳秒寿命上的实时发射。将衰减曲线拟合为指数得到寿命。频域技术以兆赫兹频
率调制该激励且随后观察响应中的发射强度波动。相位延迟和振幅调制随后可用于确定寿
命。用于快速且经济的寿命成像的频率技术现在可以从BlueshiftBiotechnologiesInc
获得。如上所述，这些限定适用于所有所述实施例。
在本发明的一个实施例中，引物被标记且使用检测结合到表面的那些标记的表面
特异检测系统来检测杂交的标记扩增子。如上所限定，表面特异是指在溶液中的标记基本
不被检测。
在优选实施例中，待检测标记的信号不依赖于所述多个核酸序列的结合状态而改
变。
在甚至更优选实施例中，待检测信号为荧光信号。优选的是，标记为小的有机荧光
团，但也可以是微粒标记（或者发荧光或者不发荧光），诸如纳米磷光体、量子点。
可以使用多个标记用于检测多个核酸，在优选实施例中同一标记用于检测每个所
述多个目标核酸序列。
表面特异检测系统择优地选自：共焦测量装置、等离子体激光测量装置以及根据
渐逝检测用于测量的装置。
如上所述，为了能够区分杂交扩增子和溶液中引物或扩增子，进行表面特异测量
是至关重要的。表面特异测量仅检测非常靠近捕获表面的标记。由于杂交只能在已经沉积
捕获探针的位置处进行且PCR混合物是均匀的，则有可能扣除背景（斑点之间的荧光强度）
并且确定杂交扩增子的数量。
可能的标记为荧光标记或非荧光（例如微粒），其中折射率或吸收的差异可以由光
学装置监测。本领域技术人员应直观地知晓合适的荧光标记或非荧光标记。
对于高度表面特异测量，也就是将背景抑制至少50倍，可以在三种不同方法之间
进行区分：
1.共焦：沿着光轴的典型测量高度为1-2μm。
2.等离子体激光：测量高度约为激励光的波长或更小。
3.渐逝：测量高度为100nm或更小。
1.共焦
共焦测量可以用各种类型成像设备（例如标准基于针孔的系统）实现。这种系统可制成
非常紧凑（PCT/IB2007/052499、PCT/IB2007/052634和PCT/IB2007/052800）。沿着系统的光
轴的不同位置产生这样的不同位置：标记被最靠近阵列表面的物镜成像。通过使用针孔且
适当定位—标记在阵列表面处具有锐利图像的位置处—可以在传感器表面附近选择小的
测量体积（沿着光轴的深度仅仅为1-2μm）。
2.等离子体激光
这里衬底覆盖有诸如Au、Ag的金属。捕获探针位于金属层上或者间隔层沉积在金属的
顶部上且随后覆盖有捕获探针。杂交DNA的标记的荧光可以在金属介质/流体界面处耦合到
表面等离子体。流体中的标记无法耦合到表面等离子体或者具有相当更小的效率耦合。通
过耦出表面等离子体（也就是，将表面等离子体模式转变为传播波）并测量耦出的功率，基
本仅测量杂交DNA的标记的荧光。结果，荧光测量的表面特异性高。
3.渐逝
作为用于增强表面特异性的另一备选方法，可以使用渐逝激励方法，其中渐逝波在衬
底表面处被激励并且激励荧光团。
作为第一种方法，可以使用在衬底—流体界面处的全内反射（TIR），其导致典型地
在阵列表面的100-200nm之内的测量（激励）体积。然而，TIR要求使用连接到衬底的玻璃棱
镜或者使用具有楔形的衬底从而使得能够将角度大于衬底—流体界面的临界角的激励光
耦合到衬底中。
备选地（如PCT/IB2006/051942、PCT/IB2006/054940中所述），可以用诸如金属的
不透明介质覆盖衬底并且用孔径（阵列）来图案化该金属，该孔径在平行于衬底－流体界面
的平面中的至少一个尺寸低于光在流体中的衍射极限。作为实例，可以用线栅图案化衬底，
该线栅具有大于光在流体中的衍射极限的一个面内尺寸和低于光在流体中的衍射极限的
另一尺寸。这导致阵列表面的50nm内的激励体积（已经在实验上演示了20-30nm的测量体
积）。这种方法与第一种方法（用于渐逝激励）相比的优点为它更简单，不需要棱镜或楔形表
面且对于入射角和激励斑点形状没有特殊要求，并且可以使用简单CCD相机用于成像荧光
并实现相当更小的激励体积。
根据本发明的装置可包括：表面杂交区域，该表面杂交区域的内表面涂布有用于
多个目标核酸序列的捕获探针；以及表面特异检测系统，该表面特异检测系统检测结合到
表面的那些标记但是基本不检测溶液中的标记。
多种不同捕获探针可以按图案化阵列涂布在杂交表面上，从而同时监测同一表面
杂交区域中多种不同扩增子的扩增。所有捕获斑点监测同一PCR混合物中不同扩增子的扩
增。这允许比当前可能实现的高得多的复用级别。这允许大于6以及多达100或更多的复用
级别。本发明的实施例的附加优点为，仅仅需要一种荧光团（一个类别），这使得不需要多种
昂贵的滤色器和/或分离的光电检测器。
因而，根据本发明的装置可以是微阵列。
在本发明的另一实施例中，表面杂交区域的固体表面上的捕获探针为折叠探针
（例如分子信标）或者其它探针（例如TaqMan探针），所述其它探针具有由于探针结构而相互
紧邻的荧光标记和猝灭剂。在此实施例中，执行PCR反应，而反应中没有任何标记或者标记
不附连到扩增引物。在PCR反应期间形成的特定扩增子可以与固体表面上的标记捕获探针
杂交，由此或者分离猝灭剂和标记（对于分子信标类型的折叠探针的情形）或者允许聚合酶
使探针水解（对于类似TaqMan捕获探针的情形）。结果，可以在捕获探针所在的斑点处测量
荧光信号。
在此实施例中，使用高度表面特异读取器并不是先决条件，因为信号仅仅在扩增
子杂交到捕获探针时产生。上面所有其它陈述也适用于本发明的这个实施例。
因而，在一些实施例中，捕获探针为具有荧光标记的探针以及由于探针结构而相
互紧邻的猝灭剂，并且在扩增子杂交到所述捕获探针的情况下可以检测信号。
在一些实施例中，根据本发明的装置的表面杂交区域包括涂布有用于多个目标核
酸序列的捕获探针的内表面，其中捕获探针被标记且在扩增子杂交到所述捕获探针的情形
中可检测信号。
根据装置的该实施例，该标记择优选自：分子信标、插入染料、TaqMan探针等。
在本发明的装置的又一实施例中，捕获探针固定在单独可识别的珠上。在优选实
施例中，不同珠具有不同捕获探针。
可以优选的是，珠被带到表面杂交区域的表面且通过表面特异检测测量捕获扩增
子。珠例如可以通过磁性致动被带到表面。
在优选实施例中，检测标记的荧光。如上所概述，本领域技术人员知晓另外的荧光
和非荧光标记。
如果捕获探针固定在珠上，则允许准均匀测定，因为珠分散在反应溶液中。准均匀
测定允许比非均匀测定更快的动力学。珠可以具有介于50nm和3μm之间的直径并且例如通
过颜色编码、条形编码或尺寸而单独可识别。含有不同捕获探针的多种珠可以存在于同一
反应溶液中。通过磁性致动（当使用（顺）磁性珠时）或者通过介电电泳（当使用非磁性珠
时），其上具有捕获扩增子的珠可以被带到表面。在该表面上，珠可以被识别且捕获扩增子
可以通过表面特异光学测量来检测。
另一种区分不同珠的方法是基于由于尺寸差异导致的沿珠周界传播的共振器模
式的共振波长的差异。这种情况下珠用作共振器，其支持沿着珠的周界传播的共振器模式
（对于球形珠，这些共振器模式为所谓的回音廊模式）。对于在沿着周界的一个来回之后的
相移为2*pi的倍数的波长，共振器共振。这些共振器模式还具有延伸到珠的环境（流体）中
的渐逝场。珠的近场区（典型地<100nm）中的荧光团可以将其荧光的一小部分耦合到由珠支
持的共振器模式。与其它波长相比，耦合到共振器模式的该一小部分荧光对于共振波长而
言是更强的，且这导致以与共振器模式或回音廊模式对应的共振峰调制该荧光光谱。珠的
典型直径大于1μm，高达50μm。可以遍及整个体积执行检测，因为由于未结合到珠的荧光团
引起的荧光具有该荧光团的本征光谱，所以不需要表面特异光学测量。
因而，在具体实施例中，根据本发明的装置的表面杂交区域包括单独可识别的珠，
其中用于多个目标核酸序列的捕获探针固定在所述单独可识别的珠上。
在优选实施例中，该装置还包括：用于将珠带到表面杂交区域的表面的装置，以及
表面特异检测器，其检测结合到表面的那些标记但是基本不检测在溶液中的标记。
本发明的方法和装置特征在于，在指定表面杂交区域中执行杂交和检测。其优点
为，可以独立于扩增过程调节用于杂交和检测的条件。例如PCR过程和表面杂交的热要求大
不相同。PCR扩增过程要求（快速）温度循环，其中循环样品的部分高于dsDNA熔化温度。另一
方面，表面杂交要求在低于核酸熔点的温度进行，并且为了优化性能，应避免高于捕获探针
部位的扩增子扩散限制局部耗尽。
本发明的多个区域构思允许对这两个过程－体积扩增和表面杂交－去耦优化。附
加地，由于每个循环中可用于杂交的时间比较长，检测是非常精确的。本发明的一些实施例
提供非常灵活的方法，因为例如可以从特定数目的循环或者在每个第N个循环上执行杂交
和检测。
不包括温度循环器区域且因而不包括快速温度变化的实施例具有这样的附加优
点：由于降低的温度引起应变的原因，它们损坏反应容器、试剂盒和/或装置的风险降低。
本发明的方法和装置允许在扩增反应期间和/或之后对经扩增的目标核酸的非常
灵敏的检测。
下述实例是说明性实例且不限制本发明的范围。
实例
实例1：
在实时PCR期间使用熔化的测定优化，以得到结合曲线的精确测量结果。
直观的测量是确定某种目标DNA的扩增子浓度高于阈值的PCR循环数目。在理想情
况下（最佳PCR效率，无其它（统计）误差源），这使得能够计算阈值PCR循环数目CT的初始拷
贝数目，在最差情况下为估计拷贝数目和实际拷贝数目之间的差异的两倍（半定量PCR）。为
了提高精确性，优选地从杂交开始已经测量杂交曲线，也就是每单位面积的杂交DNA数量与
杂交时间的曲线，因为随后杂交DNA的表面浓度充分远离平衡状态。对于多个PCR循环监测
杂交区域。
可以如下重配置单独温度区域：
1.确定CT
2.在至少CT-1个PCR循环之后对杂交区域执行熔化步骤（高温）->无杂交扩增子
3.将温度降低到杂交温度并开始测量对于目标DNA是特异的捕获探针的杂交曲线。
4.确定扩增子浓度的精确估计。
5.通过绘制熔化曲线确定非特异性结合的贡献。
6.改正非特异性结合的贡献->扩增子浓度的精确和准确估计
7.确定初始拷贝数目。
实例2：
在实时PCR期间使用分割温度区域的测定优化，用于杂交到两个分区中，仅一个分区
（A）与该杂交区域交叠。
如果希望仅在N个循环之后进行杂交，因为扩增子浓度简直太低而无法在循环<N-
1期间被检测，则对于直到循环N-1的PCR循环的表面杂交区域（“分区A”）的温度设置为充分
高于杂交温度（例如变性温度）从而避免杂交。在从循环N开始的PCR循环的表面杂交区域
（“分区B”）中，温度设置为用于引物退火的退火温度。
如果加热器元件的尺寸可以制成足够小且后续单元之间的串扰（例如由于对流）
足够小，则也可能将杂交区域分割为分区，其中在每个分区中为具有相似最优杂交温度的
捕获探针。按此方式，每种目标的杂交在最优温度条件下执行。
实例3：
实时PCR的检测方法
实时阵列PCR（具有共Nmax个循环）可以通过将PCR流体引导经过迂回结构（其中不同温
度步骤的时间可以由迂回的流动速率（压力）和布局控制）且检测杂交扩增子来执行。检测
可以按不同方式执行，这些方式例如为：
在每个循环期间在进行杂交的时间检测杂交，这能够确定结合动力学或者杂交斑点的
测量荧光信号作为时间函数的斜率。该斜率关联到目标分子（扩增子）的浓度。该方法要求
在多个杂交区域上比较快速地扫描/测量。
在第Nmax个循环之后检测，这将得到测量荧光信号的平衡值（静态图片）。该方法显
著地放宽对扫描/测量速度的要求。
一种方案，其中例如通过首先在对应于大循环数目的杂交斑点处执行检测以确定
究竟哪些杂交斑点给出信号，扫描程序适应测量的杂交信号。在下一个步骤，杂交信号不处
于平衡状态的循环的杂交区域被选择以确定杂交信号与时间曲线的斜率，这导致对浓度的
定量估计。对于100pM的检测极限，对于缔合常数kon=105M-1s-1以及解离常数koff=10-6s-1，
这对应于τ=90000s的杂交时间（对应于与平衡浓度的63%对应的杂交扩增子的表面浓度），
对于10nM的浓度，τ=1000s。假设每个PCR循环耗时90s且PCR效率为100%，则对应于7个循环
（630s）的浓度存在两个数量级差异。在1000+630=1630s之后，100pM的浓度的杂交信号仍然
不处于平衡状态，且可以通过测量杂交曲线的斜率来确定浓度。
也可想到然后清洗掉PCR缓冲液。这得到对于给定循环数目和给定杂交时间，具有
杂交扩增子的斑点的静态图片。该方法的缺点为无法确定杂交与时间曲线的斜率（扩增子
浓度的估计不那么精确），但是优点为，该清洗移除PCR缓冲液中的标记并使得测量对荧光
背景没那么灵敏。附加优点为，在流体经过杂交斑点且已经在阵列上测量杂交之后，清洗流
体可以经过斑点（或比如杂交缓冲液的不同类型缓冲液）。接着该区域的温度可以提高到95
℃且可以针对每个单独斑点测量熔化温度。
下述方法、装置、试剂盒和用途也被本发明考虑在内：
（1）用于扩增和检测反应容器中的扩增溶液中的目标核酸序列的方法，包括下述步骤：
提供反应容器，该反应容器包括在表面上固定捕获探针的至少一个表面杂交区域，其
中所述捕获探针与所述目标核酸序列上的区域基本互补；
向所述反应容器添加扩增溶液；
生成具有至少两种热去耦区域的反应容器中的温度区域分布图，其中一种区域与表面
杂交区域相同或至少交叠，其中表面杂交区域具有允许捕获探针杂交到目标核酸序列的生
成温度；
在反应容器中执行目标核酸序列的扩增；以及
在扩增期间和/或之后定期地或以限定的时间间隔检测经扩增的核酸序列，其中经扩
增的核酸序列通过在所述表面杂交区域中捕获探针与所述经扩增的核酸序列的杂交而检
测。
（2）根据（1）的方法，
其中在扩增和检测期间使所述扩增溶液经过所述至少两个热去耦区域。
（3）根据（1）至（2）的方法，其中至少一个表面杂交区域用于在整个扩增过程的多
个阶段杂交和检测经扩增的目标核酸序列。
（4）根据（3）的方法，
其中至少一个杂交区域在整个扩增过程的多个阶段用于杂交和检测，以及
其中所述至少两个热去耦区域中的两个或更多个包括在反应容器的同一隔室或体积
中。
（5）根据（3）的方法，
其中至少一个杂交区域在整个扩增过程的多个阶段用于杂交和检测，以及
其中所述至少两个热去耦区域包括在反应容器的分离隔室或体积中。
（6）根据（4）或（5）的方法，
其中反应容器包括具有基本恒定生成温度的至少一个表面杂交区域和具有在从扩增
溶液的熔点到沸点范围内的可变温度的至少一个温度循环器区域，其中扩增溶液从温度循
环器区域传递到表面杂交区域以用于检测经扩增的目标核酸，并且反过来用于进一步的扩
增。
（7）根据（6）的方法，其中反应容器包括至少一个温度循环器区域和至少一个表面
杂交区域，其中扩增反应为聚合酶链式反应（PCR）且其中聚合酶链式反应的至少变性和引
物延伸在温度循环器区域中执行且温度循环器区域中的温度至少在变性温度和延伸温度
之间循环。
（8）根据（7）的方法，其中在温度循环器区域中执行对所述目标核酸的引物退火且
其中温度循环器区域中的温度在变性温度、退火温度和延伸温度之间循环。
（9）根据（6）或（7）的方法，其中表面杂交区域中的温度适合于对所述目标核酸的
引物退火且其中在表面杂交区域中执行对所述目标核酸的引物退火。
（10）根据（1）或（2）的方法，
其中每个表面杂交区域仅用于在整个扩增过程的特定阶段杂交和检测经扩增的目标
核酸序列，以及
其中在反应容器中生成两种或更多种热去耦区域，
其中每个区域具有基本恒定生成温度，以及
其中第一种区域为表面杂交区域且第二种和另一种区域为扩增区域，
其中使扩增溶液经过全部区域，使得对于每个扩增循环经过至少一个扩增区域，且对
于其中附加地期望进行杂交和检测的每个扩增循环，经过表面杂交区域，
并且其中传输是单向的且非循环的。
（11）根据（10）的方法，
其中一种类型的所有区域中的温度相等且被一致地调节或者所有区域中的温度被分
别调节。
（12）根据（1）至（11）中任何一个的方法，
其中多种核酸序列由与每种待检测目标核酸序列互补的至少一种捕获探针检测。
（13）一种用于扩增和检测反应容器中的扩增溶液中的目标核酸序列的装置，包
括：
反应容器，用于接收包括所述目标核酸序列的扩增溶液，其中反应容器包括在表面上
固定捕获探针的至少一个表面杂交区域，其中所述捕获探针与所述目标核酸序列上的区域
基本互补，以及包括至少一个其它类型的区域；
一个或多个温度控制器，用于控制所述反应容器中至少两种温度区域的温度分布图，
其中一种区域与所述表面杂交区域基本交叠，且其中表面杂交区域具有允许捕获探针杂交
到互补目标核酸序列的基本恒定生成温度；
检测系统，该检测系统检测结合到所述捕获探针的目标核酸序列但是基本不检测未结
合到所述捕获探针的目标核酸序列；以及
传输系统，用于在各区域之间传输扩增溶液。
（14）根据（13）的装置，其中所述反应容器包括在可交换试剂盒中。
（15）根据（13）或（14）中任何一个的装置，该装置用于扩增和检测聚合酶链式反应
（PCR）中的目标核酸序列。
（16）根据（13）至（15）中任何一个的装置，其中至少一个表面杂交区域可以在整个
扩增过程的一个以上的阶段用于杂交和检测经扩增的目标核酸序列。
（17）根据（16）中任何一个的装置，其中所述至少两个温度区域中的两个或更多个
包括在反应容器的同一隔室或体积中，或者备选地其中所述至少两个温度区域包括在反应
容器的分离隔室或体积中。
（18）根据（16）至（17）中任何一个的装置，包括至少一个表面杂交区域和至少一个
温度循环器区域，温度循环器区域中的温度可以在从扩增溶液的熔点到沸点的范围内循
环。
（19）根据（13）至（18）中任何一个的装置，其中反应容器包括至少一个表面杂交区
域、至少一个生成变性区域和至少一个生成延伸区域。
（20）根据（13）至（19）的装置，其中反应容器中存在多个表面杂交区域，使得在整
个扩增过程中的两个或更多个阶段可以进行表面杂交。
（21）根据（13）至（20）中任何一个的装置，
其中反应容器包括三种热去耦区域，
其中在每个区域中生成的温度可以保持基本恒定，
且其中第一种区域为退火区域，第二种为变性区域以及第三种为延伸区域，
且其中对于期望进行检测的每个扩增循环，存在一个表面杂交区域，或者退火区域与
表面杂交区域基本交叠，
其中使扩增溶液经过全部区域，使得对于每个扩增循环首先经过变性区域，其次经过
退火区域以及再次经过延伸区域，
其中该传输是单向的且非循环的，
且其中变性区域具有允许目标核酸序列变性的生成温度，退火区域具有允许引物退火
的温度，表面杂交区域具有允许引物退火和捕获探针杂交的生成温度且延伸区域具有允许
引物延伸的生成温度。
（22）一种用于扩增和检测反应容器中的扩增溶液中的目标核酸序列的试剂盒，包
括用于接收包含所述目标核酸序列的扩增溶液的反应容器，其中反应容器包括在表面上固
定捕获探针的至少一个表面杂交区域，其中所述捕获探针与所述目标核酸序列上的区域基
本互补且其中反应容器还包括至少一个其它类型的区域。
（23）一种用于接收（22）的试剂盒的装置，包括：
一个或多个温度控制器和/或温度调节器用于生成所述试剂盒中包括的反应容器中的
至少两种温度区域的温度分布图，其中一种区域具有允许捕获探针杂交到互补目标核酸序
列的基本恒定生成温度且其中温度控制器和/或温度调节器控制、调节和维持各区域中的
温度；
检测系统，该检测系统检测结合到所述捕获探针的目标，但是基本不检测未结合到所
述捕获探针的目标；
传输系统，用于在各区域之间传输扩增溶液；以及
用于所述试剂盒的接收元件。
（24）根据（1）至（12）的方法或根据（13）至（21）或（23）的装置或根据（22）的试剂盒
用于目标核酸序列的定量分析、用于多个目标核酸序列的同时定量分析或用于分析样品以
确定目标核酸的存在的用途。
（25）根据（24）的用于临床诊断、定点照护诊断、生物分子诊断、基因或蛋白质表达
阵列、环境传感器、食物质量传感器或法医应用的用途。
（26）根据（1）至（12）的方法或根据（13）至（21）或（23）的装置或根据（22）的试剂盒
在实时PCR或实时多重PCR中的用途。