磁性纳米粒子核酸分离器、及其制法和应用 技术领域
本发明涉及一种纳米生物分离器，更具体地说，本发明涉及一种磁性纳米粒子核酸分离器。本发明还涉及该分离器的制备方法及用途。
背景技术
众所周知，纳米技术领域是当今最热门的科学技术研究领域，将纳米技术应用于生物科学领域中所形成的新兴科学技术-纳米生物技术，是利用纳米技术研究和解决生命科学领域中的重大问题的科学，它正成为当前重要的前沿科学研究领域之一。
现在，磁性纳米粒子在生物技术领域中的应用前景日益受到人们的关注。磁性纳米粒子经常被用作生物样品磁场分离的分离介质。用磁性纳米粒子的分离方法操作简便、所需设备廉价，同时分离速度快，有利于保持样品的生物活性。目前，运用越来越广泛。
用于生物技术中的磁性纳米粒子一般要求具有如下的特性：(1)粒子具有超顺磁性，易于吸附和洗脱；(2)粒子需要较大的磁化强度，以保证分离效率的灵敏度；(3)粒子表面要易于进行化学修饰，以和不同的生物和药物分子进行连接；(4)用于体内时要求有较好的生物相容性。基于此目的设计的纳米粒子分离器通常为三明治结构，内核层一般为磁性纳米材料，中间为包覆层，目前已有的产品大多数采用高分子材料作为包覆层，最外层则修饰与生物组织有特异性作用的功能基团，以满足生物分离的要求。
但是，现有技术中的分离器多采用乳液聚合得到的高分子微球，其中包覆了纳米尺寸地磁性颗粒。然而，高分子微球的结构通常比较疏松，其中包含的磁性粒子在长时间保存过程中容易脱离微球并且会产生团聚现象，从而影响产品的性能；在磁性纳米粒子上用吸附或亲合作用固定活性物质时，容易脱落。
本发明提供了一种磁性纳米粒子核酸分离器，克服了现有技术的不足。
发明内容
本发明的目的是提供一种磁性纳米粒子核酸分离器。
本发明的另一个目的是提供制备该磁性纳米粒子核酸分离器的方法。
本发明的再一个目的是将该磁性纳米粒子核酸分离器应用于分离目标DNA或RNA的分离。
在本发明的第一方面，提供了一种磁性纳米粒子核酸分离器，它含有如下的三层结构：
(1)由核壳型磁性纳米粒子构成的内核层；
(2)包覆内核层的MPTS(3-巯基丙基三甲氧基硅烷)中间层；
(3)包覆中间层的单链DNA外壳层。
在另一优选例中，所述的核壳型磁性纳米粒子内核层包括内核和外壳。所述内核层的内核成分选自：铁的氧化物、镍、镍-铁合金、或其组合。较佳地，所述内核层的内核成分是铁的氧化物。所述内核层的外壳成分选自二氧化硅、琼脂糖、烯烃聚合物、聚丙烯腈、环氧化合物、或其组合。较佳地，所述内核层的外壳成分是二氧化硅。
其中，所述单链DNA外壳层是通过过硫键与中间层连接的单链DNA。
在本发明的第二方面，提供了一种制备磁性纳米粒子核酸分离器的方法，它包括以下步骤：
(1)在含磁性纳米粒子和内核层外壳形成剂(如正硅酸乙酯)的微乳液体系中，通过油包水型反相微乳液法，形成核壳型磁性纳米粒子，所述的核壳型磁性纳米粒子包括内核和外壳，
所述的磁性纳米粒子选自：铁的氧化物、镍、镍-铁合金、或其组合；
所述的内核层外壳形成剂形成成分选自下组的外壳：二氧化硅、琼脂糖、烯烃聚合物、聚丙烯腈、环氧化合物、或其组合；
(2)使用3-巯基丙基三甲氧基硅烷对步骤(1)的核壳型磁性纳米粒子表面进行修饰，得到修饰了巯基的磁性纳米粒子；
(3)使用修饰了过硫键的单链DNA对步骤(2)的修饰了巯基的磁性纳米粒子的表面进行修饰，形成磁性纳米粒子核酸分离器。
其中，所述微乳液体系中TritonX-100、正己醇、环己烷按1∶(1～3)∶(4～6)的比例均匀混合。
在本发明的第三方面，提供了本发明所述的磁性纳米粒子核酸分离器的用途，它被用于分离DNA或RNA。
在本发明的第四方面，提供了一种分离核酸的方法，包括步骤：将该磁性纳米粒子核酸分离器加入到含有目标单链DNA或RNA的溶液中，使其在Tris-HCl和MgCl2的混合溶液中，于一定温度下充分杂交后，在外磁场的引导下将目标单链DNA或RNA分离。
附图说明
图1是修饰了巯基的磁性纳米粒子(FSM)的表面增强拉曼效应图，表明巯基被修饰在磁性纳米粒子的表面，而且被修饰在磁性纳米粒子表面的巯基在银的基底上有很好的拉曼增强效应。
图2是连接了单链DNA的磁性纳米粒子(FSMD)的表面增强拉曼效应图，表明DNA被连接到磁性纳米粒子的表面，而且有较好的拉曼增强效应。
具体实施方式
本发明者经过广泛而深入的研究，发明了在磁性纳米粒子的表面修饰能识别并结合DNA或RNA的物质，然后用这种磁性纳米粒子去捕获目标DNA或RNA，再在外磁场的作用下进行分离的技术。
本发明的制备磁性纳米粒子核酸分离器的方法包括以下步骤：
(1)制备磁性纳米粒子
用二次蒸馏水分别配制FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O的混合溶液及NaOH溶液。在铁盐的混合溶液中Fe2+离子的浓度为0.1～0.2mol/l，Fe3+离子的浓度为0.1～0.3mol/l，NaOH溶液的浓度为2～3mol/l。在剧烈搅拌下将体积为混合盐溶液体积一半的NaOH溶液缓慢地滴加到混合盐溶液中。将所得到的固体沉淀在40℃～60℃下陈化12h，用二次蒸馏水将沉淀物清洗数次，过滤后再在40℃～80℃的条件下干燥24h，在玛瑙研钵中研磨后即得产物。
(2)二氧化硅在γ-Fe2O3表面的修饰
将TritonX-100、正己醇、环己烷按1∶(1～3)∶(4～6)的比例均匀混合，形成透明稳定的微乳液体系。将上述微乳液体系置于超声波中处理30-60分钟，再向其中加入0.01～1g的γ-Fe2O3(磁性纳米粒子)，用超声波处理3分钟后取出上层液倒入三颈烧瓶中，搅拌30～60分钟使之均匀。取1ml一定浓度的浓氨水用2ml二次蒸馏水稀释，将其缓慢加入到不断搅拌的微乳液中，持续搅拌10～60分钟使氨水均匀分散在微乳液中。1小时后，向微乳液中滴加1～5ml的正硅酸乙酯(内核层外壳形成剂)，同时不断地搅拌10小时，并将体系的温度保持在15～40℃之间。向体系中加入丙酮使粒子沉淀，或者将体系静置过夜使粒子自然沉淀，使用乙醇清洗粒子。将清洗后的粒子置于300～700℃的条件下锻烧1～4个小时，收集核壳型磁性纳米粒子。
(3)用3-巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTS)修饰磁性纳米粒子表面
取15mg磁性纳米粒子加入2～10ml的乙酸和乙醇的混合液中，用超声波处理20～60分钟；称取0.01～1g MPTS，用超声波处理10～60分钟；将这两种溶液混合均匀，在10～40℃的条件下反应1小时，然后取出粒子并用乙酸和乙醇的混合液清洗3次，接着在100-300℃真空干燥2小时，收集粒子(FSM)。
(4)单链DNA在磁性纳米粒子表面的修饰
取一定量的已修饰了过硫键的单链DNA，加入到500μl的NaHCO3和Na2CO3的混合液中，混合均匀后，向该单链DNA的溶液中加入少量FSM，使之分散均匀，并在潮湿的环境中于10～50℃的条件下反应12～36小时(DNA上的过硫键与中间层上的巯基反应，使DNA分子通过过硫键直接连接于中间层)。分离清洗粒子并在20～80℃的条件下真空干燥10小时，然后用二次蒸馏水分散粒子(FSMD)，得到磁性纳米粒子核酸分离器。
适用于本发明的单链DNA的长度没有特别的限制。通常平均长度约为5～200bp，较佳地约为10～50bp。
核壳型磁性纳米粒子内核层的内核成分除了铁的氧化物以外，还有镍(Ni)或者镍(Ni)和铁(Fe)等的合金。
核壳型磁性纳米粒子内核层的外壳成分除了二氧化硅等无机包裹层以外，还有琼脂糖、烯烃聚合物、聚丙烯腈、环氧化合物等有机包裹层。对于选定的外壳成分，可根据现有技术选用合适的内核层外壳形成剂。例如当外壳成分为二氧化硅时，可选用正硅酸乙酯或其它合适的内核层外壳形成剂。
本发明的主要优点在于：
(1)使用的磁性纳米粒子是单分散性的，不产生团聚现象，磁性纳米粒子的形状和直径易于控制；
(2)能识别目标DNA或RNA的单链DNA通过化学键与磁性纳米粒子连接，牢固性好，不易脱落；
(3)与传统的电泳法相比，本发明方法简便而高效。
下面结合具体的实施例，对本发明作进一步的阐述。应该明白，本发明不限于这些具体的实施例。
实施例1
磁性纳米粒子的内核层的制备方法
采用改进的化学共沉淀制备磁性粒子的内核层，具体方法如下：用二次蒸馏水分别配制FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O的混合溶液及NaOH溶液。在铁盐的混合溶液中Fe2+离子的浓度为0.1～0.2mol/l，Fe3+离子的浓度为0.1～0.3mol/l，NaOH溶液的浓度为2～3mol/l。在剧烈搅拌下将体积为混合盐溶液体积一半的NaOH溶液缓慢地滴加到混合盐溶液中。将所得到的固体沉淀在40℃～60℃陈化12h，用二次蒸馏水将沉淀物清洗数次，过滤后再在40℃～80℃的条件下干燥24h，在玛瑙研钵中研磨后即得产物。
实施例2
核壳型核酸磁性纳米粒子的制备方法
将TritonX-100、正己醇、环己烷按1∶2∶5的比例均匀混合，形成透明稳定的微乳液体系。将上述微乳液体系置于超声波中处理30～60分钟，再向其中加入0.5g的γ-Fe2O3，用超声波处理6分钟后取出上层液倒入三颈烧瓶中，搅拌30分钟使之均匀。取1ml一定浓度的浓氨水用2ml二次蒸馏水稀释，30分钟后将其缓慢加入到不断搅拌的微乳液中，持续搅拌30分钟使氨水均匀分散在微乳液中。1小时后，向微乳液中滴加1～3ml的正硅酸乙酯，同时不断地搅拌10小时，并将体系的温度保持在15～30℃之间。向体系中加入丙酮使粒子沉淀，或者将体系静置过夜使粒子自然沉淀，使用乙醇清洗粒子。将清洗后的粒子置于400～700℃的条件下，锻烧1～4个小时，收集粒子。
实施例3
磁性纳米粒子核酸分离器的制备
取15mg实施例2中制得的磁性纳米粒子加入2ml的乙酸和乙醇的混合液中，用超声波处理20～60分钟；称取0.01g MPTS，用超声波处理10～60分钟；将这两种溶液混合均匀，在10～30℃的条件下反应1小时，然后取出粒子并用乙酸和乙醇的混合液清洗3次，接着在100～300℃真空干燥2小时，收集粒子(FSM)。从图1中可以看出，巯基被修饰到磁性纳米粒子的表面，而且有很好的拉曼增强效应。
取一定量的已修饰了过硫键的单链DNA(平均长度7bp)，加入到500μl的NaHCO3和Na2CO3的混合液中，混合均匀后，向该单链DNA的溶液中加入少量FSM，使之分散均匀，并在潮湿的环境中于20～40℃的条件下反应24小时。分离清洗粒子并在20～80℃的条件下真空干燥10小时，然后用二次蒸馏水分散粒子(FSMD)，得到磁性纳米粒子核酸分离器。从图2中可以看出，DNA探针被连接到了磁性纳米粒子表面，而且有明显的拉曼增强效应。
实施例4
磁性纳米粒子核酸分离器的制备
取15mg实施例2制得的磁性纳米粒子加入6ml的乙酸和乙醇的混合液中，用超声波处理20-60分钟；称取0.5g MPTS，用超声波处理10～60分钟；将这两种溶液混合均匀，在10～30℃的条件下反应1小时，然后取出粒子并用乙酸和乙醇的混合液清洗3次，接着在100～300℃真空干燥2小时，收集粒子(FSM)。
取一定量的已修饰了过硫键的单链DNA(平均长度50bp)，加入到500μl的NaHCO3和Na2CO3的混合液中，混合均匀后，向该单链DNA的溶液中加入少量FSM，使之分散均匀，并在潮湿的环境中于20～40℃的条件下反应24小时。分离清洗粒子并在20～80℃的条件下真空干燥10小时，然后用二次蒸馏水分散粒子(FSMD)，得到磁性纳米粒子核酸分离器。
实施例5
磁性纳米粒子核酸分离器的制备
取15mg实施例2制得的磁性纳米粒子加入10ml的乙酸和乙醇的混合液中，用超声波处理20～60分钟；称取1g MPTS，用超声波处理10～60分钟；将这两种溶液混合均匀，在10～30℃的条件下反应1小时，然后取出粒子并用乙酸和乙醇的混合液清洗3次，接着在100～300℃真空干燥2小时，收集粒子(FSM)。
取一定量的已修饰了过硫键的单链DNA(平均长度95bp)，加入到500μl的NaHCO3和Na2CO3的混合液中，混合均匀后，向该单链DNA的溶液中加入少量FSM，使之分散均匀，并在潮湿的环境中于20～40℃的条件下反应24小时。分离清洗粒子并在20～80℃的条件下真空干燥10小时，然后用二次蒸馏水分散粒子(FSMD)，得到磁性纳米粒子核酸分离器。
实施例6
取实施例3～5中制得的磁性纳米粒子核酸分离器，加入100μl总RNA水溶液中，再加入柠檬酸钠缓冲液20～50μl，混匀，在10～50℃下杂交。
在外在磁场的作用下收集磁性纳米粒子，除去清液。用柠檬酸钠缓冲液清洗磁性纳米粒子三次。将磁性纳米粒子悬浮于水中，在外磁场作用下除去磁性纳米粒子，收集水相，并在-80℃的条件下保存备用或用于RT-PCR，cDNA库构建等。
结果：实施例3-5制得的核壳型核酸磁性纳米粒子是单分散性的，不会产生团聚现象，且其形状和直径易于控制。此外，能识别目标DNA或RNA的单链DNA通过化学键与该磁性纳米粒子连接，牢固性好，不易脱落，因此分离效果非常好。
在不偏离本发明的实质和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明进行各种改动或修改，这些等价的形式同样落在本申请所附权利要求书所限定的范围内。