一种新型植物原生质体看护培养方法 【技术领域】
本发明涉及一种植物细胞的培养方法，更具体地说，本发明涉及一种植物原生质体看护培养的方法。
背景技术
原生质体(protoplast)是指脱去细胞壁的“裸露”细胞。植物原生质体的获得使得细胞间遗传物质交流和基因导入等遗传操作有了可能。因此，植物原生质体培养的成功，对植物遗传改良具有极其重要的意义。原生质体培养一般用酶消化细胞壁来游离出原生质体，然后放在液体或固体培养基中培养，再生出细胞壁后，经过持续的细胞分裂，形成愈伤组织或胚状体，分化再生出新的植株。
原生质体培养方法有多种。常用的有琼脂糖包埋培养法(固体培养法)和液体培养法等。而对于一些难于培养植物的原生质体则常采用看护培养法。原生质体看护培养法是指将原生质体和与其同种或不同种的植物细胞共同培养以提高其培养效率的一种方法。看护培养法是原生质体培养中比较有效的方法之一，到目前为止，机理尚不清楚，主要认为是看护细胞向原生质体提供了促进生长的物质，或提供了一种适宜密度效应，或吸收原生质体培养过程中产生的有毒物质等等。看护培养法主要有混合看护培养法：在培养皿中预先加入培养液，接入切成小块的待培养的原生质体包埋块，再加入一定量的悬浮细胞液充作“看护细胞”，利用悬浮细胞在培养过程中分泌出的物质，加速被看护原生质体的生长。一定时间后除去看护细胞；微孔滤膜看护培养法：将看护细胞，培养基及低融点琼脂糖混合物，倒入平皿中，待凝固之后，在表面敷一块微孔滤膜或双层滤纸，将待培养的原生质体滴加在膜上。10天后转膜一次，3周后转入无看护细胞的培养基直到原生质体形成大量的愈伤组织。另外，还有一些由此衍生出的其他看护培养方法。
由于原生质体培养时影响因素比较多，往往建立一种植物原生质体培养高效再生体系需要花较长的研究时间，例如需要摸索合适地培养基成分、选择适当的外植体等等。到目前为止，植物原生质体培养还存在着许多“困难植物”——试验了上百种甚至上千种影响因子都不能获得成功的植物。以往看护培养方法的缺点是用作看护的原生质体或细胞与被看护原生质体之间的看护效果不够充分，特别是对难于发生分裂的原生质体或在培养过程中容易褐化的原生质体更加不能获得成功。这些看护培养方法由于用于看护的原生质体(细胞或愈伤组织)与被看护的原生质体之间存在一定的距离或间隔物，往往在看护效果还没有发挥作用之前，被看护的原生质体已经褐化死亡。同时，由于常用的看护培养法往往结合了液体培养方式，使得一些易凝聚的原生质体发生坏死。因此，常用的看护培养法对许多物种并不适用。另外，常用的看护培养法还必须摸索看护原生质体或细胞与被看护原生质体的合适培养基，需花费一定的时间来研究。因此，建立一种简单的、快速易行的、能广泛应用的原生质体看护培养方法成为迫切需要。
【发明内容】
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种新的植物原生质体看护培养方法。
为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
对看护培养植物细胞和被看护培养植物细胞分别进行原生质体分离和培养，利用看护培养植物原生质体在培养过程中分泌出的物质去维持被看护植物原生质体的生长直至形成愈伤组织，其中利用看护培养植物原生质体分泌的物质去维持被看护植物原生质体的生长方法是通过以下步骤实现的：
将两种植物细胞原生质体分别在液体培养基中培养，使原生质体长出新的细胞壁；
将含有两种植物原生质体的培养基按一定比例混匀，再以琼脂糖固化；
将固化后的培养基进行暗培养。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
可以利用已经建立的原生质体高效再生体系去看护另一物种的原生质体，并使得被看护物种的原生质体能快速、高效地再生。这不仅能节省大量的时间、物力，而且还能使一些“困难植物”能快速培养成功。采用本发明的方法能使“困难植物”植物原生质体在3个月之内高效地获得再生。
【具体实施方式】
本发明的方法主要步骤是：先将两种植物原生质体分别在液体培养基中培养三天，使它们分别长出新细胞壁。再将两种植物的原生质体(等密度)等比例混匀，然后以琼脂糖固化，保证两种植物的原生质体均匀分布在培养基中。经过5星期的培养，将形成的微愈伤组织分别进行繁殖和分化，可获得高效的再生体系。在本发明的具体实施例中，用作看护培养的材料是茎用芥菜原生质体，被看护原生质体是紫甘蓝原生质体，所述的液体培养基和固体培养基全部为适用于茎用芥菜原生质体培养的培养基。
本发明的方法具体实施例1如下：
原生质体分离：
本实施例中选用的茎用芥菜的原生质体从苗龄为10天的幼苗子叶分离得到(幼苗放入含有0.5％(W/V)纤维素酶Onozuka RS，0.1％(W/V)果胶糖Y23，2mM MES，3mM CaCl2和0.4M甘露醇的酶溶液中)。
本实施例中选用紫甘蓝品种名称为Ruby ball(来自日本)，高质量的原生质体从苗龄为3-5天的紫甘蓝幼苗下胚轴获得，其原生质体分离方法与茎用芥菜子叶原生质体分离方法相同。
原生质体看护培养：
本实施例以茎用芥菜的原生质体用作看护培养的材料，以紫甘蓝原生质体用作被看护培养的原生质体。将两种原生质体分别在液体培养基(在本实施例中选用改良的MS+2.5mgl-1 2，4-D+0.5mgl-1KT)中培养三天，使它们分别长出新的细胞壁。将含有两种原生质体的培养基(其中原生质体的密度相同)以1∶1等体积混合，然后再用琼脂糖固化，保证两种原生质体均匀分布并保持一定的间距。其中琼脂糖的最终浓度为1％，原生质体培养密度为1×105cells/ml。最后将固化的培养基在25℃下进行暗培养。
植株再生情况检验：
经过5星期的培养，即可获得被看护原生质体的高效再生的微愈伤组织。将形成的微愈伤组织转移到含NAA 0.25mg/L+2、4-D0.25mg/L+BA 1mg/L+0.2M甘露醇的MS培养基上，于暗光下增殖。当愈伤组织的直径达到1mm时，将其转移到含MS BA 1mg/L+NAA 0.2mg/L培养基上进行分化培养，愈伤组织表面会出现红点。在2-3周内形成可见不定芽，再生芽的频率为56％。不定芽出现后转移到含1/2MS+NAA 0.1mg/L培养基上进行植株生根培养，然后移栽到温室中进行进一步的植物学性状观察。染色体观察表明，甘蓝母株和再生植株的染色体均为2n＝18。在植物学性状上也没有观察到明显的变异。说明该培养方法没有引起植物的遗传变异。
本发明的方法的具体实施例2中选用的紫甘蓝品种名称为红亩，所有实施方法及步骤均与具体实施例1中相同。红亩紫甘蓝原生质体为再生频率为47％，染色体观察表明，甘蓝母株和再生植株的染色体均为2n＝18。在植物学性状上也没有观察到明显的变异。
本发明的方法具体实施例3中选用的紫甘蓝品种名称为紫甘一号，所有实施方法及步骤均与具体实施例1中相同。紫甘一号紫甘蓝原生质体再生频率为33％，染色体观察表明，甘蓝母株和再生植株体的染色体均为2n＝18。在植物学性状上也没有观察到明显的变异。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。