高效蛋白提取 发明领域
本发明涉及将蛋白溶解于碱性水溶液中从动物肌肉中分离食用蛋白的方法。
发明背景
在日本，鱼浆(surimi)或成型鱼的生产已经大约有一千年的历史了。直到最近北美的超市里才出现以仿制蟹腿、龙虾块、虾和扇贝的形式出现鱼浆。北美鱼浆通常是由含脂肪少的白色肉质鱼如青鳕或牙鳕制得的。
低价动物肌肉(比如来自多脂远洋鱼或家禽骨残留物的动物肌肉)通常是人类消耗所不想要的食品来源。加工之后，所分离的蛋白的特征经常为质地不诱人、色度深暗而且气味浓，这些通常是膜脂氧化的结果。
发明概要
本发明基于这样的发现：如果将动物肌肉蛋白溶解于碱性溶液中，所得的可溶性蛋白可以被高收率地分离出来，而且以基本天然的非氧化形式存在，从而更加适合于人类食用。发现碱处理动物肌肉使脱氧血红蛋白的氧化作用以及溶酶体蛋白酶对肌球蛋白(一种主要肌肉蛋白)的水解作用最小化。在肌肉蛋白溶解于碱性水溶液之后，可以去除各种不想要的成分(比如骨、中性脂质、膜脂、脂肪块、皮、软骨以及其他不溶性物质)。然后将可溶性蛋白沉淀并且以可食用的形式收集。
因此，本发明的特征在于从动物肌肉(例如鱼肉如远洋鱼肉或鸡肉)中分离食用蛋白的方法，所述方法通过获得包含动物肌肉和水的混合物，提高混合物的pH值至足以溶解动物肌肉蛋白混合物中地至少一部分不溶性蛋白的水平，去除混合物中至少50％(重量)的总膜脂，从动物肌肉蛋白混合物中沉淀溶解的蛋白，并收集这些沉淀的蛋白，由此从动物肌肉中分离出食用蛋白。这种分离的蛋白可以用于形成可食用的蛋白凝胶，所述蛋白凝胶可以用在诸如热狗和煮熟的鱼浆的食品中。为了进一步限制氧化的程度，尤其是限制膜脂氧化程度，所述混合物可以包含铁螯合物(即和铁原子或铁离子结合并使其不具有氧化性的化合物)如乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、肌肽、鹅肌肽、尿酸、柠檬酸、磷酸盐、多磷酸盐、铁蛋白或转铁蛋白。
所述方法可以包括任选的洗涤步骤，在这个步骤中，在溶解之前用水清洗未加工的动物肌肉；或者包括从溶解蛋白中去除不溶物质如骨皮和软骨。这可以在沉淀蛋白之前采用任选的低速离心步骤完成。这里所用的“低速”是指大约4000×g或更低的速度(例如2000、2500、3000、3250、3500或3750×g)，而“高速”是指大约5000×g或更高的速度(例如5500、6000、7500、8500、10，000或更高×g)。离心可以进行足够的时间(例如5、10、15、20、25、30、40、60或更多分钟)以达到所要的结果，比如从混合物中去除膜脂或去除不溶物料。
一般而言，动物肌肉可以占所述混合物的50％(重量)或更少(例如40、30、20、15、10或5％或更少)。当想要从可溶性蛋白中去除膜脂时，混合物中动物肌肉的百分比应该更小，比如占混合物的15、10或8％(重量)或更少，使得溶液的粘度足够低以从混合物的含水部分中分离出膜脂。当溶解蛋白的粘度降低时，可以去除混合物中存在的至少约50％(如至少约60、70、80或90％)(重量)的总膜脂。
可以采用许多方法去除混合物中的膜脂。例如，以大约5000×g或更高的速度(如6000、7000、8000、9000或10,000×g或更高)离心混合物，足以使膜脂沉淀在包含溶解蛋白的水层之下。必要时或需要时，可以从水层顶部去除中性脂质(如油)。从所述混合物中去除膜脂的其他方法包括过滤和添加聚集剂。这里所用的“聚集剂”是指这样的物质：当把它加入到混合物中时，引起混合物的一种或多种分散的成分聚集，因此便于从混合物中分离出所述一种或多种成分。
通过提高混合物的pH值至大约10.0或更高(如10.5或更高)可以实现初步溶解动物肌肉蛋白。可以通过向混合物添加多磷酸盐来提高溶液pH。
通过降低碱性混合物的pH值(如大约5.5或更低)可以沉淀所溶解的蛋白。例如，可以降低pH值至大约4.0或低于4.0(如2.5-3.5，尤其是3.0)，然后提高到大约5.0或更高。可以添加酸如盐酸于水相中以降低水相的pH值。可以任选地调节盐浓度以帮助沉淀作用(如添加盐如NaCl)，并任选地向所沉淀的蛋白中添加冷冻保护剂。可以通过离心和/或借助于聚集剂如聚胺(如精胺或亚精胺)、中性聚合物或离子型聚合物、或其他任何也可用于使膜脂聚集的特定聚集剂，来收集所沉淀的蛋白。
在另一方面，本发明包括一种从动物肌肉(如鱼肉或鸡肉)中分离食用蛋白的方法，所述方法通过获得包含动物肌肉和水的混合物；提高所述混合物的pH值至足以溶解动物肌肉蛋白混合物中的至少一部分不溶性动物蛋白的水平；从所述动物肌肉蛋白中沉淀溶解蛋白；并收集所沉淀的蛋白，因此从动物肌肉中分离出食用蛋白。在此方法中，在每个步骤中维持混合物的温度为15℃或更低(如10℃或5℃或更低)，以使蛋白变性以及污染物如膜脂的有害氧化最小化。在提高pH值之前，所收集的沉淀蛋白提供了至少占混合物总动物肌肉蛋白70％(如至少80、90、95％)(重量)的收率。在可应用的情况下，可以将如这里所描述的另外任选的步骤和物质用于本方法中。
作为提高包含动物肌肉和水的混合物pH值的替代方法，可以首先获得动物肌肉，然后与pH值呈足够碱性的水溶液混合，以溶解至少一部分动物蛋白。
本发明具有几个优点。本发明的所述方法使血红蛋白的氧化潜力失活或减弱，也使肌球蛋白(动物肌肉的主要成分)的水解最小化。另外，本发明的任选的特点是基本上去除了所有的膜脂，因此进一步稳定了食用蛋白，防止其氧化。这样，本发明体现了使氧化剂失活和去除不想要的氧化底物的策略，这些使所述食用蛋白制品适宜为市售食品。
这里描述的方法可用于把多脂肌肉组织加工为饲料组合物，所述组织通常是价格低廉的原料，如可从多脂鱼类或机械去骨的家禽肉中找到。另外，所述方法可用于从含脂肪少的动物肌肉如含脂肪少的白色肉质鱼(如鳕)中分离食用蛋白。
本发明的所述方法也提供了来自动物肌肉的提高收率的蛋白。采用本发明的所述方法，通常可以从肌肉组织中获得高于70％(重量)的蛋白。在某些情况下，可以获得高于90％(重量)的蛋白收率。除了具有好的收率带来明显的经济价值之外，提高收率的结果还减少了工业加工过程中废水的蛋白含量，从而减少了环境污染。
本发明的所述方法并不要求新鲜或含脂肪少的动物肌肉作为原料。采用所述新方法可以去除任何由于氧化脂质而引起的腐败(变味或变色)。另外，可以使用包含其他脂肪组织如皮的动物部分，这是因为令人不快的脂类以及所述部分自身可以被去除。在鱼品加工的情况下，所述新方法消除了在蛋白分离之前把鱼切成片的需要，因此减少了加工成本。同样，本发明的所述方法通过去除脂质，减少了食品中的脂溶性毒素(如多氯联苯或PCB)的量。
除非另有说明，这里所用的所有技术和科学术语的意思与本发明所属领域的普通技术人员的一般理解相同。尽管以下描述了实施或试验本发明所用的合适方法和原料，但也可以使用和这里所描述的那些相似或等同的本领域熟知的其他方法和原料。这里所提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用全部结合到本文中。万一发生争议，本发明的说明书(包括定义)将起支配作用。另外，所述原料、方法和实施例只是用于说明，没有企图限制。
图面的简要描述
图1是在特定pH值下，鳕肌肉中硫代巴比土酸反应性物质(TBARS)的量的条线图。“pH 3-7”条线指在加入溶血产物后于pH 3保持1小时，然后调节至pH 7，储存。
详述
本发明涉及一种从动物肌肉中分离食用蛋白的新方法。所得食用蛋白是相对无氧化的产品，它能够形成凝胶，而且可以加工为人类食品。例如，本发明的所述方法可以用于从多脂鱼和含脂肪比较少的白色肉质鱼中生产鱼浆。
I.分离无脂质食用蛋白
总的来讲，本发明的特征在于通过首先获得包含动物肌肉和水的混合物，从动物肌肉(例如鱼肉或鸡肉)中分离食用蛋白的方法，动物肌肉占混合物的量可以小于大约15％(如5％-12％或10％)(重量)。可以使用任何水性溶剂，如水。另外，在任何机械操作之前可以用水溶液洗涤肌肉。可以将肌肉基本上稀释于水中，使得在所述方法的接连步骤中产生的溶解蛋白悬浮液/溶液的粘度足够低，从而可以通过离心去除脂质或不溶性物质。如这里所描述的，较低的粘度也可以帮助采用离心之外的方法去除混合物成分。优选蛋白悬浮液/溶液的粘度大约为75mPa·s或更小(比如大约35mPa·s或更小)。例如用Brookfield ModelLVF粘度计(Brookfield Engineering，Stoughton，MA)，采用#3或#4锭子以60rpm测定粘度。然后使用厂商提供的转换图表来计算粘度。动物肌肉可以机械碾碎、匀浆或手工垛碎。
在用水或水溶液稀释动物蛋白之后，提高混合物的pH值，例如提高至高于大约10.0(如大约10.0-11.5，或大约10.5)，使得至少50％(如至少60、70、75、80、85或90％)(重量)的动物蛋白溶解。可以选择地，也可以将包含充足的碱以使混合物的pH值升高至高于大约10.0(如大约10.0-11.5，或大约10.5)的水溶液添加到动物肌肉中，以达到相同的溶解水平。
蛋白变性和蛋白水解是溶液温度和在溶液中的时间的函数，随着溶液温度提高和在溶液中的时间增加促进蛋白的变性和分解。因此，需要降低温度和减少蛋白在溶液中的时间。结果，本发明的所述方法优选在大约0℃-10℃(如0℃、1℃、4℃或6℃)下进行。本发明的所述方法也可以采用冷冻原料如冷冻肌肉组织进行。水性组合物也可以包含防止蛋白降解的成分，例如防腐剂。可以调节溶液的离子强度以避免蛋白沉淀。也可以将肌肉组织匀浆，如破碎成大约5mm或更小的小块，以实现一经pH调节就快速提取，以进一步防止蛋白变性。
为了从溶解的蛋白中去除膜脂，可以离心(如大约5000×g至10,000×g，或更高的速度)混合物，使得从水相中分离出带电的膜脂，通过例如轻轻倒出水相以收集膜脂。离心之后可以形成几层。带电膜脂和任何残留物沉淀在底部。沉淀物的百分重量可以小于20％(如小于10％)，因为较高的沉淀百分数表示一些想要的蛋白已经和不想要的脂质一起被去除了。把沉淀百分重量定义为离心后沉淀的重量除以匀浆总重量。在沉淀之上是包含溶解蛋白的水层。在顶层，如果存在中性脂质(脂肪或油)的话，它漂浮于水层之上。在轻轻倒出水相之前，可以用吸管去除中性脂质。根据肌肉的来源，也可以存在中间层。例如，包含夹带水的溶解蛋白凝胶可以在水层和沉淀之间形成。这层凝胶可以与水层一起保留，以提高蛋白产率。当然，在工业应用中，可以采用连续流动离心机或其他工业规模机器在离心期间取出水相(以及其他相，如果想要的话)。
可以使用离心之外的其他方法从水相中分离膜脂。例如，根据所要分离的物质的大小和体积，技术人员可以利用各种各样的过滤设备。在没有膜脂聚集剂的情况下，微量过滤设备适合于分离分子量在500,000至2千万之间的分子。如果脂质聚集了，那么微粒过滤(particulate filtration)可能是合适的。这些过滤装置通常在2-350kPa的压力下操作。另外，阳离子交换膜(sc-1)和阴离子交换膜(sa-1)适宜于从混合物中去除膜脂。另外，可以使用各种过滤方法以选择或排除特定大小的肌肉蛋白。
在某些情况下，可以和具有浸入式冷却旋管以维持相对稳定温度的进料槽一起使用HF-lab-5超滤装置(Romicon，Inc.，Woburn，MA)。也可以用交叉流法，该方法具有连续去除滤饼的优点。为了回收混合物的水分或者降低混合物的盐含量，可以和电渗析一起使用滤膜将离子赶出混合物。例如，为了这种特殊的目的，可以使用叠层装置(stackpackunit)(Stantech，Inc.，Hamburg，Germany)。这种装置包含几对夹在两个电极室之间的池。
也可以采用如MPF 7000设备(Mitsubishi Heavy Industries，Ltd.)或High Pressure ACB 665设备(Gec，Alsthom；Nantes，Frances)使混合物经受高压，促进膜的去除。伴随合适的温度处理的高压处理，除了膜脂聚集和分离之外，还有益于杀死已知病原体。
除了使用高压之外，也可以向混合物中添加聚集剂以促进膜脂去除。合适的聚合物聚集剂包括角叉菜聚糖、褐藻胶、脱甲基果胶、阿拉伯树胶、脱乙酰壳多糖、聚乙烯亚胺、精胺和亚精胺。其他聚集剂包括盐如钙盐、镁盐、硫酸盐、磷酸盐和聚胺。
然后可以降低水相的pH值，使所溶解的蛋白沉淀。收率可以至少为占混合物的初始总蛋白量的70％(如至少90％)(重量)。将收率定义为所沉淀的蛋白质量除以肌肉蛋白总量。在一个实施方案中，降低pH值至大约为5.5或更低以沉淀蛋白，并通过例如离心收集蛋白。在另一个实施方案中，降低水相的pH值至小于大约4.0(如大约为2.5-3.5或大约为3.0)，然后提高至大于大约5.0以沉淀蛋白。这种pH的进一步降低，可以促进肌质蛋白在更高的pH值下沉淀。可以向沉淀的蛋白中加入冷冻保护剂(如二糖和/或多元醇如polysorbatol)，以在冷冻储存过程中保护蛋白。
可以使用任何不对终产品造成不想要的污染的酸来降低已离心混合物的pH值。例如，有机酸(如苹果酸或酒石酸)或无机酸(如盐酸或硫酸)都是合适的。具有有利pKa值的柠檬酸可以提供在pH 3和pH 5.5下的缓冲能力。具有显著挥发性并发出不想要的气味的酸，如乙酸或丁酸，都是不理要的。同样，可以使用几种碱中的任何一种来提高pH值。多磷酸盐是合适的，因为它也作为抗氧化剂，并改善肌肉蛋白的功能特性。
因为控制混合物的pH值经常是困难的，所以混合物可以包含维持酸性目标pH值或碱性目标pH值的缓冲剂。例如，诸如柠檬酸盐的化合物，它的pKa值在大约5.97的范围内，如果溶解蛋白是在pH值大约为6.0或更低时沉淀，那么可以将它加入到包含溶解蛋白的混合物中。实际上，柠檬酸盐可以作为“刹车”来确保混合物的pH值不会冲过目标pH值。给出目标pH值，缓冲剂的选择就在食品科学领域的技术范围内了。适宜于目标pH值在8.0-9.0范围的缓冲剂包括甘氨酸、精氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、肌肽、牛磺酸、焦磷酸盐、正磷酸盐。适宜于目标pH值在5.5-6.5范围的缓冲剂包括组氨酸、琥珀酸盐、柠檬酸盐、焦磷酸盐和丙二酸盐。适宜于目标pH值在2.0-2.5范围的缓冲剂包括丙氨酸、谷氨酸、柠檬酸、乳酸、磷酸或丙酮酸。
不用降低溶液的pH值，而是通过加入聚合物，可以实现蛋白沉淀，这些聚合物例如为多糖、带电聚合物、包含藻酸盐或角叉菜聚糖或同类物质的海洋亲水胶体，它们单独应用或结合离心应用。也可以调节水相的盐浓度以促进沉淀。
另外，采用所述方法，各种洗涤液、上清液和流经(flow through)部分可以再循环回较早的步骤中，以回收更多蛋白。例如，在溶解的蛋白已经沉淀之后，水性部分可以进入另一批要溶解的动物肌肉中。
II.无脂食用蛋白的用途
所述新方法可以用于加工人类消耗的原料，而这些原料由于其不稳定性和不良的感官性质而在目前没有用于作为人类食品。少量种类的鱼如鲱、鲭、油鲱、毛鳞鱼、醍鱼或沙丁鱼未被充分使用或者用于非人类用途。目前世界上大约有一半捕获的鱼没有用于人类食品。所述新方法允许更好地使用这些可利用的食品供应。所述方法可以使用白色肉质鱼和暗色肉质鱼，也可以使用鸡肉和其他原料。采用本发明的所述方法，可以在收率方面提高无脂动物肌肉(如鳕)的质量。本发明的所述方法的结果是蛋白分离物，这种蛋白分离物能够形成凝胶，例如来自机械去骨鸡肉的凝胶，这些凝胶比由不通过本发明的所述方法加工的原料制成的凝胶更强。与由未经加工的原料制成的凝胶相比，这些凝胶还具有减少的脂肪和提高的持水能力。采用本发明的所述方法生产的蛋白分离物还可以用于作为功能成分代替各种食品如香肠的蛋白部分，如肉。
III.动物肌肉来源
本发明的所述方法可以用于加工从已经去除了鱼片的鱼中回收的肉。这些原料通常不用于人类食品。同样，在切取了多个部分以供零售之后剩下的鸡骨架的用途是很小的。本发明的所述方法可以加工这些鸡和鱼的部分，生产适宜于人类消耗的食用蛋白。可用于本发明的所述方法的其他未被充分利用的肌肉来源包括南极磷虾，它们可以大量获得，但是由于小而难于转变为人类食品。
典型的适宜于本发明的所述方法的初始动物肌肉来源包括鱼片、去头及去内脏的鱼、甲壳类动物(如磷虾)、软体动物(如乌贼)、鸡肉和其他家禽(如火鸡)、牛肉、猪肉或羔羊。
将在以下的实施例中进一步描述本发明，这些实施例并不限制权利要求书所限定的本发明的范围。
实施例
实施例1：滴定法测定最佳蛋白溶解的pH值
鱼的预处理。从地方鱼品加工者获得质量很好的大西洋鳕。好好地修整鳕肌肉，碾碎为1/8英寸的小块，每份肌肉分别与九份冷的(6℃)去离子蒸馏水混合，并在PolytronPCU 1机器(Brinkman Instruments，Westbury，NY)中于76速度匀浆1分钟。
碱性溶解。鳕匀浆的pH值为6.85。向匀浆加入1摩尔浓度的NaOH，直到它达到9.04-11.50范围内的特定pH水平。用BrookfieldModel LVF粘度计(Brookfield Engineering，Stoughton，MA)采用#3或#4锭子于60rpm测量4-6℃、特定pH值下的溶液的粘度。使用厂商提供的转换图表计算粘度。然后采用L5-6B超离心机，用35号转子(10,000×g)于9300rpm离心混合物60分钟，以形成乳化油顶层、包含溶解蛋白的中间水层，以及膜沉淀。在某些情况下，当使用含脂肪少的白色肉质鱼时，可能不存在乳化油层。用吸液管去除油，然后轻轻地倒出水溶液收集水层。粘度和溶解度结果见表1。
表1pH粘度(mPa·s)％蛋白溶解度％沉淀物重量9.04 373.5 33.37 31.189.50 409.0 36.85 40.4210.00 638.5 78.82 28.2210.49 59.5 88.90 15.0810.99 57.4 99.56 13.5211.50 29.5 ＞99.9 4.956.85 222.5 --- ---
采用Biuret反应，如Torten等人，Food Sci.168：168-174，1963所描述的方法，测定蛋白的质量。把蛋白溶解百分数定义为水层中蛋白的质量除以初始匀浆中的蛋白质量。沉淀物重量百分数是离心后沉淀物的重量除以总匀浆重量。沉淀重量值高指示去除膜脂的蛋白。表1的最后一行代表用1M NaOH调节之前的匀浆。
表1指出，蛋白溶解度大于70％发生在pH值高于10.0，粘度降到低于75mPa·s发生在pH值10.0-10.5之间或更高，沉淀物重量百分数降到低于15％发生在pH值大约为10.5或更高。表1中的数据表明，有效蛋白溶解度(＞70％)发生在pH值高于大约10.5。由于当pH值高于大约10.5时粘度降到低于75mPa·s，蛋白溶解度百分数升高到大于75％。同样，当pH值升高到高于10.5时沉淀物重量百分数下降到小于15％。如果粘度太高，蛋白和膜共沉淀而被去除。通常要求粘度为75mPa·s或更小以通过离心去除膜脂，而没有一起去除掉相当大部分的蛋白。pH值为10的样品粘度高，蛋白溶解度良好。然而该样品难以为工业设备所处理。沉淀重量百分数大约为15％或更低被认为是可以接受的。因此，尽管可以应用大约为10.0的pH值，但接近或高于10.5的更高pH值具有更高的商业价值。
实施例2：鳕鱼浆和鲭鱼浆的生产
如上述实施例1中所述预处理鳕。也从当地鱼品加工者获得并如实施例1中所述加工大西洋鲭。采用Kelleher等人在J.Food.Sci.57：1103-1108和1119，1992所描述的方法评定鲭为II级质量。将混合物pH值调节至10.5以溶解蛋白。然后离心混合物，如实施例1所描述的方法收集水层。
向蛋白水溶液中加入1M HCl，直到它的pH值为5.5。在BeckmanL5-65B超离心机的19号转子中于15,000rpm(34,600×g)离心20分钟，收集所沉淀的蛋白。轻轻地倒出上清液，向蛋白沉淀中加入包含4％蔗糖、4％山梨醇和1.2％三磷酸钠的冷冻保护剂。在小型冷藏间中采用Oskar型斩剁机(Sunbeam-Oster，Hattiesburg，MS)斩剁混合物30秒，使其形成鱼浆。用聚乙烯Whirl-pak7袋包装鱼浆，并在-40℃冷冻至少12小时。
在Oskar斩剁机中斩剁2分钟之前，在小型冷藏间(4℃)中将所述冷鱼浆调温(temper)30分钟。斩剁时以鱼浆的3％(w/w)向其加入NaCl。将所斩剁的糊状物灌注到不锈钢管(直径19mm×175mm)中并于90℃煮20分钟。在从管中倒出并于6℃放置24小时之前，将所煮好的鱼浆放置在冰中20分钟。表2列出了所煮好食品的物理性质。采用与配备有5公斤装料槽和速度为100mm/min十字头的Instron1000型通用材料试验仪器(Instron Corp.，Canton，MA)连接的5mm不锈钢探头，测定凝胶的强度和位移(displacement)值。如Lanier的“Measurementof Surimi Composition and Functional Properities(鱼浆组分和功能性质的测量)”载于：Surimi Technology(Lanier等人)，第123-163页，MarcelDekker，Inc.，New York，1992中所描述的方法，记录和计算这些值。
表2肌肉来源应变应力(kPa)鳕2.21±0.10128.13±7.33鲭1.95±0.0891.2±0.00
对于鳕，所述值代表来自一个凝胶样品的三个煮好管的平均值和标准偏差。对于鲭，所述值代表来自一个凝胶样品的二个煮好管的平均值和标准偏差。
所有凝胶的质量良好。一般而言，应变值(弹性成分)大于1.9-2.0的被评为A级凝胶。所有凝胶的应力值(坚硬成分)都很好，而大部分市售凝胶的应力值至少大约为30-35kPa。
实施例3：从鲱浅色肌肉生产蛋白分离物
鱼的预处理。从D & B Bait，Gloucester，MA获得新鲜鲱，并存放在冰上运送到the University of Massachusetts Marine Station(大约运送时间为15分钟)。到达实验室时，目测将鱼分为4级：僵硬、I级、II级和III级(Kelleher等人，J.Food.Sci.57：1103-1108和1119，1992)。宰后嫩化时间的范围一般是6-36小时。手工切取白色肉，采用厨用绞肉机(Kitchen Aid Inc.，St.Joseph，MI，USA)将其推过3mm的栅板。
蛋白分离。采用与可变自动转换器(Dayton，Ohio USA)连接的Kinematica Gmb H Polytron(Westbury，NY，USA)，用9倍体积的冰冷蒸馏水匀浆所绞碎的肌肉(120-300g)1分钟(速度50，120V)。滴加2NNaOH直到pH达到10.8，使匀浆中的蛋白溶解。于18,000×g(20分钟)在15分钟内离心蛋白悬浮液，给出4相：漂浮的“乳化层”、澄清的上清液、柔软的凝胶样沉淀物和略硬的底层沉淀。将“乳化层”和上清液这两相经过双层干酪包布过滤，将上清液与“乳化层”分开。采用2N HCl调节pH值至4.8-7如5.5，使可溶性蛋白沉淀下来。通过第二次以10,000×g离心收集所沉淀的蛋白。鱼浆生产。用手挤压或者通过离心(20分钟，18,000×g)去除碱性产生的蛋白沉淀物中过量的水。这样使碱性产生的沉淀物的含水量(Mc)从88±1％下降到72±3％(n＝7)。然后用蒸馏水将两种沉淀物的Mc调节为80％，并与冷冻保护剂混合物(4％蔗糖、4％山梨醇、0.3％三磷酸钠)混合。最终的Mc为73.2±0.5％。在塑料袋中于80℃冷冻鱼浆。
鱼浆凝胶的生产。如Kelleher和Hultin(Kelleher和Hultin，FunctionalChicken muscle protein isolates prepared using low ionic strength and acidsolubilization/precipitation(采用低离子强度以及酸溶解/沉淀制备功能性鸡肉蛋白分离物)，载于Meat Science in the New Millennium，出自the53rd annual reciprocal met conference(第53届互惠肉类年会)，theUniversity of Ohio State，June，18-21，第76-81页(2000))所描述的方法制备凝胶，只是在2％ NaCl中斩剁之后，用10％ NaOH或10％ HCl调节鱼浆的pH值为7.1-7.2。根据待进行的凝胶测量的类型，将鱼浆包装在纤维素肠衣(The Sausage Maker Inc.，Buffalo，NY)或19mm的金属管中。
凝胶的质量。采用Wu等人J.Tex.Studies，16：53-74(1985)的扭转技术，或者用Rheo Tex型凝胶凝计AP-83(Sun Sciences Co.Seatlle，WA，USA)，分析应变和应力(结构破坏)。后者测量变形(mm)以及穿透2.5cm的凝胶段所需要的峰值力(g)。凝胶也经过Kudo等人(1973)所描述的折叠试验，折叠3mm的凝胶片一次或两次。按照前面Kelleher和Hultin的方法测量Hunter色度值“L，”、“a，”和“b，”。
表3提供了采用新鲜鲱浅色肉和在冰上柔化(aged)6天、以相同方法加工的鲱浅色肉碱性辅助制备的鱼浆和鱼浆凝胶的数据。冷冻保护剂混合物由4％山梨醇、4％蔗糖和0.3％三磷酸钠组成。凝胶包含2％的NaCl并于90℃成型30分钟。用Rheotex AP-83(Sun Science Co.Ltd，Nichimo International Inc，Seattle，WA，USA)测量断裂力和变形。同一行中具有不同的数字的值显著不同(p≤0.05)。该数据表明，采用本发明的所述方法既可以从新鲜的鲱、也可以从经柔化的鲱制备良好质量的鱼浆和鱼浆凝胶。
表3原料/鱼浆特性 新鲜鲱 pH 10.8 经柔化的鲱 pH 10.8肌肉的含水量(Mc)(％) 79.6 80.6肌肉脂含量(％dw) 11.1 8.8肌肉TBARS(μmol TBA/kg) 5 28蛋白沉淀物的Mc(％) 87.3 87.7脱水蛋白沉淀物的Mc(％) 74.4 74.5具有冷冻保护剂的鱼浆的Mc 72.5 73.1具有冷冻保护剂的鱼浆的pH 6.87 6.42胶凝之前的pH 7.15 7.11最终鱼浆凝胶的Mc(％) 70.7 69.9凝胶的特性折叠试验 5 3断裂力(g) 871±62 464±11变形(mm) 9.2±0.7 6.2±0.3
表4提供了从新鲜鲱浅色肉碱性辅助制备的鱼浆和鱼浆凝胶的数据。冷冻保护剂混合物由4％山梨醇、4％蔗糖和0.3％三磷酸钠组成。凝胶包含2％NaCl并于90℃成型30分钟。采用扭转技术(Wu等人，J.Tex.Studies，16：53-64(1985))，用Brookfield数码粘度计(DV-II型，Brookfield engineering Inc.Stoughton，MA，USA)测量应力和应变。结果表示为平均值±SD(n＝4)。用Hunter LabScan II色度计(HunterAssociates Laboratories，Reston，VA)测量色度。色度测量结果表示为平均值±SD(n＝5)。采用L、a和b(参见前面Kelleher和Hultin(2000)的方法)平均值，按照下面的公式计算白度：100-((100-L)2+a2+b2)0.5(Lanier，“Meseaurement of Surimi Composition and Functional Properties”载于：Surimi Technology(Larier等人编著)，第123-163页，MarcelDekker，Inc.，New York，1992)。
表4原料/鱼浆特性 pH 10.8肌肉的Mc(％) 80肌肉脂含量(％dw) 11.3蛋白沉淀物的Mc(％) 87.5脱水蛋白沉淀物的Mc(％) 72.8含有冷冻保护剂的鱼浆的Mc(％) 73.6含有冷冻保护剂的鱼浆的pH 6.0凝胶前的pH 7.1凝胶的特性最终鱼浆凝胶的Mc(％) 74.1折叠试验 5应力(kpa) 56.1±2.4应变 1.6±0.1G 35.4±2.1L 66.5±0.3a -2.4±0.4b 8.1±0.9白度 65.5
实施例4：从机械分离去骨的鸡肉(MSDC)生产蛋白分离物
通过与实施例3相同的碱性方法从MSDC制备蛋白分离物。在pH5.5收集蛋白分离物。然后将蛋白分离物分为两批，向每批中加入2.5％的NaCl。调节一个样品的pH值为6.0，调节另一个样品的pH值为7.0。然后将物料灌注到肠衣中并于90℃水浴加热30分钟。取出物料，并在冰浴中冷却，并于测试之前在冰箱中存放过夜。也直接从MSDC制备凝胶作为对照。
比较蛋白分离物(通过本发明的所述方法制备的)和原始MSDC的凝胶特性。表5提供了结果。
表5蛋白分离物 pH 6.0蛋白分离物 pH 7.0 MSDC％原始脂(基于干重) -- -- 52.2％脂(基于干重) 9.1 9.5 41.7pH 6.18 7.03 6.66％水 78 79 64L值 54 52 48扭转试验应力(kPa) 78 -- 44应变 1.45 -- 1.45穿刺，凝胶强度，g.cm较短时间加热a 677 463 395较长时间加热a 842 517 255
a由于样品位置的不同而暴露于蒸煮温度较短或较长的时间。
用本发明的所述方法制备的蛋白分离物表现出持水性和凝胶强度得到改善。在pH 6制备的蛋白分离物含脂肪少的部分含有的水分比MSDC含脂肪少的部分的多28％(而且重21.1％)。所述蛋白分离物的脂含量也小于MSDC的脂含量。
实施例5：使用蛋白分离物作为功能成分，以及不同斩剁方法对凝胶质量的影响
考察使用由本发明的所述方法制备的蛋白分离物作为食品成分的影响。具体地说，用碱性提取的蛋白分离物代替鸡胸肌(chicken breastmuscle)维也纳小香肠中的鸡胸肉。还考察不同斩剁方法对于凝胶质量的影响。
蛋白分离物的制备。将4800ml水加到600g MSDC(1∶8 w/v)中。用polytron匀浆所得混合物2分钟，并去除混合物顶部的脂肪。然后调节pH至10.5。于10,000×g离心混合物30分钟。去除混合物顶部的中性脂肪和沉淀中的不溶性部分(主要包含凝胶原和骨残留物)。将上清液经过双层干酪包布过滤以截留脂肪球，并调节pH为5.5以沉淀蛋白。然后两次于10,000×g离心混合物30分钟。以相同的速度再次离心沉淀物30分钟以进一步减少含水量。
维也纳小香肠的制备。按照表6列出的配方制备包含0％、25％以及50％蛋白分离物(PI)的维也纳小香肠。
表6成分对照100％CBM 25％PI代替 50％PI代替CBM 124.13 93.09 62.06PI 0.00 31.03 62.06冰 12.41 12.41 12.41盐 2.89 2.89 2.89STP 0.49 0.49 0.49亚硝酸钠 0.02 0.02 0.02异抗坏血酸盐(Erythobate) 0.07 0.07 0.07脂肪(猪肉，30％) 60.00 60.00 60.00
斩剁方法。使用的斩剁方法如下：方法(a)：将包含所有成分的混合物斩剁2.5分钟；方法(b)：将包含除脂肪外所有成分的混合物斩剁1分钟，然后加入脂肪再进行斩剁(1.5分钟)；方法(c)：将包含除脂肪和蛋白分离物外所有成分的混合物斩剁1分钟，然后加入脂肪再进行斩剁(0.5分钟)，然后加入蛋白分离物再进行斩剁(1分钟)。在低于18℃的温度下，每斩剁30秒用手搅和。结果在下表中描述。
表7
蒸煮并冷却之后的水分损失百分比 蛋白组合物 斩剁方法 ％总脂肪损失 ％总水分损失 100％CBM a 没观察到 3.8±0.6 75％CBM+25％PI a 没观察到 4.5±0.7 75％CBM+25％PI b 没观察到 4.3±0.4 75％CBM+25％PI c 没观察到 4.5±0.3 50％CBM+50％PI a 没观察到 7.5±0.6
表8
凝胶制品的pH值 蛋白组合物 pH值 100％CBM 6.27 75％CBM+25％PI 6.21 75％CBM+25％PI 6.19 75％CBM+25％PI 6.20 50％CBM+50％PI 6.18
表9
扭转试验 蛋白组合物 应力 应变 100％CBM 81.1±4.9 1.68±0.02 75％CBM+25％PI 80.8±3.8 1.66±0.06 75％CBM+25％PI 97.5±10.7 1.78±1.72 75％CBM+25％PI 88.9±8.9 1.72±0.11 50％CBM+50％PI 76.22±9.9 1.46±0.11
表10
色度比较 蛋白组合物 L a b 100％CBM 78.44±0.45 4.7±0.68 10.43±0.64 75％CBM+25％PI 73.22±0.48 7.47±0.19 10.48±0.05 75％CBM+25％PI 73.72±0.35 7.43±0.17 10.59±0.17 75％CBM+25％PI 71.64±0.88 8.28±0.18 10.61±0.18 50％CBM+50％PI 70.03±0.54 7.29±0.14 10.16±0.10
观察到用蛋白分离物可以代替至少25％的鸡胸肉，而除了色度之外，没有任何显著的功能特性损失。
实施例6：碱性处理动物肌肉通过使脱氧血红蛋白失活而防止氧化
为了确定碱性溶解动物肌肉蛋白是否导致与膜质去除无关的优点，如Richards等人，J.Agric.Food Chem.48：3141-3147，2000所描述的方法制备洗净的鳕肌肉。然后将鲟鱼溶血产物加入到洗净的鳕样品中，以获得浓度为6μmol/kg的血红蛋白。在为所述样品建立了稳定的pH值后，将其于5℃存放15小时。温育结束时，如上面Richards等人所描述的方法量化硫代巴比土酸反应性物质(TBARS)(一种氧化产物的代用品)。图1总结了所得结果，表明在pH值大约为7或大于7时，血红蛋白依赖性氧化作用被减弱或消除了。在pH值低于7时，发现了显著的氧化作用。一般而言，TBAR值大于20mol/kg就表明强氧化作用。如上面Richards等人所描述，这种血红蛋白依赖的氧化作用减弱，与总血红蛋白中脱氧血红蛋白形式的比率减小相符。因此，结果提示，碱性处理动物肌肉，尤其是红色动物肌肉，阻止动物肌肉混合物中脱氧血红蛋白与生物分子反应和氧化生物分子，由此部分解释了这里所描述的本发明的优点。
实施例7：碱性处理动物肌肉通过至少两种机理提高了可食用且可胶凝蛋白的收率。
为了更好地理解这里所描述的高蛋白收率和优质凝胶的机理，如Kelleher等人“Functional chicken muscle isolates prepared using low ionicstrength，and solubilization/precipitation，”53rd Ann.Reciprocal MeatConf.，June 18-21，2000，Am.Meat.Sci.Assoc.，Savoy，II，第76-81页所描述，在盐酸(pH 2.6)中预处理鲱肌肉。采用相同的方法在碱(pH 10.7)中生产蛋白分离物，只是在这种情况下，采用氢氧化钠在碱性pH下溶解和温育。在冰上温育样品大约165分钟，然后在标准还原条件下，上样至4-20％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上。凝胶电泳和考马斯蓝染色，使得在大约205kDa处看到肌球蛋白重链蛋白条带。值得注意的是，在pH 2.6温育的鲱肌肉表现出肌球蛋白重链大大降解，而在pH 10.7温育的鲱肌肉中没有检测到肌球蛋白重链的损失。假设了碱性条件抑制负责肌球蛋白在更呈酸性的pH下水解的溶酶体蛋白酶(如组织蛋白酶)。
在第二个实验中，狭鳕肌肉蛋白如实施例1所描述的方法制备、在不同pH条件下溶解，并沉淀。沉淀后所回收的蛋白重量百分数在中性pH时为22.7％、在pH 11.0时为66.1％、在pH 3.0时为58.5％。注意到从pH 11.0的样品中回收的蛋白能够形成凝胶。这个结果部分引致了下面的假设。
鳕类鱼，如狭鳕、太平洋无须鳕和非洲鳕都是重要的食用鱼，并用于制备鱼浆。当冷冻鳕类鱼时，肉中一种酶——三甲胺氧化物脱甲基酶，将肉中的三甲胺氧化物分解为二甲胺和甲醛。所产生的甲醛接着使肌肉蛋白变性，因此使它们不溶性，甚至在碱性条件下也不溶性。相信所描述的碱性处理可以溶解某些经修饰的蛋白，因为在这种pH条件下蛋白带高负电荷。也可能是碱性处理可以至少部分逆转鱼蛋白与甲醛的反应，因此使鱼蛋白可溶。
该实施例的结果表明本发明的优点可以通过多于一种的机制实现。
其他实施方案
人们会理解，虽然已经结合本发明的详述描述了本发明，但前面描述的目的是说明而不限制本发明的范围，本发明的范围由权利要求书的范围所限定。其他方面、优点以及改良都在以下权利要求书的范围内。