抗内皮细胞素及其编码基因和制药用途 【技术领域】
本发明属于基因工程技术领域。涉及一种抗内皮细胞素(内皮细胞生长抑制剂)及其编码基因和在制备抗肿瘤血管生成的药物中的应用。
背景技术
传统的肿瘤治疗方法或药物主要都是针对肿瘤细胞的，往往具有较大的毒副作用。近年来的研究表明，血管生成旺盛是实体肿瘤组织得以迅速生长和转移的基础。通过抑制新生血管的形成，切断肿瘤的血液供应和营养供给则可以抑制肿瘤生长并诱导肿瘤内部细胞凋亡。
内皮细胞生长抑制剂是一种具有专一性抑制血管内皮细胞生长和诱导血管内皮细胞凋亡活性的蛋白类因子，通过抑制血管内皮细胞增殖而抑制血管生成。由于正常组织的血管内皮细胞是不再分裂增殖的，因而不受该药物的影响，这充分显示此类生物基因工程药物优于以往的抗癌药物，具有高度的选择性、特异性和极小的毒副作用。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种新的抗内皮细胞素(内皮细胞生长抑制剂)及其编码基因和在制备抗肿瘤血管生成的药物中的应用。
本发明的抗内皮细胞素是筛选自重组的人胶原蛋白IV(human collagen type IV)地一个活性内片段，即胶原蛋白IV的α2链NC1区1～89氨基酸序列的片段；其在还原型聚丙烯酰胺凝胶电泳上检测分子量约10千道尔顿。通过RT-PCR方法从人胎盘脐带组织总RNA中筛选得到其编码DNA，即人抗内皮细胞素cDNA，并通过基因工程方法，将抗内皮细胞素cDNA转入宿主细胞表达，再经蛋白纯化，即可得到上述有活性的重组人抗内皮细胞素蛋白。
本发明所提到的胶原蛋白IV的α2链的cDNA序列已在以下文献中公开：
Hostikka S L and Tryggvason K.The complete primary structure of the alpha 2 chain of human typeIV collagen and comparison with the alpha 1(IV)chain.J.Biol.Chem.263(36)，19488-19493(1988)
本发明的抗内皮细胞素的氨基酸序列如序列表序列<400>2所示。
该抗内皮细胞素可通过将其编码基因克隆至pET3c或pPIC9K等表达载体，再转化大肠杆菌或毕赤酵母菌等宿主细胞后，经IPTG或甲醇等诱导表达，再经蛋白纯化而得到。
本发明的抗内皮细胞素的编码基因的核苷酸序列如序列表序列<400>1所示。
该抗内皮细胞素编码基因可通过提取人胎盘脐带组织总RNA，用RT-PCR的方法，从脐带组织cDNA库中分离胶原蛋白IV的α2链NC1区cDNA，再用PCR筛选而得到。
经试验证明，本发明的抗内皮细胞素对脐静脉内皮细胞具有明显的专一性抑制生长和诱导细胞凋亡的活性。用鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制试验可检测到重组抗内皮细胞素的抑制血管生成活性。在接种黑色素瘤的小鼠肿瘤动物模型中，皮下注射重组抗内皮细胞素可检测到其对实体肿瘤的生长具有明显抑制作用。
因此，本发明的抗内皮细胞素可用于制备抑制血管内皮细胞增殖及诱导血管内皮细胞凋亡并能在体内抑制血管生成的药物；以及用于制备治疗实体肿瘤的药物。
【具体实施方式】
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1抗内皮细胞素基因的克隆
首先合成以下两条PCR引物：
P1.CCGAATTCCATATGGTCAGCATCGGCTACCTCCTGGTGA
EcoRI NdeI
P2：CCGGATCCGCGGCCGCTAGGGCAGCGGCGCAGTGGTAGAGA
BamHI NotI
以人胎盘脐带组织总RNA为模板，用RT-PCR方法扩增先得到胶原蛋白IV的α2链NC1区cDNA，再以此为模板，用PCR方法扩增得到其NC1区编码1～89个氨基酸序列的DNA即抗内皮细胞素基因cDNA。PCR反应条件如下：94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共进行30个循环。得到长度约300bp的PCR产物，用EcoRI和BamHI酶切后克隆至载体pSP72中，进行DNA序列测定，序列结果见序列表。
实施例2 抗内皮细胞素基因在大肠杆菌中的表达
用BamHI和NdeI双酶切含抗内皮细胞素基因的PCR扩增产物回收大小约300bp的目标片段与同样用BamHI和NdeI双酶切的pET-3c载体连接转化E.coli DH5α，筛选阳性克隆子pET-CN，再将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)，获得抗内皮细胞素表达菌。接种于LB培养基中37℃培养至OD600＝0.6加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃诱导表达8小时。经SDS-PAGE电泳检测，表达菌体总蛋白与宿主菌相比，在10千道尔顿的位置有一条明显的重组蛋白表达带。经凝胶光密度扫描分析，表达重组蛋白占菌体总蛋白的35.3％。菌体裂解获得包含体，经洗涤，变性，蛋白复性后，再经超滤浓缩，凝胶过滤层析得到纯化的重组抗内皮细胞素。
实施例3 抗内皮细胞素基因在毕赤酵母中的表达
用EcoRI和NotI双酶切含抗内皮细胞素基因的PCR扩增产物回收大小约300bp的目标片段与同样用EcoRI和NotI双酶切的pPIC9K载体连接转化E.coli DH5α，筛选阳性克隆质粒pPIC-CN，再将重组质粒线性化后转化毕赤酵母GS115，在含4mg/ml G418的YPD平板上筛选高拷贝整合的转化子。酵母转化子接种BMGY培养基培养至OD600＝2～6时，换成含甲醇的BMMY培养基诱导表达48小时。
表达蛋白分泌至培养基中，回收培养上清依次用离子交换层析、超滤、凝胶过滤等进行纯化，得到纯化的重组抗内皮细胞素。
实施例4 重组抗内皮细胞素对培养的脐静脉内皮细胞生长的抑制
在96孔培养板上进行测定，人脐静脉内皮细胞(ECV-304)的浓度为40000cells/mL，每孔加入0.1mL细胞悬液培养24h后更换新鲜培养液0.15mL。试验组中每孔各加入0.05mL的样品(本发明的重组抗内皮细胞素)，使样品终浓度分别为0.01mg/L、0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L，阴性对照孔加入等体积的PBS作用72h后各孔加入0.02mL噻唑蓝(MTT)溶液反应4h，每孔加入0.15mL的二甲亚砜(DMSO)，振荡10min，以655nm为参考波长于570nm处测定OD570值。抑制率CI＝(对照组OD570-样品组OD570)×100％÷对照组OD570，结果显示重组抗内皮细胞素在0.01mg/L浓度下就能显著抑制人脐静脉内皮细胞(ECV-304)的生长。其抑制率为55％，在0.01mg/L～40mg/L范围内最高抑制率为70.1％，表明重组抗内皮细胞素对人脐静脉内皮细胞的生长有显著的抑制作用。
实施例5 重组抗内皮细胞素诱导血管内皮细胞凋亡的作用
以样品浓度40mg/L为试验浓度，细胞的培养和样品作用时间同实施例4，样品作用结束后离心收集细胞，弃去培养液，PBS洗涤2次，加入冰预冷的70％的乙醇固定，检测时离心弃去固定液，PBS重悬400目的筛网过滤，离心弃去PBS后，用PI染液染色，4℃避光30分钟，上流式细胞仪检测。结果表明与阴性对照相比重组抗内皮细胞素作用于人脐静脉内皮细胞后诱导了细胞凋亡。凋亡率为97％，对照的为3.67％，效果极显著。
实施例6 重组抗内皮细胞素对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的抑制作用
孵化第6天的鸡胚，开窗后以定性滤纸为载体，加入体积为10μL的10μg、20μg、40μg各剂量组重组抗内皮细胞素，同时设置10μL的PBS阴性对照，每组5个鸡胚。继续孵育48 h后开窗观察。结果表明重组抗内皮细胞素在10μg剂量下能抑制鸡胚CAM新生血管形成，20μg剂量下能显著抑制鸡胚CAM新生血管生成，40μg剂量下能强烈地抑制鸡胚CAM新生血管生成，而PBS阴性对照组鸡胚CAM血管网茂盛。说明重组抗内皮细胞素具有抑制鸡胚CAM新生血管生成的活性。
实施例7 重组抗内皮细胞素对小鼠实体肿瘤生长的抑制作用
在BALB/c小鼠前右肢背部皮下按每只小鼠7.5×106 cells/mL×0.2mL的细胞量接种B16黑色素瘤细胞后，随机分成5组，每组5只。小鼠从接种细胞第二天开始，在接种细胞的周围部位试验组每天按10mg/kg的量注射体积为0.2mL的纯化重组抗内皮细胞素，对照组注射相同体积的PBS。连续注射15天，隔天称量各组小鼠体重。从对照组出现明显的B16黑色素瘤开始隔天测量肿瘤的体积。结束给药的次日处死小鼠，小心剥离小鼠皮下肿瘤组织并称重，按肿瘤的抑制率＝(对照组平均瘤重-试验组平均瘤重)×100％÷对照组平均瘤重，计算重组抗内皮细胞素对B16黑色素瘤的抑制率。结果表明与对照组相比给药组小鼠的体重略有降低，对照组在接种B16黑色素瘤细胞后第5天在接种部位就能看到明显的黑色肿块出现，并且生长迅速，在第15天时体积达到1679.06mm3。而给药组在接种B16黑色素瘤细胞后第6天才在个别小鼠的接种部位看到有黑色肿瘤的出现，并且生长缓慢，在第15天时体积只有1.04mm3。结束给药后剥离皮下肿瘤组织，以肿瘤的平均瘤重来计算，重组抗内皮细胞素对B16黑色素瘤的抑制率达93％。
序列表
<110>中山大学
<120>抗内皮细胞素及其编码基因和制药用途
<160>2
<210>1
<211>295
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(10)...(282)
<400>1
gaattccat atg gtc agc atc ggc tac ctc ctg gtg aag cac agc 45
Met Val Ser Ile Gly Tyr Leu Leu Val Lys His Ser
1 5 10
cag acg gac cag gag ccc atg tgc ccg gtg ggc atg aac aaa ctc 90
Gln Thr Asp Gln Glu Pro Met Cys Pro Val Gly Met Ash Lys Leu
15 20 25
tgg agt gga tac agc ctg ctg tac ttc gag ggc cag gag aag gcg 135
Trp Ser Gly Tyr Ser Leu Leu Tyr Phe Glu Gly Gln Glu Lys Ala
30 35 40
cac aac cag gac ctg ggg ctg gcg ggc tcc tgc ctg gcg cgg ttc 180
His Asn Gln Asp Leu Gly Leu Ala Gly Ser Cys Leu Ala Arg Phe
45 50 55
age acc atg ccc ttc ctg tac tgc aac cct ggt gat gtc tgc tac 225
Ser Thr Met Pro Phe Leu Tyr Cys Asn Pro Gly Asp Val Cys Tyr
60 65 70
tat gcc agc cgg aac gac aag tcc tac tgg ctc tct acc act gcg 270
Tyr Ala Ser Arg Asn Asp Lys Ser Tyr Trp Leu Ser Thr Thr Ala
75 80 85
ccg ctg ccc tag cggccgcgga tcc 295
Pro Leu Pro
90
<210>2
<211>90
<212>PRT
<213>人(Homo sapiens)
<400>2
Met Val Ser Ile Gly Tyr Leu Leu Val Lys His Ser Gln Thr Asp
1 5 10 15
Gln Glu Pro Met Cys Pro Val Gly Met Asn Lys Leu Trp Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Leu Leu Tyr Phe Glu Gly Gln Glu Lys Ala His Asn Gln
35 40 45
Asp Leu Gly Leu Ala Gly Ser Cys Leu Ala Arg Phe Ser Thr Met
50 55 60
Pro Phe Leu Tyr Cys Asn Pro Gly Asp Val Cys Tyr Tyr Ala Ser
65 70 75
Arg Asn Asp Lys Ser Tyr Trp Leu Ser Thr Thr Ala Pro Leu Pro
80 85 90