一种纤维素酶高效生产方法技术领域
本发明涉及发酵工程技术领域，具体涉及一种纤维素酶生产方法。
背景技术
纤维素酶来源广泛、成分复杂，广泛存在于昆虫体、软体动物体以及真菌、
细菌与放线菌等微生物的代谢产物中，主要生产途径是微生物发酵，其中以丝状
真菌和细菌纤维素酶应用最为广泛，目前主要还是利用真菌来发酵产纤维素酶。
在细菌中大多数好氧细菌和厌氧细菌都富含丰富的纤维素酶系，特别是瘤胃
中富含多种纤维素降解酶系的厌氧菌。世界纤维素市场中的纤维素酶有20％来自
木霉属和曲霉属。主要是由于丝状真菌具有产酶的诸多优点：①产生的纤维素酶
为胞外酶，便于酶的分离和提取；②产酶效率高，且产生纤维素酶的酶系结构较
为合理；③同时可产生许多半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等。纤维素酶是一个复
合酶系，酶系由三类功能不同但又互补的酶组成。这三类酶分别是内切葡聚糖酶
(EG，Cx酶，又称CMC酶)、外切葡聚糖酶(纤维二糖水解酶，CBH，C1酶)和β-
葡萄糖苷酶(BGL，纤维二糖酶)；大多数编码纤维素酶的基因是染色体基因。纤
维素酶系降解原理目前尚无定论，主要有三种作用机理：协同理论、碎片假说和
原初反应假说，其中以协同理论被大部分研究学者和专家所认可，其主要观点为
内切葡聚糖这类酶首先作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解
β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截断，产生大量非还原性末端。然后外切葡聚
糖酶逐个切下纤维素的非还原末端水解产生纤维二糖；而β-葡萄糖苷酶则水解纤
维二糖生成葡萄糖。三者缺一不可，协同作用，也只有在合适的比例和组成下，
才能共同作用快速实现纤维素的完全水解。
纤维素酶发酵过程容易受到碳水阻遏效应(CCR)对酶发酵合成的影响，即在
半纤维素和/或纤维素酶合成过程中，往往由于培养基中存在着葡萄糖、木糖等
单糖而通过碳水阻遏效应(CCR)抑制了酶的合成。目前常用选育方法消除部分
CCR效应，例如，周广麟等人先后研究了去泛素化蛋白酶基因creB缺失及转录
调控基因bglR缺失对生产菌株生长状态及形态、纤维素酶活力、纤维素酶性质
的影响。creB基因缺失突变株纤维素酶表达分泌抗葡萄糖代谢阻遏效应，菌株
的滤纸酶活、内切纤维素酶活、木聚糖酶活以及外切纤维素酶活分别提高1.8倍、
1.71倍、2.06倍以及2.04倍，其胞外蛋白质含量提高了2.68倍；而bglR基因
为转录调控因子的缺失，β葡萄糖苷酶酶活力得到大幅度提高，提高了40％，但
滤纸酶活、内切葡聚糖酶及木聚糖酶活明显降低。现有技术虽然取得了一定成效，
但如何解决纤维素酶发酵过程碳水阻遏效应(CCR)、提高纤维素生产能力，仍是
本领域技术人员面临的主要问题。
发明内容
为解决上述现有技术中存在的问题，发明人通过研究发现，草酸青霉发酵生
产纤维素酶的过程中，补料、DO、pH等发酵条件与纤维素酶表达量密切相关，
通过补料、DO、pH等工艺实现了纤维素的表达量和胞外蛋白的表达量的大幅度
增加；进一步的，通过研究发现，补料过程中，菌株的代谢与摄氧率极为相关，
通过OUR控制可以解除补料过程的碳阻遏效应，控制OUR维持在一定水平维
持菌株正常生长代谢来增强次级产物纤维素酶的产生，可以明显提高生产纤维素
酶的FPA、β葡萄糖苷酶活力和蛋白含量。
具体的，本发明提供了以下技术方案：
一种草酸青霉液态发酵生产纤维素酶的方法，其特征在于，控制整个发酵期
间pH维持在3.5～6.0之间，发酵中后期至发酵结束期间进行补料培养，期间控
制摄氧率(OUR)维持12(±5)～35(±5)mmol/L/h。
本领域技术人员应当明了草酸青霉发酵生产纤维素酶中进入发酵中后期的
时间，此时葡萄糖消耗，碳阻遏效应解除，纤维素酶开始合成，优选，发酵24h
至发酵结束期间进行补料培养。
优选的，补料培养过程中，OUR与溶氧、补料三者变量关系，溶氧与补料呈
协同互补关系，OUR与溶氧具有一定的比例关系，通过更换桨叶，调节搅拌转速
保持溶氧在15％以上。
优选的，补料培养期间控制摄氧率(OUR)维持15(±5)～30(±5)mmol/L/h。
优选的，发酵过程pH调节为：发酵开始pH调整为5.5—6.0，0-20hpH逐
渐下降，用氨水控制发酵培养基pH3.5以上，50-60h后pH回升至5.5-6.0后，
开始用磷酸调节pH至6.0以下；
优选的，发酵过程进行通气量控制，每分钟通气量：发酵体积≥1:1；
优选的，发酵过程调节溶氧，发酵起始溶氧调整至100％，发酵过程中通过
调节搅拌转速保持溶氧在15％以上；
优选的，整个发酵过程温度保持28～33℃；
更为优选的，将草酸青霉划线接种于麸皮培养基中28～32℃培养3-5天，待
长出粉红色的孢子后转接至新鲜麸皮培养基培养3天作为菌种。接0.2-20cm2菌
种接种于种子培养基中，28～32℃200rpm发酵24～48h，制备成一级种子，按照
5％～10％的接种量接种一级种子于种子培养基中，28～32℃200rpm培养30～42h
制成二级种子，然后将二级种子接种于产酶培养基进行产酶发酵。产酶发酵具体
参数控制如下：
(1)pH调节：发酵开始pH调整为5.5—6.0，0-20hpH逐渐下降，用氨水控制
发酵培养基pH3.5以上，50-60h后pH回升至5.5-6.0后，开始用磷酸调节pH至
6.0以下；
(2)通气量控制：每分钟通气量：发酵体积≥1:1；
(3)溶氧调节：发酵起始溶氧调整至100％，发酵过程中通过调节搅拌转速保持
溶氧在15％以上；
(4)温度调控：整个发酵过程温度保持28～33℃；
(5)OUR调节：
发酵开始，OUR随菌体浓度增加而逐渐升高，在该培养基条件下，在40h
左右达到最高值，约23-27mmol/L/h，维持约10～15h后，随着培养基中碳源和
氮源的耗尽，发酵开始出现碳氮源限制，反应速率开始下降，OUR开始降低，
在OUR出现明显下降后，约在下降4h(发酵时间约50h左右)，开始补加葡萄
糖、木糖或微晶纤维素，控制OUR至15(±5)—30(±5)mmol/L/h之间维
持100h，出现最高纤维素酶滤纸活力，胞外蛋白含量最大，此时停止发酵。
培养过程所用的培养基如下：
麸皮培养基：7～10％麸皮与适量的自来水中，煮沸30min，8层纱布过滤，再
用自来水定容到所需要的体积，加入1.5％的琼脂，配置成麸皮斜面培养基，用
于菌种活化与筛选。
种子培养基：1％木糖渣，1％麸皮，1％葡萄糖，1％蛋白胨，0.2％硫酸铵，
0.3％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，50mL于500mL三角瓶中，121℃灭菌20min。
产酶培养基：2～7％木糖渣，1～4％麸皮，0.2～1％微晶纤维素，0.5％豆饼粉，
0.2％硫酸铵，0.1％尿素，0.3％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，0.3％吐温80，121℃
灭菌30min。
采用质谱仪或尾气分析仪对发酵过程中的进气和尾气进行实时在线采集分
析，该质谱仪能够精确测定发酵过程尾气中的氢气、氮气、二氧化碳和氧气等分
子量300以内的可挥发性气体。使用之前用标准气体对仪器的响应度进行标定。
摄氧率(OUR)测定:
OUR的计算通过对发酵尾气的分析数据计算得到。以进气和尾气中惰性气
体N2维持恒定建立平衡方程,求得OUR的计算公式如下:
![]()
f
=
273
273
+
t
i
n
·
P
i
n
.
1
1
+
h
×
10
-
5
]]>
Fin：进气流量L/min；V：发酵液体积L；C惰in/CO2in/CCO2in：分别为进气中惰性
气体、氧气及二氧化碳的质量分率；CO2out/CCO2out：分别为排气中氧气和二氧
化碳的质量分率；Pin：进气的绝对压强Pa；tin：进气的温度℃；h：进气的相对
湿度(％)。
本发明的优点在于，
(1)通过维持菌株的最佳OUR值来实现菌株生长最佳的碳氮比，防止菌
体在发酵过程中出现营养饥饿现象而导致自噬现象，而导致蛋白含量偏低，酶活
力不高的现象。
(2)通过OUR来控制菌体整个生理状态与生长状态，形成了菌体生长、
纤维素酶产生和大规模生产的核心控制因素，可以数十倍放大、准确控制大规模
发酵。
(3)通过OUR来反应菌体生长需求，部分解除碳阻遏效应，大幅度提高
酶活力水平和蛋白水平。
附图说明
图1实施例1发酵结果
图2实施例2发酵结果
图3实施例3发酵结果
图4对比例1发酵结果
具体实施方式
实施例1：
种子培养基：1％木糖渣，1％麸皮，1％葡萄糖，1％蛋白胨，0.2％硫酸铵，
0.3％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，50mL于500mL三角瓶中，121℃灭菌20min。
产酶培养基：3％木糖渣，3％麸皮，0.2％微晶纤维素，0.5％豆饼粉，0.2％硫
酸铵，0.1％尿素，0.3％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，0.3％吐温80，121℃灭菌30min。
滤纸酶(FPA)酶活测定方法：发酵液8000rpm离心10min，取上清为粗酶液，
用于酶活力及蛋白含量测定。参照轻工业行业标准(QB2583-2003)进行测定，
取适当稀释的粗酶液0.5mL，以50mg(1cm×6cm)新华滤纸条为底物，加入pH4.8
醋酸缓冲液1.5mL和0.5mL，以不加底物为对照，50℃反应60min，取出，加入
3mlDNS溶液，沸水浴中保持10min，水浴冷却，定容至25ml，混匀，在540nm
处比色。
Bradford法测定蛋白含量：以牛血清白蛋白制作标准曲线，根据标准曲线计
算出粗酶液中的蛋白含量。
将草酸青霉JUA10-1划线接种于麸皮培养基中28～32℃培养7天，待长出粉
红色的孢子后转接至新鲜麸皮培养基培养5天作为菌种。接1cm2菌种接种于种
子培养基中，28～32℃200rpm发酵24～48h，制备成一级种子，按照5％～10％的
接种量接种一级种子于种子培养基中，28～32℃200rpm培养30～42h制成二级种
子，然后将二级种子接种于4L产酶培养基中，在5L保兴发酵罐中进行产酶发
酵，采用气相色谱质谱联用仪(型号GC-MS6800)进行尾气分析OUR、CER指
标。(OUR与CER指标基本一致，以OUR进行表征)。
(1)pH调节：发酵开始pH调整为5.5—6.0，发酵前期pH逐渐下降，用氨
水控制渣4.0以上，中后期pH回升用磷酸调节pH至5.5以下；(2)通气量控制：
每分钟通气量：发酵体积＝1:1；(3)溶氧调节：发酵起始溶氧调整至100％，发
酵过程中通过调节搅拌转速保持溶氧在30％以上；(4)温度调控：整个发酵过程
温度保持30℃；(5)发酵开始，OUR随菌体浓度增加而逐渐升高，在该培养基
条件下，在40h左右达到最高值，约23(±5)-27(±5)mmol/L/h，维持约10～15h
后，随着培养基中碳源和氮源的耗尽，发酵开始出现碳氮源限制，反应速率开始
下降，OUR开始降低，开始补加葡萄糖，维持OUR至20±5mmol/L/h，后期控
制17±5mmol/L/h维持100h。发酵结果：纤维素酶活力在发酵96h时，酶活力最
高，FPA约为9.3U/mL，β葡萄糖苷酶活力为10.1U/mL，蛋白含量为8.8mg/mL。
实施例2
种子培养基：1％木糖渣，1％麸皮，1％葡萄糖，1％蛋白胨，0.2％硫酸铵，
0.3％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，50mL于500mL三角瓶中，121℃灭菌20min。
产酶培养基：6％木糖渣，4％麸皮，0.2％微晶纤维素，0.5％豆饼粉，0.2％硫
酸铵，0.1％尿素，0.3％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，0.3％吐温80，121℃灭菌30min。
滤纸酶(FPA)酶活测定方法和Bradford法测定蛋白含量如上所述。
将草酸青霉JUA10-1划线接种于麸皮培养基中30℃培养5天，待长出粉红
色的孢子后转接至新鲜麸皮培养基培养5天作为菌种。接2cm2菌种接种于种子
培养基中，28～32℃200rpm发酵24～48h，制备成一级种子，按照5％～10％的接
种量接种一级种子于种子培养基中，28～32℃200rpm培养30～42h制成二级种子，
然后将二级种子接种于40L产酶培养基中，在50L保兴发酵罐中进行产酶发酵，
采用气相色谱质谱联用仪(型号GC-MS6800)进行尾气分析OUR、CER指标。
(1)pH调节：发酵开始pH调整为5.5—6.0，发酵前期pH逐渐下降，用氨
水控制渣4.0以上，中后期pH回升用磷酸调节pH至5.5以下；(2)通气量控制：
每分钟通气量：发酵体积＝1:1；(3)溶氧调节：发酵起始溶氧调整至100％，发
酵过程中通过调节搅拌转速保持溶氧在30％以上；(4)温度调控：整个发酵过程
温度保持30℃；(5)发酵开始，OUR随菌体浓度增加而逐渐升高，在该培养基
条件下，在60h左右达到最高值，约24±5mmol/L/h，维持约10～15h后，随着培
养基中碳源和氮源的耗尽，发酵开始出现碳氮源限制，反应速率开始下降，OUR
开始降低，开始补加葡萄糖母液，维持OUR至24±5mmol/L/h，后期控制27±5
mmol/L/h维持100h。发酵结果：纤维素酶活力在发酵96h时，酶活力最高，FPA
约为22.1U/mL，β葡萄糖苷酶活力为24.3U/mL蛋白含量为24.7mg/mL。
实施例3
种子培养基：1％木糖渣，1％麸皮，1％葡萄糖，1％蛋白胨，0.2％硫酸铵，
0.3％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，50mL于500mL三角瓶中，121℃灭菌20min。
产酶培养基：6％木糖渣，4％麸皮，0.2％微晶纤维素，0.5％豆饼粉，0.2％硫
酸铵，0.1％尿素，0.3％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，0.3％吐温80，121℃灭菌30min。
滤纸酶(FPA)酶活测定方法和Bradford法测定蛋白含量如上所述。
将草酸青霉JUA10-1划线接种于麸皮培养基中30℃培养5天，待长出粉红
色的孢子后转接至新鲜麸皮培养基培养5天作为菌种。接10cm2菌种接种于种子
培养基中，28～32℃200rpm发酵24～48h，制备成一级种子，按照5％的接种量接
种一级种子于种子培养基中，28～32℃200rpm培养30～42h制成二级种子，然后
将二级种子按5％的接种量接种于1.6t产酶培养基中，在2t发酵罐中进行产酶
发酵，采用气相色谱质谱联用仪(型号GC-MS6800)进行尾气分析OUR、CER
指标。
(1)pH调节：发酵开始pH调整为5.5，发酵前期pH逐渐下降，用氨水控
制pH在4.0以上，中后期pH回升用磷酸维持pH5.0-6.6之间；(2)通气量控制：
每分钟通气量：发酵体积＝1:1；(3)溶氧调节：发酵起始溶氧调整至100％，发
酵过程中通过调节搅拌转速保持溶氧在20％以上；(4)温度调控：整个发酵过程
温度保持30℃；(5)发酵开始，OUR随菌体浓度增加而逐渐升高，在该培养基
条件下，在60h左右达到最高值，约18±5mmol/L/h，维持约10～15h后，随着培
养基中碳源和氮源的耗尽，发酵开始出现碳氮源限制，反应速率开始下降，OUR
开始降低，开始补加葡萄糖母液，维持OUR至20±5mmol/L/h，后期控制20±5
mmol/L/h维持100h。发酵结果：纤维素酶活力在发酵96h时，酶活力最高，FPA
约为17.5U/mL，β葡萄糖苷酶活力为16.1U/mL蛋白含量为20.2mg/mL，见图3。
对比例1：
滤纸酶(FPA)酶活测定方法：发酵液8000rpm离心10min，取上清为粗酶液，
用于酶活力及蛋白含量测定。参照轻工业行业标准(QB2583-2003)进行测定，
取适当稀释的粗酶液0.5mL，以50mg(1cm×6cm)新华滤纸条为底物，加入pH4.8
醋酸缓冲液1.5mL和0.5mL，以不加底物为对照，50℃反应60min，取出，加入
3mlDNS溶液，沸水浴中保持10min，水浴冷却，定容至25ml，混匀，在540nm
处比色。
Bradford法测定蛋白含量：以牛血清白蛋白制作标准曲线，根据标准曲线计
算出粗酶液中的蛋白含量。
种子培养基：1％木糖渣，1％麸皮，1％葡萄糖，1％蛋白胨，0.2％硫酸铵，
0.3％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，50mL于500mL三角瓶中，121℃灭菌20min。
产酶培养基：3％木糖渣，3％麸皮，0.2％微晶纤维素，0.5％豆饼粉，0.2％硫
酸铵，0.1％尿素，0.3％磷酸二氢钾，0.05％硫酸镁，0.3％吐温80，121℃灭菌30min。
将草酸青霉JUA10-1划线接种于麸皮培养基中28～32℃培养6天，待长出粉
红色的孢子后转接至新鲜麸皮培养基培养3天作为菌种。接1cm2菌种接种于
50mL种子培养基中，28～32℃200rpm发酵24～48h，制备成一级种子，按照5％
的接种量接种一级种子于400mL种子培养基中，28～32℃200rpm培养42h制成
二级种子，然后将二级种子按照10％的接种量接种于4L产酶培养基中，在5L
保兴发酵罐中进行产酶发酵。
产酶发酵具体参数控制如下：pH发酵开始pH调整为5.5，发酵前期pH逐
渐下降，用氨水控制pH在4.0以上，中后期pH回升用磷酸维持pH5.0-6.6之间；
通气量为每分钟通气量：发酵体积为1:1，将发酵起始溶氧调整至100％，转速
控制在200rpm以上，按2g/L/h速率进行补料，发酵过程中通过调节搅拌转速保
持溶氧在20％以上，OUR不做控制，自然回落。整个发酵过程温度保持30℃，
发酵在96h达到最高酶活达6FPA/mL，β葡萄糖苷酶活力为3.1U/mL，蛋白含量
3.6mg/mL。溶氧、OUR与FPA之间关系如图4所示。
本发明通过试验其他生产纤维素酶草酸青霉菌株，具有相似的纤维素酶代谢
情况。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围
的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技
术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范
围以内。