一种脱细胞颌下腺基质材料及其制备方法.pdf

本发明公开了一种脱细胞颌下腺基质材料及其制备方法，其特点是选取健康的动物的颌下腺组织进行物理、化学和酶综合法处理，通过不同无机盐溶液浸泡在低温环境下处理制备,获得具有良好的生物相容性和适当的生物降解速率的脱细胞颌下腺基质材料。该材料可用于颌下腺再生修复以及颌下腺疾患的研究模型。其材料来源广泛、易得，价格低廉，制作容易。

1.  一种脱细胞颌下腺基质材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)选取健康的动物颌下腺组织切成小块，用PBS缓冲液清洗备用；
(2)将所述颌下腺组织块反复冻融3次；
(3)把颌下腺组织块置于75％酒精中消毒；
(4)将颌下腺组织块悬于入无菌三级水中，4℃中速搅拌处理6-12小时；
(5)将颌下腺组织块悬于5mM CaCl₂和5mM MgCl₂无菌溶液中，4℃中速搅拌处理12小时；
(6)将颌下腺组块织悬于1M NaCl无菌溶液中，4℃中速搅拌处理12小时；
(7)将颌下腺组织块悬于无菌PBS缓冲溶液中，4℃中速搅拌处理12小时，获得所述脱细胞颌下腺基质材料。

2.  根据权利要求1所述的脱细胞颌下腺基质材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中选取颌下腺组织为新鲜的无病毒感染的、无病史的动物颌下腺。

3.  根据权利要求1所述的脱细胞颌下腺基质材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中，将颌下腺组织切成的小块为1cm见方的小块。

4.  根据权利要求1所述的脱细胞颌下腺基质材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中，破碎细胞的方法为将组织块放入-80℃冰冻30分钟后取出，在37℃水浴解冻，如此反复冻融3次。

5.  根据权利要求1所述的脱细胞颌下腺基质材料的制备方法，其特征在于：所述脱细胞颌下腺基质材料可放置于含有90μg/ml氨苄的PBS中，4℃保存2个月以上。

6.  按照权利要求1～5任意一项的方法制备得到的脱细胞颌下腺基质材料。

一种脱细胞颌下腺基质材料及其制备方法
技术领域
本发属于及生物医用材料的加工领域，具体涉及一种脱细胞颌下腺基质材料及其制备方法。
背景技术
细胞外基质(extracellular matrix，ECM)是由细胞分泌到细胞外间充质中的蛋白质和多糖类大分子物质。ECM通过高度组织有序的细胞外微环境，构成复杂的网架连接组织结构，对细胞的生存、分化等细胞生理活动具有关键的调节作用。因此，可模拟ECM的支架基底和支架材料是组织工程研究和组织修复的理想载体。细胞与ECM的接触是动态的，ECM的变化将会导致邻近细胞形态和功能的改变。用于组织工程的理想支架材料需要为种植的细胞提供与体内ECM相同或者相似的微环境(包括ECM的组成、结构和生物力学特征等)。但是，天然的ECM是由多种蛋白质组成(主要分为胶原、糖蛋白、氨基聚糖及蛋白聚糖、弹性蛋白4大类)，并且具有复杂的结构，不易在体外重构与体内ECM组成相同和结构一致的ECM材料。通过不同化学、物理或酶学去细胞方法从组织和器官获得天然的ECM，为解决这一难题提供了新的有效解决途径。去细胞化基质具有组织或者细胞特异性的ECM蛋白质和微结构，同时具有良好的力学特性、细胞相容性以及生物降解性，有利于细胞粘附、生长、增殖及分化。
制备脱细胞基质材料的方法有很多，主要是通过物理、化学和生物酶综合处理的方法。中国专利申请号为201110134511.9的发明专利涉及制备一种脱细胞真皮基质材料的方法，虽然可以比较彻底地去除细胞而且处理时间短，但是制备过程中采用了十二烷基硫酸钠(SDS)的处理。由于SDS的强洗脱效果，很大程度上破坏了细胞基质的结构完整性和生物活性，此外使用SDS制备的细 胞外基质具有潜在的生物毒性，不利于该基质材料对组织的三维结构重建。中国专利申请号为201210237911.7的发明专利涉及制备一种细胞外基质支架材料的脱细胞方法。虽然采用了吡喃葡萄糖苷降低了去污剂在清洗过程中可能对再植细胞造成的潜在生物毒性，但主要应用于含较多胶原纤维和弹力纤维的组织和器官，应用到被膜较薄，主要由腺泡结构组成的颌下腺组织中并不完全适用，并且本发明无需核酸酶处理，成本更低，方法也更为简便。
发明内容
本发明的目的是为了克服以上技术的不足，采用健康的动物颌下腺组织为原料，应用复合酶处理剂和无机盐等化学物质，提供一种具有良好生物相容性和适当的生物降解速率的脱细胞颌下腺基质材料。
本发明的内容包括一种脱细胞颌下腺基质材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)选取健康的动物颌下腺组织，切成1厘米见方的小块，用PBS缓冲液清洗备用；
(2)将颌下腺组织块反复冻融3次，破碎细胞；
(3)把颌下腺组织块置于75％酒精中消毒；
(4)将颌下腺组织块悬于入无菌三级水中，4℃中速搅拌处理6-12小时；
(5)将颌下腺组织块悬于5mM CaCl₂和5mM MgCl₂无菌溶液中，4℃中速搅拌处理12小时；
(6)将颌下腺组块织悬于1M NaCl无菌溶液中，4℃中速搅拌处理12小时；
(7)将颌下腺组织块悬于无菌PBS缓冲溶液中，4℃中速搅拌处理12小时，获得所述脱细胞颌下腺基质材料。
进一步地，所述步骤(1)中选取组织为新鲜的无病毒感染的、无病史的动物颌下腺。
进一步地，所述步骤(1)中将颌下腺组织切成的小块为1cm见方的小块。 
进一步地，所述步骤(2)中，破碎细胞的方法为将组织块放入-80℃冰冻30分钟后取出，在37℃水浴解冻，如此反复冻融3次。
进一步地，所述脱细胞颌下腺基质材料可放置于含有90μg/ml氨苄的PBS中，4℃保存2个月以上。
本发明的内容还包括根据上述任意一项的方法制备获得的脱细胞颌下腺基质材料。
本发明的脱细胞颌下腺基质材料的制备方法中所有操作均在无菌超净工作台中进行。
采用本发明的方法所制备的脱细胞颌下腺基质材料，能够满足以下医学应用和医学研究的要求：
1、作为颌下腺的替代品，用于手术后颌下腺损伤和缺失的修复。
2、可作为细胞培养和组织工程体外模型材料，如用于颌下腺再生和颌下腺发育研究等。
本发明的方法和产品具有以下优点：
1、在维持动物颌下腺三维组织构造不变的前提下，彻底清除了动物颌下腺中的细胞成分，得到具有完整的三维组织构造的颌下腺基质。
2、具有良好的力学性能、可赋形性、良好的细胞分化增殖环境以及良好的粘附性能；
3、方法简便、易行，经济、合理、安全、可靠。
4、整个工艺过程属于清洁化制备，对环境无污染。
附图说明
图1a为含有细胞的新鲜小鼠颌下腺组织的HE染色显微镜照片(×200)， 图1b为经脱细胞处理后的小鼠颌下腺细胞外基质材料的HE染色显微镜照片(×200)。
图2a为含有细胞的新鲜小鼠颌下腺组织的扫描电子显微镜照片，图2b为经脱细胞处理后的小鼠颌下腺细胞外基质材料的扫描电子显微镜照片。
图3为新鲜小鼠颌下腺组织DNA含量和脱细胞处理后小鼠颌下腺细胞外基质材料中的DNA含量柱状图。
图4a为含有细胞的新鲜小鼠颌下腺组织的Collagen Ⅰ免疫组化结果，图4b为经脱细胞处理后的小鼠颌下腺细胞外基质材料的Collagen Ⅰ免疫组化结果。
图5a为含有细胞的新鲜小鼠颌下腺组织的CollagenⅣ免疫组化结果，图5b为经脱细胞处理后的小鼠颌下腺细胞外基质材料的CollagenⅣ免疫组化结果。
图6a为含有细胞的新鲜小鼠颌下腺组织的Fibronectin免疫组化结果，图6b为经脱细胞处理后的小鼠颌下腺细胞外基质材料的Fibronectin免疫组化结果。
图7a为含有细胞的新鲜小鼠颌下腺组织的Laminin免疫组化结果，图7b为经脱细胞处理后的小鼠颌下腺细胞外基质材料的Laminin免疫组化结果。
图8a为含有细胞的新鲜大鼠颌下腺组织的HE染色显微镜照片，图8b为经脱细胞处理后的大鼠颌下腺细胞外基质材料的HE染色显微镜照片。
图9为经脱细胞处理后的大鼠颌下腺脱细胞外基质的扫描电子显微镜照片。
图10为新鲜大鼠颌下腺组织DNA含量和脱细胞处理后大鼠颌下腺脱细胞外基质材料中的DNA含量柱状图。
图11a和图11b为小鼠颌下腺ECM材料在注射小鼠颌下腺原代细胞培养30天后的HE染色显微镜照片。其中图11b为(×200)。
图12a和图12b为利用Matrigel作为基质模型诱导颌下腺干细胞分化，14天后的HE染色显微镜照片。其中图12a为(×100)，图12b为(×200)。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述。
实施例1小鼠颌下腺ECM的制作
(1)取材：选取健康的小鼠的颌下腺组织，切成1厘米见方的小块，用PBS清洗两遍。至于EP管中-80℃冰箱备用。 
(2)破碎细胞：将组织块从-80℃冰箱取出在37℃水浴锅解冻后再放回-80℃冰箱冰冻30分钟，如此反复冻融3次。
(3)消毒和准备：把组织块至于75％的酒精中，用缝合线将颌下腺组织块吊起，悬挂于250ml的广口瓶中，并在瓶底放置一枚1cm的磁力搅拌棒。
(4)预清洗和破碎：加入250ml的无菌三级水，至于磁力搅拌器上(档位2)4℃处理6小时。
(5)清洗并增强核酸酶酶活：将颌下腺组织换到装有250ml5mM CaCl₂和5mM MgCl₂无菌溶液的小型搅拌循环器中。4℃处理12小时。
(6)清洗细胞残片：将颌下腺组织换到装有250ml 1M NaCl无菌溶液的小型搅拌循环器中。4℃处理12小时。
(7)清洗：将颌下腺组织换到装有250ml无菌PBS缓冲溶液的小型搅拌循环器中，4℃处理12小时。
结果评价
1、ECM结构观察：ECM用10％中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋、切成0.5μm厚的薄片，经脱蜡脱水，苏木素-伊红(HE)染色，观察ECM结构，其HE染色显微镜照片见图1b，同时制作新鲜小鼠颌下腺组织的HE染色，其显微镜照片见图1a。可见用本发明方法制备的小鼠ECM结构，证实无细胞结构残 留，并且细胞外基质结构保持完整。
2、ECM超微结构观察：将ECM组织用临界点干燥仪干燥，镀金，扫描电子显微镜观察，拍摄电子显微镜照片见图2b，同时拍摄新鲜小鼠颌下腺组织电子微镜照片见图2a。对比两图可见用本发明方法制备的小鼠颌下腺ECM结构，可以完整地脱去细胞结构，并且比较完好地保留了细胞外基质结构的纤维结构。
3、ECM中DNA含量检测：将ECM组织磨碎后，用DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN)裂解消化提取DNA，并用Nano-drop(Thermo)测定DNA含量，并与新鲜小鼠颌下腺组织DNA含量进行对比，结果见图3。可见用本发明方法制得的小鼠ECM中，DNA含量减少了98.75％，表明成功去除了绝大部分核酸残留。
4、ECM中CollagenⅠ蛋白的免疫组化检测：ECM用10％中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋、切成0.5μm厚的薄片，经脱蜡脱水，去过氧化物酶，抗原修复，山羊血清封闭，孵育Collagen Ⅰ抗体(稀释比例1:500)(abcam)4℃过夜，孵育二抗室温1小时，DAB显色，封片观察，拍摄显微镜照片如图4b所示；同时拍摄新鲜小鼠颌下腺组织的Collagen Ⅰ免疫组化显微镜照片4a作为对照。可见本发明制备的ECM材料较正常颌下腺的免疫组化结果着色更深，并且分布广泛，表明保留了Collagen Ⅰ蛋白。
5、ECM中CollagenⅣ蛋白的免疫组化检测：ECM用10％中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋、切成0.5μm厚的薄片，经脱蜡脱水，去过氧化物酶，抗原修复，山羊血清封闭，孵育CollagenⅣ抗体(稀释比例1:300)(abcam)4℃过夜，二抗室温孵育1小时，DAB显色，封片观察拍摄显微镜照片如图5b所示；同时拍摄新鲜小鼠颌下腺组织的CollagenⅣ免疫组化显微镜照片5a作为对照。可见本发明制备的ECM材料较正常颌下腺的免疫组化结果着色更深，并且分布 广泛，表明保留了CollagenⅣ蛋白。
6、ECM中laminin蛋白的免疫组化检测：ECM用10％中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋、切成0.5μm厚的薄片，经脱蜡脱水，去过氧化物酶，抗原修复，山羊血清封闭，孵育laminin抗体(稀释比例1:200)(abcam)4℃过夜，二抗室温孵育1小时，DAB显色，封片观察，拍摄显微镜照片如图6b所示；同时拍摄新鲜小鼠颌下腺组织的Laminin免疫组化显微镜照片6a作为对照。可见本发明制备的ECM材料较正常颌下腺的免疫组化结果着色更深，并且分布广泛，表明保留了Laminin蛋白。
7、ECM中fibronectin蛋白的免疫组化检测：ECM用10％中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋、切成0.5μm厚的薄片，经脱蜡脱水，去过氧化物酶，抗原修复，山羊血清封闭，孵育fibronectin抗体(稀释比例1:250)(abcam)4℃过夜，二抗室温孵育1小时，DAB显色，封片观察，拍摄显微镜照片如图7b所示；同时拍摄新鲜小鼠颌下腺组织的fibronectin免疫组化显微镜照片7a作为对照。可见本发明制备的ECM材料较正常颌下腺的免疫组化结果着色更深，并且分布广泛，表明保留了fibronectin蛋白。
实施例2,大鼠颌下腺ECM的制作
(1)取材：选取健康的大鼠的颌下腺组织，分解为一厘米见方的小块，用PBS清洗两遍。至于EP管中-80℃冰箱备用。
(2)破碎细胞：将组织块从-80℃冰箱取出在37℃水浴锅解冻后再放回-80℃冰箱冰冻30分钟，如此反复冻融3次。
(3)消毒和准备：把组织块至于75％的酒精中，用缝合线将颌下腺组织块吊起，悬挂于250ml的广口瓶中，并在瓶底放置一枚1cm的磁力搅拌棒。
(4)预清洗和破碎：加入250ml的无菌三级水，至于磁力搅拌器上(档位2) 4℃处理12小时。
(5)清洗并增强核酸酶酶活：将颌下腺组织换到装有250ml5mM CaCl₂和5mM MgCl₂无菌溶液的小型搅拌循环器中。4℃处理12小时。
(6)清洗细胞残片：将颌下腺组织换到装有250ml1M NaCl无菌溶液的小型搅拌循环器中。4℃处理12小时。
(7)清洗：将颌下腺组织换到装有250ml无菌PBS缓冲溶液的小型搅拌循环器中，4℃处理12小时。
结果评价
1、ECM结构观察：ECM用10％中性福尔马林固定、脱水、石蜡包埋、切成0.5μm厚的薄片，经脱蜡脱水，HE染色，观察ECM结构其HE染色显微镜照片见图8b，同时制作新鲜大鼠颌下腺组织的HE染色，其显微镜照片见图8a。可见用本发明方法制备的大鼠ECM结构中无细胞结构残留，并且细胞外基质结构保持完整。
2、ECM超微结构观察：将ECM组织用临界点干燥仪干燥，镀金，扫描电子显微镜观察，见图9。可见用本发明方法制备的大鼠颌下腺ECM结构，去除了原有颌下腺组织中的细胞结构，并且比较完好地保留了细胞外基质结构的纤维结构。
3、ECM中DNA含量检测：将ECM组织磨碎后，用DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN)裂解消化提取DNA，并用Nano-adrop(Thermo)测定DNA含量，并与新鲜大鼠颌下腺组织DNA含量进行对比，结果见图10。可见用本发明方法制得的大鼠ECM中，DNA含量减少99.46％，表明成功去除了绝大部分核酸残留。
实施例3,小鼠颌下腺ECM在颌下腺组织重构研究的应用
(1)准备细胞：取两只C57小鼠唾液腺用75％乙醇浸泡15s，预冷的1×PBS漂洗两次，剪碎为2mm³大小的碎片。加入3ml dispase37℃水浴锅消化60min。用预冷的1×PBS漂洗2次(1000rpm离心4min,加入10ml1×PBS4℃搅动10min)。用40um滤膜过滤收集颌下腺细胞。
(2)注射细胞：在超净工作台中用无菌的大头针将实施例1制得的小鼠颌下腺ECM固定在新制蜡板上。用酒精灯将巴氏管拉取口径大约为100μm左右的玻璃针，吸取步骤(1)中分离的颌下腺原代细胞注入颌下腺ECM组织中。
(2)培养：将注入颌下腺原代细胞的颌下腺ECM组织放至于盛有1ml颌下腺诱导分化培养液的24孔细胞培养板的一个孔中，将培养板放于37℃的CO₂培养箱，定期换液，培养30天。
(3)组织固定：将培养后的颌下腺ECM组织至于10％中性福尔马林中，固定48小时。
(4)制片：将固定的ECM组织用PBS缓冲液洗5分钟，经自动脱水机脱水、石蜡包埋、石蜡切片、切成5μm的薄片，烘片过夜，4℃保存。
(5)HE染色：将组织切片用二甲苯脱蜡，酒精梯度复水后用苏木素染色5分钟，伊红染色1分钟，酒精梯度脱水，二甲苯透化，中性树脂封片观察。
在此补充利用Matrigel诱导功能性颌下腺重构的方法，用于与颌下腺ECM材料在颌下腺重构中的作用作对照。
(1)准备细胞：取两只C57小鼠唾液腺用75％乙醇浸泡15s，预冷的1×PBS漂洗两次，剪碎为2mm³大小的碎片。加入3ml dispase37℃水浴锅消化60min。用预冷的1×PBS漂洗2次(1000rpm离心4min,加入10ml1×PBS4℃搅动10min)。用40um滤膜过滤收集颌下腺细胞。
(2)Matrigel中培养：细胞计数，将颌下腺细胞与Matrigel按1×10⁴Cell/50ul  Matrigel的比例均匀混合后，种入96孔板中。每孔加入100ul颌下腺诱导分化培养液。将培养板放于37℃的CO₂培养箱，定期换液，培养14天。
(3)组织固定：将培养后的颌下腺重构模型至于10％中性福尔马林中，固定48小时。
(4)制片：将固定的颌下腺重构模型用PBS缓冲液洗5分钟，经自动脱水机脱水、石蜡包埋、石蜡切片、切成5μm的薄片，烘片过夜，4℃保存。
(5)HE染色：将组织切片用二甲苯脱蜡，酒精梯度复水后用苏木素染色5分钟，伊红染色1分钟，酒精梯度脱水，二甲苯透化，中性树脂封片观察。
结果评价
小鼠颌下腺ECM材料在注射颌下腺原代细胞诱导培养后的HE染色显微镜照片，如图11a和图12b所示(12b为11a的放大图)。在图中可以看出本发明制备的小鼠颌下腺ECM材料中的颌下腺细胞具有良好的增殖能力并以5～8个细胞为一组围绕形成腺泡样结构。而在利用Marigel构建的颌下腺重构模型(图12a和图12b)中，经过诱导分化，颌下腺细胞呈较为致密或疏散团状结构聚集存在，，在基质模型中受到外力挤压没有表现出良好的迁移能力，也没有形成在颌下腺ECM材料中腺泡样的结构。
以上实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明内容作出一些非本质的改进和调整。