一种道古霉素关键中间体 A40926 B0 组分的纯化制备方法 【技术领域】
本发明涉及道古霉素 (dalbavancin) 关键中间体 A40926 B0 组分的纯化制备方法， 即可用于道古霉素合成的、 色谱纯度大于 97％的 A40926 B0 组分的制备方法。背景技术
道古霉素 (Dalbavancin) 是第二代新型半合成糖肽类抗生素， 其结构与万古霉 素、 替考拉宁相似， 用于革兰氏阳性病原菌引起的严重系统组织感染。 道古霉素是由放线菌 次级代谢产物 A40926 的 B0 组分经过结构修饰而得， 在体内外较万古霉素和替考拉宁具有 更广泛的抗菌谱， 对包括葡萄球菌、 链球菌、 肠球菌以及甲氧西林耐药菌株在内的所有凝固 酶阴性葡萄球菌 (coagulase-negative stapHycoccus， CoNS) 均有效， 且活性明显优于万古 霉素和替考拉宁， 尤为适用于治疗由耐 MRSA、 CoNS 以及链球菌 (streptococcus)， 包括耐青 霉素的肺炎球菌等革兰氏阳性菌引起的严重感染。 动物实验及国外的一些临床实验研究结 果表明 ： 道古霉素在高于治疗剂量数倍的静脉给药中显示出良好的耐受性， 且道古霉素在 体内呈现良好的药物动力学特征， 有高而持久的血药浓度， 成为唯一可隔周给药的注射抗 生素。
从 A40926 B0 组分出发， 经酯化、 酰胺化、 水解， 最后才能得到道古霉素， 因此制备 高纯度 A40926 B0 组分是道古霉素合成的关键。道古霉素关键中间体 A40926 B0 组分为放 线菌的次级代谢产物， 是通过微生物发酵获得的。由于微生物发酵产物成分复杂， 再加上 A40926 B0 组分结构复杂， 对热、 酸稳定性差等特点， 因此， 制备高纯度 A40926 B0 组分难度 非常大， 同时， 这也是道古霉素制备工艺的关键所在， 目前尚无 A40926 B0 组分制备相关的 文献报道。
A40926 B0 组分的结构式如下 ：
R1 ： -(CH2)8CH(CH3)2M： α-D-mannopyranosyl发明内容
本发明的主要目的是为了解决道古霉素关键中间体 A40926 B0 组分纯化问题， 并 提供用于制备道古霉素的高纯度 A40926 B0 组分 ( 色谱纯度大于 97％ )。
为了达到上述目的， 本发明提供了一种高纯度道古霉素关键中间体 A40926B0 组分 的制备方法， 该方法包括以下步骤 ：
步骤一 ： 将粗品进行凝胶层析、 大孔吸附分离以得到 A40926 B0 组分的半纯品。
步骤二 ： 将上述 A40926 半纯品进行反相柱层析， 减压浓缩， 可得高纯度 A40926 B0 组分， 其色谱纯度可达 97％以上。
根据本发明， 凝胶层析采用葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶进行层析。
根据本发明， 大孔吸附分离采用平均孔径为 70 ～ 100 埃的多孔性吸附树脂 D140、 D141 进行分离。
根据本发明， 反相柱为 C8 或 C18 柱， 其柱料的粒径为 20 ～ 50μm。
根据本发明， 所述反相柱层析上样方法为 ： 用 5％左右的乙醇溶液溶解样品， 溶解 后样品的浓度为 5g/L 左右， 然后再加入分析纯的氯化钠， 使氯化钠的浓度为 5％左右， 然后 用 1N 氢氧化钠调节 pH 至 7.5 ～ 8.5， 然后上样。 根据本发明， 反相层析柱在上样前先用 5％的乙醇溶液平衡柱子， 上样后用 10％ 乙醇加 5％氯化钠的水溶液冲洗柱子， 冲洗 3 ～ 8 个柱体积。
根据本发明， 反相柱层析的解析剂为 10 ～ 15％乙醇溶液。
根据本发明， 减压浓缩温度为 45 ～ 70℃， 典型的浓缩温度为 55 ～ 60℃。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行更进一步详细说明， 但不是对本发明的限定。 另外， 除非另有说明， 在本说明书中， 一般操作均是在室温条件下进行的， 室温是指 5-30℃。
实施例 1
将 15g A40926 粗品溶解于 200ml 碳酸钠∶碳酸氢钠＝ 0.05M ∶ 0.01M 的缓冲溶 液中， 过滤得 200ml 滤液， 对该滤液进行 HPLC 分析， A40926B0 组分的含量为 8.47g， 该滤液 pH 值为 9.2， 把上述滤液以 0.2BV/hr 的流速滴在填充了 200mlsepharose-6B 凝胶的柱上 (φ3mm×30mm)， 再分别以 4BV 的碳酸钠∶碳酸氢钠＝ 0.05M ∶ 0.01M 的缓冲溶液、 4BV 含 1％三羟甲基氨基甲烷的上述缓冲液以 2BV/hr 的流速进行预洗， 最后用含 1％三羟甲基氨 基甲烷的上述缓冲液以 2BV/hr 的流速洗脱。得 A40926 粗品洗脱液 400ml， 经高效液相分 析， 洗脱液中 A40926 B0 组分峰面积占总面积的 82.7％， 得到高纯度粗提物 7.51g， 回收率 为 88.7％。
实施例 2
将 15g A40926 粗品溶解于 200ml 碳酸钠∶碳酸氢钠＝ 0.05M ∶ 0.01M 的缓冲溶 液中， 过滤得 200ml 滤液， 对该滤液进行 HPLC 分析， A40926 B0 组分的含量为 8.47g， 该滤液 pH 值为 9.2， 把上述滤液以 0.2BV/hr 的流速滴在填充了 200ml 葡聚糖凝胶 G-25 的柱上， 再 分别以 4BV 的碳酸钠∶碳酸氢钠＝ 0.05M ∶ 0.01M 的缓冲溶液、 4BV 含 1％三羟甲基氨基甲烷的上述缓冲液以 2BV/hr 的流速进行预洗， 最后用含 1％三羟甲基氨基甲烷的上述缓冲液 以 2BV/hr 的流速洗脱。 得 A40926 粗品洗脱液 500ml， 经高效液相分析， 洗脱液中 A40926 B0 组分峰面积占总面积的 81.4％， 得到高纯度粗提物 7.58g， 回收率为 89.5％。
实施例 3
将实施例 1 中经凝胶层析得到的工艺液， 调 pH 至 7.0， 通过大孔树脂 D141( 平均孔 径 80 埃 )， 用 4BV pH ＝ 3 的盐酸溶液， 流速为 2BV/hr 洗涤该树脂柱， 再用 4BV 10％的乙醇 溶液以流速为 2BV/hr 洗涤， 然后用 60％乙醇溶液以 1BV/hr 的流速洗脱， 得到 320ml 洗脱 液， 溶出液中 B0 组分的峰面积为总峰面积的 87.7％， 回收了 A40926 B0 组分 6.85g， 回收率 为 91.2％， 55 ～ 60℃减压浓缩， 得 A40926B0 组分的半纯品 7.8g。
实施例 4
将实施例 2 中经凝胶层析得到的工艺液， 调 pH 至 7.0， 通过大孔树脂 D140( 平均孔 径 100 埃 )， 用 4BV pH ＝ 3 的盐酸溶液， 流速为 2BV/hr 洗涤该树脂柱， 再用 4BV 10％的乙 醇溶液以流速为 2BV/hr 洗涤， 然后用 60％乙醇溶液以 1BV/hr 的流速洗脱， 得到 320ml 洗脱 液， 溶出液中 B0 组分的峰面积为总峰面积的 87.1％， 回收了 A40926 B0 组分 6.93g， 回收率 为 91.4％， 55 ～ 60℃减压浓缩， 得 A40926B0 组分的半纯品 7.95g。
实施例 5
将实施例 3 中的 A40926 B0 组分半纯品用 1000ml 5％的乙醇溶液溶解样品， 向样 品溶液再加入分析纯的氯化钠 5g， 用 1N 氢氧化钠调节 pH 至 7.5， 然后上反相柱。
C18 反 相 柱 柱 料 ( 日 本 富 士 公 司 ) 规 格 ： Lot.No ： R050517 ； Pro.No ： SMB100 ～ 20/45 ； Size ： 20 ～ 45μm。
量取 C18 反相柱料 600ml， 用 5％乙醇溶液装柱并平衡柱子。上样完毕， 用 10％乙 醇加 5％氯化钠的水溶液冲洗柱子 3000ml， 用 10％乙醇溶液解析， 洗脱 7000ml 后开始收集， 总计收集 7000ml 后停止收集， 合并收集液， 55 ～ 60℃减压浓缩， 得 A40926 B0 组分高纯品 4.8g， HPLC 纯度 97.66％， 收率 68.4％。
实施例 6
将实施例 4 中的 A40926 B0 组分半纯品用 1000ml 5％的乙醇溶液溶解样品， 向样 品溶液再加入分析纯的氯化钠 5g， 用 1N 氢氧化钠调节 pH 至 8.0， 然后上反相柱。
C18 反 相 柱 柱 料 ( 日 本 富 士 公 司 ) 规 格 ： Lot.No ： R050517 ； Pro.No ： SMB100 ～ 20/45 ； Size ： 20 ～ 45μm。
量取 C18 反相柱料 600ml， 用 5％乙醇溶液装柱并平衡柱子。上样完毕， 用 10％乙 醇加 5％氯化钠的水溶液冲洗柱子 3000ml， 用 12％乙醇溶液解析， 洗脱 6000ml 后开始收集， 总计收集 5500ml 后停止收集， 合并收集液， 55 ～ 60℃减压浓缩， 得 A40926 B0 组分高纯品 4.71g， HPLC 纯度 97.35％， 收率 66.2％。
实施例 7
将按实施例 4 方法制备的 A40926 B0 组分半纯品用 1000ml 5％的乙醇溶液溶解样 品， 向样品溶液再加入分析纯的氯化钠 5g， 用 1N 氢氧化钠调节 pH 至 8.5， 然后上反相柱。
C18 反 相 柱 柱 料 ( 日 本 富 士 公 司 ) 规 格 ： Lot.No ： R050517 ； Pro.No ： SMB100 ～ 20/45 ； Size ： 20 ～ 45μm。
量取 C18 反相柱料 600ml， 用 5％乙醇溶液装柱并平衡柱子。上样完毕， 用 10％乙醇加 5％氯化钠的水溶液冲洗柱子 3000ml， 用 15％乙醇溶液解析， 洗脱 3000ml 后开始收集， 总计收集 3800ml 后停止收集， 合并收集液， 55 ～ 60℃减压浓缩， 得 A40926 B0 组分高纯品 的 HPLC 纯度为 97.26％， 收率 69.1％。6