用于乙醇生产的可利用木糖的发酵单胞菌的木糖醇合成突变体.pdf

用于乙醇生产的可利用木糖的发酵单胞菌的木糖醇合成突 变体
    本申请要求于 2006 年 9 月 28 日申请的美国临时申请 No.60/847813 的权益， 其全 部内容作为本申请的一部分并入本申请中， 用于所有的目的。
     政府权利声明
     本发明是在美国政府支持下完成的， 由能源部授予的合同号为 04-03-CA-70224 和 DE-FC36-03GO13146。政府在本发明中享有某些权利。
     发明领域 本发明涉及微生物及基因工程领域。更具体地， 开发了一株对葡萄糖 - 果糖氧化 还原酶基因进行了遗传修饰的、 可利用木糖的发酵单胞菌。该菌株在发酵及乙醇生产期间 木糖代谢中的有害的副产物——木糖醇的产量降低了。
     发明背景
     通过微生物来生产乙醇可为化石燃料提供替代的能源来源， 因而是目前研究中 的一个重要领域。运动发酵单胞菌是一种可生长在葡萄糖、 果糖、 及蔗糖上、 通过恩杜糖 解途径将这些糖类代谢为 CO2 和乙醇的产乙醇细菌。尽管野生型菌株不能以木糖为碳源， 但已构造了可生长在这种糖上的重组运动发酵单胞菌菌株 (US 5514583， US5712133， WO 95/28476， Feldmann et al.(1992)Appl MicrobiolBiotechnol 38 ： 354-361， Zhang et al.(1995)Science 267 ： 240-243)。
     木糖是可水解的木质纤维素原料中主要的戊糖， 因此可在发酵中提供充足的、 低 廉的可用碳源。已对运动发酵单胞菌改造使其表达木糖代谢所需的四种酶 ： 1) 木糖异构 酶， 催化木糖向木酮糖的转化 ； 2) 木酮糖激酶， 将木酮糖磷酸化形成木酮糖 5- 磷酸 ； 3) 转 酮 醇 酶 及 4) 转 醛 醇 酶 (US 5514583， US 6566107 ； Zhang et al.(1995)Science267 ： 240-243)。通过这四种酶的联合作用以及细胞正常的代谢机制， 三分子的木糖被转化为二 分子的葡萄糖 6- 磷酸及一分子的甘油醛 3- 磷酸， 随后在葡萄糖一侧的途径中被转化为乙 醇和 CO2( 参见图 1)。
     尽管已经成功构建了用于木糖代谢的运动发酵单胞菌菌株， 但这些菌株不能如利 用葡萄糖那样， 利用木糖生长并产生乙醇。导致利用木糖生长不良的一个因素是产生了 作为木糖代谢副产物的木糖醇 (Feldmann et al. 同上 ； Kim et al.(2000)Applied and EnvironmentalMicrobiology 66 ： 186-193)。 木糖醇通过木酮糖激酶被磷酸化， 产生木糖醇 5- 磷酸， 它在细胞中累积并抑制细菌生长。 木糖醇的合成也降低了乙醇产量， 因为可利用木 糖的重组运动发酵单胞菌菌株不能将木糖醇转化为乙醇。此外， 木糖醇也是木糖异构酶的 255-261)， 该酶可催化工程菌木糖代谢途 潜在抑制剂 (Smith etal.(1991)Biochem J.277 ： 径中利用木糖的第一个步骤。参见图 2 表示木糖醇合成及作用的图表。
     尚未确定在体内与木糖醇合成有关的生理途径及酶。不过， 已表明来自野生型 运动发酵单胞菌的无细胞提取物在添加了 NADPH 时可还原木糖生成木糖醇 (Feldmann et al.， 同上 )， 并且该反应是由 NADPH 依赖的醛糖还原酶来催化的。也表明了运动发酵
     单胞菌的无细胞提取物可在没有添加 NADPH 的情况下将少量的木糖转化为木糖醇， 而且 在这些条件下当还向反应混合物中加入了纯化的木糖异构酶时木糖醇产量增加了 3-4 倍 (Danielson， 2001， University of Colorado MastersThesis)。由于木糖异构酶能够将木 糖转化为木酮糖， 近来实验的合理推论是运动发酵单胞菌中的酶——葡萄糖 - 果糖氧化还 原酶 (GFOR) 可以利用木糖作为电子供体、 木酮糖作为电子接纳体来生成木糖醇， 这些将在 下文进行更为详尽的讨论。 因此， 基于体外实验， 在运动发酵单胞菌中至少存在两条木糖醇 产生途径， 但是它们在生理条件下对木糖醇形成的贡献程度仍待确定。
     为了高水平地生产乙醇， 在可能导致渗透压休克的高浓度可发酵碳源中培养运 动发酵单胞菌。当将野生型菌株转移到含＞ 200g/L 葡萄糖和果糖或者＞ 360g/L 蔗糖的 液体培养基中时， 在开始生长前的长时间的延迟期即为渗透压休克 (Loos et al.(1994)J Bacteriol176 ： 7688-7693)。此外， 当将野生型菌株转移到高浓度的这些糖类中时， 向培养 基中添加山梨糖醇可减少延迟期 (Wiegert et al.(1996)ArchMicrobiol 166 ： 32-41， Loos et al 同上 )。
     也表明了当在浓缩的葡萄糖与果糖混合物 (Loos et al. 同上 ) 或者浓缩的蔗糖 溶液 (-， Weigert et al 同上， Loos et al 同上 ) 中培养野生型运动发酵单胞菌时， 周质 酶——葡萄糖 - 果糖氧化还原酶 (GFOR) 在渗透压平衡中发挥重要作用。 简而言之， GFOR 与 其紧密结合的辅助因子以如图表 1 中所示的典型的乒乓机制来催化葡萄糖到葡糖酸内酯 的氧化以及后来的果糖到山梨糖醇的还原。 在周质空间产生的山梨糖醇逆浓度梯度转运到 细胞内， 在那里它由于不发生进一步的代谢而累积到很高水平。细胞内高浓度的山梨糖醇 会消除质膜内外的渗透压差异， 恢复渗透压平衡。
     当在低浓度蔗糖 ( ＜ 150g/L) 中进行培养时， 一株不能产生山梨糖醇的野生型运 动发酵单胞菌的自发突变株可比野生型细胞生产出更高水平的乙醇， 但该菌株不能在高浓 度蔗糖中生长 (Kirk and Doelle(1993)Biotechnol.Letters 15 ： 985-990)。后来发现该 突变株缺少葡萄糖 - 果糖氧化还原酶 (GFOR) 的表达， 这使得它不能将任何蔗糖来源的果糖 转化为多余的副产物山梨糖醇 (Wiegert et al. 同上 )。也表明可通过向培养基中添加山 梨糖醇的方式来恢复山梨糖醇缺陷的突变株在高浓度蔗糖中的生长 (Wiegert et al.， 同 上 )。 因此， 当在浓缩的葡萄糖与果糖混合物中或者浓缩的可被宿主细胞转化酶水解为葡萄 糖与果糖的蔗糖中培养运动发酵单胞菌时， GFOR 通过合成山梨糖醇在渗透压平衡中发挥着 至关重要的作用。
     图表 I
     CN1600850(A) 描述了一株具有失活的 GFOR 基因从而不能利用木糖的运动发酵单 胞菌突变株， 以及使用该菌株来进行乙醇生产。当葡萄糖、 果糖和蔗糖用作碳源时， 该菌株 中没有山梨糖醇的产生会导致更高水平的乙醇。
     在改造后的、 利用木糖及葡萄糖混合物 ( 没有添加蔗糖或果糖 ) 生长的、 可利用木 糖的运动发酵单胞菌菌株中降低或消除了葡萄糖 - 果糖氧化还原酶酶活的效应仍是未知
     的。 对于当在含木糖的培养基上进行培养时能够产生更多量乙醇的、 可利用木糖的运 动发酵单胞菌菌株仍有需求。申请人已经通过确定体内木糖醇产生的主要途径、 并利用基 因失活消除了与其形成有关的酶的活性、 进而生成了具有更高乙醇产量的运动发酵单胞菌 菌株， 从而解决了该问题。
     发明概述
     本发明涉及诸如运动发酵单胞菌 (Zymomonas mobilis) 这样的发酵单胞菌菌株， 当在存在木糖的情况下进行培养时， 其木糖醇产量降低了， 而乙醇产量增高了。申请人已 发现在可代谢木糖的运动发酵单胞菌中木糖醇产量主要是由葡萄糖 - 果糖氧化还原酶 (GFOR) 这个酶来介导的。 构建了不表达 GFOR 的遗传改良菌株 ( 譬如敲除 GFOR 的突变株 )， 发现当利用含有木糖的糖类混合物上培养， 木糖醇的产量降低了。当利用存在山梨醇的高 糖混合物培养时， GFOR 敲除突变株还可以比表达 GFOR 的亲代菌株消耗更多的木糖并产生 更高浓度的乙醇。此外， GFOR 敲除突变株的乙醇产量 ( 消耗每克糖产生的乙醇量 ) 有了显 著增高。
     因此， 本发明提供了能够通过在糖类培养基中发酵， 利用木糖来生产乙醇的发酵 单胞菌属的重组微生物， 所述微生物含有至少一种可降低葡萄糖 - 果糖氧化还原酶酶活的 遗传修饰。本发明包括能够利用木糖产生乙醇的发酵单胞菌菌株， 它由于 GFOR 基因的遗传 改造而表现出 GFOR 活性的降低。任何 GFOR 活性的降低均在本发明范畴内， 包括完全失活 针对 GFOR 活性的基因和 / 或完全敲除 GFOR 酶活的突变。
     此外， 本发明提供了生成 GFOR 活性有所降低的发酵单胞菌菌株的方法， 其包括 ：
     a) 提供能够在适当条件下利用木糖产生乙醇的重组发酵单胞菌菌株 ； 及
     b) 向 (a) 中的重组发酵单胞菌菌株引入至少一种遗传修饰， 其中所述修饰可降低 葡萄糖 - 果糖氧化还原酶活性。
     附图、 生物保藏及序列描述的简要说明
     可通过下述详细描述、 附图及作为本发明一部分的附加的序列描述来更为充分地 了解本发明。
     图 1 所示的是用于改造运动发酵单胞菌以利用木糖的四种酶 ( 框内 ) 以及使用木 糖进行乙醇生产的生化途径的示意图。
     图 2 所示的是改造后木糖途径的前两个步骤 ( 框内 )、 木糖醇合成、 木糖醇 5- 磷酸 形成 ( 一种毒性削弱的中间物 ) 及木糖醇对木糖异构酶的抑制的示意图。
     图 3 所示的是对转酮醇酶 (A)、 转醛醇酶 (B)、 木糖异构酶 (C) 和木酮糖激酶 (D) 进行酶测定的策略。
     图 4 所示的是 pMODPgaptaltktCm 的质粒图谱。
     图 5 所示的是 pMODPgapxylABCm 的质粒图谱。
     图 6 所示的是在用 PgapxylAB 转化的 T2C、 T3C、 T4C 和 T5C 谱系中木糖异构酶 (XI) 和木酮糖激酶 (XK) 活性的图。
     图 7 所示的是在用 PgapxylAB 转化的 T2C、 T3C、 T4C 和 T5C 谱系中转醛醇酶 (TAL) 和转酮醇酶 (TKT) 活性的图。
     图 8 所示的是所选择的适于利用木糖的菌株菌落的％理论乙醇产量及％理论木
     糖利用图。
     图 9 所示的是适应利用木糖的菌株在含 5％葡萄糖的 RM(RMG) 中培养 50 代之前或 之后于含 5％木糖 (RMX5％ ) 的 RM( 丰富培养基 ) 上培养 70 小时时的生长图。
     图 10 所示的是所选择的菌株——ZW658 与对照菌株——8b 相比较， 在 RM+10％葡 萄糖 (RMG10％ )(A、 B) 及 RM+8％木糖 (RMX8％ )(C、 D) 中的生长、 葡萄糖或木糖利用及乙醇 与木糖醇产量图。
     图 11 所示的是所选择的菌株——ZW658 与对照菌株——8b 相比较， 在不含醋酸盐 (A、 B) 或含有 0.6％醋酸盐 (C、 D) 的、 RM+10％葡萄糖 (RMG10％ ) 及 RM+8％木糖 (RMX8％ ) 中的生长、 葡萄糖或木糖利用及乙醇与木糖醇产量图。
     图 12 所示的是在为了对 GFOR 基因进行插入失活而构建自杀构建体时所制备的质 粒、 以及终产物 GFORSp-9WW 的图谱。
     图 13 所示的是用来构建木糖异构酶表达质粒——pZB 188/Kan-XylA 而制备的载 体的图谱， 以及用于该构建体的大肠杆菌木糖异构酶表达盒的图表 ( 框内 )
     图 14 所示的是在存在或者没有木糖异构酶表达时， 具有或者不具有 GFOR 基因失 活的 ZW1 菌株的木糖醇与木酮糖产量图。 图 15 所示的是利用总计为 97g/L 木糖 + 葡萄糖培养没有 (A) 或者具有 (B)GFOR 基 因失活的可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株时， 其生长、 葡萄糖或木糖利用及乙醇产量图。
     图 16 所示的是利用总计为 188g/L 木糖 + 葡萄糖培养没有 (A) 或者具有 (B)GFOR 基因失活的可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株时， 其生长、 葡萄糖或木糖利用及乙醇产量 图。
     图 17 所示的是在存在不同浓度山梨糖醇时具有 GFOR 基因失活的、 可利用木糖的 运动发酵单胞菌菌株的生长图。
     图 18 所示的是在没有 (A、 B) 或存在 (C、 D) 醋酸盐、 利用总计为 174g/L 木糖 + 葡 萄糖培养没有 (A、 C) 或者具有 (B、 D)GFOR 基因失活的可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株 时， 其木糖利用、 乙醇产量及木糖醇产量图。
     图 19 所示的是在没有 (A、 B) 或存在 (C、 D) 醋酸盐、 利用总计为 203g/L 木糖 + 葡 萄糖培养没有 (A、 C) 或者具有 (B、 D)GFOR 基因失活的可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株 时， 其木糖利用、 乙醇产量及木糖醇产量图。
     图 20 所示的是在添加了用于增加缓冲能力的碳酸氢钾的、 没有 (A、 B) 或存在 (C、 D) 醋酸盐、 利用总计为 203g/L 木糖 + 葡萄糖培养没有 (A、 C) 或者具有 (B、 D)GFOR 基因失 活的可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株时， 其木糖利用、 乙醇产量及木糖醇产量图。
     图 21 所示的是在进行可控 pH 的发酵中， 在存在醋酸盐、 利用总计为 189g/L 木糖 + 葡萄糖培养具有 GFOR 基因失活的可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株时， 其木糖与葡萄糖 利用、 乙醇产量及木糖醇产量图。
     图 22 所示的是 pZB 188/Kan 以及可在运动发酵单胞菌中复制的 Cre 表达载体 pZB 188/kan-Cre 的质粒图谱。
     图 23A 所示的是在可控 pH 条件下， 在含有醋酸盐的高葡萄糖 + 木糖中 ZW801-4 与 ZW800 生长的比较。
     图 23B 所示的是 ZW801-4 相对于 ZW800 的葡萄糖与木糖利用及乙醇产量图。
     图 24 所示的是 ZW801-4 中翻译后的突变序列与野生型 GFOP 蛋白的比对。 可通过下述详细描述以及作为本申请一部分的附加序列描述来更为充分地理解本发明。 下列序列符合 37C.F.R.1.821-1.825( “对含核苷酸序列和 / 或氨基酸序列事项的 专利申请的要求 - 序列规则” )， 并与世界知识产权组织 (WIPO) 标准 ST.25(1998)、 EPO 及 PCT 的序列列表要求 ( 规则 5.2 及 49.5(a-bis)、 以及行政指导 208 项与附录 C) 相一致。 核 苷酸及氨基酸序列数据中所用的符号和格式符合 37C.F.R.§1.822 中给出的规则。
     在此用光盘来提供序列列表。因此根据 37CFR 1.52(e) 通过参考的方式将含有序 列列表的光盘的内容并入本申请。光盘以一式两份的形式来提交， 彼此间相互一致。光盘 标记为 “拷贝 1- 序列列表” 和 “拷贝 2- 序列列表” 。光盘含有下列文件 ： CL3604seq list. ST25。
     SEQ ID NOs ： 1 和 2 是用于从 pZB4 中扩增含甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶基因启动子 (Pgap) 的 DNA 片段的引物的核苷酸序列。
     SEQ ID NOs ： 3 和 4 是用于从 pZB4 中扩增含 tal 编码区的 DNA 片段的引物的核苷 酸序列。
     SEQ ID NOs ： 5 和 6 是用于从 Pgap 及 tal 片段中扩增含 Pgaptal 的 DNA 片段的引物 的核苷酸序列。
     SEQ ID NOs ： 7 和 8 是用于从 pZB186 中扩增含 loxP::Cm 的 DNA 片段的引物的核 苷酸序列。
     SEQ ID NO ： 9 是 pMODPgaptaltktCm 质粒的完整核苷酸序列。
     SEQ ID NOs ： 10 和 11 是用于在具有 pMODPgaptaltktCm 的转化子中扩增含 tal 及 tkt 编码区的 3kb DNA 片段的引物的核苷酸序列。
     SEQ ID NO ： 12 是 pMODPgapxylABCm 质粒的完整核苷酸序列。
     SEQ ID NOs ： 13 和 14 是用于从具有 pMODPgapxylABCm 的 T2C、 T3C、 T4C 及 T5C 整合 子中扩增 1.6kb PgapxylA DNA 片段的引物的核苷酸序列。
     SEQ ID NOs ： 15 和 16 是用于从具有 pMODPgapxylABCm 的 T2C、 T3C、 T4C 及 T5C 整合 子中扩增 1.3kb xylB DNA 片段的引物的核苷酸序列。
     SEQ ID NOs ： 17 和 18 是用于从含 pgm 基因的 3’ 末端部分、 ldh 基因及 adhl 基因 的 5’ 末端部分的运动发酵单胞菌 W1 基因组 DNA 中扩增 2268bp DNA 片段的引物的核苷酸 序列。
     SEQ ID NOs ： 19 和 20 是用于从 pACYC184 中扩增四环素抗性盒的引物的核苷酸序 列。
     SEQ ID NOs ： 21 和 22 是用于生成 loxP 位点的寡聚核苷酸序列。
     SEQ ID NOs ： 23 和 24 是用于生成 loxP 位点的寡聚核苷酸序列。
     SEQ ID NOs ： 25 和 26 是用于从 pHP15578 中扩增 Specr 盒的引物的核苷酸序列。
     SEQ ID NOs ： 27 和 28 是用于从 ZW1 基因组 DNA 中扩增 3′ GFOR 侧翼 DNA 的引物 的核苷酸序列。
     SEQ ID NOs ： 29 和 30 是用于从 ZW1 基因组 DNA 中扩增 5′ GFOR 侧翼 DNA 的引物 的核苷酸序列。
     SEQ ID NO ： 31 是 pGFORSp-9WW 质粒的核苷酸序列。
     SEQ ID NOs ： 32 和 33 是用于从 pET-24a 中扩增 Kanr- 盒的引物的核苷酸序列。
     SEQ ID NO ： 34 是来源于 pZB4 的大肠杆菌 xylA 表达盒的核苷酸序列。
     SEQ ID NOs ： 35 和 36 是用于扩增 Cre- 表达盒的引物的核苷酸序列。
     SEQ ID NO ： 37 是 ZW801-4 中被破坏的 GFOR 编码区的完整的核苷酸序列 ( 从起始 密码子到原有的终止密码子 )。
     EQ ID NO ： 38 是野生型 GFOR 编码区的完整的核苷酸序列 ( 从原有的起始密码子 到原有的终止密码子 )。
     申请人根据国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约将下述 生物学保藏物保藏在美国典型培养物保藏中心 (ATCC)10801 University Boulevard， Manassas， VA 20110-2209 ：
     发明详述
     本发明描述了通过修饰内源葡萄糖 - 果糖氧化还原酶 (GFOR) 基因进行了改造的 可利用木糖的重组发酵单胞菌菌株， 以及制备 GFOR 被修饰的发酵单胞菌菌株的方法。本文 所述的方法包括任何可消除或减少 GFOR 酶活性的遗传修饰， 它可在木糖代谢期间导致木 糖醇产量的降低并增加乙醇产量。经遗传修饰后的、 GFOR 酶活性降低的、 可利用木糖的发 酵单胞菌可用于通过发酵来生产乙醇的方法。 通过全新的发酵单胞菌菌株所生产的乙醇可 用作化石燃料的替代能源。
     下述缩写及定义将用于阐明本发明及权利要求。
     ″葡萄糖 - 果糖氧化还原酶″缩写为 GFOR。
     RM 是丰富培养基。
     RMG5％是 RM+5％葡萄糖。
     RMG10％是 RM+10％葡萄糖。
     RMX8％是 RM+8％木糖。
     RMX2％是 RM+2％木糖。
     RMX5％是 RM+5％木糖。
     RMGX10％ 8％是 RM+10％葡萄糖和 8％木糖。
     RMGX5％ 8％是 RM+5％葡萄糖和 8％木糖。
     “基因” 是指包括编码序列之前 (5’ 非编码序列 ) 或之后 (3’ 非编码序列 ) 的调控 序列在内的可表达特定蛋白的核酸片段。 “天然基因” 或 “野生型基因” 是指与其自身调控序 列以天然状态存在的基因。 “嵌合基因” 是指任何非天然基因的基因， 含有不会同时以天然 状态存在的调控序列及编码序列。因此， 嵌合基因可含有来自不同来源的调控序列及编码 序列， 或者来自相同来源的调控序列与编码序列以与天然状态不同的方式排列在一起。 “内
     源基因” 是指在生物基因组中位于其天然位置的天然基因。 “外源” 基因是指在宿主生物中 通常不存在的基因， 但是通过转基因方式导入到宿主生物中。外源基因可包括插入到非天 然生物体内的天然基因， 或者嵌合基因。
     术语 “基因构建体” 是指编码用于表达一种或多种特定蛋白的核酸片段。在基因 构建体中， 基因在性质上可以是天然的、 嵌合的或者外源的。 典型地， 基因构建体会含有 “编 码序列” 。 “编码序列” 是指编码特定氨基酸序列的 DNA 序列。
     “启动子” 或 “起始控制区” 是指能够控制编码序列表达的 DNA 序列或者有功能的 RNA。通常， 编码序列位于启动子序列的 3’ 端。启动子可以全部来自天然基因， 或者由来自 天然存在的不同启动子的不同元件组成， 或者还可以含有合成的 DNA 片段。本领域的技术 人员知道在不同的组织或者细胞类群中、 或在不同的发育阶段、 或为了对不同的环境条件 做出应答， 可使用不同的启动子来指导基因表达。在绝大多数细胞类群中可在大部分时间 使基因进行表达的启动子通常称之为 “组成型启动子” 。
     本申请中所用术语 “表达” 是指来源于某个基因的正义 (mRNA) 或反义 RNA 的转录 及稳定累积。表达也可以指将 mRNA 翻译为多肽。 “反义抑制” 是指产生的反义 RNA 转录物 能够抑制靶蛋白的表达。 “过表达” 是指在转基因生物中基因产物的产量超过了正常的或非 转化生物中的产量水平。 “共抑制” 是指正义 RNA 转录物或片段的产生能够抑制相同的或者 基本上相似的外源或内源基因的表达 (U.S.5,231,020)。
     本申请中所用术语 “信使 RNA(mRNA)” 是指没有内含子并可由细胞翻译为蛋白的 RNA。
     本申请中所用术语 “非功能基因” 是指不表达所编码蛋白的基因——该基因在野 生型菌株中通常是内源的。可在任何水平上——譬如转录、 RNA 加工或翻译水平上破坏非 功能基因的表达。典型地， 非功能基因极少或者不表达所编码的蛋白。然而， 它仍可编码比 野生型蛋白具有更低酶活性的修饰蛋白。
     本申请中所用术语 “转化” 是指将核酸片段转入到宿主生物中， 并可稳定遗传。转 入的核酸可以是可在宿主细胞中维持的质粒的形式， 或者某些转入的核酸也可以整合到宿 主细胞的基因组中。含有转化核酸片段的宿主生物被称为 “转基因” 或 “重组” 或者 “转化” 生物。
     本申请中所用术语 “质粒” 及 “载体” 是指通常携带不参与细胞核心代谢的基因的 额外的染色体元件， 一般以环状双链 DNA 分子的形式存在。这些元件可以是来自任何来源 的自主复制序列、 基因组整合序列、 噬菌体或核苷酸序列、 线性或环状、 单链或双链 DNA 或 RNA， 其中一些核苷酸序列连接起来或者重构成为独特的构建体， 它可将启动子片段、 产生 所需基因产物的 DNA 序列以及合适的 3’ 非翻译序列转入到细胞中。
     术语 “可操作连接到” 是指将核酸序列连接到单个核酸片段上， 从而使其中某个的 功能受到另一个的影响。 例如， 启动子当能够影响编码序列的表达时， 它可操作连接到编码 序列上 ( 即， 编码序列处于启动子的转录控制下 )。 编码序列可以正义方向或反义方向可操 作连接到调控序列上。
     术语 “选择标记” 是指某种鉴定因子， 通常是能够根据标记基因的效果——例如对 抗生素的抗性来进行选择的抗生素或化学抗性基因， 其中上述效果用于追踪目标核酸的遗 传和 / 或鉴定继承了目标核酸的细胞或生物。术语 “基本上消除了” 木糖醇产生及 “基本上没有” 副产物木糖醇是指使用典型的 实验室分析所检测木糖醇的量接近或者近似为 0 的情形。
     术语 “高浓度的混合糖类” 是指在培养基中的总糖浓度能使可利用木糖的运动发 酵单胞菌的 GFOR 突变株的生长受到抑制。尽管确切浓度会随培养基中的其它组分有很大 变化， 典型地， 它高于约 100g/L。
     术语 “可发酵的糖” 是指在发酵过程中可用作微生物的碳源的寡糖与单糖。
     术语 “木质纤维” 是指同时含有木质素及纤维素的组分。木质纤维原料也可含有 半纤维素。
     术语 “纤维质” 是指含有纤维素及包括半纤维素在内的其它成分的组分。
     术语 “糖化作用” 是指从多糖中产生可发酵的糖类。
     术语 “预处理的生物量” 是指在糖化作用前进行过预处理的生物量。
     “生物量” 是指任意的纤维质或木质纤维原料， 并包括含有纤维素、 优选地进一步 含有半纤维素、 木质素、 淀粉、 多糖和 / 或单糖的原料。生物量也可以含有其它组分， 譬如蛋 白和 / 或脂类。生物量可以是单一来源， 或者生物量可包括来自一种来源以上的混合物 ； 例如， 生物量可以包括玉米棒子及玉米干草的混合物， 或者草及叶子的混合物。 生物量包括 单不限定于， 生物能源作物、 农作物剩余物、 城市生活垃圾、 工业固体废物、 来自造纸厂的淤 泥、 庭园垃圾、 木材及林业垃圾。生物量的实施例， 包括但不限定于， 玉米粒、 玉米棒子、 诸 如玉米壳这样的作物剩余物、 玉米秸秆、 草、 小麦、 小麦杆、 大麦、 大麦杆、 秸秆、 水稻杆、 柳枝 稷、 废纸、 甘蔗渣、 高梁、 大豆、 从磨碎的谷子、 树木、 枝条、 根、 叶片、 木片、 锯屑、 灌木和矮树 中获得的组分、 蔬菜、 水果、 花及动物肥料。 “生物量水解产物” 是指由生物量糖化作用获得的产物。生物量也可以在糖化作用 前进行预处理。
     本文所用的标准重组 DNA 及分子克隆技术在本领域是周知的， 在
     Sambrook， J.， Fritsch， E.F.and Maniatis， T.Molecular Cloning ： A Laboratory nd Manual， 2 ed. ； Cold Spring Harbor Laboratory ： ColdSpring Harbor， New York， 1989( 在 下 文 为 “Maniatis” )； and bySilhavy， T.J.， Bennan， M.L.and Enquist， L.W.Experiments withGene Fusions ； Cold Spring Harbor Laboratory ： Cold Spring Harbor ， New York ， 1984 ； and by Ausubel ， F.M.et al. ， In Current Protocolsin Molecular Biology， published by Greene Publishing and Wiley-Interscience， 1987， 中有描述。
     本发明涉及增加乙醇生产的、 可利用木糖的发酵单胞菌的改造菌株。通过可利用 木糖的运动发酵单胞菌来提高乙醇产量的挑战在于减少或消除木糖醇的合成， 这 (a) 意味 着不会对碳吸 (carbon sink) 收造成增值 ； (b) 抑制木糖利用的第一个步骤 ； 及 (c) 可被磷 酸化成抑制细菌生长的毒性削弱的中间物。申请人已发现内源 GFOR 酶主要负责体内木糖 醇的合成， 通过减少或消除 GFOR 酶活， 可提高从木糖到乙醇的生产 ( 速度、 产量及滴度 )。
     可利用木糖的发酵单胞菌宿主菌株
     任何能够利用木糖作为碳源的发酵单胞菌菌株均可用作制备本发明菌株的宿主。 发酵单胞菌菌株， 譬如已经对木糖发酵成乙醇进行了改造的运动发酵单胞菌是更为有用 的。内源基因可提供部分代谢途径， 或可通过任意已知的遗传操作技术来进行改变以提供
     对木糖代谢有用的具有酶活性的蛋白。例如， 内源转酮醇酶可与其它导入的酶活性相互补 产生木糖利用途径。 典型地， 如通过参考整合到本申请中的 US 5514583 所述， 将 4 个基因导 入到运动发酵单胞菌中用来表达参与木糖代谢的 4 个酶 ( 图 1)。 它们包括编码催化木糖转 化为木酮糖的木糖异构酶、 及将木酮糖磷酸化以形成木酮糖 5- 磷酸的木酮糖激酶的基因。 此外， 戊糖磷酸化途径中的两个酶——转酮醇酶和转醛醇酶， 能将木酮糖 5- 磷酸转化为可 将戊糖代谢与糖酵解中恩杜糖解途径相关联的中间物， 可使木糖代谢为乙醇。编码这些酶 的 DNA 序列可从诸如肠道细菌及某些酵母与真菌这样的能代谢木糖的众多微生物中的任 一一种来获得。编码区的来源包括黄单胞菌 (Xanthomonas)、 克雷伯氏杆菌 (Klebsiella)、 埃 希 氏 菌 (Escherichia)、红 细 菌 (Rhodobacter)、黄 杆 菌 (Flavobacterium)、醋 杆 菌 (Acetobacter)、葡 糖 杆 菌 (Gluconobacter)、根 瘤 菌 (Rhizobium)、土 壤 杆 菌 (Agrobacterium)、 沙 门 氏 菌 (Salmonella)、 假 单 胞 菌 (Pseudomonads) 及 发 酵 单 胞 菌 (Zymomonas)。特别有用的是大肠杆菌的编码区。
     编码 DNA 序列可操作地连接到诸如运动发酵单胞菌甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶启动 子 (GAP 启动子 )， 及运动发酵单胞菌烯醇化酶启动子 (ENO 启动子 ) 这样的、 可在运动发 酵单胞菌细胞中表达的启动子上。编码区可单独通过启动子来表达， 或者两个或多个编 码区连接成一个用同一个启动子进行表达的操纵子。得到的嵌合基因可导入到发酵单 胞菌中并维持在质粒上， 或使用譬如同源重组、 定点整合或随机整合的方式整合到基因 组中。具体所用的可利用木糖的菌株包括 CP4(pZB5)(US 5514583)、 ATCC31821/pZB5(US 6566107)、 8b(US20030162271 ； Mohagheghi et al.， (2004)Biotechnol.Left.25 ； 321-325) 及 ZW658( 在本文中进行描述 ； 保藏， ATTCC#PTA-7858)。
     也可在本发明过程中使用进行了其它改造以利用不属于天然底物的、 与木糖类似 的其它糖类的发酵单胞菌菌株。在 US 5843760 中描述了改造后可利用阿拉伯糖的运动发 酵单胞菌菌株的实施例， 通过参考的方式并入到本申请中。
     发现由 GFOR 进行的木糖醇合成
     由可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株合成的有害副产物——木糖醇， 会降低乙醇 的产量并导致可抑制细菌生长的毒性组分——木糖醇 -5- 磷酸的形成 ( 参见图 2)。此外， 木糖醇是在改造后木糖利用途径中的第一个酶——木糖异构酶的有效抑制物， 它的合成会 降低细胞代谢木糖的能力。 尽管体外实验已表明在运动发酵单胞菌中至少有两个木糖醇形 成的途径 (Feldmann et al. 同上， Danielson et al. 同上 )， 申请人发现生理产生的大部 分木糖醇是 GFOR 酶活的结果。如本文所述， 现在已发现由在含有木糖的培养基上培养的可 利用木糖 ( 或野生型运动发酵单胞菌的木酮糖合成的衍生物 ) 的运动发酵单胞菌菌株合成 的木糖醇的量在缺少 GFOR 酶活时明显降低了。申请人已发现木糖到木酮糖的转化是体内 GFOR 介导的木糖醇产生的先决条件， 该反应仅发生在可表达木糖异构酶的运动发酵单胞菌 菌株中。因此， 认为改造后可利用木糖生长的运动发酵单胞菌菌株中木糖醇的主要生理性 来源是由 GFOR 通过图表 II 和 III 中描述的其中一个或两个反应来合成的。
     图表 II图表 III
     需注意在两个图表中， 木酮糖作为 GFOR 专性的电子接纳体， 并且该化合物被还原 成木糖醇， 作为对比， 在已知利用果糖的反应中会产生山梨糖醇 ( 图表 I)。 尽管 GFOR 对葡萄 糖和果糖十分具有特异性， 但已表明它也可以使用其它糖类作为电子供体和电子接纳体， 虽然相当稀少 (Zachariou and Scopes(1986)Journal of Bacteriology167 ： 863-869)。 因此， 当将木糖和果糖与纯化后的蛋白一起温育时， 可观察到山梨糖醇的产生， 但同使用葡 萄糖的对照反应相比， GFOR 酶活约降低了 12 倍。在同一篇论文中， 表明了木酮糖可以替代 果糖作为电子接纳体， 该反应生成了如图表 III 中所述的木糖醇。然而， 使用该底物组合， GFOR 的酶活性降低了约 14 倍。除了这些观察资料外， 还表明当向提供木酮糖来源的反应 混合物中加入纯化的木糖异构酶时， 从野生型运动发酵单胞菌制备的无细胞提取物能够从 木糖生成木糖醇 (Danielson 同上 )， 因此表明了 GFOR 也能够催化图表 II 所述的反应。不 过， 无论在活细胞中是否发生了这些 GFOR 介导的反应、 如果发生了它们对体内木糖醇的形 成又有多大程度的影响， 在申请人的发现之前仍有待确定。同样不确定的还有也存在于野 生型运动发酵单胞菌无细胞提取物中的能够直接将木糖转化为木糖醇的 NADPH 依赖的醛 糖还原酶活性 (Feldmann et al. 同上 )。实际上， 没有一个利用无细胞提取物的实验关注 过上述关于 GFOR 与 NADPH 依赖的醛糖还原酶对体外木糖醇形成的相对贡献， 更不用说在经 过相关条件下的体内实验了。因此， 申请人关于在改造后可利用木糖生长的运动发酵单胞 菌， 于生理条件下， 在含木糖培养基中主要是由 GFOR 来负责木糖醇的产生的这个发现是令 人震惊的， 不能通过以前的技术进行预测。
     改变 GFOR 基因表达
     对本发明中可利用木糖的发酵单胞菌进行改造， 使其 GFOR 编码基因的表达降低 或者不表达， 从而减少木糖醇的合成。本领域技术人员所知的、 任何可减少有功能的酶的 遗传修饰方法均可用来改变 GFOR 的表达。方法包括但不限制于， 删除编码 GFOR 的基因的 整个基因或其一部分、 将一段 DNA 片段插入到 GFOR 基因 ( 在启动子或者编码区内 ) 中从 而不表达蛋白或者在更低水平进行表达、 向 GFOR 编码区引入可增加终止密码子或移码的 突变从而不表达有功能的蛋白、 以及向 GFOR 编码区引入一个或多个突变以改变氨基酸从 而表达的是无功能的或者只有较低酶活性的蛋白。此外， 可通过表达反义 RNA 或干扰 RNA 来封闭 GFOR 的表达， 可引入能够产生共抑制的构建体。本领域技术人员利用编码 GFOR 酶 的已知序列 (SEQ ID NO ： 3) 可以很容易地实现所有这些方法。在某些修饰过程中， GFOR 编码序列周围的 DNA 序列也是有用的， 其可由运动发酵单胞菌完整基因组序列 (GenBank Accession#AE008692) 中获得。
     如本申请实施例 3 和 5 中所示， 一种特别合适的用来产生遗传修饰的 GFOR 菌株的 方法是， 使用通过结合有壮观霉素抗性基因或者其它选择标记的 GFOR 侧翼 DNA 序列介导的 同源重组， 将选择标记插入到 GFOR 编码区从而不会表达有功能的 GFOR 酶。此外， 选择标记
     也可以有位点特异性的重组位点， 通过接下来表达相应的位点特异性的重组酶， 可在不回 复 GFOR 基因活性的情况下将抗性基因从 GFOR 基因上切除。位点特异性重组会留下一个重 组位点， 它会破坏 GFOR 酶的表达。如本领域技术人员所周知， 可构建同源重组载体， 在切除 选择标记后同样可在 GFOR 基因中产生缺失。
     优选地， 应彻底消除 GFOR 的表达， 不过， GFOR 表达的显著降低也是本发明的体现。 在此情况下， 无功能的 GFOR 基因是指不以正常方式发挥功能， 从而低于 GFOR 酶的正常水 平。某些基因失活的方法可导致仍有某些残留的低水平表达， 譬如共抑制。本文中， 修饰的 GFOR 菌株是指具有较少或者没有 GFOR 酶活性的遗传修饰菌株。GFOR 修饰菌株的生长和乙 醇生成
     在缺少或者存在其它糖类 ( “混合糖类” ) 的情况下， 于含木糖的培养基中培养本发 明中 GFOR 修饰的、 可利用木糖的发酵单胞菌。混合糖类含有至少一种除木糖之外的其它糖 类。任何可为发酵单胞菌细胞代谢提供能量来源的糖类、 或者任何存在于含有木糖的混合 物中的糖类均可包括在内。希望能够利用由生物量糖化作用 (biomasssaccharification) 产生的糖类培养 GFOR 修饰的、 可利用木糖的运动发酵单胞菌细胞。典型地， 例如专利申请 WO2004/081185 以及共有且共同未决的美国专利申请 60/670437 中所述那样， 生物量是经 过预处理的， 然后如 Lynd， L.R.， et al.(Microbiol.Mol.Biol.Rev.(2002)66 ： 506-577) 所 综述用糖化作用的酶进行处理。 生物量糖化作用产生的糖类， 典型地含有木糖与葡萄糖、 果 糖、 蔗糖、 半乳糖、 甘露糖和 / 或阿拉伯糖的混合物。优选地， 混合糖类组分中含有木糖与葡 萄糖， 其中也可以有其它糖类。
     混合物中不同糖类的比例可以有很大差异， 典型地， 木糖至少为总糖量的约 10％。 优选地， 木糖为约 40％至约 60％之间。在糖类中存在由某些生物量譬如甘蔗渣的糖化作用 所产生的果糖， 可替代一部分木糖或者葡萄糖， 这样木糖至少占糖类混合物的约 10％。此 外， 阿拉伯糖来源于半纤维素， 并且是来源于含半纤维素的糖化生物量的混合糖类中的典 型成分。
     在不属于 GFOR 修饰菌株的、 可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株不会产生木糖醇 的发酵条件下， 本发明中 GFOR 修饰的可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株可生长并产生与 非 GFOR 修饰菌株等量的乙醇。例如， 在譬如约 100g/L 的混合糖类、 其中葡萄糖与木糖的 比为 5 ∶ 4 的低糖培养基中， GFOR 修饰的、 可利用木糖的运动发酵单胞菌细胞表现得与非 GFOR 修饰菌株很相似。
     为了在发酵时获得最大的乙醇产量及效率， 希望可在含包括木糖在内的高水平糖 类的培养基中培养可利用木糖的产乙醇生物。为了培养本发明的运动发酵单胞菌菌株， 可 在培养基中使用高浓度的混合糖类。这样可以直接使用生物量糖化作用的糖类， 或者略加 稀释后使用， 从而减少发酵物体积——这在商业规模的乙醇生产中是很受欢迎的。使用高 糖浓度可产生更高浓度的乙醇。在发酵培养基中混合糖类的浓度典型地为至少约 120g/L 直至约 300g/L。特别有用的是浓度在约 150g/L 到约 235g/L 之间的高浓度混合糖类。
     在期望生产乙醇的高浓度混合糖类条件下， GFOR 修饰的可利用木糖的运动发酵单 胞菌所用的发酵培养基中含有山梨糖醇。 申请人惊奇地发现向高混合糖类培养基中添加山 梨糖醇可使 GFOR 修饰的、 可利用木糖的运动发酵单胞菌生长很好， 而未加入山梨糖醇的、 GFOR 修饰的、 可利用木糖的运动发酵单胞菌极少生长或不生长。这与可产生 GFOR 的菌株明显相反， 后者在延迟期 12-36 小时后不添加山梨糖醇的情况下能够适应浓缩的糖类混合 物。在缺少果糖或蔗糖 ( 作为果糖来源 ) 的培养基中， 认为 GFOR 不会合成山梨糖醇或者在 渗透适应中发挥作用。当生长培养基中没有果糖时， 如图表 I 所示的 GFOR 在山梨糖醇合成 中的已知反应无法继续。具有正常 GFOR 酶活性的、 可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株能够 在浓缩的葡萄糖和木糖混合物中生长的能力——尽管有一个长的延迟期， 表明了通过 GFOR 进行的山梨糖醇合成对于渗透适应不是必需的， 因为没有果糖， GFOR 不会合成山梨糖醇。 因 而在缺少果糖的生长培养基中， 消除 GFOR 酶活性不会对山梨糖醇产生水平有什么影响， 在 浓缩的葡萄糖和木糖混合物中， GFOR 修饰的、 可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株生长对山 梨糖醇的需求是完全未料到的。
     在培养基中可含有浓度在约 2mM 到 200mM 之间的山梨糖醇 (D- 山梨糖醇和 / 或 L- 山梨糖醇 )。在培养基中更为适合的终浓度为浓度在约 2mM 到 100mM 之间， 浓度在 5mM 到 20mM 之间是优选的。在培养基中也可使用甘露醇来替代山梨糖醇， 或与山梨糖醇一起使 用。在通过参考并入本申请的共有且共同未决的美国申请 #60/847997 中， 发现甘露醇具有 与山梨糖醇相似的效应。此外， 发现半乳糖醇和 / 或核糖醇可用来替代山梨糖醇或甘露醇 或者与其一起使用。山梨糖醇、 甘露醇、 半乳糖醇、 核糖醇或其组合均可以以同关于山梨糖 醇的描述中相同的浓度来应用。
     在不属于 GFOR 修饰菌株的、 可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株能够产生木糖醇 的发酵条件下， 譬如在存在或缺少诸如乙酸盐这样的抑制物的高糖培养基中， 本发明的 GFOR 修饰的、 可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株表现得要优于 GFOR 未修饰的菌株。 申请人 发现所消耗的木糖总量与最终乙醇滴度在 GFOR 修饰菌株中均大于未修饰的菌株。此外， 在 相应处理条件下， GFOR 修饰的、 可利用木糖的运动发酵单胞菌在发酵中没有产生木糖醇， 尽 管在本文实施例 6 中所示的特定环境中通过非 GFOR 机制可能会有少量合成。
     木糖利用及乙醇生产中的改进在不同的发酵条件下会有所变化。在 GFOR 未被 修饰的、 可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株可产生高水平木糖醇的条件下， 缺少木糖醇合 成对 GFOR 突变体会产生更大影响。例如， 当在培养基中存在诸如乙酸盐这样的抑制物时， GFOR 未修饰的菌株产生了更多量的木糖醇。这种木糖醇的产生可通过 GFOR 突变来彻底消 除， 该突变会使得木糖利用及乙醇产生比在不使用 GFOR 突变体来产生少量木糖醇的条件 下有更大增加。由于在处理后的纤维质生物量中特别存在乙酸盐， 希望利用来源于处理后 的纤维质生物量的碳源生长的、 产乙醇生物对乙酸盐具有更低的敏感性。 因此， 当在发酵中 使用生物量水解物时， 利用 GFOR 修饰的、 可利用木糖的运动发酵单胞菌菌株进行的发酵会 特别有益。
     生产乙醇的发酵
     对于乙醇生产， 将重组的 GFOR 修饰的、 可利用木糖的运动发酵单胞菌接种到含包 括木糖在内的混合糖类的培养基上。当混合糖类的浓度高到可抑制生长时， 培养基含有山 梨糖醇、 甘露醇或其混合物。 半乳糖醇或核糖醇可以替代山梨糖醇或甘露糖醇， 或与它们组 合使用。 在可进行发酵并产生乙醇的培养基上培养运动发酵单胞菌。 发酵在无需补充空气、 氧气或其它气体的条件下进行 ( 它包括诸如厌氧、 微需氧或者微好氧发酵这样的条件 ) 至 少约 24 小时， 也可进行 30 小时或以上。到达最大乙醇产量的时间是不同的， 依赖于发酵条 件。 典型地， 如果在培养基中存在抑制物， 则需要有更长的发酵周期。 发酵可以在约 30℃到约 37℃之间的温度下于约 4.5 到约 7.5 的 pH 值下进行。
     在实验室规模的发酵中， 以及在可产生商品化用量的乙醇的规模放大的发酵中， 可在含包括木糖在内的混合糖类的培养基中培养 GFOR 修饰的、 可利用木糖的运动发酵单 胞菌， 当希望获得商品化产量的乙醇时， 可应用不同的培养方法。例如， 可通过批式培养及 持续培养方法从 GFOR 修饰的、 可利用木糖的运动发酵单胞菌进行大规模产物的生产。典型 的批式培养法是一个封闭的体系， 其中在培养开始时设定好培养基的组分， 在培养过程中 不进行人为改变。这样， 在培养过程开始时， 将培养基与期望的生物一起温育， 不需向体系 中加入什么即可进行生长并有代谢活性。不过典型地， “批式” 培养根据加入的碳源来分批， 通常尝试去控制诸如 pH 及氧浓度这样的因素。在批式体系中， 系统的代谢物及生物量组分 持续改变直至培养结束。在批式培养中细胞平和地通过静态延迟期到高速生长的对数期， 最终到达生长速率降低或终止的稳定期。如果不经处理， 稳定期的细胞终将死亡。在某些 体系中， 终产物或中间产物产量中的大多数通常是由对数期的细胞产生的。在其它体系中 可获得稳定期或者对数后期的产量。
     标准批式体系的一个变型是补料批式体系。对于 GFOR 修饰的、 可利用木糖的运 动发酵单胞菌， 补料批式培养过程也是适用的， 它包括一个典型的批式体系， 只是在培养过 程中将底物以增量形式加入。当分解代谢抑制会抑制细胞的代谢并且希望培养基中只有 有限量的底物时可使用补料批式体系。在补料批式体系中测定实际底物浓度是困难的， 因此可基于诸如 pH 以及废气例如 CO2 分压这样的可测定因素的改变来进行估算。批式及 补料批式培养方法在本领域中是常见的并且是周知的， 可在 Biotechnology ： A Textbook of IndustrialMicrobiology， Crueger， Crueger， and Brock， Second Edition(1989) Sinauer Associates， Inc.， Sunderland， MA， or Deshpande， Mukund V.， Appl.Biochem. Biotechnol.， 36， 227， (1992) 中找到示例， 此处通过参考的方式并入本申请。
     商品化的乙醇生产也可通过持续培养来完成。持续培养是开放体系， 其中向生物 反应器中持续加入给定的培养基， 并同时移走等量的条件培养基。持续培养通常使细胞维 持在一个恒定的高液相密度， 其中细胞主要处于对数期生长之中。 或者， 可通过固定细胞来 实现持续培养， 其中持续加入碳源和营养物， 并从细胞团中持续移走有价值的产物、 副产物 或废物。可使用许多由本领域技术人员已知的天然和 / 或合成材料组成的固相支持物来进 行细胞固定。
     持续或半持续培养允许调节可影响细胞生长或终产物浓度的某个因素或多个因 素。例如， 某个方法可以以固定速率来维持， 诸如碳源或氮源水平这样的限制性养分， 同时 调整所有其它参数。 在其它体系中， 当通过培养基浊度来测定的细胞浓度保持恒定时， 可持 续改变许多影响生长的因素。持续体系试图维持稳定状态的生长条件， 从而由于移走培养 基造成的细胞损失与培养基中细胞生长速率是相平衡的。 在持续培养过程中调节养分及生 长因素从而使产物形成速率最大化的方法以及技术在工业微生物领域是周知的， Brock， 同 上， 详细描述了多种方法。
     特别适合乙醇生产的发酵形式如下所述。在摇瓶的半复合培养基中， 于约 30 ℃ 到约 37 ℃以约 150rpm 的速度在定轨摇床中培养所需的 GFOR 修饰的、 可利用木糖的运动 发酵单胞菌菌株， 然后转移到含有相似培养基的 10L 种子发酵罐中。在种子发酵罐中无氧 培养种子培养物直至 OD600 在 3 到 6 之间， 此时将其转移到产物发酵罐， 在这里对发酵参数进行优化以生产乙醇。从种子罐中转入到的产物罐中典型的接种物体积范围从约 2％到约 20％ v/v。典型的发酵培养基含有诸如磷酸钾 (1.0-10.0g/l)、 硫酸铵 (0-2.0g/l)、 硫酸镁 (0-5.0g/l)、 复合氮源， 例如酵母提取物或大豆碱性产物 (0-10g/l) 这样的基本培养基组 分。在培养基中存在终浓度为约 5mM 的山梨糖醇或甘露醇。将提供碳源的包括木糖及至少 一种其它糖类， 譬如葡萄糖 ( 或蔗糖 ) 在内的混合糖类， 持续加入到培养罐中弥补最初批次 碳源 (50-200g/l) 的损耗以最大化乙醇产率及滴度。可动态调节碳源补给速率， 以确保培 养物不会过量累积葡萄糖， 这会导致诸如乙酸这样的有毒副产物的增加。为了从所利用的 底物来实现乙醇产量的最大化， 生物量生长受批式起始时或发酵过程中加入的磷酸盐的量 的控制。使用苛性溶液 ( 譬如氢氧化铵、 氢氧化钾或氢氧化钠 ) 及硫酸或磷酸将 pH 值控制 在 5.0-6.0。将发酵温度控制在 30℃ -35℃。为了使泡沫最小化， 如有需要则向罐中加入防 沫剂 ( 任何种类——基于硅树脂、 基于有机物等 )。 可选择性地使用诸如卡那霉素这样的抗 生素——菌株中存在该种抗生素的抗性基因， 以使污染最小化。
     任何上述条件及本领域技术人员已知的这些条件的其它改变， 均是由可利用木糖 的重组发酵单胞菌菌株来生产乙醇的合适条件。
     实施例 本发明通过以下实施例进行进一步详细说明。 应理解这些描述本发明的优选实施 方案的实施例仅起示例性作用。通过以上讨论及这些实施例， 本领域的技术人员可了解本 发明的基本特征， 而且在不偏离其主旨和范围的情况下， 可对本发明进行各种改变和修改 以使其满足不同用途和情形。
     常规方法
     此处所用的标准重组 DNA 和分子克隆技术是本领域已知的， 在 Sambrook， J.， nd Fritsch， E.F.and Maniatis， T.， Molecular Cloning ： A Laboratory Manual， 2 ed.， Cold Spring Harbor Laboratory ： ColdSpring Harbor， NY(1989)( 在下文中为 “Maniatis” )； and by Silhavy， T.J.， Bennan， M.L.and Enquist， L.W.， Experiments with GeneFusions， Cold Spring Harbor Laboratory ： Cold Spring Harbor， NY(1984) ； and by Ausubel， F.M.et al.， Current Protocols in MolecularBiology， published by Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience， Hoboken， NJ(1987) 中有描述。
     缩写的含义如下 ： ” kb” 是指千碱基， “bp” 是指碱基对， “nt” 是指核苷酸， ” hr” 是 指小时， “min” 是指分钟， “sec” 是指秒， “d” 是指天， “L” 是指升， “ml” 是指毫升， “μL” 是 指微升， “μg” 是指微克， “ng” 是指纳克， “mM” 是指毫摩尔， “μM” 是指微摩尔， “nm” 是指纳 r 米，″ μmol” 是指微摩尔， “pmol” 是指皮摩尔， “Cm” 是指氯霉素， “Cm “是指氯霉素抗性， s r s “Cm ” 是指氯霉素敏感， “Sp “是指壮观霉素抗性， “Sp ” 是指壮观霉素敏感， “XI” 是木糖异 构酶， “XK” 是木酮糖激酶， “TAL” 是转醛醇酶， “TKT” 是转酮醇酶， “EFT” 是指经过的发酵时 间， “RM” 是指含 10g/L 酵母提取物及 2g/L KH2PO4 的丰富培养基， “MM” 是指含 10g/L 酵母提 取物、 5g/L 胰蛋白胨、 2.5g/L(NH4)2SO4 和 0.2g/L KH2PO4 的接合培养基 (mating medium)。
     制备用于酶活测定的发酵单胞菌的无细胞提取物
     将细胞在 50ml RM+2％葡萄糖中， 30℃培养过夜至 OD600 为 1.0-1.2。于 4500rpm， 4℃离心 10 分钟收获细胞。除去上清， 并用 25ml 冰冷的超声缓冲液 (10mM Tris， pH 7.6， 10mM MgCl2) 洗涤细胞沉淀， 然后在 4500rpm 离心 10 分钟。将细胞沉淀重悬在 2.0-2.5ml
     补加 1mM 二硫苏糖醇的超声缓冲液中。以每份 500μl 的量在 Eppendorf 离心机中于 4℃ 离心 1 分钟。除去大部分上清液， 剩余约 10-20μl 以防止沉淀干燥。将细胞冷冻并储存 在 -80℃， 以备检测。在检测前， 将细胞融化， 并用 500μl 补加 1mM 二硫苏糖醇的超声缓冲 液重悬。将混合物用 Branson 超声仪 450 在 62％占空比 (duty cycle)， 输出控制为 2 的条 件下超声 2 次， 每次 45 秒， 在两次超声之间保持样品冷冻 3-5 分钟。将样品用 Beckman 离 心机， 于 14,000rpm， 4℃离心 60 分钟。将上清转移到新管中， 并保持在 4℃。使用 Pierce BCA 检测法测定蛋白浓度。
     通常首先进行转酮醇酶 (TKT) 检测， 因为该酶比其它酶更不稳定。 TKT 检测的图如 图 3A 所示。
     在微孔板检测中， 于 30℃下， 将 20μl 无细胞提取物加入到各孔中、 包含下述组分 的反应混合物中， 所述反应混合物包括以下终浓度的组分 ： 0.37mM NADP、 50mM TrisHCl pH 7.5、 8.4mM Mg Cl2、 0.1mM TPP( 焦磷酸硫胺素氯化物 )、 0.6mM E4P( 赤藓糖 -4- 磷酸 )、 4mM BHP(β 羟基丙酮酸 )、 4U/ml PGI( 磷酸葡萄糖异构酶 )、 及 4U/ml G6PD( 葡萄糖 -6- 磷酸脱 氢酶 )。在微孔板读数仪上读取 A3403-5 分钟。TKT 活性计算如下 ：
     1 单位相当于在 30℃下形成 1μmol D- 果糖 -6- 磷酸 / 分钟。
     U( 微摩尔 / 分钟 ) ＝斜率 (dA340/ 分钟 )* 反应体积 (μL)/6220/0.55cm
     (NADP → NADPH 的摩尔数是在 1cm 比色皿中每摩尔每 L 6220A340)。
     ( 微孔板中每孔 200μl 光程长 (pathlength) ＝ 0.55cm)
     比活性 (μmole/min-mg) ＝ μmole/min/ 蛋白浓度 (mg)
     转醛醇酶 (TAL) 检测的基础如图 3B 所示。在微孔板检测中， 在 30℃下， 将 20μl 无细胞提取物加入到各孔中、 包含下述组分的反应混合物中， 所述反应混合物包括以下终 浓度的组分 ： 0.38mMNADH、 87mM 三 乙 醇 胺、 17mM EDTA、 33mM F6P( 果 糖 -6- 磷 酸 )、 1.2mM E4P( 赤藓糖 -4- 磷酸 )、 2.0U/ml GDH( 甘油 -3- 磷酸脱氢酶 ) 和 20U/ml TPI( 丙糖磷酸异 构酶 )。将板温育 5 分钟。然后读取 A3403-5 分钟。TAL 活性计算如下 ： 1 单位相当于在 30℃ 下每分钟形成 1μmol D- 甘油醛。
     U( 微摩尔 / 分钟 ) ＝斜率 (dA340/ 分钟 )* 反应体积 (μL)/6220/0.55cm
     (NADH → NAD 的摩尔数是在 1cm 比色皿中每摩尔每 L 6220A340)。
     ( 微孔板中每孔 200μl 光程长＝ 0.55cm)
     比活性 (μmole/min-mg) ＝ μmole/min/ 蛋白
     木糖异构酶 (XI) 检测的基础如图 3C 所示。在微孔板检测中， 在 30℃下， 将 20μl 无细胞提取物加入到各孔中、 包含下述组分的反应混合物中， 所述反应混合物包括以下终 浓度的组分 ： 0.256mMNADH、 50mM 木糖、 10mM MgSO4、 10mM 三乙醇胺和 1U/ml SDH( 山梨糖醇 脱氢酶 )。在微孔板读数仪上读取 A3403-5 分钟。XI 活性计算如下 ： 1 单位相当于在 30℃ 下每分钟形成 1μmol D- 木酮糖。U( 微摩尔 / 分钟 ) ＝斜率 (dA340/ 分钟 )* 反应体积 (μL)/6220/0.55cm
     (NADHP → NAD 的摩尔数是在 1cm 比色皿中每摩尔每 L 6220A340)。
     ( 微孔板中每孔 200μl 光程长＝ 0.55cm)
     比活性 (μmole/min-mg) ＝ μmole/min/ 蛋白浓度 (mg)
     木酮糖激酶 (XK) 检测的基础如图 3D 所示。在微孔板检测中， 在 30℃下， 将 20μl无细胞提取物加入到各孔中、 包含下述组分的反应混合物中， 所述反应混合物包括以下 终浓度的组分 ： 0.2mM NADH、 50mM Tris HCl pH 7.5、 2.0mm MgCl2-6H2O、 2.0M ATP 0.2M PEP( 磷酸烯醇式丙酮酸 )、 8.5mM D- 木酮糖、 5U/ml PK( 丙酮酸激酶 ) 和 5U/ml LDH( 乳酸 脱氢酶 )。在微孔板读数仪上读取 A3403-5 分钟。XI 活性计算如下 ：
     1 单位相当于在 30℃下每分钟 1μmol D- 木酮糖转变为 D- 木酮糖 -5- 磷酸。
     U( 微摩尔 / 分钟 ) ＝斜率 (dA340/ 分钟 )* 反应体积 (μL)/6220/0.55cm
     (NADH → NAD 的摩尔数是在 1cm 比色皿中每摩尔每 L 6220A340)。
     ( 微孔板中每孔 200μl 光程长＝ 0.55cm)
     比活性 (μmole/min-mg) ＝ μmole/min/ 蛋白浓度 (mg)HPLC 方法
     用 Agilent 1100 系 列 HPLC 和 Agilent ChemStation 软 件 进 行 LC3D 分 析。 柱 子用的是带有 BioRad Micro-Guard Cartridge Cation-H(125-0129) 的 BioRad Aminex HPX-87H(HPLC 有机分析柱 125-0140)。操作条件如下 ：
     流速 0.6mL/min
     溶剂 0.01N H2SO4
     停止时间 25min
     注射体积 5μL
     自动进样 温度控制 @10℃或 4℃
     柱温 55℃
     检测器 折射系数 (40℃ )
     使用外部标准校准曲线
     实施例 1
     构建可发酵木糖的运动发酵单胞菌菌株 ZW658
     通过一系列转座事件将两个包含编码木糖异构酶、 木酮糖激酶、 转醛醇酶和转酮 醇酶的四个木糖利用基因的操纵子 PgapxylAB 和 Pgaptaltkt 整合到 ZW1(ATCC#31821) 基因组 中， 然后在含木糖的选择培养基上适应而构建 ZW658。如美国专利申请 20030162271 所述， 以前已通过向运动发酵单胞菌 5C 的基因组进行同源重组及转座方法而整合了两个操纵子 PgapxylAxylB 和 Penotaltkt 及选择性抗生素标记， 然后通过适应和 NTG 突变构建了命名为 8b 的、 可发酵木糖的运动发酵单胞菌。在制备 ZW658 时， 使用了转座 (Epicentre′ s EZ::Tn 体外转座系统 )， 因为该方法相对于位点特异的同源重组的优势在于， 整合位点具有多种选 择， 而且插入频率相对较高。将编码木糖利用的酶的四个基因排列并克隆在两个独立的操 纵子 PgapxylAB 和 Pyaptaltkt 中以用于整合。将抗生素抗性标记——旁侧为两个 P1 噬菌体 Cre 重组酶识别序列 (loxP) 的氯霉素抗性 (Cmr) 基因克隆到每个操纵子中用于整合子的筛 选。两个操纵子的整合通过 Pgaptaltkt， 然后是 PyapxylAB 的两步连续方式完成。在两个整 合事件中均使用 Cm 抗性选择， 因为它可通过质粒上的 Cre 重组酶的表达， 然后在每次整合 后通过消除质粒而除去。该过程可允许用相同的抗生素标记进行多次筛选。更重要的是， 它允许去除引入的用于筛选整合的操纵子的抗生素标记。 该过程消除了抗生素抗性基因对 商用发酵菌株的负面影响。
     构建用于转座的 pMODPgaptaltkfCm
     如美国专利申请 20030162271( 本文实施例 9) 所述， 从 pUCtaltkt( 美国专利申请20030162271) 中通过 BgIII/Xbal 消化分离出 2.2kb 含大肠杆菌转酮醇酶 (tkt) 编码区的 DNA 片段， 并克隆到用 BamHl/Xbal 消化的 pMOD(Epicentre Biotechnologies， Madison， WI) 载体中， 得到 pMODtkt。通过将运动发酵单胞菌 gap 基因的启动子区 (Pgap ； 甘油醛 -3- 磷 酸脱氢酶 ) 与大肠杆菌转醛醇酶编码区 (tal) 进行如下融合而得到命名为 Pgaptal 的 PCR 片段。用描述在 US 5514583( 实施例 3) 中的构建体 pZB4 通过引物 SEQ ID NOs ： 1和2扩 增 Pgap 片段。pZB4 含有 Pgap-xylA/xylB 操纵子和 PENO-tal/tkt 操纵子。tal 编码区片段用 引物 SEQ ID NOs ： 3 和 4 从 pZB4 扩增。以 Pgap 和 tal 片段为模板， 通过引物 SEQ ID NOs ： 5 和 6 扩增 Pgaptal 片段。该片段用 Xbal 消化并克隆到质粒 pMODtkt 的 tkt 编码区上游。用 Cmlox(F， sfi) 和 Cmlox(R， sfi) 引物 (SEQ ID NOs ： 7 和 8)， 以 pZB186 为模板， 通过 PCR 产 生 loxP::Cm 片段。 pZB186 是运动发酵单胞菌天然质粒和 pACYC184 的组合， 如 US514583( 实 施例 3) 和 Zhang et al.((1995)Science 267 ： 240-243) 所述。最后， 将 loxP::Cm PCR 片 段插入到含 Pgaptaltkt 的质粒的 Sfil 位点， 形成整合型质粒 pMODPgaptaltktCm( 图 4)。在 该质粒中， PgaptaltktloxP::Cm 片段插入到 pMOD 载体的两个嵌合末端 ( 转座酶结合位点 )。 pMODPgaptaltktCm 质粒的完整核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 9 所示。
     pMODPgaptaltktCm 在 ZW1 中的转座和转化
     由于质粒 pMOD 是基于 pUC 的载体， 因此在发酵单胞菌中是非复制型载体。将质粒 2+ pMODPgaptaltktCm 用转座酶在存在 Mg 时， 室温下处理 1 小时， 并通过电穿孔转化 ZW1 细胞 ( 使用 BioRad GenePulser， 设置为 200ohms， 25μF 和 16kV/cm)。 将电穿孔的细胞在含 10g/ L 酵母提取物、 5g/L 胰蛋白胨、 2.5g/L(NH4)2SO4、 0.2g/LK2HPO4)， 并补加 50g/L 葡萄糖和 1mM MgSO4 的结合培养基 (MM) 中， 30℃温育 6 小时。将转化混合物涂布在补加 50g/L 葡萄糖和 120μg/mL 氯霉素， 并含 15g/L Bacto 琼脂的 MM 琼脂平板上， 在 30℃厌氧培养。约 2 天后 1 可见转化子。转化 / 转座频率约为 3x10 /μg DNA。
     共获得 39 个 Cmr 转化子克隆。挑取 21 个克隆， 并进一步通过 PCR 和酶活性检测法 进行分析。用引物 SEQ ID NOs ： 10 和 11 通过 PCR 验证在转化子中确实存在含 tal 和 tkt 编码区的 3kb DNA 片段。用来自 21 个整合子克隆的质粒 DNA 进行回复转化， 没有在大肠杆 菌中产生回复转化子， 这表明 tal 和 tkt 整合到 ZW1 的基因组中。用修改的微孔板方法对 这些整合子检测其转醛醇酶和转酮醇酶活性 ( 一般方法 )。用 Pierce BCA 蛋白检测法测 定蛋白浓度。将转化子在含 2％ (w/v) 葡萄糖， 并补加 120μg/ml 氯霉素的 RM 培养基， 在 50ml 锥形离心管中 30℃培养。对照菌株 8b 与 ZW1 进行同样培养 (ZW1 用补加 2％葡萄糖的 RM) 用于酶活性检测。当 OD600 达到 1.0 时收获细胞。将细胞洗涤 1 次并重悬在超声缓冲液 (10mM Tris-HCl， pH 7.6 和 10mM MgCl2) 中。酶活性检测如美国专利申请 20030162271 所 述。单位定义为 mole/min-mg。除 1 株外， 所有样品均具有转醛醇酶和转酮醇酶活性。
     用 tkt 探针对用 Pstl 消化的、 选择的整合子基因组和质粒 DNA 进行 Southern 杂 交。ZW1 DNA 不与 tkt 探针杂交。在所有整合子基因组 DNA 样品中可见 1 条共同的 1.5kb 带， 它是 tkt 的 Pst1 位点和 tal 的 Pst1 位点之间预期的 DNA 片段。第二个可见的高分子 量 (6kb 或更大 ) 的带是独立株系 T2、 T3、 T4 和 T5 特有的， 表明在每个株系中具有独立的基 因组整合位点。有趣的是， T5 的质粒和基因组 DNA 均与 tkt 探针杂交， 表明在 T5 的天然质 粒中也整合了 Pgaptaltkt。选择这 4 个菌株 (T2、 T3、 T4 和 T5) 进行进一步的 Cre 处理， 以 r r 除去 Cm 标记。Cre 处理以从 taltkt 整合子中除去 Cm 标记为了从染色体中除去 Cmr， 用 pZB 188/Spec-Cre 转化 T2、 T3、 T4 和 T5。该质粒是 发酵单胞菌 - 大肠杆菌穿梭载体 pZB188[Zhang et al.(1995)Science 267 ： 240-243 ； US 5514583] 的衍生物， 其包含 Cre 重组酶表达盒。除了用壮观霉素抗性基因代替卡那霉素抗 性基因， pZB188/Spec-Cre 与实施例 10 中描述的 Cre 表达载体 (pZB188/Kan-Cre) 相同。在 含 2％葡萄糖和 200μg/ml 壮观霉素的 MM 琼脂培养基上筛选转化子。将 Spr 抗性克隆挑取 到补加 2％葡萄糖和 200μg/ml 壮观霉素的 RM 琼脂平板上， RM 琼脂平板补加 2％葡萄糖和 s 120μg/mL Cm。挑取的克隆 100％是 Cm ， 这表明通过 Cre 高效去除 Cmr。将 SprCms 转化子培 养在补加 2％葡萄糖的 RM 中， 37℃进行 2 到 5 次转移， 以去除 pZB188aadACreF。在每次转 移中， 将细胞稀释并铺在补加 2％葡萄糖的 RM 琼脂平板上， 以挑取到有或无 200μg/ml Sp s 的相同培养基的其它平板上。通过 PCR 分析 Sp 克隆， 以确定 pZB188aadACreF 丢失。消除 质粒的整合子后代命名为 T2C、 T3C、 T4C 和 T5C。为了检测这些转座整合子是否是稳定的， 将这 4 个菌株培养在补加 2％葡萄糖的 RM 中， 然后转移到 10ml 相同培养基中， 37℃平行培 养 2 个检测管。将细胞每天进行转移， 共进行 10 天， 或约 100 代。在第 1 次和第 10 次转移 后将克隆稀释并铺在 RMG 平板上进行克隆分离。共 12 个来自每个菌株每次转移的克隆通 过 5′ Pgap 和 3′ tkt 引物 (SEQ ID NOs 1 和 11) 进行的检测 Pgaptaltkt 存在的克隆 PCR 检 测为阳性。也检测了第 1 次和第 10 次转移后的分离株的转醛醇酶和转酮醇酶活性 ( 如一 般方法所述 )。所有这 4 个整合子在非选择性培养基中转移 100 代后均具有相似的 TAL 和 TKT 活性水平， 这表明这些整合子是遗传稳定的。
     构建用于转座的 pMODPgapxylABCm
     下 一 步 是 进 一 步 将 PgapxylABloxP::Cm 操 纵 子 整 合 到 ZW1::Pgaptaltkt 整 合 子 (T2C、 T3C、 T4C 和 T5C) 中。 基 于 质 粒 pMODPgaptaltktCm( 图 4) 构 建 整 合 型 质 粒 pMODPgapxylABCm( 图 5)。通过 Sacl/Sfil 消化除去 PgaptaltktDNA 片段。通过连接引入含 Sacl、 Notl 和 Sfil 限制性位点的接头片段。然后将从 pZB4(US 5514583) 分离的 PgapxylAB 的 Notl 片段克隆到接头的 Notl 位点。木糖异构酶 (XI) 由 xylA 编码， 木酮糖激酶 (XK) 由 xylB 编码。pMODPgapxylABCm 质粒的完整序列如 SEQ ID NO ： 12 所示。
     pMODPgapxylABCm 在 T2C、 T3C、 T4C 和 T5C 中的转座和转化
     通过与 PgaptaltktCm 整合相似的方法， 用转座酶处理的 pMODPgapxylABCm( 如上所 述 ) 转化 / 转座 T2C、 T3C、 T4C 和 T5C。在 2 次转化 / 转座实验中通过 Cm 筛选后获得 6 个 整合子 (T3CCmX1、 T3CCmX2、 T3CCmX3、 T4CCmX1、 T5CCmX1、 T5CCmX2)。所有整合子均通过 PCR 用两组引物 ： SEQ ID NOs ： 13 和 14 及 SEQ IDNOs ： 15 和 16 验证 xylAB 的存在， 除了 T2CcmX1 和 T2CcmX6 用引物 SEQ ID NOs ： 13 和 14 没有检测到 PCR 片段。
     对包括 2 个 PCR 阴性的株系在内的整合子均检测 XI、 XK、 TAL 和 TKT 活性 ( 一般方 法 )。如图 6 和 7 所示的结果表明， 6 个 xylAB 整合子 T3CCmX1、 T3CCmX2、 T3CCmX3、 T4CCmX1、 T5CCmX1 和 T5CCmX2 均具有 XI、 XK、 TAL 和 TKT 活性。与阴性亲本对照 ( 图 6) 相比较， XI 和 XK 活性是新获得的。TAL 和 TKT 活性维持在亲本对照水平。所有这些结果表明产生了蛋白 并具有功能。酶活性水平具有差异， TI 和 XK 活性与用相同质粒转化 / 转座的 ZW1 的整合 子的活性相似。XI、 XK、 TAL 和 TKT 的活性水平比菌株 8b 的活性低。
     通过 Southern 杂交验证 xylAB 操纵子的整合。将 6 个株系的基因组和质粒 DNA 用 Sphl 消化， 并与地高辛标记的 xylB 探针杂交。在所有基因组 DNA 样品中均存在一条约3kb 的共同条带， 它是由 xylB 的 Sphl 位点和 pMOD 载体临近克隆位点的另一个 Sphl 位点 产生的， 另外， 基因组 DNA 样品中更高分子量的杂交带表明 PgapxylAB 操纵子在染色体上有 4 个整合位点。T3CCmX1 和 T3CCmX2 具有相同的整合位点， T3CCmX3 和 T4CCmX1 可能具有相 同的整合位点， T5CCmX1 和 T5CCmX2 每个具有单独的整合位点。用 PstI 消化相同的 DNA， 然 后用 tkt 探针进行 Southern 杂交， 表明每个整合子均具有与其各自亲本相同的杂交模式。
     ZW1::PgaptaltktPgapxylAB Cm 整合子在木糖培养基上的适应
     尽 管 存 在 所 有 四 种 木 糖 利 用 的 酶 活 性， 但以前的观察 ( 美国专利申请 20030162271) 表明整合子可能不立即在木糖上生长。 在木糖上的生长可通过在木糖培养基 ( 或者在试管中， 或者在平板上 ) 上延长培养而发生， 这个过程称为适应。
     将 菌 株 进 行 如 下 适 应。 将 ZW1::PgaptaltktPgapxylABCm 整 合 子 菌 株 接 种 到 含 RMX( 含 10g/l 酵母提取物、 2g/l KH2PO4、 20g/l 或 2％ (w/v) 木糖 ) 及 RMGX( 含有 0.025％ (w/ v) 葡萄糖和 4％ (w/v) 木糖的 ) 的试管或平板上。 低水平的葡萄糖用于支持最初的生长， 以 增加在适应中的突变机会。在至少 5 次培养基和平板的木糖适应试验中有 1 次是成功的。 在 30℃厌氧培养 10 天后， 用 T3CCmX1 和 T3CCmX2 细胞铺板的 MMGX 上分别可见 17 和 19 个克 隆。 克隆在平板上较小， 而且看起来不健康 ( 透明 )。 将 12 个克隆 (4 个来自 T3CCmX1 平板 ： T3CCmX11、 T3CCmX12、 T3CCmX13 和 T3CCmX110 ； 8 个来自 T3CCmX2 平板 ： T3CCmX24、 T3CCmX25、 T3CCmX26、 T3CCmX27、 T3CCmX28、 T3CCmX29、 T3CCmX211 和 T3CCmX212) 接种到 RMGCm120 中， 并转移到 3ml RMX 中进行进一步适应， 以获得能在木糖上快速生长的株系。
     在含 3ml RMX 的试管中的整合子的适应在 30℃进行。不断用 Spectronic 601 分 光光度计监测 OD600。当达到中期生长阶段 (mid-logphase) 时， 将培养物转移到新鲜 RMX 试 管中。该过程进行 7 次转移。在转移后生长速度和最终 ODs( 非线性读数 ) 均有提高。
     在第 6 次转移时， 将培养物在 RMX 平板上划线以分离单克隆。有 3 个整合子 ： T3CCmX13、 T3CCmX26 和 T3CCmX27 在 RMX 划线平板上长的比其它更快， 它们在表中和以下讨 论中被称为 X13、 X26 和 X27。为了筛选最好的木糖生长株， 分别将 TX13、 X26 和 X27 的 4 个 大 (L1-4) 和 4 个小 (S1-4) 克隆在 RMX 试管中筛选和培养， 对其生长、 糖利用和乙醇的产生 进行监测。将克隆在 30℃培养过夜， 然后接种 OD600 ＝ 0.05 到 2 个 3ml RMX 试管中。X27 在 RMG 中比其它培养物生长更慢， 因此在 6.5 小时后再次接种。 69 小时 ( 对 X27 为 62.5 小时 ) 后， 对样品进行 HPLC 分析 ( 一般方法 )。图 8 列出培养物在 69 小时 ( 对所有 X27 培养物为 62.5 小时 ) 后培养物的平均乙醇产量 ( 理论产量的％ ) 和木糖利用 (％ )。 大克隆和小克隆 之间没有显著差异。虽然 X27 在木糖上的性能比 X26 好， 但它在葡萄糖上生长更慢。因此， 选择最好的株系 X13(X13L3) 和 X26(X26L1) 的大克隆在 pH 控制的发酵中进行进一步评估。 在 37℃， 在 RMG(6％葡萄糖 )、 RMX(6％木糖 ) 和 RMGX(8％∶ 4％； 葡萄糖∶木糖 ) 中对菌株 X13L3 和 X26L1 及对照菌株 8b 进行发酵。 生长在 RMG(6％ ) 和 RMGX(8％∶ 4％ ) 中的 X13L3 和 X26L1 对葡萄糖的发酵进行的较快。 X13L3 和 X26L1 在 RMGX(8％∶ 4％ ) 中对木糖的发酵 均比菌株 8b 更慢。 另外， 在 37℃， 在 RMX(6％ ) 中， X13L3 和 X26L1 的生长均发生长时间延迟。 在 RMX(6％ ) 发酵中有几个分离株 X13b、 X13c 和 X13FL 发生回复。 对这些分离株和原始菌株 X13a(X13L3 的分离株 ) 如本实施例前述进行 Cre 处理， 以从 ZW1::PgaptaltktPgapxylABCm 菌 r r 株中除去 Cm 标记。得到的 Cre 处理的无 Cm 的整合子命名为 ： X13aC、 X13bC、 X13cC、 X13FLC 和 X26C。整合子通过在 RMX(5％ ) 中， 37℃的系列转移而在木糖培养基中的适应如前所述， 最初 ZW1::PgaptaltktPgapxylABCm 菌株在 RMX 中， 在 30℃的适应极大提 高了菌株在这些条件下的生长。 但适应的菌株在 RMX(6％ ) 中， 在 37℃生长和发酵时有长时 间延迟。为了进一步提高整合子在包括更高糖浓度和温度的优选过程条件下的木糖发酵， 在 RMX(5％ ) 中， 在 37℃继续进行演化或适应过程。 进行系列转移并筛选生长株。 在本过程 中所用的整合子包括 X13aC、 X13bC、 X13cC、 X26C 和 X13FLC。这 5 个菌株在转移到 RMX(5％ ) 中， 在 37℃进行另外 5 到 16 次转移前， 在 RMX 中 30℃培养并进行 6 次转移。在所有转移中 和转移后， 将培养物在 RMX 平板上划线， 并在 37℃培养以分离单克隆。 将大克隆在 RMX 平板 上进一步划线 3 到 4 次， 并在 37℃培养， 以纯化克隆。最后将大克隆在 RMX(5％ )， 37℃培养 进行筛选。
     对来自 RMX(5％ ) 培养基， 37℃适应的菌株的评估
     最初将系列转移后适应的 18 个分离克隆在 RMX(5％ ) 试管中， 在 37℃进行检测。 选择 12 个菌株进行第二次试管评估。在所有评估中均包括菌株 8b 进行比较。将 18 个克 隆在 RMG 中， 37℃培养过夜， 离心， 并将细胞接种到 4ml RMX(5％ ) 中， 37℃， 在试管中静置培 养以进行第一次评估。基于生长 ((OD600， 非线性 ) 和终点 HPLC 结果 ( 低残留木糖和高产量 乙醇 )， 筛选 12 个菌株进行第二次评估。 第二次评估的目标之一是检测这些菌株在木糖上生长和木糖利用能力的稳定性。 所有这 12 个菌株均进行稳定性研究， 以检测适应的菌株是否在非选择培养基上在 37℃系 列转移 50 代后是稳定的。将 RMG(5％ ) 转移前后的培养物接种到 RMX(5％ ) 试管中， 37℃ 培养进行评估。通过在 Spectronic 601 分光光度计直接读取试管来监测非线性 ODs。在 RMG 培养 50 代前和后在 RMX(5％ ) 中第 70 个小时生长的 ODs 描绘在图 9 中。结果表明多 数菌株在 RMG 中 37℃培养 50 代后仍是稳定的。也通过 HPLC 分析终点 ( 静止期 ) 上清的木 糖和乙醇浓度。 在这些培养物中的低残留木糖和高乙醇浓度支持菌株在木糖上很好生长和 发酵的事实。
     基于以上试管评估结果 ( 低残留木糖， 高乙醇浓度和更高 OD) 和以下通过高浓度 葡萄糖和 / 或木糖 ( 大于 20％ ) 及葡萄糖和木糖与乙酸盐的混合物的微滴定板生长筛选 在高糖和有乙酸盐时生长更好的菌株， 例如命名为 ZW658 的菌株 #26， 它具有最好的综合性 能。
     实施例 2
     在 37℃对木糖利用提高最多的菌株的发酵评估
     以下实施例描述木糖利用提高的发酵单胞菌菌株 ZW658 在模拟预期的生物量水 解产物的糖浓度和乙酸盐水平的发酵条件下的发酵性能。将菌株 ZW658 接种到含分别补加 10％葡萄糖 (RMG10％ )、 8％木糖 (RMX8％ )、 10％葡萄糖 +8％木糖 (RMGX10％ 8％ ) 和 10％ 葡萄糖 +8％木糖 +0.6％乙酸盐 (RMGXAc10％ 8％ 0.6％ ) 的 RM 培养基的发酵罐中。所有 的发酵在含 300ml 培养基的 Sixfors 中， 150rpm， pH5.5， 37℃进行。对发酵罐中的培养基 过夜排除氮气， 并在接种前停止。在发酵时不排除氮气。用于发酵的接种物是通过将工作 储液在 RMG5％中复苏后， 用 RMGX(10％， 4％ )， 在烧瓶中 (150rpm)37℃培养而制备的。菌株 8b 在相同条件下作为对照。如图 10 所示， ZW658 与 8b 相比较， 在 RMG10％中长的更慢 (A 和 B)， 在 RMX8％中与 8b 生长的速率相同 (C 和 D)。尽管生长速度较慢， 但图 10 表明 ZW658 的乙醇产量 (93％ ) 与 8b 在葡萄糖培养基的终点发酵时相同。在 RMX8％培养基中， ZW658
     的乙醇产量 (0.46g 乙醇 /g 糖 ) 高于 8b(0.44g 乙醇 /g 糖 )。在 RMX8％中， ZW658 比 8b 多 产生 4g/l 乙醇。有趣的是， 在 RMX8％的发酵终点， ZW658 不产生任何木糖醇， 而 8b 产生低 水平木糖醇 (0.7g/l)。如图 11 的数据表明 ZW658 比 8b 在发酵含 (C、 D) 和不含 (A、 B) 乙 酸盐 (acetate) 的 10％葡萄糖 +8％木糖中发酵的更好， 具有更多的葡萄糖和木糖消耗、 更 少的木糖醇产量和更多的乙醇产量。对两个菌株在 RMG10％ X8％中， 37℃， pH5.5 时， 在发 酵终点大部分葡萄糖均被利用， 而大部分木糖仍残留， 尽管 ZW658 比 8b 多利用了约 8g/l 木 糖。在 RMG10％ X8％中， 37℃， pH5.5 发酵， 在发酵终点 ZW658 的木糖醇产量 (4.9g/l) 显著 低于 8b(8.2g/l)。在存在乙酸盐 (6g/l) 时， 两个菌株的细胞生长均显著降低， 从而在葡萄 糖和木糖中均表现出较差的发酵性能， 虽然 ZW658 在更多的葡萄糖和木糖消耗、 更少的木 糖醇产量和更多的乙醇产量上表现出略好的发酵性能。不象在 RMX8％中一样， 两个菌株在 有或无乙酸盐的 RMG10％ X8％中均产生副产物木糖醇， 虽然与 8b 相比较， ZW658 产生更少 的木糖醇。两个菌株的发酵性能总结在表 1 中。总的来说， ZW658 比 8b 在纯的糖发酵中表 现更好。如实施例 1 所述， ZW658 没有抗生素选择标记， 这对商业应用的发酵微生物是一个 有价值的特性。
     表 1.ZW658 和 8b 乙醇产生的发酵性能总结 .
     CPI 是细胞产率系数 ： g 乙醇 /g 细胞干重
     实施例 3
     制备自杀型构建体用于在 ZW1 和 ZW658 中进行葡萄糖 - 果糖氧化还原酶 (GFOR) 基因的插入失活
     用于在 ZW1 和 ZW658 中敲除编码葡萄糖 - 果糖氧化还原酶基因的自杀型构建 体 ( ″ GFORSp-9WW ″ ) 来源于另一个以前通过宿主介导的双交换同源重组， 并以壮观霉 素抗性为选择性标记对运动发酵单胞菌 D- 乳酸脱氢酶基因插入失活的自杀型构建体 (″ pLDHSp-9WW″ )。pLDHSp-9WW 也来源于多种以前产生的构建体。下面对所有这些构建 体的最初前体是质粒载体 pNEB193(NEB#N3051S ； New EnglandBiolabs)。选择该质粒是因 为它可在大肠杆菌中复制， 但不能在运动发酵单胞菌中复制。所有参与产生 GFOR 敲除构建 体的步骤和中间体从质粒 pNEB193 开始按时间顺序进行描述。
     pLDH193 的构建
     将 pNEB 193 用 Sbfl 和 Ascl 双消化， 用于插入到如下所述的 DNA 片段中。这两个
     限制性位点是唯一的， 位于质粒的多克隆区。用 Qiagen′ s QIAQuick 纯化试剂盒 ( 货号 #28104) 根据说明书纯化 Sbfl/Ascl- 线性化的 pNEB193 质粒 DNA 片段。克隆到 pNEB193 中 的 DNA 片段是从用 Qiagen′ s Blood & Cell Culture Maxi 试剂盒 ( 货号 #13362) 分离的 菌株 ZW1 的运动发酵单胞菌基因组 DNA 通过 PCR 扩增获得的长 2268bp 的片段。用于该片 段 PCR 扩增的合成寡核苷酸是引物 1 和 2 ：
     引物 1(SEQ ID NO ： 17)
     CTACTCATTTcctgcaggTGGTAACTCATTGCGCGCTC
     引物 2(SEQ ID NO ： 18)
     CATCTTACTggcgcgccAAAAATCTGCGGCTGACATAC
     引 物 1( 正 向 引 物 ) 的 下 划 线 碱 基 与 GenBank 登 录 号 AE008692 的 核 苷 酸 1262739-1262720 在编码磷酸甘油酸变位酶 (pgm) 的开放阅读框的 3’ 末端杂交， 而小写字 母对应于添加到引物 5’ 末端的 Sbfl 位点。引物 2( 反向引物 ) 的下划线碱基与 GenBank 登录号 AE008692 的核苷酸 1260490-1260472 杂交， 其正处于编码乙醇脱氢酶 (adhl) 的开 放阅读框的上游， 而小写字母对应于添加到引物 5’ 末端的 Ascl 位点。因此， 作为 PCR 扩增 靶的 2268bp DNA 片段由以下元件组成， 起始于 Sbfl 位点， 终止于 Ascl 位点 ： (a)pgm 基因 3’ 末端 ； (b) 编码 D- 乳酸脱氢酶的完整的 ldh 基因， 和 (c)adhl 基因的 5’ 非编码区。用 Sbfl 和 Ascl 切割 PCR 产物， 将得到的 DNA 片段连接到前述 Sbfl/Ascl- 线性化的 pNEB 193 载体中。用连接反应混合物转化大肠杆菌 JM 110， 并将转化的细胞涂布在含氨苄青霉素 (100μg/ml) 的 LB 培养基上。最初用重悬克隆和引物 1 和 2 通过 PCR(“克隆 PCR” ) 来鉴 定含具有正确大小插入的质粒的氨苄青霉素抗性转化子。然后用 Sbfl 和 Ascl 限制性消化 分析来验证阳性克隆， 并对用氨苄青霉素抗性转化子进行克隆 PCR 产生的 2268bp 片段进行 DNA 序列分析。选择进行进一步操作的质粒以下命名为 pLDH193。
     pLDHTc139#7 的构建
     质粒 pLDH193 具有唯一的 Ncol 位点， 临近于 ldh 开放阅读框的中部。该位点 用于插入赋予四环素抗性的 DNA 片段。本操作所用的四环素抗性盒 (Tcr- 盒 ) 以质粒 pACYC184(GenBank 登录号 X06403) 为 DNA 模板， 引物 3 和 4 为 PCR 引物， 通过 PCR 产生。
     引物 3(SEQ ID NO ： 19)
     ACTCATTTccatggCGATCGCACTATgcggccgcAATGTAGCACCTGAAGTCAGCC
     引物 4(SEQ ID NO ： 20)
     ATCTCACTccatggCCGGCCAACTAttaattaaGAATTGATTGGCTCCAATTCTTG
     引物 3( 正向引物 ) 的粗体下划线碱基与四环素抗性基因上游杂交。引物 3 的 5’ 末端也具有 3 个限制性位点 (Ncol、 AsiSl 和 Notl)。Ncol 位点是小写字母。AsiSl 位点 是细下划线。Notl 位点是斜体小写字母。引物 4( 反向引物 ) 的粗体下划线碱基与四环素 抗性基因终止密码子下游杂交， 该引物也具有添加到其 5’ 末端的 3 个限制性位点 (Ncol、 Fsel 和 Pacl)。与上面标记相同， Ncol 位点是小写字母， Fsel 位点是细下划线， Pacl 位点 r 是斜体小写字母。用 Ncol 切割通过引物 3 和 4 产生的 1448bp 的 Tc - 盒， 并通过制备型凝 胶电泳进行纯化。然后将得到的 DNA 片段连接到质粒 pLDH193 的 ldh 开放阅读框的唯一的 Ncol 位点中。为了使没有插入片段的载体的自环化可能性最小， 在连接前将 Ncol- 消化的 pNEB193 用小牛肠碱性磷酸酶进行去磷酸化。 将连接反应混合物引入到大肠杆菌 JM110 中，并将转化的细胞涂布含 20μg/ml 四环素的 LB 平板。用 Ncol、 AsiSl、 Notl、 Fsel 和 Pacl 限 制性消化分析来鉴定含具有正确大小插入的质粒的四环素抗性转化子， 并用合适的引物通 r 过 PCR 分析来验证 Tc - 盒的方向。筛选进行进一步操作的质粒 (pLDHTc 139#7) 的环状图 谱如图 12 所示。 在此处未描述的实验中， 该自杀型构建体用于在 ZW1 中通过宿主介导的、 双 交换同源重组， 并在四环素上生长作为筛选而进行 D- 乳酸脱氢酶基因的插入失活 ( 即 “破 坏” 或 “敲除” )。
     pLDHTc139#7-9WW 的构建
     已证明 pLDHTc139#7 可在 ZW1 中用于 “敲除” D- 乳酸脱氢酶基因， 因此下一步是 修饰该构建体， 使其可在基因破坏后， 通过 Cre 重组酶从染色体中除去筛选标记。为了达到 r 该目标， 利用 Tc - 盒旁侧的 4 个限制性位点， 即 5’ 末端的 AsiSl 和 Notl 和 3’ 末端的 Pacl 和 Fsel 将两个野生型 loxP 位点 (Lee and Saito， 1998) 添加到 pLDHTc139#7 中。在用两 个酶切割构建体并纯化得到的大 DNA 片段后， 第一个 loxP 位点插入到质粒 pLDHTc139#7 的 AsiSl 和 Notl 位点之间。插入到该位置的 loxP 位点用两个合成的、 5’ 末端磷酸化的寡核 苷酸 5 和 6(SEQID NOs ： 21 和 22) 产生。
     寡核苷酸 5(SEQ ID NO ： 21) ；
     cgcATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATgc
     寡核苷酸 6(SEQ ID NO ： 22) ：
     ggccgcATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATgcgat
     这些寡核苷酸相互补， 退火后形成全长双链野生型 loxP 位点， 在两端有单链突 出， 从而使 DNA 片段连接到 pLDHTc139#7 的 AsiSl 和 Notl 位点。寡核苷酸的大写字母对应 于全长野生型 loxP 位点， 而小写字母表示用于连接双链 DNA 片段到 pLDHTc139#7 的 AsiSl 和 Notl 位点的核苷酸。
     用连接反应混合物转化大肠杆菌 DH10B， 并在含 20μg/ml 四环素的 LB 平板上涂布 转化细胞。通过限制性消化分析、 克隆 PCR 和相关区域的 DNA 序列分析来鉴定含具有正确 插入到 pLDHTc139#7 的 AsiSl 和 Notl 位点的 loxP 位点的质粒的四环素抗性转化子。选择 进行进一步操作的质粒以下命名为 pLDHTc139#7-9W。
     然后在用酶切割质粒并纯化得到的大载体片段后， 将第二个野生型 loxP 位点插 r 入到 pLDHTc139#7-9W 的 Tc - 盒另一端的 Pacl 和 Fsel 位点之间。插入到该位置的 loxP 位 点用两个合成的、 5’ 末端磷酸化的寡核苷酸 7 和 8(SEQ ID NOs ： 23 和 24) 产生。
     寡核苷酸 7(SEQ ID NO ： 23) ：
     taaATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATggccgg
     寡核苷酸 8(SEQ ID NO ： 24) ：
     ccATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATttaat
     寡核苷酸 7 和 8 相互互补， 退火后形成全长双链野生型 loxP 位点， 在两端有单链 突出， 从而使 DNA 片段连接到 pLDHTc139#7-9W 的 Pacl 和 Fsel 位点。寡核苷酸的大写字母 对应于全长野生型 loxP 位点， 而小写字母表示用于连接双链 DNA 片段到 pLDHTc139#7-9W 的 Pacl 和 Fsel 位点的核苷酸。
     用连接反应混合物转化大肠杆菌 DH10B， 并在含 20μg/ml 四环素的 LB 平板上涂布 转化细胞。通过限制性消化分析、 克隆 PCR 和相关区域的 DNA 序列分析来鉴定含具有正确插入到 pLDHTc139#7-9W 的 Pacl 和 Fsel 位点的 loxP 位点的质粒的四环素抗性转化子。选 择进行进一步操作的质粒以下命名为 pLDHTc139#7-9WW。该构建体的环状图谱如图 12 所 示。
     pLDHSp-9WW 的构建
     pLDHSp-9WW 与 pLDHTc139#7-9WW 相同， 但后一个构建体的四环素抗性盒被赋予壮 观霉素抗性的 DNA 片段 ( 即 Spec- 盒 ) 代替。后者以质粒 pHP15578(Cahoon et al， 2003) r 为模板， 用引物 9 和 10 通过 PCR 产生。pHP15578 含 Spec - 盒及其启动子的完整核苷酸序 列， 它基于转座子 Tn7 编码 3′ (9)-O- 核苷酸转移酶的 aadA 基因的公开序列 (GenBank 登 录号 X03403)。
     引物 9(SEQ ID NO ： 25)
     ATAAAAgcggccgcAGCACAGGATGA
     引物 10(SEQ ID NO ： 26)
     GGCGttaattaaGGCAGGTCAGCAAG
     引 物 9( 正 向 引 物 ) 的 下 划 线 碱 基 与 Specr- 盒 启 动 子 上 游 (GenBank 登 录 号 X03043 nts6-17) 杂交， 而小写字母对应于添加到引物 5’ 末端的 Notl 位点。引物 10( 反 r 向引物 ) 的下划线碱基与 Spec - 盒终止密码子下游约 130 碱基处 (GenBank 登录号 X03043 nts1006-1019) 杂 交， 而 小 写 字 母 对 应 于 添 加 到 引 物 5’末 端 的 Pacl 位 点。 将 1040bp r PCR- 产生的 Spec - 盒用 Notl 和 Pacl 双消化， 通过琼脂糖凝胶电泳纯化 DNA 片段。将质粒 pLDHTc139#7-9WW 也用相同的两个限制性酶切割以除去 Tcr- 盒， 并将得到的大载体片段通 过琼脂糖凝胶电泳纯化。然后将两个目的 DNA 片段连接在一起， 并将转化反应混合物通过 电穿孔引入大肠杆菌 DH10B 中。将转化子涂布在含壮观霉素 (200μg/ml) 的 LB 培养基上， 并在 37℃培养。通过 Notl 和 Pacl 的限制性消化分析鉴定含具有正确大小插入片段的质 粒的壮观霉素抗性转化子， 选择进一步操作的质粒以下命名为 pLDHSp-9WW ； 该构建体的环 状图谱如图 12 所示。在此处未描述的实验中， 在 ZW1 中用 pLDHSp-9WW 通过对壮观霉素抗 性为选择标记敲除 D- 乳酸脱氢酶基因。用自杀型构建体进行的基因失活通过宿主介导的 双交换同源重组发生 (WO 01/83784A2)， 这使得旁侧为两个野生型 loxP 位点的 ldh 开放阅 r 读框中部插入选择性标记 (Spec - 盒 )。双交换事件通过 pLDHSp-9WW 中 Specr- 盒旁侧的 两个 DNA 片段定位于 ldh 基因。这些片段其中之一 ( 以下指 5’ ldh 旁侧 DNA) 在 Specr- 盒 上游， 位于 Sbfl 和 AsiSl 位点之间。这一约 1100bp 的 DNA 片段的核苷酸序列与编码 pgm 基因 3’ 末端及 ldh 开放阅读框约前一半的 ZW1 染色体 DNA 相同。另一 DNA 片段 ( 以下指 3′ ldh 旁侧 DNA) 位于 Fsel 和 Ascl 位点之间的 Specr- 盒的反向末端。3′ ldh 旁侧 DNA 的核苷酸序列 ( 也为约 1100bp) 与编码 ldh 基因另一半和部分 adhl 基因 5′非翻译区的染 色体 DNA 相同。当 5′和 3′ ldh 旁侧 DNA 片段与其染色体互补部分相互作用并进行同源 重组时发生双交换事件。 该现象基本不可逆， 完全由宿主酶系统介导， 可通过在开放阅读框 r 中间插入 Spec - 盒而使染色体 ldh 基因失活。由于构建体不能在运动发酵单胞菌中复制， 使其成为自杀型构建体， 因此用 pLDHSp-9WW 产生稳定的壮观霉素抗性克隆的唯一方法是 通过同源重组发生的双交换事件 ( 除了在极低频率发生的自发药物抗性突变体 )。需要注 意的是通过双交换事件插入到染色体中的 Specr- 盒仍然夹在存在于自杀型构建体中的两 个野生型 loxP 位点之间。由于这种安排易于通过实施例 10 所述的 Cre 表达载体从 D- 乳酸脱氢酶基因中除去选择标记， 但不重新激活该基因。
     pGFORSp-9WW 的构建
     将 pLDHSp-9WW 在如下所述的 2 步流程中转变为用于运动发酵单胞菌葡萄糖 - 果 糖氧化还原酶 (GFOR) 基因失活的自杀型构建体。第一步是除去 3′ ldh 旁侧 DNA， 并用将 质粒定位到编码 GFOR 的染色体基因的类似 DNA 片段代替。后一个 DNA 片段 ( 以下称为 3′ GFOR 旁侧 DNA) 以 ZW1 基因组 DNA 为模板， 用引物 11 和 12 为 PCR 引物通过 PCR 产生。
     引物 11(SEQ ID NO ： 27)
     CTACTCATggccggccTCAGAACGATCCTGCACAGC
     引物 12(SEQ ID NO ： 28)
     CATCTTACTggcgcgccGGACGAGGTTCATCATCAGG
     引物 11( 正向引物 ) 的下划线碱基与对应于 GFOR 开放阅读框中部的 GenBank 登 录号为 AE008692 的核苷酸 684324-684305 杂交， 而小写字母对应于添加于引物 5’ 末端的 Fsel 位点。引物 12( 反向引物 ) 的下划线碱基与对应于 GFOR 终止密码子下游约 625bp 的 GenBank 登录号为 AE008692 的核苷酸 683124-683143 杂交， 而小写字母对应于添加到引物 5’ 末端的 Ascl 位点。用 Fsel 和 Ascl 切割 1234bp PCR 片段。也用相同的限制性酶切割 pLDHSp-9WW， 以除去 3′ ldh 旁侧 DNA， 并通过琼脂糖凝胶电泳纯化该操作中获得的大载体 片段。然后将 PCR- 产生的 3 ′ GFOR 旁侧 DNA 连接在上述凝胶纯化的大载体片段的 Fsel 和 Ascl 位点， 并将一份连接反应混合物通过电穿孔转化到大肠杆菌 DH10B 中。将转化的细 胞涂布在含 200μg/ml 壮观霉素的 LB 培养基上， 并将平板在 37℃培养。通过克隆 PCR 和 Fsel 和 Ascl 的限制性消化分析鉴定含具有正确大小插入片段的质粒的壮观霉素抗性转化 子， 选择进一步操作的质粒以下命名为 pLDH/GFORSp-9WW。
     下一步是从 pLDH/GFORSp-9WW 中除去 5′ ldh 旁侧 DNA， 并用 5′ GFOR 旁侧 DNA 替 代， 从而在选择破坏 GFOR 开放阅读框的染色体靶处发生双交换事件。以 ZW1 基因组 DNA 为 模板， 引物 13 和 14 为 PCR 引物， 通过 PCR 产生 5′ GFOR 旁侧 DNA 片段。
     引物 13(SEQ ID NO ： 29) ：
     CTACTCATatgcatGTCCAGAAAAGACAGCATTCC
     引物 14(SEQ ID NO ： 30) ：
     CATCTTACTgcgatcgcTGCACGGTTCATTGGAT
     引物 13( 正向引物 ) 的下划线碱基与对应于 GFOR 起始密码子上游约 520bp 的 而小写字母对应于添加到引物 GenBank 登录号为 AE008692 的核苷酸 685584-685564 杂交， 5’ 末端的 Nsil 位点。引物 14( 反向引物 ) 的下划线碱基与对应于临近 GFOR 开放阅读框中 部及引物 11 结合位点上游的、 GenBank 登录号为 AE008692 的核苷酸 684396-684415 杂交， 而小写字母对应于添加到引物 5’ 末端的 AsiSl 位点。用 Nsil 和 AsiSl 切割 1217bp PCR 产 物， 也用 Sbfl 和 AsiSl 双消化 pLDH/GFORSp-9WW， 以除去 5′ ldh 旁侧 DNA ； 并通过琼脂糖凝 胶电泳纯化该操作中获得的大载体片段。然后将 PCR 产生的 5′ GFOR 旁侧 DNA 连接在上述 凝胶纯化的大载体片段的 Sbfl 和 AsiSl 位点间， 并将一份连接反应混合物通过电穿孔转化 到大肠杆菌 SCS110( 它是 dcm 和 dam ) 中， 以获得非甲基化的质粒 DNA 进行 ZW1 和 ZW658 的 后续转化， 在以下实施例 5 和 7 中详细描述。 值得注意的是将非甲基化质粒 DNA 用于来源于 ZW4 的运动发酵单胞菌的转化对成功非常关键， 因为从野生型大肠杆菌菌株， 例如 DH10B 中分离的甲基化质粒 DNA 易于被宿主的限制 / 修饰系统破坏 ( 如 US 6566107B1 所述 )。另外 值得注意的是 Nsil 和 Sbfl 具有互补的粘性末端， 但当它们连接后， 则两个位点均被破坏。 将转化子涂布在含 100μg/ml 壮观霉素的 LB 培养基上， 并将平板在 37℃培养。通过克隆 PCR 和限制性消化分析鉴定含具有正确大小插入片段的质粒的壮观霉素抗性转化子。得到 的用于在 ZW1 和 ZW658 中敲除 GFOR 基因的自杀型构建体以下命名为 pGFORSp-9WW。该质粒 的环状图谱如图 12 所示， 其完整核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 31 中所示。需要注意的是该自 杀型构建体和运动发酵单胞菌染色体 GROR 基因之间的双交换事件会导致插入两个野生型 loxP 位点旁侧的 Specr- 盒， 与上述 pLDH-Spec-9WW 的情况类似。
     实施例 4
     生成针对运动发酵单胞菌的大肠杆菌木糖异构酶表达载体
     如下所述， 以大肠杆菌 / 运动发酵单胞菌穿梭载体 (pZB188) 为起始材料构建在运 动发酵单胞菌中表达大肠杆菌木糖异构酶的质粒构建体 (pZB188/Kan-XylA)( 图 13)。 参与 构建 pZB188 的步骤描述在 US 5,514,583 中。简言之， 该 7008bp 质粒可在大肠杆菌和运动 发酵单胞菌中复制， 因为它具有两个不同的复制原点， 分别针对每个细菌种类。pZB188 也 r 包含赋予四环素抗性的 DNA 片段 ( 即 Tc - 盒 )。构建 pZB188/Kan-XylA 的第一步是从 pZB 188 中除去 Tcr- 盒， 并用赋予卡那霉素抗性的 DNA 片段 ( 即 Kanr- 盒 ) 代替。 为了从 pZB188 r 中除去 Tc - 盒， 将质粒用 Xbal 和 BssHll 切割， 并通过琼脂糖凝胶电泳纯化得到的大载体片 段。以质粒 pET-24a(Novagen) 为模板， 通过引物 15 和 16 进行 PCR 扩增以产生 Kanr- 盒。 pET-24a 含有 Kanr 基因的完整开放阅读框及其相关启动子。
     引物 15(SEQ ID NO ： 32) ： GCtctagaGCAGCAGATTACGCGC
     引物 16(SEQ ID NO ： 33) ： ACATTGgcgcgcTTAGAAAAACTCATC
     引物 15( 正向引物 ) 的下划线碱基与对应于 pET-24a 的 Kanr 基因起始密码子上 游约 160bp 处杂交， 而小写字母对应于添加到引物 5’ 末端的 Xbal 位点。引物 16( 反向引 r 物 ) 的下划线碱基与对应于 Kan 基因包括终止密码子的开放阅读框另一端杂交， 而小写字 母对应于添加到引物 5’ 末端的 BssHll 位点。用 Xbal 和 Bsshll 切割 991bp PCR 产生的 r Kan - 盒， 并通过琼脂糖凝胶电泳进行纯化。
     然后通过标准连接反应将得到的 DNA 片段插入到上述 pZB188DNA 片段的 Xbal 和 BssHll 位点。通过电穿孔将转化反应混合物引入大肠杆菌 DH10B 中， 将细胞涂布在含卡那 霉素 (50μg/ml) 的 LB 培养基上 ； 并在 37℃培养。从卡那霉素抗性转化子中分离质粒 DNA， 并将得到的构建体以下命名为 pZB188/Kan ； 该穿梭载体的环状图谱如图 13 所示。
     在下一步中， 将大肠杆菌木糖异构酶表达盒插入到用 Ncol 和 Acll 双酶切的质粒 pZB188/Kan 的 Ncol 和 Acll 位点之间， 通过琼脂糖凝胶电泳纯化的大载体片段。作为大肠 杆菌木糖异构酶表达盒的约 2KbpDNA 片段来源于用 Ncol 和 Clal 切割并通过琼脂糖凝胶电 泳纯化相关 DNA 片段的质粒 pZB4。质粒 pZB4 在 US 5514583 中有详细描述， 大肠杆菌表达 盒 PgapxylA(SEQ ID NO ： 34) 的示意图如图 13 框出的图谱所示。
     Ncol 和 Clal 位点分别位于大肠杆菌木糖异构酶表达盒的 5′和 3′末端。如 US 5514583 所述， 该片段包含强的组成型运动发酵单胞菌甘油醛 3- 磷酸脱氢酶 (GAP) 启动子， 它是恰好与编码木糖异构酶的大肠杆菌 xylA 基因的完整开放阅读框融合在一起的。它在 紧邻木糖异构酶终止密码子处也包含小的茎环区。 通过标准连接反应将大肠杆菌木糖异构酶表达盒插入到 pZB188/Kan 的 Ncol 和 Acll 位点之间。需要注意的是 Clal 和 Acll 产生 互补的 “粘性末端” ， 但它们连接后则两个位点均被破坏。然后将连接反应混合物通过电穿 孔转化到大肠杆菌 SSC110(dGm-， dam-) 中， 以获得非甲基化质粒 DNA 进行以下实施例 6 所 述的运动发酵单胞菌的转化， 并将转化的细胞涂布在含卡那霉素 (50μg/ml) 的 LB 培养基 上， 37℃培养。通过限制性消化分析和克隆 PCR 鉴定含具有正确大小插入片段的质粒的卡 那霉素抗性转化子。 用于在运动发酵单胞菌中表达大肠杆菌木糖异构酶的质粒以下命名为 “pZB188/Kan-XylA” ， 该构建体的环状图谱如图 13 所示。
     实施例 5
     产生 ZW1GFOR 敲除突变体
     为了在 ZW1( 衍生 ZW658 的野生型菌株 ) 中除去 GFOR 酶活性， 使用了在实施例 3 中 详细描述的自杀型构建体 pGFORSp-9WW。将非复制型质粒 DNA 通过电穿孔引入到细菌宿主 中， 基本如 US 5514583 所述。简言之， DNA 转化反应包括 50μl 含约 1010 细胞 /ml 的 10％ (v/v) 甘油和约 0.9ug 如实施例 3 所述从大肠杆菌 SSC110 分离的非甲基化质粒 DNA。对照 反应进行相同处理， 只是不加入任何质粒 DNA。电穿孔仪设置为 16kv/cm、 200Ω、 25μF， 电 转杯的缺口宽度为 0.1cm。电穿孔后， 将转化反应物用 1.0ml MMG 培养基 (50g/L 葡萄糖、 10g/L 酵母提取物、 5g/L 胰蛋白胨、 2.5g/L(NH4)2SO4、 0.2g/L K2HPO4 和 1mM MgSO4) 稀释， 并 将细胞在 30℃复苏约 5 小时。然后在无菌 1.5-ml 离心管中通过室温下离心 (13,000X g， 5min) 收获细胞， 并小心除去上清。将细胞沉淀重悬在 150μl 液体 MMG 培养基中， 用 50 和 100μl 细胞悬浮液涂布含 1.5％琼脂和 200μg/ml 壮观霉素的 MMG 培养基上。将平板在厌 氧培养箱 30℃培养， 在 2 到 3 天后在实验平板上出现 50 到 150 个克隆。这时在对照平板上 没有壮观霉素抗性克隆， 虽然在另外 48 小时培养时间后会出现少许克隆。选择从转化中得 到的 2 个具有 GFOR 敲除构建体的壮观霉素抗性克隆用于以下进一步的操作。
     以前用运动发酵单胞菌和与 pGFORSp-9WW 类似的自杀型构建体进行的实验表明， 最初染色体和质粒 DNA 的整合是在两个靶位点之一的单交换事件， 单交换事件最后发展为 双交换事件。 双交换事件的转变通常在含针对自杀型构建体的选择性试剂的液体培养基中 进行一系列转移后很快发生。为了利于两个选择的 ZW1 转化子发生由 GFOR 敲除构建体介 导的双交换事件， 将细胞接种到 10ml 含 100g/L 葡萄糖和 200μg/ml 壮观霉素的 RM 培养基 (10g/L 酵母提取物和 2g/LKH2PO4) 中。在 30℃培养 24 小时后， 两个培养物均达到静止期。 然后， 用 10μl 第一代培养物接种 10ml 相同的生长培养基， 在 30℃培养 24 小时后， 两个培 养物也均达到静止期。 最后， 用 10μl 第二代培养物接种 10ml 相同的生长培养基， 并在 30℃ 再培养 24 小时。在液体培养基中进行最后一次转移后， 将第三代培养物稀释并涂布在含壮 观霉素 (200μg/ml) 的 MMG 培养基上以获得单克隆， 平板在 30℃厌氧条件下培养 48 小时。
     用 3 对不同的引物通过克隆 PCR 实验验证双交换事件确实发生。第一对 PCR 引 物仅扩增自杀型构建体的 5′ GFOR 旁侧 DNA 与其染色体互补区进行单交换事件而产生正 确大小的 DNA 片段。同样， 第二对 PCR 引物仅扩增自杀型构建体的 3′ GFOR 旁侧 DNA 与其 染色体互补区进行单交换事件而产生正确大小的 DNA 片段。最后， 第三对 PCR 引物仅扩增 发生双交换事件， 并排除单和双交换事件混合群体而产生正确大小的 DNA 片段。用于本分 析中的两个壮观霉素抗性克隆来源于两个不同的具有自杀型构建体的 ZW1 电穿孔反应的 原始转化子， 在液体培养基中转移 3 次， 涂布以获得上述单克隆， 本实验的对照是亲本菌株ZW1。由于两个转化子用 3 对不同的引物对均产生阳性结果， 因此只选择其中一个进行以下 分析。该菌株 (ZW1GFOR 敲除突变体 ) 以下命名为 ZW1-ΔGFOR。
     实施例 6
     在生理条件下葡萄糖 - 果糖氧化还原酶是木糖醇形成的主要贡献者
     用 ZW1GFOR 敲除突变体 (ZW1-ΔGFOR) 检测假说 ： 在利用木糖的运动发酵单胞菌重 组菌株中木糖醇的形成至少部分由周质空间的酶 GFOR， 或其也具有酶活性的更大分子量的 胞质前体介导 (Loos etal.， 同上 )。如实施例 2( 图 11) 所示， 木糖醇是利用木糖的菌株 8b 和 ZW658 的主要副产物， 但它仅在生长培养基中存在木糖时形成。虽然野生型运动发酵单 胞菌菌株， 例如 CP4 具有可直接还原木糖为木糖醇的 NADPH 依赖的醛糖还原酶 (Feldmann et al， 同上 )， 但可能在生长培养基中含有木糖或葡萄糖和木糖混合物时， GFOR 也在体内参 与木糖醇的形成， 如图表 II 和 III 所示。 但对这些发生的任何一个反应， 酶都需要接近木酮 糖， 因为该化合物是 GFOR 介导的木糖醇产生的专性 (obligatory) 电子接纳体， 如体外 GFOR 酶性状检测 (Zachariou and Scopes， 同上 ) 和用粗无细胞提取物进行的实验 (Danielson 同上 ) 所示。在构建的利用木糖生长的运动发酵单胞菌中， 木糖醇合成必需的木酮糖可通 过催化木糖代谢 ( 图 1) 第一个步骤的木糖异构酶产生， 该酶在野生型菌株， 例如 ZW1 中不 存在。
     为了检测在生长培养基中存在木糖和葡萄糖时 GFOR 产生木糖醇的可能性， 将如 实施例 4 所述的大肠杆菌木糖异构酶表达载体 (pZB188/Kan-XylA) 导入 ZWl 和 ZWl-ΔGFOR 中。其策略是在不能利用这些糖生长的两个菌株中提供从木糖转变为木酮糖的途径， 并测 定 GFOR 是否可产生木糖醇。用于转化的电穿孔流程基本如实施例 5 所述， 但在复苏阶段后 将转化的细胞涂布在含 300μg/ml 卡那霉素的 MMG 培养基上。将 ZW1 和 ZW1-ΔGFOR 也用 与 pZB188/Kan-XylA 相同但不含大肠杆菌木糖异构酶表达盒的 pZB188/Kan( 图 13) 转化， 作为本实验的对照。通过克隆 PCR 鉴定含 pZB188/Kan-XylA 或对照质粒的卡那霉素抗性 克隆， 并随机选择每个转化反应的代表性克隆进行如图 14 所示的实验。这 4 个含质粒的 菌株以下命名为 ZW1(pZB188/Kan)、 ZW1(pZB188/Kan-XylA)、 ZW1-ΔGFOR(pZB188/Kan) 和 ZW1-ΔGFOR(pZB 188/Kan-XylA)。
     将在 30℃下， 过夜培养物培养在含 5ml 60g/L 葡萄糖、 10g/L 酵母提取物、 10g/L KH2PO4、 2g/L(NH4)2SO4、 1g/L MgSO2(7H2O) 和 300μg/ml 卡那霉素的 15ml 带盖试管中。然后 用每份过夜培养物接种含相同生长培养基， 存在或不存在 20g/L 木糖的 20ml 培养物 ( 在 50-ml 带盖试管中 ) 中。在 30℃轻轻振荡培养， 最初 OD600 值为～ 0.1。培养 0、 24、 48 和 120 小时后除去 1.0ml 培养物， 用具有折光率检测器 (Hewlett-Packard， Palo Alto， CA) 的 HP 1100 进行 HPLC 分析， 以检测发酵液中存在的木糖、 木酮糖和木糖醇浓度。 在进行 HPLC 分析 前， 通过离心除去细胞， 并将上清通过 0.22μm 醋酸纤维素 Spin-X 离心管过滤器 (Costar， catalog number 8160) 以除去小颗粒。在 AminexHPX-87H 柱 (Bio-Rad) 上， 在 55℃， 无梯 度条件下以流速 0.6ml/min， 0.01N H2SO4 为流动相分离化合物。用已知浓度的标准品定量 目标峰， 所有结果表示为 g/L。
     结果表明， 当具有 “空” 载体的对照菌株 ZW1(pZB188/Kan) 在存在葡萄糖和木糖的 条件下进行培养时， 在 120 小时培养时间后， 生长培养基中仅有小量木糖醇积累 ( 图 14A)。 该菌株木糖醇的最大量为＜ 0.5g/L。相反， 当 ZW1(pZB188/Kan) 生长在相同浓度的葡萄糖但没有木糖的条件下， 则没有木糖醇产生， 对其它 3 个菌株也是这样。因此， 只有在存在葡 萄糖和木糖时进行的实验如图 14 所示。显然， 大肠杆菌木糖异构酶在 ZW1 中的表达极大增 加了发酵液中木糖醇的量， 到 120 小时， ZW1(pZB188/Kan-XylA) 比 ZW1(pZB188/Kan) 多产 生 5 倍的该化合物 ( 图 14B)。如预期一样， 木糖异构酶在 ZW1 中的表达也导致木酮糖的产 生， 因为木糖异构酶催化木糖到木酮糖的异构化。 需注意的是在本实验中， 加到生长培养基 中约 16％的总木糖转变为木酮糖或木糖醇。 另外值得注意的是在这两个化合物之间存在明 显的前体 / 产物的关系 ( 木酮糖降低， 则木糖醇增加 )， 这与在培养基中存在葡萄糖和木糖 时， GFOR 在生理条件下可将木酮糖转变为木糖醇的假说相一致。
     与 ZW1 相似， ZW1-ΔGFOR 在没有木糖异构酶表达载体时产生极少的木糖醇 ( 图 14C)。在这些条件下形成的小量木糖醇可能来自 NADPH 依赖的醛糖还原酶， 如 Feldmann et al.(1992 同上 ) 所述。令人惊讶的是， 与用 ZW1(pZB188/Kan-XylA) 获得的结果相比 较， 当木糖异构酶在 ZW1GFOR 敲除突变体中表达时， 没有额外的木糖醇产生 ( 图 14D)。 ZW1-ΔGFOR(pZB 188/Kan-XylA) 确实产生了大量木酮糖， 形成的该化合物的量与由相应 ZW1 菌株 ( 即 ZW1(pZB188/Kan-XylA) 产生的木酮糖和木糖醇的总量一样。 这些实验清楚表 明， 当酶接近木酮糖时， GFOR 在体内参与木糖醇的形成， 这种情况在葡萄糖和木糖混合物中 培养的、 利用木糖的运动发酵单胞菌重组菌株中确实发生。这些结果进一步表明当运动发 酵单胞菌重组菌株在含木糖的培养基生长时， NADPH- 依赖的醛糖还原酶对木糖醇的产生不 具有重要作用， 这与文献 (Feldmann et al， 同上 ； Kim et al， 同上 ) 的预期相矛盾。
     实施例 7
     ZW658GFOR 敲除突变体的产生及该菌株不产生功能性 GFOR 酶的验证
     在 ZW658 中， 在存在葡萄糖和木糖醇时， 在生理条件下， 编码如实施例 6 所述的、 参 与运动发酵单胞菌中木糖醇形成的 GFOR 基因通过自杀型构建体 pGFORSp-9WW( 如实施例 3 所述 ) 进行插入失活。 该流程中的所有步骤与实施例 5 中所述的 ZW1GFOR 敲除突变体相同， 包括用 3 组 PCR 引物验证双交换事件。选择进行进一步所述实验的 ZW658 敲除突变体以下 命名为 ZW800。
     为了验证 ZW800 不产生在生理反应中由 GFOR 催化的、 从葡萄糖和果糖产生山梨糖 醇的酶， 进行了以下实验。将 1.5 毫升 ZW800 和亲本 ZW658 培养物在 30℃， 在 10ml 带盖试 管中的含 75g/L 葡萄糖、 25g/L 木糖、 10g/L 酵母提取物、 2g/L KH2PO4 和 1g/L MgSO4 的液体 培养基中培养到早期静止期。 当培养物达到 OD600 约 5.5 时， 通过离心收获细胞， 仔细除去上 清并抛弃。然后将细胞沉淀重悬在 5ml 含以下组分的新鲜生长培养基中 ： 110g/L 葡萄糖、 110g/L 果糖、 10g/L 酵母提取物、 2g/L KH2PO4、 1g/L MgSO4 和 4g/L KHCO3。以上所有步骤在 无菌条件下进行， 生长培养基的最初 pH 在细胞重悬前用浓磷酸调整到 5.8。然后将得到的 培养物在 30℃培养， 并轻轻振荡 (150rpm)， 在如表 2 所示的时间点除去样品， 并用如实施例 6 所述的相同流程进行发酵液的 HPLC 分析。 本实验的目标峰是葡萄糖、 果糖、 山梨糖醇和乙 醇， 用已知量的标准品计算离心除去细胞后它们在发酵液中的浓度 ； 表 2 的所有浓度表示 为 g/L。
     表 2ZW658 和 ZW800 中山梨糖醇的产生——体外测定
     31101861385 A CN 101861386说小时 0 23 47 0 23 47 葡萄糖 110 5.99 1.55 110 0 0明书果糖 110 61.43 21.98 110 60.44 6.79 山梨糖醇 0 45.99 45.89 0 0 10.21 乙醇 0 49.36 69.04 0 73.85 96.2130/37 页菌株 ZW658 ZW658 ZW658 ZW800 ZW800 ZW800
     如表 2 所示， ZW658 培养物在 23 小时后消耗了几乎所有葡萄糖和约一半的果糖， 并产生相当量的山梨糖醇和乙醇为主要产物 ； 后两个化合物的值在第一个时间点分别为 45.99g/L 和 49.36g/L。因此， 在 ZW658 培养物中， 最初的果糖有 40％以上通过 GFOR 转变为 山梨糖醇。显著不同的是， 在 23 小时培养后， 在 ZW800 培养物的发酵液中没有检测到山梨 糖醇， 而葡萄糖和果糖几乎定量转变为乙醇， 这与消耗每克糖产生 0.51 克乙醇的理论值相 近。 值得注意的是在另外 24 小时培养后， ZW658 培养物中的山梨糖醇的量没有进一步增加。 这与预期相符， 因为几乎所有的葡萄糖已在早期被消耗， 而用果糖进行 GFOR 反应没有电子 供体。有趣的是， 在 47 小时的时间点， ZW800 培养物的发酵液中有小量山梨糖醇 (10.21g/ L)， 这可能是由 NADPH 依赖的醛糖还原酶 (Feldmann et al.， 同上 ) 或其它仍未阐明的酶产 生。但上述结果表明插入到 ZW800 中的 GFOR 开放阅读框中部的 Specr- 盒即使不完全， 也 极大地破坏了 GFOR 酶活性。
     该结论的进一步支持来自用 ZW1、 ZW658 和 ZW800 制备的无细胞提取物的体外实 验。其目标是确定是否 ZW658 可在没有添加其它的底物或辅因子的情况下将木糖转变为木 糖醇， 并研究是否 ZW800 由于 GFOR 失活而丧失进行该反应的能力。用运动发酵单胞菌无细 胞提取物中 GFOR 介导的木糖醇产生有 3 个条件 ： 1) 可还原 GFOR 紧密结合辅因子的糖电子 供体， 例如葡萄糖或木糖， 2) 木酮糖作为电子接纳体， 因为它是酶实际将其还原为木糖醇的 化合物， 及 3) 功能性 GFOR 酶。如果不向反应混合物中加入木酮糖， 则无细胞提取物也必需 含有木糖异构酶将木糖转变为木酮糖。 用 100ml 在 33 ℃， 培养在含 10g/L 酵母提取物、 2g/L KH2PO4 和 50g/L 葡萄糖的 250ml 锥形瓶中的培养物制备无细胞提取物。在 OD600 为 2-3 时通过离心收获细胞， 并用冰 50mM Tris-HCl(pH 7.0)， 1.0mM MgCl2， 1mM 二硫苏糖醇洗涤 2 次。 将最终沉淀重悬在 1.0ml 相同缓冲液中， 并通过超声破碎细胞。通过 4℃离心 (16,000x g， 60min) 除去细胞碎片， 并 立即用无细胞提取物进行如下所述的木糖醇产生的检测。 在聚丙烯微离心管中进行 500μl 反应， 管中含具有以下终浓度的组分 ： 50mM Tris-HCl(pH 7.0)， 1.0mM MgCl2， 1mM 二硫苏糖 醇， 66mM 木糖和 0.32-0.35mg 无细胞提取物蛋白 ； 通过 BCA 蛋白检测法 (Pierce) 测定蛋白 浓度， 以牛血清白蛋白为标准。 在 40℃温育 15 小时后， 用终浓度为 30mM 新戊酸终止反应， 并 取一份用 SH1011 柱 (Showdex) 进行 HPLC 分析， 以 0.01N 硫酸为流动相。柱温维持在 50℃，
     流速为 1.0ml/min。本实验对照不加入无细胞提取物， 但其它处理相同。
     如表 3 所示， 当将 ZW1 无细胞提取物加入到反应混合物中， 在 15 小时的温育时 间内木糖不能转变为木酮糖或木糖醇。如已提及的， 该结果与预期相符， 因为与 ZW658 和 ZW800 相比较而言， ZW1 是野生型菌株， 不表达大肠杆菌木糖异构酶。相反， 当使用 ZW658 无 细胞提取物时则产生大量木酮糖和木糖醇， 因为它含有这两种化合物形成所必需的酶。在 这种情况下， 约 8％最初的 66mM 木糖用于木糖醇的产生， 因为当加入到反应混合物中的木 糖为 GFOR 的唯一底物时， 每产生 1 个分子木糖醇需消耗两分子木糖。最后， 最重要的是， ZW800 无细胞提取物仅能将木糖转变为木酮糖， 因为虽然它含有木糖异构酶活性， 但它缺失 GFOR 酶活性。这些结果进一步表明， ZW800 不产生功能性 GFOR 酶， 而且进一步证明该蛋白 以木糖为电子供体， 将木酮糖还原为木糖醇， 如以前用加入了纯化的木糖异构酶的野生型 无细胞提取物所示的结果一样 (Danielson 同上 )。
     表 3.GFOR 介导的、 由木糖生成木糖醇也需要木酮糖——体外测定
     无细胞提取物 none ZW1 ZW658 ZW800
     木酮糖 (mM) 0 0 9.45 10.63木糖醇 (mM) 0 0 2.6 0实施例 8
     在浓缩的葡萄糖和木糖混合物中山梨糖醇是 ZW800 生长所必需的
     检测 ZW800 在浓缩的葡萄糖和木糖混合物中产生乙醇的发酵性能。该实验在 pH- 控制的发酵罐中进行， 使用总糖为 97g/L 或 188g/L， 葡萄糖和木糖的固定比例为～ 5 ∶ 4。
     将 ZW658 和 ZW800 的种子培养物在含 75g/L 葡萄糖、 25g/L 木糖、 10g/L 酵母提取 物、 10g/L KH2PO4、 2g/L(NH4)2SO4 和 1g/LMgSO4 的液体培养基的摇瓶中， 37℃下培养 ； 最初 pH 用 4N KOH 调整为 5.5。当 OD600 达到～ 5.0 时， 用 50ml 种子培养物接种含 450ml 生长培养 基的 1 升发酵罐 ( B-DCU system， Sartorius BBISystem Inc.， Bethlehem， Pennsylvania， USA)。最终 500ml 培养物含 5g/L 酵母提取物、 2g/L KH2PO4、 2g/L(NH4)2SO4、 1g/L MgSO4 及低浓度糖 (54g/L 43g/L 木糖 ) 或高浓度糖 (104g/L 葡萄糖、 84g/L 木糖 )。 在 33℃培养， 通过自动加入 4N KOH 维持 pH5.5。混合速度设置为 150rpm。在多个时间点， 取出 1 份发酵液用与实施例 6 所述相同流程和条件进行 HPLC 分析。本实验的目标化合物 是葡萄糖、 木糖和乙醇， 用已知浓度的标准品定量色谱峰。也用设定光密度为 600nm 的分光 光度计通过以下浊度变化监测细胞生长， 并将得到的 OD600 做图。
     如图 15 所示， 当发酵罐含低浓度糖 (54g/L 葡萄糖、 43g/L 木糖 ) 时， GFOR 失活对 生长、 糖消耗或乙醇滴度没有影响。但如图 16 所示， 当总糖浓度增加约 2 倍时， 则发酵性能 有很大差异。ZW658 的延迟期约 30 小时， 这对利用木糖的运动发酵单胞菌重组菌株从葡萄糖和木糖稀释混合物转移到总糖超过 180g/L 的相同糖的浓缩混合物时是典型现象。在延 迟期后， 细胞开始生长并消耗培养物中的所有葡萄糖和约 75％木糖， 因此得到最终乙醇滴 度为～ 73g/L( 图 16A)。相比之下， ZW800 培养物甚至在 130 小时培养时间后不从延迟期复 苏 ( 图 16B)， 该结果在两个独立的情况下获得。
     如图 15 所示， 由于 ZW800 在葡萄糖和木糖稀释混合物中生长很好， 因此该菌株不 能在高糖混合物中复苏可能与渗透压力相关。 当野生型运动发酵单胞菌转移到葡萄糖和果 糖混合物， 或通过转化酶可产生葡萄糖和果糖的高浓度蔗糖中时， GFOR 确实通过产生山梨 糖醇而在维持渗透平衡方面具有重要作用 (Loos et al.， 同上 )。由 GFOR 在周质空间产生 的山梨糖醇逆浓度梯度进入细胞内， 由于不进行进一步代谢而高水平积累。从而消除跨质 膜的渗透压差异， 并保持渗透平衡 (Wiegert et al.， 同上 )。但 GFOR 介导的山梨糖醇产生 的前提是同时存在葡萄糖和果糖， 在缺少果糖的培养基中不发生该反应。由于山梨糖醇是 GFOR 的生理性重要的产物， 但该酶在 ZW800 中失活， 因此在以下实验中检测了向浓缩的葡 萄糖和木糖混合物中增加山梨糖醇的效果。
     在高浓度混合物中培养～ 70 小时后 ( 时间点由图 16 的垂直箭头指定 )， 从发酵 罐中除去 5 份 4.5ml 延迟的 (stalled)ZW800 培养物并转移到 15ml 带盖的试管中。然后向 4 个试管补加 0-20mM 山梨糖醇 ( 终浓度 )， 而且在所有情况下， 将培养物的总体积用去离子 水调整为 5.0ml ； 本实验所用的山梨糖醇储液也由水配制。当向 10％稀释的生长培养基中 加入水和山梨糖醇时， 对第五个培养物不做任何添加， 作为对照。 然后将所有培养物在 33℃ 轻轻振荡 (200rpm) 培养， 并用分光光度计监测生长。如图 17 所示， 当向生长培养基中加入 山梨糖醇后， 细胞几乎立即开始生长， 甚至在最低检测浓度时 (5mM) 也是如此。而且发现不 加入山梨糖醇， 但用水将培养物稀释 10％， 将总糖浓度从 188g/L 降低到 169g/L 时也刺激生 长。但山梨糖醇对生长的刺激作用大大强于稀释的作用。
     通过山梨糖醇得到的 ZW800 生长的拯救 (rescue) 完全在意料之外， 因为 ZW658 在 葡萄糖和果糖混合物， 而没有已知来源的果糖中从延迟期复苏， 并生长很好。 由于后一化合 物是 GFOR 介导的山梨糖醇产生的专性电子接纳体， GFOR 在含高浓度葡萄糖和木糖的培养 基中能合成山梨糖醇或在渗透平衡方面起重要作用并不明显。因此不能表明山梨糖醇是 ZW658 或 ZW800 在浓缩的葡萄糖和木糖混合物中的生长的重要因子。
     实施例 9
     GFOR 失活可在处理相关条件 (process relevant conditions) 下提高从木糖到乙 醇的产量
     对 ZW658 和 ZW800 在浓缩的葡萄糖和木糖混合物中的发酵性能在处理相关条件下 以并行方式进行比较， 以测定 GFOR 失活是否是有利的或有害的代谢工程策略。由于在这些 实验中使用高浓度葡萄糖和木糖， 因此向培养基中加入山梨糖醇以使 ZW800 生长。在此处 未描述的实验中， 也发现山梨糖醇消除了 ZW658 的延迟期。因此， 对生长培养基补充山梨糖 醇可提供理想的在处理相关条件下来比较这两个菌株的方式。
     用两种总糖浓度， 存在和不存在乙酸盐下， 将 ZW658 和 ZW800 在 6 个不同条件下 进行比较， 对更浓缩的糖混合物， 检测了两种不同的缓冲能力。这些实验用 20ml 培养物在 30℃， 在 50ml 试管中轻轻振荡 (150rpm) 培养进行。不控制 pH， 但最初生长培养基中的 pH 用浓磷酸在用种子培养物接种前调整到 5.8。基本生长培养基含 10g/L 酵母提取物、 2g/LKH2PO4、 1g/L MgSO4、 5mM 山梨糖醇和或者 4g/L( 图 18 和 19) 或者 8g/L( 图 20)KHCO3。所有 以上和以下的值是加入种子培养物后的终浓度。用 KHCO3 增加生长培养基的缓冲能力， 以 使在细菌生长时通常发生的 pH 降低最小。所有这些实验的碳源是两种不同总糖浓度的葡 萄糖和木糖混合物， 其与预处理的玉米秸水解物中的这两种糖的比例相似。葡萄糖和木糖 的最初浓度分别为或者 92g/L 和 82g/L( 图 18) 或者 107g/L 和 96g/L( 图 19 和 20)。其中 也存在 6g/L of 乙酸盐 ( 预处理玉米秸水解物中存在的抑制剂 )。将种子培养物在 30℃， 在含 75g/L 葡萄糖、 25g/L 木糖、 10g/L 酵母提取物、 2g/L KH2PO4、 1g/L MgSO4 的液体培养基 中培养到 OD600 为～ 5.0， 并用 1/10 体积接种实验培养物。在不同时间点， 除去 1 份发酵液 如前实施例 6 所述进行 HPLC 分析。本实验的目标化合物是葡萄糖、 木糖、 乙醇和木糖醇， 所 有的值以 g/L 计。由于实际上所有的葡萄糖在第一个采样时间点均被消耗， 因此该糖的值 不在图中画出。
     从如图 18-20 所示的实验表明， ZW800 在所有检测的条件下均优于 ZW658， 根据两 个不同的标准进行判定 ： (a) 在实验过程中消耗的木糖的总量， 及 (b) 达到的最大乙醇滴 度。而且从该数据也表明， 当遇到最胁迫的条件 ( 即所有的葡萄糖被消耗完， 而且乙醇浓度 开始达到毒性水平 ) 时， GFOR 失活起到极大的有利作用。事实上， 当生长培养基中存在将 产生额外的胁迫的、 抑制浓度的乙酸盐时观察到两个菌株最大的差异。 在三组实验条件下， ZW800 在存在乙酸盐时的乙醇滴度平均增加量是 10.2 ％， 其值在 4.4 ％到 13.7 ％。ZW800 在三个实验中， 在没有乙酸盐时产生的乙醇也比 ZW658 多， 在这种情况下的平均增加量是 3.2％。 与预期一样， ZW658 将木糖转变为大量的不期望的副产物木糖醇， 当条件最胁迫 ( 即 在发酵最后阶段， 当生长培养基中存在乙酸盐时 ) 时， 该化合物达到最高水平。例如， 在如 图 18-20 所示的有乙酸盐的实验中， ZW658 将消耗的总木糖的 8.1％、 8.3％和 9.9％转变为 木糖醇。相反， ZW800 培养物在任何检测条件下都没有木糖醇的产生。这些结果清楚地表 明， GFOR 失活利于在处理相关条件下代谢木糖产生乙醇， 特别是在存在抑制浓度的乙酸盐 时。如图 18 和 19 所示的试管实验进行了两次， 确实获得相同的结果。
     另一个用 ZW800 和 ZW658 在 pH 控制的发酵罐中， 在含乙酸盐的浓缩葡萄糖和木糖 混合物中进行了并行实验。由运动发酵单胞菌产生的代谢副产物例如有机酸和二氧化碳 降低生长培养基的 pH， 这可增加乙酸和乙酸盐的比例， 而已知质子化物质是实际上抑制细 菌生长的化合物 (Kim et al， (2000)Applied Biochemistry and Biotechnology， 84-86 ： 357-370)。因此， 在大规模发酵中， pH 是非常重要的， 因为 pH 从 5.8 降低到 5.0 将使乙酸 的浓度增加 5 倍。
     将 ZW800 和 ZW658 种子培养物在摇瓶中， 37 ℃， 在含 75g/L 葡萄糖、 25g/L 木糖、 10g/L 酵母提取物、 10g/L KH2PO4、 2g/L(NH4)2SO4 和 1g/L MgSO4 的液体培养基中培养 ； 起始 pH 用 4N KOH 调整为 5.5。当 OD600 达到～ 5.0 时， 用 50ml 种子培养物接种到含 450ml 生长 培养基的 1 升发酵罐 (BIOSTATO B-DCU system， Sartorius BBISystem Inc.， Bethlehem， Pennsylvania， USA) 中。最终 500ml 培养物含 92g/L 葡萄糖、 97g/L 木糖、 10g/L 酵母提取 物、 2g/L KH2PO4、 10mM 山梨糖醇和 7.2g/L 乙酸盐。在 33℃培养， 通过自动加入 4N KOH 维 持 pH 在 5.5， 混合速度为 150rpm。在不同时间点， 取出 1 份发酵液用实施例 6 所述相同流 程对其进行 HPLC 分析。本实验的目标化合物是葡萄糖、 木糖、 乙醇和木糖醇， 也对细胞生长 (OD600) 进行监测。图 21 所示的是用 ZW800 培养物的整个时间段的发酵罐运行的参数， 表4总结了两个菌株木糖、 乙醇和木糖醇的终点值。
     表 4.ZW800 和 ZW658 在 pH 控制的发酵罐中的木糖、 乙醇和木糖醇的终点值
     ZW658 乙醇 (g/L) 消耗的木糖 (g/L) 木糖醇 (g/L) 乙醇产量 (g 乙醇 /g 糖 )
     ZW800 72.31 69.14 0 0.4565.95 60.71 3.92 0.43与有乙酸盐的试管结果 ( 图 18-20) 相同， ZW800 比 ZW658 在 pH- 控制的发酵罐中 多消耗 14％的木糖， 而且多产生 9.6％的乙醇 ( 图 21)。由于 ZW800 不产生任何可检测到 的木糖醇， 因此该菌株乙醇的产量高约 5％。相比之下， 木糖醇在 ZW658 发酵液中的终浓度 为 3.92g/L， 代表在实验过程中消耗的总木糖的约 6.5％。这些实验对 GFOR 失活可通过去 除木糖醇形成而提高由木糖产生的乙醇产量提供了另外的证据。如已知的， 不期望的副产 物木糖醇以至少两个不同的方式干扰木糖代谢并抑制细菌生长， 其导致低水平的 ATP。因 此， 当 GFOR 产生木糖醇时， 它降低了运动发酵单胞菌应对所有其它通常在从木质纤维素贮 存物发酵产生乙醇的过程中遇到的能量消耗胁迫的能力。与 ZW658 相比， 由于 ZW800 不需 要与木糖醇相关的胁迫相竞争， 因此它可在发酵后期阶段产生最高水平胁迫时消耗更多的 木糖， 产生更多的 ATP 和更多的乙醇。
     实施例 10
     从 ZW800 中 去 除 选 择 性 标 记 及 获 得 的 菌 株 ZW801-4 的 特 征 Cre 表 达 构 建 体 pZB188-Kan/Cre 的产生
     如 实 施 例 3 所 述， 插 入 到 ZW800 的 GFOR 开 放 阅 读 框 中 的 Specr 盒 夹 在 两 个 野 生 型 loxP 位 点 之 间。 这 种 排 列 易 于 从 染 色 体 中 通 过 Cre 重 组 酶 (Sternberg and Hamilton(1981)J.Mol.Biol.150 ： 467-486 ； Leeand Saito 同 上， Trinh et al(2000) Journal of Immunological Methods244(2) ： 185-193) 除去选择性标记。但为了达到该目 的， 首先需要产生可在运动发酵单胞菌中复制的 Cre 表达载体 ( 图 22)。Cre 表达载体的前 体是如实施例 4 详细描述的 pZB188/Kan。简言之， pZB188/Kan 是可在大肠杆菌和运动发酵 单胞菌中复制的穿梭载体， 因为它具有两个细菌种的复制原点。它也含有赋予卡那霉素抗 r 性的 DNA 片段 ( 即 Kan 盒 )。用 Ncol 和 Notl 对 pZB 188/Kan 进行双消化， 并通过琼脂糖 凝胶电泳纯化大载体片段。下一步是通过 PCR 用引物 17 和 18 产生 Cre 表达盒。扩增 Cre 表达盒所用的 DNA 模板是含噬菌体 P1Cre 重组酶整个基因及其启动子的质粒 (Sternberg et al(1986)J.Mol.Biol.187(2) ： 197-212)。
     引物 17(SEQ ID NO ： 35)
     CTACTCATccatggCATCTTGAGCTTGAGAAAAACC
     引物 18(SEQ ID NO ： 36)
     CATCTTACTgcggccgcTTAATGGCTAATCGCCATCTTC引物 17( 正向引物 ) 的下划线碱基与对应于 Cre 起始密码子上游 200bp 处 GenBank 登录号为 X03453 的序列的 nt 286-307 杂交， 而小写字母对应于添加到引物 5’ 末端的 Ncol 位点。 引物 18( 反向引物 ) 的下划线碱基与 Cre 开放阅读框另一端 GenBank 登录号为 X03453 的序列的 nt 1523-1503 结合， 而小写字母对应于添加到引物 5’ 末端的 Notl 位点。用 Ncol 和 Notl 双消化 1238bp PCR 产物， 并通过琼脂糖凝胶电泳纯化得到的含 Cre 重组酶完整开 放阅读框及其推测的启动子的 DNA 片段 (Sternberg et al， 1986 同上 )。然后通过标准连 接反应将 Cre- 表达盒插入到上述 pZB188/Kan DNA 片段的 Ncol 和 Notl 位点。将连接反 应混合物电转入大肠杆菌 DH10B， 并将转化的细胞涂布在含卡那霉素 (50μg/ml) 的 LB 培 养基上 ； 37℃培养。从卡那霉素抗性转化子中分离质粒 DNA， 然后将该制备物导入大肠杆菌 JM110(dcm ， dam ) 以获得非甲基化的质粒 DNA 进行后续的运动发酵单胞菌转化 ( 参见以下 描述 )。Cre 表达载体 pZB188/Kan-Cre 的质粒图谱如图 22 所示。
     Cre 处理以从 ZW800 染色体中除去选择性标记并消除 Cre 表达载体
     噬菌体 P1 的 Cre 重组酶 (Cre) 可识别特异的 34bp 的 DNA 序列—— “loxP 位点” ， 该位点在 8bp 的非对称核心旁侧含有两个 13bp 反向重复 (Sternberg and Hamilton， 1981， 同上 ； Lee and Saito， 同上 ； Trinh et al， 同上 )。 Cre 也可以切割任何位于两个相同的 loxP 位点之间的干扰 DNA 片段， 而且切割反应非常快。 为了从 GFOR 开放阅读框中除去 Specr 盒， 将 Cre 表达载体 (pZB188/Kan-Cre) 导入 ZW800 中。
     转化流程基本如实施例 5 所述， 但在复苏阶段后， 将细胞涂布在含 350μg/ml 作为 Cre 表达载体选择试剂的卡那霉素 MMG 培养基上。从该过程复苏的原代转化子对壮观霉素 不再有抗性， 因为通过 Cre 从染色体除去的 Specr 盒是在运动发酵单胞菌中不能复制的环 状 DNA 片段。 在 30℃， 在厌氧条件下培养 48 小时后， 将两个 Kanr/Specs 原代转化子进行 Cre 质粒消除过程。虽然 pZB188/Kan-Cre 可在运动发酵单胞菌中复制， 但在不合卡那霉素的培 养基上培养细胞很容易使该质粒丢失。为了在本发明中消除 Cre 表达载体， 将细胞在升高 的温度 (37℃ ) 下， 在不含卡那霉素的液体培养基中培养 ； 每隔 24-36 小时将细胞转移到含 相同组分的新鲜生长培养基中。在进行至少 50 代后， 在 MMG 平板上分离单克隆， 并从两个 原始的原代转化子中随机选择 5 个克隆进行进一步分析。与预期一致， 这些克隆都不能在 含卡那霉素 (350μg/ml) 或壮观霉素 (200μg/ml) 的 MMG 平板上生长。虽然不能在卡那霉 素上生长是质粒消除过程成功的很好提示， 但该结论也用与 Cre 表达盒杂交的引物通过克 隆 PCR 进行验证。基于这些实验， 选择 3 个 Cre 处理的、 质粒消除的 ZW800 衍生物进行进一 步分析， 这些菌株以下命名为 ZW801-4、 ZW801-5 和 ZW801-6。
     为了研究这些菌株在葡萄糖和木糖浓缩混合物中， 在存在抑制浓度的乙酸盐时表 现如何， 进行了摇瓶实验。在本分析中也包括 ZW658 和 ZW800。将种子培养物在 30℃， 在含 75g/L 葡萄糖、 25g/L 木糖、 10g/L 酵母提取物、 2g/L KH2PO4、 1g/L MgSO4 的液体培养基中培 养至 OD600 ～ 3.0， 用 10％接种物作为 15ml 的实验培养物。将后者在 50ml 试管中， 在 30℃ 振荡 (150rpm) 培养。生长培养基含 10g/L 酵母提取物、 2g/L KH2PO4、 1g/L MgSO4、 5mM 山梨 糖醇、 40mMKHCO3、 95g/L 葡萄糖、 90g/L 木糖和 7.7g/L 乙酸盐 ； 最初 pH 用浓磷酸调整为 5.8。 在不同时间点， 除去 1 份培养物进行如前实施例 6 所述的发酵液 HPLC 分析。本实验的目标 化合物是葡萄糖、 木糖、 乙醇和木糖醇， 所有值以 g/L 计。
     如表 5 所示， ZW658 产生 66.35g/L 乙醇， 并留下 40.6g/L 残余的木糖。ZW658 由于具有功能性 GFOR 酶， 因此也产生 3.19g/L 不期望的副产物木糖醇。与以前其它并行实验所 观察到的一样， ZW800 比 ZW658 多消耗 17％的木糖， 多产生 6.2％的乙醇， 而且不产生任何 可检测的木糖醇。虽然用 ZW801-4 和 ZW801-6 获得的结果略好一些， 但这些差异可能在实 验误差范围内， 不是统计学显著的。本实验中观察到的 ZW801-5 相对较差的性能难以理解， 不再进一步研究。基于这些结果， 选择菌株 ZW801-4 进行进一步分析。
     表 5.ZW658、 ZW800、 ZW801-4、 ZW801-4 和 ZW801-5 在高糖醋酸下的摇瓶实验
     菌株 ZW658 ZW658 ZW658 ZW658 ZW800 ZW800 ZW800 ZW800 ZW801-4 ZW801-4 ZW801-4 ZW801-4 ZW801-5 ZW801-5 ZW801-5 ZW801-5小时 0 15.5 38 62 0 15.5 38 62 0 15.5 38 62 0 15.5 38 62葡萄糖 95.7 27.75 0 0 95.7 30.64 0 0 95.7 28.04 0 0 95.7 55.61 0 0木糖 89.3 80.93 42.71 40.6 89.3 81.36 37.29 32.34 89.3 80.82 36.13 30.28 89.3 85.62 46.83 39.54木糖醇 0 0 1.85 3.19 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0乙醇 3.2 37.39 66.53 66.35 3.2 36.05 69.82 70.47 3.2 37.75 70.54 71.25 3.2 21.86 64.92 66.1938101861385 A CN 101861386说小时 0 15.5 38 62 葡萄糖 95.7 32.34 0 0明书木糖 89.3 82.02 36.39 29.55 木糖醇 0 0 0 0 乙醇 3.2 34.89 70.64 71.7437/37 页菌株 ZW801-6 ZW801-6 ZW801-6 ZW801-6
     为了验证摇瓶实验表明 ZW 801-4 至少与 ZW800 表现一样的结果， 将这两个菌株在 pH 控制的条件下进行比较。 将种子培养物在 30℃， 在含 75g/L 葡萄糖、 25g/L 木糖、 10g/L 酵 母提取物、 2g/L KH2PO4、 1g/L MgSO4 的培养基中培养。当 OD600 达到～ 4.6 时， 用 17ml 种子 培养物接种含 153ml 生长培养基的 pH 控制的生物反应器中。最终 170ml 培养物中含 105g/ L 葡萄糖、 100g/L 木糖、 10g/L 酵母提取物、 2g/LKH2PO4、 1g/L MgSO4、 5mM 山梨糖醇和 7.2g/L 乙酸盐。在 33℃培养， 通过自动加入 4N KOH 将 pH 维持在 5.5 ； 搅拌速度为～ 150rpm。在不 同时间点， 从生物反应器中取出 1 份培养物进行如上所述的发酵液 HPLC 分析， 并对 OD600 进 行监测。在这些实验条件下， ZW800 和 ZW 801-4 的生长曲线几乎重叠 ( 图 23A)。葡萄糖和 木糖消耗的时间段也基本上一样， 而且两个菌株产生具有相同动力学的相同量的乙醇 ( 图 23B)。 另外， 这两个菌株均不产生任何可检测的木糖醇。 基于这些结果， 我们认为从 GFOR 开 r 放阅读框中除去 Spec - 盒不能使 GFOR 酶活性恢复或部分恢复， 而且该操作对发酵性能没 有坏的影响。虽然 ZW800 和 ZW801-4 都比具有功能性 GFOR 酶的亲本菌株 (ZW658) 表现好， 但优选的用于商业用途的菌株是 ZW801-4， 因为它不含有对抗生素赋予抗性的外源基因。
     来自 ZW801-4 的基因组 DNA 的序列分析提供了确实发生正确的 Cre 切除事件的明 确证据。 ZW801-4 中被破坏的 GFOR 开放阅读框的完整核苷酸序列 ( 从原始起始密码子到原 始终止密码子 ) 如 SEQ IDNO ： 37 所示， 图 24 所示的是翻译的突变序列与野生型 GFOR 蛋白 的比对 ； 后者由 GenBank 登录号 AE008692 的核苷酸 683751-685052 的反向互补序列编码。 与预期一样， Specr 盒的 Cre 切割在 GFOR 开放阅读框中间留下 1 个野生型 loxP 位点， 该插 入事件产生成熟前截短蛋白的同框终止密码子 ； “lox 瘢痕” 由灰色高亮残基表示。作为自 杀型构建体设计的结果， 突变的核苷酸序列也在相同位置缺失～ 72bp 的原始野生型 GFOR 核苷酸序列。39101861385 A CN 101861386序列 序列表表1/22 页<110>E.I.du Pont de Nemours and Company Viitanen， Paul McCutchen， Carol <120> 用于乙醇生产的可利用木糖的发酵单胞菌的木糖醇合成突变体 <130>CL3604 <160>38 <170>PatentIn version 3.4 <210>1 <211>44 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引物 <400>1 cagtctagag gccgcctagg ccgttcgatc aacaacccga atcc <210>2 <211>30 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引物 <400>2 caatttgtcc gtcatgttta ttctcctaac <210>3 <211>30 <212>DNA404430101861385 A CN 101861386序列表2/22 页<213> 人工序列 <220> <223> 引物 <400>3 gttaggagaa taaacatgac ggacaaattg <210>4 <211>29 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引物 <400>4 ccagatcgtc tagattacag cagatcgcc <210>5 <211>44 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引物 <400>5 cagtctagag gccgcctagg ccgttcgatc aacaacccga atcc <210>6 <211>29 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引物 <400>641302944101861385 A CN 101861386序列表3/22 页ccagatcgtc tagattacag cagatcgcc <210>7 <211>73 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引物 <400>7 cagggccgcc taggccataa cttcgtatag catacattat acgaagttat cctgtgacgg aagatcactt cgc <210>8 <211>71 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引物 <400>8 cagggcctag gcggccataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat cctgaaccga cgaccgggtc g <210>9 <211>6882 <212>DNA <213> 人工序列 <220> <223> 质粒 pMODPgaptaltktcm <400>9 cggccataac aatttgcttt aggcgtttaa gcagtactgt atgaacctga2960 7360 71ttcgtataat cgaatttctg gggcaccaat tgtaattcat atcgccagcggtatgctata ccattcatcc aactgcctta taagcattct gcatcagcaccgaagttatc gcttattatc aaaaaattac gccgacatgg cttgtcgcct42ctgaaccgac acttattcag gccccgccct aagccatcac tgcgtataatgaccgggtcg gcgtagcacc gccactcatc agacggcatg atttgcccat60 120 180 240 300101861385 A CN 101861386序ggggcgaaga ggattggctg tcaccgtaac tattcactcc tgaacactat gcattcatca tttacggtct gcaactgact gtatatccag tcaaaaaata tgccgatcaa acaccaggat tatgctatac tcagggttga aggcggtttg cgttcggctg atcaggggat taaaaaggcc aaatcgacgc tccccctgga gtccgccttt cagttcggtg cgaccgctgc atcgccactg tacagagttc ctgcgctctg acaaaccacc aaaaggatct aaactcacgt tttaaattaa cagttaccaa catagttgcc ccccagtgct aaaccagcca ccagtctatt caacgttgtt attcagctcc agcggttagc actcatggtt agttgtccat agacgaaaaa acgccacatc agagcgatga cccatatcac ggcgggcaag ttaaaaaggc gaaatgcctc tgattttttt cgcccggtag cgtctcattt ttatttattc gaagttatgg gatgtgtata cgtattgggc cggcgagcgg aacgcaggaa gcgttgctgg tcaagtcaga agctccctcg ctcccttcgg taggtcgttc gccttatccg gcagcagcca ttgaagtggt ctgaagccag gctggtagcg caagaagatc taagggattt aaatgaagtt tgcttaatca tgactccccg gcaatgatac gccggaaggg aattgttgcc gccattgcta ggttcccaac tccttcggtc列表tttaaatcaa ataaaccctt atgtgtagaa gtttgctcat tctttcattg aaggccggat agctgaacgg ttacgatgcc gcttccttag tcattatggt ttggcccagg tcttccgtca ctctagagtc gcattaatga ttcctcgctc ctcaaaggcg agcaaaaggc 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