改进的胰岛淀粉样多肽衍生物 发明领域 本发明涉及与白蛋白和 / 或胰岛淀粉样多肽 (amylin) 受体结合的人胰岛淀粉样 多肽或其类似物的衍生物， 涉及包含这些衍生物的药物组合物， 涉及获取它们的方法以及 用作药物的胰岛淀粉样多肽衍生物。
发明背景
大量人群罹患糖尿病和肥胖症并且数量还在不断增加。 糖尿病是一种利用葡萄糖 的能力部分或完全丧失的代谢疾病。
许多治疗方案的目标是针对过量血糖， 而其它方案则主要集中在减轻体重。用于 降低血糖的最有效抗糖尿病药是胰岛素及其类似物。 长期以来， 已经知道， 当传统胰岛素用 于治疗糖尿病时， 它与体重增加有关。胰岛素经皮下注射， 每日多达数次。
2 型糖尿病通常在早期用节食和运动来治疗。 随着病症发展， 添加不同口服抗糖尿 病药。在这一时期， 也可使用注射用药例如 GLP-1 类似物。一般而言， 这些药物对具有能释 放胰岛素和胰岛淀粉样多肽的功能性 β 细胞的患者最有效。
人胰岛淀粉样多肽是一种长度为 37 个氨基酸的肽， 其理化性质使其用作药物时 有困难。具体地讲， 它在体外 (in-vitro) 和 / 或离体 (ex-vivo) 具有形成原纤维的趋势并 因沉淀而变得无效。一种称为 Symlin 的药品目前已上市， 该药品含有人胰岛淀粉样多肽
的类似物 ( 普兰林肽 (pramlintide))。与人胰岛淀粉样多肽相比， 在普兰林肽中， 37 个氨 基酸中有 3 个被脯氨酸取代。这基本上改进了形成原纤维的趋势。然而， 甚至是普兰林肽 也难以在中性 pH 溶液中保存， 因而在一种酸性溶液中提供， 即 Symlin 。 已经描述了具有改进的药动学或药效学 (PK/PD) 特性的各种胰岛淀粉样多肽类 似物和衍生物。 然而， 仍然需要提供具有天然人胰岛淀粉样多肽活性的类似物和衍生物， 以 及具有延长的药动学特性的衍生物， 表现出比天然人胰岛淀粉样多肽更高的溶解度和 / 或 稳定性。
发明概述
本发明一方面涉及人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物， 其中
a) 位置 1 的氨基酸残基是与由 1-10 个氨基酸组成的 N- 端延伸连接的任何天然氨 基酸， 其中
a. 所述延伸与白蛋白结合残基进一步连接， 任选通过接头， 或
b. 位置 2-37 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代， 并且所述赖氨酸残基与白蛋白 结合残基连接， 任选通过接头 ；
或
b) 位置 3、 17、 21、 25 或 29 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代并且其中所述赖氨酸 残基与白蛋白结合残基连接， 任选通过接头 ；
或
c) 位置 18 的氨基酸残基是精氨酸， 并且位置 1-17 或 19-37 的氨基酸残基已被赖 氨酸残基取代， 并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白结合残基 r 连接， 任选通过接头 ；
其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
本发明又一方面涉及一种用于延长人胰岛淀粉样多肽或其类似物在患者体内的 作用时间的方法， 所述方法的特征在于以下修饰 ：
a) 修饰位置 1 的氨基酸残基， 即通过用任何天然氨基酸任选取代， 并通过将所述 天然氨基酸与由 1-10 个氨基酸组成的 N- 端延伸连接， 并且进一步
a. 将所述延伸与白蛋白结合残基连接， 任选通过接头， 或
b. 修饰位置 2-37 的氨基酸残基， 即通过用赖氨酸残基取代， 并通过将所述赖氨酸 残基与白蛋白结合残基连接， 任选通过接头，
或；
b) 修饰位置 3、 17、 21、 25 或 29 的氨基酸残基， 即通过用赖氨酸残基取代并且通过 将所述赖氨酸残基与白蛋白结合残基连接， 任选通过接头，
或；
c) 修饰位置 18 的氨基酸残基， 即通过用精氨酸残基取代， 并且修饰位置 2-17 或 19-37 的氨基酸残基， 即通过用赖氨酸残基取代并且通过将所述赖氨酸残基与白蛋白结合 残基连接， 任选通过接头 ； d) 位置 18 的氨基酸是精氨酸， 位置 25、 位置 28 和位置 29 的氨基酸都是脯氨酸， 位置 1-17 或 19-37 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代， 并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白 结合残基连接， 任选通过接头。
其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
本发明也提供包含本发明衍生物的药物组合物和本发明衍生物在制备用于治疗 疾病的药物中的用途。
发明详述
本发明的目的是提供与白蛋白和 / 或胰岛淀粉样多肽受体结合的人胰岛淀粉样 多肽或其类似物的衍生物。
本发明一方面提供人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物， 其中
a) 位置 1 的氨基酸残基是与由 1-10 个氨基酸组成的 N- 端延伸连接的任何天然氨 基酸， 其中
a. 所述延伸与白蛋白结合残基进一步连接， 任选通过接头， 或
b. 位置 2-37 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代， 并且所述赖氨酸残基与白蛋白 结合残基连接， 任选通过接头 ；
或
b) 位置 3、 17、 21、 25 或 29 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代并且其中所述赖氨酸 残基与白蛋白结合残基连接， 任选通过接头 ；
或
c) 位置 18 的氨基酸残基是精氨酸， 并且位置 1-17 或 19-37 的氨基酸残基已被赖 氨酸残基取代， 并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白结合残基连接， 任选通过接头 ；
其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
本发明一方面提供人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物， 其中
a) 位置 1 的氨基酸残基是与由 1-10 个氨基酸组成的 N- 端延伸连接的任何天然氨
基酸， 其中
a. 所述延伸与白蛋白结合残基进一步连接， 任选通过接头， 或
b. 位置 2-37 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代， 并且所述赖氨酸残基与白蛋白 结合残基连接， 任选通过接头 ；
或
b) 位置 3 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白 结合残基连接， 任选通过接头 ；
或
c) 位置 17、 21、 25 或 29 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代并且其中所述赖氨酸残 基与白蛋白结合残基连接， 任选通过接头 ；
或
d) 位置 18 的氨基酸残基是精氨酸， 并且位置 1-17 或 19-37 的氨基酸残基已被赖 氨酸残基取代， 并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白结合残基连接， 任选通过接头 ；
其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
本发明一方面提供人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物， 其中
位置 1 的氨基酸残基是与由 1-10 个氨基酸组成的 N- 端延伸连接的任何天然氨基酸， 其中 a. 所述延伸与白蛋白结合残基进一步连接， 任选通过接头， 或
b. 位置 2-37 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代， 并且所述赖氨酸残基与白蛋白 结合残基连接， 任选通过接头 ；
并且位置 25、 位置 28 和位置 29 的氨基酸残基已被脯氨酸取代并且任选位置 18 的 氨基酸残基是精氨酸 ；
其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
本发明一方面提供人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物， 其中
位置 3、 17、 21、 25 或 29 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代并且其中所述赖氨酸残 基与白蛋白结合残基连接， 任选通过接头并且位置 25、 位置 28 和位置 29 的氨基酸残基已被 脯氨酸取代并且任选位置 18 的氨基酸残基是精氨酸 ；
其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
本发明一方面提供人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物， 其中
位置 1 的氨基酸残基是谷氨酸或精氨酸， 并且其中所述谷氨酸或精氨酸与由 1-10 个氨基酸组成的 N- 端延伸连接， 其中所述延伸与白蛋白结合残基进一步连接， 任选通过接 头；
其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
本发明一方面提供人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物， 其中
位置 1 的氨基酸残基是谷氨酸或精氨酸， 并且其中所述谷氨酸或精氨酸与由 1-6 个氨基酸组成的 N- 端延伸连接， 其中所述延伸与白蛋白结合残基进一步连接， 任选通过接 头；
其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
本发明一方面提供人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物， 其中
位置 1 的氨基酸残基是谷氨酸或精氨酸， 并且其中所述谷氨酸或精氨酸与由 5 个 氨基酸、 4 个氨基酸、 3 个氨基酸、 2 个氨基酸或 1 个氨基酸组成的 N- 端延伸连接， 其中所述 延伸与白蛋白结合残基进一步连接， 任选通过接头 ；
其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
本发明一方面提供人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物， 其中
位置 1 的氨基酸残基是与由 1-10 个氨基酸组成的 N- 端延伸连接的任何天然氨基 酸， 并且位置 2-37 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代， 其中所述赖氨酸残基与白蛋白结合 残基连接， 任选通过接头 ；
其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
一方面提供人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物， 其中
位置 3 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白结 合残基连接， 任选通过接头 ；
其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
一方面提供人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物， 其中
位置 17、 21、 25 或 29 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代并且其中所述赖氨酸残基 残基与白蛋白结合残基连接， 任选通过接头 ； 其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
本发明一方面提供人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物， 其中
位置 17 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白结 合残基连接， 任选通过接头 ；
其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
本发明一方面提供人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物， 其中
位置 21 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白结 合残基连接， 任选通过接头 ；
其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
本发明一方面提供人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物， 其中
位置 29 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代并且其中所述赖氨酸残基方面与白蛋 白结合残基连接， 任选通过接头 ；
其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
一方面提供人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物， 其中
位置 18 的氨基酸残基是精氨酸， 并且位置 1-17 或 19-37 的氨基酸残基已被赖氨 酸残基取代， 并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白结合残基连接， 任选通过接头 ；
其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
一方面提供人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物， 其中
位置 1 的氨基酸残基是谷氨酸或精氨酸， 位置 25、 28 和 29 的氨基酸残基都是脯氨 酸， 并且其中所述谷氨酸或精氨酸与由 5 个氨基酸、 4 个氨基酸、 3 个氨基酸、 2 个氨基酸或 1 个氨基酸组成的 N- 端延伸连接， 其中所述延伸与白蛋白结合残基进一步连接， 任选通过接 头；
其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
一方面提供人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物， 其中
位置 25、 28 和 29 的氨基酸残基都是脯氨酸， 并且位置 1-17 或 19-37 的氨基酸残基 已被赖氨酸残基取代， 并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白结合残基连接， 任选通过接头 ；
其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
一方面提供人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物， 其中
位置 1 的氨基酸残基是谷氨酸或精氨酸， 位置 18 的氨基酸残基是精氨酸， 位置 25、 28 和 29 的氨基酸残基都是脯氨酸， 并且其中所述谷氨酸或精氨酸与由 5 个氨基酸、 4 个氨 基酸、 3 个氨基酸、 2 个氨基酸或 1 个氨基酸组成的 N- 端延伸连接， 其中所述延伸与白蛋白 结合残基进一步连接， 任选通过接头 ；
其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
一方面提供人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物， 其中
位置 18 的氨基酸残基是精氨酸， 位置 25、 28 和 29 的氨基酸残基都是脯氨酸， 并且 位置 1-17 或 19-37 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代， 并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白 结合残基连接， 任选通过接头 ；
其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
下面是各方面的非限制性列表， 其在本文其它地方有进一步描述 ：
1. 一种具有 SEQ ID NO ： 17 的人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物， 其中
a) 位置 1 的氨基酸残基是与由 1-10 个氨基酸组成的 N- 端延伸连接的任何天然氨 基酸， 其中
a. 所述延伸与白蛋白结合残基进一步连接， 任选通过接头， 或
b. 位置 2-37 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代， 并且所述赖氨酸残基与白蛋白 结合残基连接， 任选通过接头 ；
或
b) 位置 3、 17、 21、 25 或 29 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代并且其中所述赖氨酸 残基与白蛋白结合残基连接， 任选通过接头 ；
或
c) 位置 18 的氨基酸残基是精氨酸， 并且位置 1-17 或 19-37 的氨基酸残基已被赖 氨酸残基取代， 并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白结合残基连接， 任选通过接头 ；
其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
2. 方面 1 的具有 SEQ ID NO ： 17 的人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物， 其中
a) 位置 1 的氨基酸残基是与由 1-10 个氨基酸组成的 N- 端延伸连接的任何天然氨 基酸， 其中
a. 所述延伸与白蛋白结合残基进一步连接， 任选通过接头， 或
b. 位置 2-37 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代， 并且所述赖氨酸残基与白蛋白 结合残基连接， 任选通过接头 ；
或
b) 位置 3 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白 结合残基连接， 任选通过接头 ；
或c) 位置 17、 21、 25 或 29 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代并且其中所述赖氨酸残 基与白蛋白结合残基连接， 任选通过接头 ；
或
d) 位置 18 的氨基酸残基是精氨酸， 并且位置 1-17 或 19-37 的氨基酸残基已被赖 氨酸残基取代， 并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白结合残基连接， 任选通过接头 ；
其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
3. 方面 1 或 2 的具有 SEQ ID NO ： 17 的人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物， 其中
位置 1 的氨基酸残基是与由 1-10 个氨基酸组成的 N- 端延伸连接的任何天然氨基 酸， 其中
a) 所述延伸与白蛋白结合残基进一步连接， 任选通过接头
b) 位置 2-37 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代， 并且所述赖氨酸残基与白蛋白 结合残基连接， 任选通过接头 ；
并且位置 25、 位置 28 和位置 29 的氨基酸残基已被脯氨酸取代并且任选位置 18 的 氨基酸残基是精氨酸 ；
其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。 4. 方面 1 或 2 的具有 SEQ ID NO ： 17 的人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物，其中 位置 3、 17、 21、 25 或 29 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代并且其中所述赖氨酸残 基与白蛋白结合残基连接， 任选通过接头并且位置 25、 位置 28 和位置 29 的氨基酸残基已被 脯氨酸取代并且任选位置 18 的氨基酸残基是精氨酸 ；
其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
5. 方面 1-4 中任一项的衍生物， 其中所述衍生物是 SEQ ID NO ： 17 的人胰岛淀粉 样多肽或其类似物， 其中
位置 3 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白结 合残基连接， 任选通过接头。
6. 方面 6 的衍生物， 其中所述衍生物是 SEQ ID NO ： 17 的人胰岛淀粉样多肽或其 类似物， 其中
位置 17 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白结 合残基连接， 任选通过接头。
7. 方面 1-4 中任一项的衍生物， 其中所述衍生物是 SEQ ID NO ： 17 的人胰岛淀粉 样多肽或其类似物， 其中
位置 21 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白结 合残基连接， 任选通过接头。
8. 方面 1-4 中任一项的衍生物， 其中所述衍生物是 SEQ ID NO ： 17 的人胰岛淀粉 样多肽或其类似物， 其中
位置 25 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白结 合残基连接， 任选通过接头。
9. 方面 1-4 中任一项的衍生物， 其中所述衍生物是 SEQ ID NO ： 17 的人胰岛淀粉
样多肽或其类似物， 其中
位置 29 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白结 合残基连接， 任选通过接头。
10. 方面 1-4 中任一项的衍生物， 其中所述衍生物是 SEQ IDNO ： 17 的人胰岛淀粉 样多肽或其类似物， 其中
位置 18 的氨基酸是精氨酸， 位置 25、 位置 28 和位置 29 的氨基酸都是脯氨酸， 位置 1-17 或 19-37 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代， 并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白结合 残基连接， 任选通过接头。
11. 方面 1-10 中任一项的衍生物， 其中， 与人胰岛淀粉样多肽相比， 所述衍生物具 有 1-12 个氨基酸取代。
12. 方面 1-11 中任一项的衍生物， 其中， 与人胰岛淀粉样多肽相比， 所述衍生物具 有 3-10 个氨基酸取代。
13. 方面 1-12 中任一项的衍生物， 其中， 与人胰岛淀粉样多肽相比， 所述衍生物具 有 3、 4、 5、 6、 7、 8 或 9 个氨基酸取代。
14. 方面 1-13 中任一项的衍生物， 其中所述衍生物是 SEQ IDNO ： 17 的人胰岛淀粉 样多肽的类似物， 其中与人胰岛淀粉样多肽相比， 已添加 0-8 个额外电荷。 15. 方面 14 的衍生物， 其中已通过以下方法添加 0-8 个额外电荷 ： 用带电荷氨基 酸取代人胰岛淀粉样多肽或其类似物的一个或多个氨基酸残基和 / 或在 N- 端延伸中添加 带电荷氨基酸， 或在白蛋白结合残基或聚乙二醇聚合物和 / 或接头中添加带负电荷的实 体。
16. 方面 14 或 15 的衍生物， 其中已通过以下方法添加 0-8 个额外电荷 ： 用谷氨酸 残基和 / 或天冬氨酸残基取代人胰岛淀粉样多肽或其类似物的一个或多个氨基酸残基和 / 或在 N- 端延伸中添加带电荷氨基酸。
17. 方面 14-16 中任一项的衍生物， 其中已通过以下方法添加 0-8 个额外电荷 ： 在 N- 端延伸中添加带电荷氨基酸。
18. 方面 1-17 中任一项的衍生物， 其中所述衍生物包含由 1-10 个氨基酸组成的 N- 端延伸， 其中所述延伸与白蛋白结合残基进一步连接， 任选通过接头。
19. 方面 18 的衍生物， 其中所述衍生物包含由 1-8 个氨基酸组成的 N- 端延伸， 其 中所述延伸与白蛋白结合残基进一步连接， 任选通过接头。
20. 方面 19 的衍生物， 其中所述衍生物包含由 1-6 个氨基酸组成的 N- 端延伸， 其 中所述延伸与白蛋白结合残基进一步连接， 任选通过接头。
21. 方面 20 的衍生物， 其中所述衍生物包含由 5 个氨基酸组成的 N- 端延伸， 其中 所述延伸与白蛋白结合残基进一步连接， 任选通过接头。
22. 方面 20 的衍生物， 其中所述衍生物包含由 4 个氨基酸组成的 N- 端延伸， 其中 所述延伸与白蛋白结合残基进一步连接， 任选通过接头。
23. 方面 20 的衍生物， 其中所述衍生物包含由 3 个氨基酸组成的 N- 端延伸， 其中 所述延伸与白蛋白结合残基进一步连接， 任选通过接头。
24. 方面 23 的衍生物， 其中所述 N- 端延伸选自 Glu-Glu-Arg、 Glu-Glu-Glu 和 Glu-Lys-Arg。
25. 方面 20 的衍生物， 其中所述衍生物包含由 2 个氨基酸组成的 N- 端延伸， 其中 所述延伸与白蛋白结合残基进一步连接， 任选通过接头。
26. 方面 25 的衍生物， 其中所述 N- 端延伸是 Glu-Lys。
27. 方面 20 的衍生物， 其中所述衍生物包含由 1 个氨基酸组成的 N- 端延伸， 其中 所述延伸与白蛋白结合残基进一步连接， 任选通过接头。
28. 方面 25 的衍生物， 其中所述 N- 端延伸选自 Arg、 Lys 和 Glu。
29. 方 面 1 的 衍 生 物， 所述衍生物包含下式 1 的氨基酸序列 ： Xaa1-Cys-Xaa3Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Xaa 17-Xaa 18-Ser-Ser-Xa a 21-Asn-Xaa 23-Gly-Xaa 25-Xaa 26-Leu-Xaa 28-Xaa 29-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr 式 (1)(SEQ ID No ： 18)
其中
Xaa1 缺失或独立选自 Lys、 Arg 和 Glu ；
Xaa3 独立选自 Asn、 Gly、 Gln 和 Lys ；
Xaa17 独立选自 Ala、 Val 和 Lys ；
Xaa18 独立选自 His、 Pro 和 Arg ； Xaa21 独立选自 Asn、 Gln 和 Lys ；
Xaa23 独立选自 Phe 和 Leu ；
Xaa25 独立选自 Ala、 Pro 和 Lys ；
Xaa26 独立选自 Val 和 Ile ；
Xaa28 独立选自 Ser 和 Pro ；
Xaa29 独立选自 Ser、 Pro 和 Lys ；
C- 端可任选衍生为酰胺 ；
N- 端可任选延伸 1-10 个氨基酸残基
其中氨基酸残基 Xaa1 与由 1-10 个氨基酸组成的 N- 端延伸连接， 所述延伸能与白 蛋白结合残基进一步连接， 任选通过接头， 或者
氨基酸残基 Xaa1、 Xaa3、 Xaa17、 Xaa21、 Xaa25 或 Xaa29 是赖氨酸， 并且所述赖氨酸残基 与白蛋白结合残基连接， 任选通过接头 ；
其中如果 Xaa1 是 Lys， Xaa3 是 Asn， Xaa21 是 Asn， Xaa25 是 Ala 或 Pro， 则 Xaa29 是 Lys ； 和
如果 Xaa1 是 Glu 或 Arg， 则所述 Glu 或 Arg 与由 1-10 个氨基酸组成的 N- 端延伸 连接， 并且所述延伸与白蛋白结合残基进一步连接， 和
如果 Xaa1 是 Lys， 则式 (1) 中选自 Xaa1、 Xaa3、 Xaa21、 Xaa25 和 Xaa29 的位置的一个氨 基酸与白蛋白结合残基连接， 任选通过接头。
30. 方面 29 的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基是亲脂残基。
31. 方面 29 的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基在生理 pH 时带负电荷。
32. 方面 29 的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基包含在生理 pH 时可带负电荷的基 团。
33. 方面 32 的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基包含羧酸基团。
34. 方面 29-33 中任一项的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基与白蛋白非共价结
合。 35. 方面 29-34 中任一项的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基对人血清白蛋白的 结合亲和力低于约 10μM 或低于约 1μM。
36. 方面 29 的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基选自直链烷基、 支链烷基、 具有 ω- 羧酸基团的基团和部分或完全氢化环戊并菲 (cyclopentanophenanthrene) 骨架。
37. 方面 29 的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基是汽巴克隆基 (cibacronyl) 残 基。
38. 方面 29 的衍生物， 其中所述亲脂残基包含部分或完全氢化环戊并菲骨架。
39. 方面 29-30 的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基具有 6-40 个碳原子、 8-26 个 碳原子或 8-20 个碳原子。
40. 方面 29-30 的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基是选自 CH3(CH2)rCO- 的酰 基， 其中 r 为 4-38 的整数， 优选为 4-24 的整数 ； 更优选选自 CH3(CH2)6CO-、 CH3(CH2)8CO-、 CH3(CH2)10CO-、 CH3(CH2)12CO-、 CH3(CH2)14CO-、 CH3(CH2)16CO-、 CH3(CH2)18CO-、 CH3(CH2)20CO- 和 CH3(CH2)22CO-。
41. 方面 29-30 的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基是直链或支链烷烃 α， ω- 二 羧酸的酰基。
42. 方面 29-30 的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基是选自 HOOC(CH2)sCO- 的酰基， 其中 s 为 4-38 的整数， 优选为 4-24 的整数 ； 更优选选自 HOOC(CH2)14CO-、 HOOC(CH2)16CO-、 HOOC(CH2)18CO-、 HOOC(CH2)20CO- 和 HOOC(CH2)22CO-。
43. 方面 29-30 的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基是式 CH3(CH2)vCO-NHCH(COOH) (CH2)2CO- 的基团， 其中 v 为 10-24 的整数。
44. 方 面 29-30 的 衍 生 物，其 中 所 述 白 蛋 白 结 合 残 基 是 式 CH3(CH2) 其中 w 为 8-24 的整数。 wCO-NHCH((CH2)2COOH)CO- 的基团，
45. 方 面 29-30 的 衍 生 物， 其 中 所 述 白 蛋 白 结 合 残 基 是 式 -NHCH(COOH) (CH2)4NH-CO(CH2)yCH3 的基团， 其中 y 为 8-18 的整数。
46. 方面 29 的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基是其中 l 为 12、 13、14、 15、 16、 17、 18、 19 或 20。
47. 方面 29-46 中任一项的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基通过接头是通过赖 氨酸残基的 ε- 氨基连接。
48. 方面 29-47 中任一项的衍生物， 其中所述接头包含 1-4 个氨基酸残基。
49. 方面 48 的衍生物， 其中所述接头是 Glu-Glu-Glu-Glu、 Glu-Arg-Glu-Glu、 Glu、 Glu-Glu、 Glu-Glu-Arg。
50. 方面 29-49 中任一项的衍生物， 其中所述接头包含一个或多个烷撑二醇单元， 例如 1-5 个乙二醇单元。
51. 方 面 29-50 中 任 一 项 的 衍 生 物，其 中 所 述 接 头 包 含 -C(O)-(CH2) l-O-[(CH2CH2-O]m-(CH2)p-[NHC(O)-(CH2)l-O-[(CH2)n-O]m-(CH2)p]q-NH-，
其中 l、 m、 n 和 p 独立地为 1-5， q 为 0-5。52. 方面 29-51 中任一项的衍生物， 其中所述接头包含十六烷酰基氨磺酰基部分。
53. 包含方面 1-52 中任一项的衍生物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
54. 方面 53 的药物组合物， 其适于胃肠外给药。
55. 用作药物的方面 1-52 中任一项的衍生物。
56. 用作药物的方面 1-52 中任一项的衍生物， 用于治疗或预防高血糖症、 2 型糖尿 病、 葡萄糖耐量减低、 1 型糖尿病、 肥胖症、 高血压、 X 综合征、 血脂异常 (dyslipidemia)、 认 知障碍、 动脉粥样硬化、 心肌梗塞、 冠心病和其它心血管疾病、 中风、 炎症性肠综合征、 消化 不良和胃溃疡。
57. 用作药物的方面 1-52 中任一项的衍生物， 用于延迟或阻止 2 型糖尿病的疾病 进程。
58. 用作药物的方面 1-52 中任一项的衍生物， 用于减少食物摄取， 减少 β 细胞凋 亡， 增加 β 细胞功能和 β 细胞量， 和 / 或用于恢复 β- 细胞的葡萄糖敏感性。方面 1-42 中任一项的衍生物在制备药物中的用途。
59. 方面 1-52 中任一项的衍生物在制备用于治疗或预防以下疾病的药物中的用 途： 高血糖症、 2 型糖尿病、 葡萄糖耐量减低、 1 型糖尿病、 肥胖症、 高血压、 X 综合征、 血脂异 常、 认知障碍、 动脉粥样硬化、 心肌梗塞、 冠心病和其它心血管疾病、 中风、 炎症性肠综合征、 消化不良和胃溃疡。
60. 方面 1-52 中任一项的衍生物在制备用于延迟或阻止 2 型糖尿病的疾病进程的 药物中的用途。
61. 方面 1-52 中任一项的衍生物在制备用于以下目的的药物中的用途 ： 减少食物 摄取， 减少 β- 细胞凋亡， 增加 β- 细胞功能和 β- 细胞量， 和 / 或用于恢复 β- 细胞的葡 萄糖敏感性。
62. 一种用于延长人胰岛淀粉样多肽或其类似物在患者体内的作用时间的方法， 所述方法的特征在于以下修饰 ：
a) 修饰位置 1 的氨基酸残基， 即通过用任何天然氨基酸任选取代， 并通过将所述 天然氨基酸与由 1-10 个氨基酸组成的 N- 端延伸连接， 并且进一步
a. 将所述延伸与白蛋白结合残基连接， 任选通过接头， 或
b. 修饰位置 2-37 的氨基酸残基， 即通过用赖氨酸残基取代， 并通过将所述赖氨酸 残基与白蛋白结合残基连接， 任选通过接头，
或；
b) 修饰位置 3、 17、 21、 25 或 29 的氨基酸残基， 即通过用赖氨酸残基取代并且通过 将所述赖氨酸残基与白蛋白结合残基连接， 任选通过接头，
或；
c) 修饰位置 18 的氨基酸残基， 即通过用精氨酸残基取代， 并且修饰位置 2-17 或 19-37 的氨基酸残基， 即通过用赖氨酸残基取代并且通过将所述赖氨酸残基与白蛋白结合 残基连接， 任选通过接头 ；
d) 位置 18 的氨基酸是精氨酸， 位置 25、 位置 28 和位置 29 的氨基酸都是脯氨酸， 位置 1-17 或 19-37 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代， 并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白 结合残基连接， 任选通过接头。其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
63. 方面 62 的方法， 其中人胰岛淀粉样多肽或其类似物在患者体内的作用时间延 长至超过约 40 小时。
64. 方面 62 或 63 中任一项的方法， 其中所述人胰岛淀粉样多肽或其类似物如同方 面 1-52 中任一项的进一步定义。
65. 一种用于治疗、 预防或缓解患者的以下疾病的方法 ： 高血糖症、 2 型糖尿病、 葡 萄糖耐量减低、 1 型糖尿病、 肥胖症、 X 综合征或血脂异常， 所述方法包括给予患者方面 1-52 中任一项的衍生物或方面 53 或 54 的药物组合物。
66. 一种用于制备方面 53 或 54 的药物组合物的方法， 所述方法包括将方面 1-52 中任一项的衍生物与药学上可接受的物质和 / 或赋形剂混合。
67. 实施例的胰岛淀粉样多肽衍生物。
本发明进一步归纳于下列方面 ：
1a. 一种具有 SEQ ID NO ： 17 的人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物， 其中
位置 1 的氨基酸残基是与由 1-10 个氨基酸组成的 N- 端延伸连接的任何天然氨基 酸， 其中 所述延伸与白蛋白结合残基进一步连接， 或
位置 2-37 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代， 并且所述赖氨酸残基与白蛋白结 合残基连接， 任选通过接头 ；
或
位置 3、 21、 25 或 29 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代并且其中所述赖氨酸残基 与白蛋白结合残基连接， 任选通过接头 ；
或
位置 18 的氨基酸残基是精氨酸， 并且位置 1-17 或 19-37 的氨基酸残基已被赖氨 酸残基取代， 并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白结合残基或聚乙二醇聚合物连接， 任选通 过接头 ；
其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
2a. 方面 1a 的具有 SEQ ID NO ： 17 的人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物， 其 中
位置 1 的氨基酸残基是与由 1-10 个氨基酸组成的 N- 端延伸连接的任何天然氨基 酸， 其中
所述延伸与白蛋白结合残基或聚乙二醇聚合物进一步连接， 或
位置 2-37 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代， 并且所述赖氨酸残基与白蛋白结 合残基或聚乙二醇聚合物连接， 任选通过接头 ；
或
位置 3 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白结 合残基或聚乙二醇聚合物连接， 任选通过接头 ；
或
位置 21、 25 或 29 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代并且其中所述赖氨酸残基与 白蛋白结合残基或聚乙二醇聚合物连接， 任选通过接头 ；
或
位置 18 的氨基酸残基是精氨酸， 并且位置 1-17 或 19-37 的氨基酸残基已被赖氨 酸残基取代， 并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白结合残基或聚乙二醇聚合物连接， 任选通 过接头 ；
其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
3a. 方面 1a 或 2a 的具有 SEQ ID NO ： 17 的人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生 物， 其中
位置 1 的氨基酸残基是与由 1-10 个氨基酸组成的 N- 端延伸连接的任何天然氨基 酸， 其中
所述延伸与白蛋白结合残基或聚乙二醇聚合物进一步连接， 或
位置 2-37 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代， 并且所述赖氨酸残基与白蛋白结 合残基或聚乙二醇聚合物连接， 任选通过接头 ；
并且任选位置 18 的氨基酸残基是精氨酸 ；
其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
4a. 方面 1a 或 2a 的具有 SEQ ID NO ： 17 的人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生 物， 其中 位置 3、 21、 25 或 29 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代并且其中所述赖氨酸残基 与白蛋白结合残基或聚乙二醇聚合物连接， 任选通过接头 ；
并且任选位置 18 的氨基酸残基是精氨酸 ；
其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
5a. 方面 1a 或 2a 的衍生物， 其中所述衍生物是 SEQ ID NO ： 17 的人胰岛淀粉样多 肽， 其中
位置 1 的氨基酸残基是与由 1-10 个氨基酸组成的 N- 端延伸连接的任何天然氨基 酸， 其中
所述延伸与白蛋白结合残基或聚乙二醇聚合物进一步连接， 或
位置 2-37 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代， 并且所述赖氨酸残基与白蛋白结 合残基或聚乙二醇聚合物连接， 任选通过接头 ；
或
位置 3、 21、 25 或 29 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代并且其中所述赖氨酸残基 与白蛋白结合残基或聚乙二醇聚合物连接， 任选通过接头 ；
或
位置 18 的氨基酸残基是精氨酸， 并且位置 1-17 或 19-37 的氨基酸残基已被赖氨 酸残基取代， 并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白结合残基或聚乙二醇聚合物连接， 任选通 过接头。
6a. 方面 1a-4a 中任一项的衍生物， 其中所述衍生物是 SEQ IDNO ： 17 的人胰岛淀 粉样多肽或其类似物， 其中
位置 3 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白结 合残基或聚乙二醇聚合物连接， 任选通过接头。
7a. 方面 6a 的衍生物， 其中所述衍生物是 SEQ ID NO ： 17 的人胰岛淀粉样多肽或
其类似物， 其中
位置 3 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白结 合残基连接， 任选通过接头。
8a. 方面 1a-4a 中任一项的衍生物， 其中所述衍生物是 SEQ IDNO ： 17 的人胰岛淀 粉样多肽或其类似物， 其中
位置 21 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白结 合残基或聚乙二醇聚合物连接， 任选通过接头。
9a. 方面 1a-4a 中任一项的衍生物， 其中所述衍生物是 SEQ IDNO ： 17 的人胰岛淀 粉样多肽或其类似物， 其中
位置 25 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白结 合残基或聚乙二醇聚合物连接， 任选通过接头。
10a. 方面 1a-4a 中任一项的衍生物， 其中所述衍生物是 SEQ IDNO ： 17 的人胰岛淀 粉样多肽或其类似物， 其中
位置 29 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白结 合残基或聚乙二醇聚合物连接， 任选通过接头。
11a. 方面 1a-4a 中任一项的衍生物， 其中所述衍生物是 SEQ IDNO ： 17 的人胰岛淀 粉样多肽或其类似物， 其中
位置 18 的氨基酸是精氨酸， 并且位置 1-17 或 19-37 的氨基酸残基已被赖氨酸残 基取代， 并且其中所述赖氨酸残基与白蛋白结合残基或聚乙二醇聚合物连接， 任选通过接 头。
12a. 方面 1a-11a 中任一项的衍生物， 其中， 与人胰岛淀粉样多肽相比， 所述衍生 物具有 1-12 个氨基酸取代。
13a. 方面 1a-12a 中任一项的衍生物， 其中， 与人胰岛淀粉样多肽相比， 所述衍生 物具有 1-10 个氨基酸取代。
14a. 方面 1a-13a 中任一项的衍生物， 其中， 与人胰岛淀粉样多肽相比， 所述衍生 物具有 1-8 个氨基酸取代。
15a. 方面 1-14 中任一项的衍生物， 其中， 与人胰岛淀粉样多肽相比， 所述衍生物 具有 1-6 个氨基酸取代。
16a. 方面 1a-15a 中任一项的衍生物， 其中， 与人胰岛淀粉样多肽相比， 所述衍生 物具有 1-4 个氨基酸取代。
17a. 方面 1a-16a 中任一项的衍生物， 其中所述衍生物是 SEQ IDNO ： 17 的人胰岛 淀粉样多肽的类似物， 其中与人胰岛淀粉样多肽相比， 已添加 0-8 个额外电荷。
18a. 方面 17a 的衍生物， 其中已通过以下方法添加 0-8 个额外电荷 ： 用带电荷氨 基酸取代人胰岛淀粉样多肽或其类似物的一个或多个氨基酸残基和 / 或在 N- 端延伸中添 加带电荷氨基酸， 或在白蛋白结合残基或聚乙二醇聚合物和 / 或接头中添加带负电荷的实 体。
19a. 方面 17a 或 18a 的衍生物， 其中已通过以下方法添加 0-8 个额外电荷 ： 用谷 氨酸残基和 / 或天冬氨酸残基取代人胰岛淀粉样多肽或其类似物的一个或多个氨基酸残 基和 / 或在 N- 端延伸中添加带电荷氨基酸。20a. 方面 17a-19a 中任一项的衍生物， 其中已通过以下方法添加 0-8 个额外电荷 ： 在 N- 端延伸中添加带电荷氨基酸。
21a. 方面 1a-3a、 5a 或 12a-20a 中任一项的衍生物， 其中所述衍生物包含由 1-10 个氨基酸组成的 N- 端延伸， 其中所述延伸与白蛋白结合残基或聚乙二醇聚合物进一步连 接。
22a. 方面 21a 的衍生物， 其中所述衍生物包含由 1-8 个氨基酸组成的 N- 端延伸， 其中所述延伸与白蛋白结合残基或聚乙二醇聚合物进一步连接。
23a. 方面 22a 的衍生物， 其中所述衍生物包含由 1-6 个氨基酸组成的 N- 端延伸， 其中所述延伸与白蛋白结合残基或聚乙二醇聚合物进一步连接。
24a. 方面 23a 的衍生物， 其中所述衍生物包含由 5 个氨基酸组成的 N- 端延伸， 其 中所述延伸与白蛋白结合残基或聚乙二醇聚合物进一步连接。
25a. 方面 24a 的衍生物， 其中所述衍生物包含由 4 个氨基酸组成的 N- 端延伸， 其 中所述延伸与白蛋白结合残基或聚乙二醇聚合物进一步连接。
26a. 方面 25a 的衍生物， 其中所述衍生物包含由 3 个氨基酸组成的 N- 端延伸， 其 中所述延伸与白蛋白结合残基或聚乙二醇聚合物进一步连接。
27a. 方面 26a 的衍生物， 其中所述衍生物包含由 2 个氨基酸组成的 N- 端延伸， 其 中所述延伸与白蛋白结合残基或聚乙二醇聚合物进一步连接。
28a. 方面 27a 的衍生物， 其中所述衍生物包含由 1 个氨基酸组成的 N- 端延伸， 其 中所述延伸与白蛋白结合残基或聚乙二醇聚合物进一步连接。
29a. 方面 1a 的衍生物， 所述衍生物包含下式 1 的氨基酸序列 ： Xaa1-Cys-Xaa3-Thr -Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Xaa17-Xaa18-Ser-Ser-Xaa21-AsnXaa23-Gly-Xaa25-Xaa26-Leu-Xaa28-Xaa29-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr
式 (1)(SEQ ID No ： 18)
其中
Xaa1 缺失或独立选自 Lys 和 Glu ；
Xaa3 独立选自 Asn、 Gly 和 Lys ；
Xaa17 独立选自 Ala、 Val 和 Lys ；
Xaa18 独立选自 His、 Pro 和 Arg ；
Xaa21 独立选自 Asn、 Gln 和 Lys ；
Xaa23 独立选自 Phe 和 Leu ；
Xaa25 独立选自 Ala、 Pro 和 Lys ；
Xaa26 独立选自 Val 和 Ile ；
Xaa28 独立选自 Ser 和 Pro ；
Xaa29 独立选自 Ser、 Pro 和 Lys ；
C- 端可任选衍生为酰胺 ；
N- 端可任选延伸 1-10 个氨基酸残基
其中如果 Xaa1 是 Lys， Xaa3 是 Asn， Xaa21 是 Asn， Xaa25 是 Ala 或 Pro， 则 Xaa29 是 Lys ； 和
如果 Xaa1 是 Glu， 则所述 Glu 与由 1-10 个氨基酸组成的 N- 端延伸连接， 并且所述延伸与白蛋白结合残基或聚乙二醇聚合物进一步连接， 和
如果 Xaa1 是 Lys， 则式 (1) 中选自 Xaa1、 Xaa3、 Xaa21、 Xaa25 和 Xaa29 的位置的一个氨 基酸与白蛋白结合残基或聚乙二醇聚合物连接， 任选通过接头。
30a. 方面 1a-29a 中任一项的衍生物， 其中所述衍生物与聚乙二醇聚合物连接。
31a. 方面 30a 的衍生物， 其中所述聚乙二醇聚合物是分子量为至少 30kD 的聚乙二 醇。
32a. 方面 30a-31a 中任一项的衍生物， 其中所述聚乙二醇聚合物是支链聚乙二 醇。
33a. 方面 1a-29a 中任一项的衍生物， 其中所述衍生物与白蛋白结合残基连接。
34a. 方面 33a 的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基是亲脂残基。
35a. 方面 33a 的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基在生理 pH 时带负电荷。
36a. 方面 33a 的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基包含能带负电荷的基团。
37a. 方面 36a 的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基包含羧酸基团。
38a. 方面 33a-37a 中任一项的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基与白蛋白非共价 结合。
39a. 方面 33a-38a 中任一项的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基对人血清白蛋白 的结合亲和力低于约 10μM 或低于约 1μM。
40a. 方面 33a 的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基选自直链烷基、 支链烷基、 具有 ω- 羧酸基团的基团和部分或完全氢化环戊并菲骨架。
41a. 方面 33a 的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基是汽巴克隆基 (cibacronyl) 残 基。
42a. 方面 34a 的衍生物， 其中所述亲脂残基包含部分或完全氢化环戊并菲骨架。
43a. 方面 34a 的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基具有 6-40 个碳原子、 8-26 个碳 原子或 8-20 个碳原子。
44a. 方 面 34a 的 衍 生 物， 其 中 所 述 白 蛋 白 结 合 残 基 是 选 自 CH3(CH2)rCO- 的 酰 基， 其中 r 为 4-38 的整数， 优选为 4-24 的整数 ； 更优选选自 CH3(CH2)6CO-、 CH3(CH2)8CO-、 CH3(CH2)10CO-、 CH3(CH2)12CO-、 CH3(CH2)14CO-、 CH3(CH2)16CO-、 CH3(CH2)18CO-、 CH3(CH2)20CO- 和 CH3(CH2)22CO-。
45a. 方面 34a 的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基是直链或支链烷烃 α， ω- 二 羧酸的酰基。
46a. 方面 34a 的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基是选自 HOOC(CH2)sCO- 的酰基， 其中 s 为 4-38 的整数， 优选为 4-24 的整数 ； 更优选选自 HOOC(CH2)14CO-、 HOOC(CH2)16CO-、 HOOC(CH2)18CO-、 HOOC(CH2)20CO- 和 HOOC(CH2)22CO-。
47a. 方面 34a 的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基是式 CH3(CH2)vCO-NHCH(COOH) (CH2)2CO- 的基团， 其中 v 为 10-24 的整数。
48a. 方 面 34a 的 衍 生 物，其 中 所 述 白 蛋 白 结 合 残 基 是 式 CH3(CH2) 其中 w 为 8-24 的整数。 wCO-NHCH((CH2)2COOH)CO- 的基团，
49a. 方面 34a 的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基是式 COOH(CH2)xCO- 的基团， 其 中 x 为 8-24 的整数。50a. 方 面 34a 的 衍 生 物， 其 中 所 述 白 蛋 白 结 合 残 基 是 式 -NHCH(COOH) (CH2)4NH-CO(CH2)yCH3 的基团， 其中 y 为 8-18 的整数。
51a. 方面 33a 的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基是肽， 例如包含小于 40 个氨基 酸残基的肽。
52a. 方面 33a-51a 中任一项的衍生物， 其中所述白蛋白结合残基任选通过接头是 通过赖氨酸残基的 ε- 氨基连接的。
53a. 包含方面 1a-52a 中任一项的衍生物和药学上可接受的赋形剂的药物组合 物。
54a. 方面 53a 的药物组合物， 其适于胃肠外给药。
55a. 用作药物的方面 1a-52a 中任一项的衍生物。
56a. 用作药物的方面 1a-52a 中任一项的衍生物， 用于治疗或预防高血糖症、 2型 糖尿病、 葡萄糖耐量减低、 1 型糖尿病、 肥胖症、 高血压、 X 综合征、 血脂异常、 认知障碍、 动 脉粥样硬化、 心肌梗塞、 冠心病和其它心血管疾病、 中风、 炎症性肠综合征、 消化不良和胃溃 疡。
57a. 用作药物的方面 1a-52a 中任一项的衍生物， 用于延迟或阻止 2 型糖尿病的疾 病进程。
58a. 用作药物的方面 1a-52a 中任一项的衍生物， 用于减少食物摄取， 减少 β 细胞 凋亡， 增加 β 细胞功能和 β 细胞量， 和 / 或用于恢复 β 细胞的葡萄糖敏感性。
59a. 方面 1a-42a 中任一项的衍生物在制备药物中的用途。
60a. 方面 1a-52a 中任一项的衍生物在制备用于治疗或预防以下疾病的药物中的 用途 ： 高血糖症、 2 型糖尿病、 葡萄糖耐量减低、 1 型糖尿病、 肥胖症、 高血压、 X 综合征、 血脂 异常、 认知障碍、 动脉粥样硬化、 心肌梗塞、 冠心病和其它心血管疾病、 中风、 炎症性肠综合 征、 消化不良和胃溃疡。
61a. 方面 1a-52a 中任一项的衍生物在制备用于延迟或阻止 2 型糖尿病的疾病进 程的药物中的用途。
62a. 方面 1a-52a 中任一项的衍生物在制备用于以下目的的药物中的用途 ： 减少 食物摄取， 减少 β 细胞凋亡， 增加 β 细胞功能和 β 细胞量， 和 / 或用于恢复 β 细胞的葡 萄糖敏感性。
63a. 一种用于延长人胰岛淀粉样多肽或其类似物在患者体内的作用时间的方法， 所述方法的特征在于以下修饰 ：
修饰位置 1 的氨基酸残基， 即通过用任何天然氨基酸任选取代， 并且通过将所述 天然氨基酸与由 1-10 个氨基酸组成的 N- 端延伸连接， 并且进一步
将所述延伸与白蛋白结合残基或聚乙二醇聚合物连接， 或
修饰位置 2-37 的氨基酸残基， 即通过用赖氨酸残基取代， 并通过将所述赖氨酸残 基与白蛋白结合残基或聚乙二醇聚合物连接， 任选通过接头，
或；
修饰位置 3、 21、 25 或 29 的氨基酸残基， 即通过用赖氨酸残基取代并且通过将所述 赖氨酸残基与白蛋白结合残基或聚乙二醇聚合物连接， 任选通过接头，
或；修饰位置 18 的氨基酸残基， 即通过用精氨酸残基取代， 并且修饰位置 2-17 或 19-37 的氨基酸残基， 即通过用赖氨酸残基取代并且通过将所述赖氨酸残基与白蛋白结合 残基或聚乙二醇聚合物连接， 任选通过接头 ；
其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
64a. 方面 63a 的方法， 其中人胰岛淀粉样多肽或其类似物在患者体内的作用时间 延长至超过约 40 小时。
65a. 方面 63a 或 64a 中任一项的方法， 其中所述人胰岛淀粉样多肽或其类似物如 同方面 1a-52a 中任一项的进一步定义。
66a. 一种用于治疗、 预防或缓解患者的以下疾病的方法 ： 高血糖症、 2 型糖尿病、 葡萄糖耐量减低、 1 型糖尿病、 肥胖症、 X 综合征或血脂异常， 所述方法包括给予患者方面 1a-52a 中任一项的衍生物或方面 53a 或 54a 的药物组合物。
67a. 一种用于制备方面 53a 或 54a 的药物组合物的方法， 所述方法包括将方面 1a-52a 中任一项的衍生物与药学上可接受的物质和 / 或赋形剂混合。
一方面， 提供表现出高效力的人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物。 又一方面， 提供比人胰岛淀粉样多肽的效力有所改进的人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物。 再一 方面， 提供具有与普兰林肽相似效力的人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物。 再一方面， 提供比普兰林肽的效力有所改进的人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物。
术语 “效力” ( 或活性 ) 是指本发明衍生物对胰岛淀粉样多肽受体的亲和力并且可 在本文测定部分所述的萤光素酶测定中进行检测。
一方面， 提供物理稳定的人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物。 又一方面， 提供 比人胰岛淀粉样多肽的物理稳定性更高的人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物。
对于本发明的衍生物而言， 本文所用的术语 “物理稳定性” 是指当蛋白质暴露给热 机应力和 / 或与不稳定界面和表面 ( 例如疏水表面和界面 ) 相互作用时， 蛋白质不形成生 物失活和 / 或不溶性蛋白质聚集体的趋势。可通过目测、 本文其它地方所述的 ThT 原纤维 形成测定和 / 或浊度测定， 评价含水蛋白质制剂的物理稳定性。
本文所用的术语 “人胰岛淀粉样多肽” 是指具有 SEQ ID NO 17 所示序列的人胰 岛淀粉样多肽。该术语包括但不限于一种来自胰脏 β 细胞的 37 个氨基酸的人肽激素， 称 为 amylin( 胰岛淀粉样多肽 )， 与胰岛素共分泌。人胰岛淀粉样多肽具有下列氨基酸序列 ： Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-His-Ser-S er-Asn-Asn-Phe-Gly-Ala-Ile-Leu-Ser-Ser-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr(SEQ ID NO ： 17)。因此， 结构式为 Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-AsnPhe-Leu-Val-His-Ser-Ser-Asn-Asn-Phe-Gly-Ala-Ile-Leu-Ser-Ser-Thr-Asn-Val-Gly-S er-Asn-Thr-Tyr-NH2(SEQ ID NO ： 17)( 如下所示 ) 并具有位于 2 个 Cys 残基之间的二硫桥 和 C- 端酰胺基团。
在本文中， 术语 “人胰岛淀粉样多肽类似物” 是指这样的肽 ： 其中 SEQ ID NO ： 17 的人胰岛淀粉样多肽的一个或多个氨基酸残基已被其它氨基酸残基独立取代和 / 或其中人 胰岛淀粉样多肽的一个或多个氨基酸残基已缺失和 / 或其中一个或多个氨基酸残基已添 加到人胰岛淀粉样多肽。一方面， 取代或添加是用任何天然氨基酸。胰岛淀粉样多肽类似 物也包括在 SEQ ID NO ： 17 中的至少一个或多个氨基酸位置上具有插入、 缺失和 / 或取代的 胰岛淀粉样多肽。氨基酸插入、 缺失或取代的数量可以是至少 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11 或 12 个。插入或取代可以是用其它天然或非天然氨基酸、 合成氨基酸、 肽模拟物或其它化 合物。
本文所用的术语 “天然氨基酸” 是选自以下的氨基酸 ( 通常是括号中的 3 个字 母的代码 &1 个字母的代码 ) ： 甘氨酸 (Gly&G)、 脯氨酸 (Pro&P)、 丙氨酸 (Ala&A)、 缬氨酸 (Val&V)、 亮氨酸 (Leu&L)、 异亮氨酸 (Ile&I)、 甲硫氨酸 (Met&M)、 半胱氨酸 (Cys&C)、 苯丙 氨酸 (Phe&F)、 酪氨酸 (Tyr&Y)、 色氨酸 (Trp&W)、 组氨酸 (His&H)、 赖氨酸 (Lys&K)、 精氨酸 (Arg&R)、 谷氨酰胺 (Gln&Q)、 天冬酰胺 (Asn&N)、 谷氨酸 (Glu&E)、 天冬氨酸 (Asp&D)、 丝氨酸 (Ser&S) 和苏氨酸 (Thr&T)。如果因打字错误， 与常用代码比有偏差， 就采用常用代码。本 发明胰岛素中存在的氨基酸优选是可由核酸编码的氨基酸。
在本发明的一个方面， 氨基酸残基的添加或缺失可在肽的 N- 端和 / 或肽的 C- 端 发生。 一方面， 氨基酸残基的取代或添加包括谷氨酸残基、 赖氨酸残基、 精氨酸残基、 组 氨酸残基和 / 或天冬氨酸残基的取代和 / 或添加， 从而得到与母体胰岛淀粉样多肽相比具 有 0-8 个额外电荷的胰岛淀粉样多肽类似物。又一方面， 氨基酸残基的取代或添加包括谷 氨酸残基、 精氨酸残基和 / 或天冬氨酸残基的取代和 / 或添加， 从而得到与母体胰岛淀粉样 多肽相比具有 0-8 个额外电荷的胰岛淀粉样多肽类似物。还一方面， 氨基酸残基的取代或 添加包括谷氨酸残基和 / 或精氨酸残基 (s) 的取代和 / 或添加， 从而得到与母体胰岛淀粉 样多肽相比具有 0-8 个额外电荷的胰岛淀粉样多肽类似物。再一方面， 氨基酸残基的取代 或添加包括谷氨酸残基的取代和 / 或添加， 从而得到与母体胰岛淀粉样多肽相比具有 0-8 个额外电荷的胰岛淀粉样多肽类似物。
人胰岛淀粉样多肽类似物一方面优选具有 30-45 个天然存在或非天然存在的氨 基酸， 优选 35-40 个天然存在或非天然存在的氨基酸。
本文所用的术语 “衍生物” 是指这样的肽 ： 其中肽的一个或多个氨基酸残基已被修 饰， 例如通过烷基化、 酰基化、 酯形成、 酰胺形成或通过马来酰亚胺偶联。
本文所用的术语 “人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物” 或 “胰岛淀粉样多肽衍 生物” 是指人胰岛淀粉样多肽的衍生物或人胰岛淀粉样多肽类似物的衍生物。
在本发明的又一方面， 人胰岛淀粉样多肽类似物与人胰岛淀粉样多肽具有足够的 同源性， 使得它表现出人胰岛淀粉样多肽的至少 70％体内活性。
本发明的衍生物能够与以下受体结合或以别的方式直接或间接相互作用 ： 胰岛淀 粉样多肽受体， 或者胰岛淀粉样多肽本身可与之相互作用而引起生物反应 ( 例如减少食物 摄取 ) 的一种或多种其它受体。本发明的衍生物可与胰岛淀粉样多肽受体结合， 其亲和力 好于 20nM、 10nM 或 5nM， 更优选其亲和力好于 2nM、 1nM、 0.5nM、 0.2nM 或 0.10nM。
在本发明的一个方面， 本发明的衍生物可保留胰岛淀粉样多肽的生物活性的至少 约 25％、 优选约 30％、 40％、 50％、 60％、 70％、 80％、 90％、 95％、 98％或 99％。另一方面， 本
发明的衍生物表现出改进的生物活性。又一方面， 本发明的衍生物表现出胰岛淀粉样多肽 的生物活性的至少约 110％、 125％、 130％、 140％、 150％、 200％或更高。
术语 “活性” 一方面是指降低食欲和 / 或增加饱感的能力。在本发明的一个方面， 按照例如在标题 “测定” 之下的药理学测定 I 和 II 中所述， 通过对降低食欲能力的测定而 测定活性。
在本发明的一个方面， 本发明的衍生物相对于溶媒给予可表现出有能力减少累积 食物摄取量 5％以上， 优选 15％以上， 更优选 25％以上， 甚至更优选 35％以上或 40％以上， 最优选 50％以上。
本文所用的术语 “作用时间” 是指可测定药理学效应 ( 例如食物摄取减少 ) 的时 间跨度。
在本发明的一个方面， 与人胰岛淀粉样多肽相比， 胰岛淀粉样多肽衍生物在体外 和 / 或离体很少有可能形成原纤维。可在例如术语 “物理稳定性” 定义之下所述的硫黄素 T 试验 (Thioflavin T test) 中， 对原纤维形成趋势进行评价。
一方面， 与普兰林肽相比， 在类似条件下， 本发明的胰岛淀粉样多肽衍生物具有 形成含 α 螺旋构象的趋势增加。通过在 220nm 处负性摩尔圆二色信号 (negative molar circular dichroism signal) 强度来评价 α 螺旋的含量， α 螺旋的经典 CD 光谱信号为 ： 正峰约 190nm， 负峰约 208nm。
在本发明的一个方面， 通过标准方法 ( 例如本领域技术人员已知的 ELISA) 测定， 与普兰林肽相比， 胰岛淀粉样多肽衍生物的药动学特性延长。 在本发明的另一方面， 胰岛淀 粉样多肽衍生物的血浆 为至少 1 小时。 在本发明的另一方面， 血浆 为至少 1.5 小时。 在本发明的另一方面， 胰岛淀粉样多肽衍生物的血浆 为至少 2 小时。在本发明的另一 方面， 胰岛淀粉样多肽衍生物的血浆 为至少 4 小时。在本发明的另一方面， 胰岛淀粉样 多肽衍生物的血浆 为至少 6 小时。 在本发明的另一方面， 胰岛淀粉样多肽衍生物的血浆 为至少 8 小时。在本发明的另一方面， 胰岛淀粉样多肽衍生物的血浆 为至少 12 小 时。在本发明的另一方面， 胰岛淀粉样多肽衍生物的血浆 为至少 16 小时。在本发明的 另一方面， 胰岛淀粉样多肽衍生物的血浆 为至少 24 小时。 在本发明的一个方面， 胰岛淀 粉样多肽衍生物的血浆 为至少 48 小时。在本发明的一个方面， 胰岛淀粉样多肽衍生物 的血浆 为至少 96 小时。
在本发明的又一方面， 人胰岛淀粉样多肽类似物具有修饰的人胰岛淀粉样多肽的 氨基酸序列， 使得有 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21 或 22 个 氨基酸与人胰岛淀粉样多肽的相应位置上的氨基酸不同。
在本发明的又一方面， 与人胰岛淀粉样多肽相比， 类似物包括 22 个或小于 22 个修 饰 ( 取代、 缺失、 添加 )。在本发明的又一方面， 与人胰岛淀粉样多肽相比， 类似物包括小于 21 个修饰 ( 取代、 缺失、 添加 )。在本发明的又一方面， 与人胰岛淀粉样多肽相比， 类似物包 括小于 20、 小于 19、 小于 18、 小于 17、 小于 16、 小于 15、 小于 15、 小于 13、 小于 12、 小于 11、 小 于 10 个修饰 ( 取代、 缺失、 添加 )。 在本发明的又一方面， 与人胰岛淀粉样多肽相比， 类似物 包括小于 9 个修饰 ( 取代、 缺失、 添加 )。在本发明的又一方面， 与人胰岛淀粉样多肽相比， 类似物包括小于 8 个修饰 ( 取代、 缺失、 添加 )。 在本发明的又一方面， 与人胰岛淀粉样多肽 相比， 类似物包括小于 7 个修饰 ( 取代、 缺失、 添加 )。在本发明的又一方面， 与人胰岛淀粉样多肽相比， 类似物包括小于 6 个修饰 ( 取代、 缺失、 添加 )。在本发明的又一方面， 与人胰 岛淀粉样多肽相比， 类似物包括小于 5 个修饰 ( 取代、 缺失、 添加 )。在本发明的又一方面， 与人胰岛淀粉样多肽相比， 类似物包括小于 4 个修饰 ( 取代、 缺失、 添加 )。 在本发明的又一 方面， 与人胰岛淀粉样多肽相比， 类似物包括小于 3 个修饰 ( 取代、 缺失、 添加 )。在本发明 的又一方面， 与人胰岛淀粉样多肽相比， 类似物包括小于 2 个修饰 ( 取代、 缺失、 添加 )。在 本发明的又一方面， 与人胰岛淀粉样多肽相比， 类似物仅包括 1 个修饰 ( 取代、 缺失、 添加 )。
在本发明的一个方面， 人胰岛淀粉样多肽类似物具有修饰的人胰岛淀粉样多肽的 氨基酸序列， 使得 12 个氨基酸残基被取代或缺失。
在本发明的一个方面， 人胰岛淀粉样多肽类似物具有修饰的人胰岛淀粉样多肽的 氨基酸序列， 使得 12 个氨基酸残基被取代或缺失并且 N- 端延伸 1-10 个氨基酸残基。
在本发明的一个方面， 人胰岛淀粉样多肽类似物具有修饰的人胰岛淀粉样多肽的 氨基酸序列， 使得 11、 10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、 2 或 1 个氨基酸残基被取代或缺失。
在本发明的一个方面， 人胰岛淀粉样多肽类似物具有修饰的人胰岛淀粉样多肽的 氨基酸序列， 使得 11、 10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、 2 或 1 个氨基酸残基被取代或缺失并且 N- 端延伸 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9 或 10 个氨基酸残基。
在本发明的一个方面， 修饰是取代。在本发明的一个方面， 修饰是缺失。在本发明 的一个方面， 修饰是添加。
一方面， 人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物在 N- 端延伸。又一方面， 人胰岛 淀粉样多肽或其类似物的衍生物在 N- 端延伸， 其中 N- 端延伸是由 1-10 个氨基酸、 1-8 个 氨基酸或 1-6 个氨基酸组成。又一方面， 人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物在 N- 端延 伸， 其中 N- 端延伸是由 5 个氨基酸、 4 个氨基酸、 3 个氨基酸、 2 个氨基酸或 1 个氨基酸组成。 又一方面， N- 端延伸与白蛋白结合残基进一步连接， 任选通过接头。
一方面， 本发明涉及具有 SEQ ID NO.17 的人胰岛淀粉样多肽衍生物。
另一方面， 本发明涉及人胰岛淀粉样多肽类似物的衍生物。
在本发明的另一方面， 与人胰岛淀粉样多肽相比， 所述衍生物具有 1-12 个氨基酸 取代。
在本发明的另一方面， 与人胰岛淀粉样多肽相比， 所述衍生物具有 1-6 个氨基酸 取代。
在本发明的另一方面， 与人胰岛淀粉样多肽相比， 所述衍生物具有 1-5 个氨基酸 取代。
在本发明的另一方面， 与人胰岛淀粉样多肽相比， 所述衍生物具有 1-4 个氨基酸 取代。
在本发明的另一方面， 与人胰岛淀粉样多肽相比， 所述衍生物具有 1-3 个氨基酸 取代。
在本发明的另一方面， 与人胰岛淀粉样多肽相比， 所述衍生物具有 1-2 个氨基酸 取代。
另一方面， 本发明涉及人胰岛淀粉样多肽类似物的衍生物， 所述衍生物依照本发 明被进一步修饰， 其中人胰岛淀粉样多肽类似物是 25Pro 28Pro 29Pro 人胰岛淀粉样多肽 (SEQ ID NO ： 1) ：Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-ValHis-Ser-Ser-Asn-Asn-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-ThrTyr(SEQ ID NO ： 1)。
另一方面， 本发明涉及衍生物， 其中所述白蛋白结合残基， 任选通过接头是通过赖 氨酸残基的 ε- 氨基连接的。
另一方面， 本发明涉及衍生物， 其中所述白蛋白结合残基或聚乙二醇聚合物， 任选 通过接头是通过赖氨酸残基的 α- 氨基连接的。
另一方面， 本发明涉及衍生物， 其中所述赖氨酸残基与白蛋白结合残基通过接头 连接。
本文所用的术语 “与 ... 连接” 是指通过化学键的化学连接。例如赖氨酸残基与白 蛋白结合残基通过化学键连接。作为实例， 这样的化学键可通过赖氨酸 ε 氨基的衍生化， 通过与白蛋白结合残基例如长脂肪酸的活性酯酰化而得到。
本发明所用的连接两个化学部分的其它实例包括但不限于烷基化、 酯形成、 酰胺 形成或马来酰亚胺偶联。
本文所用的术语 “白蛋白结合残基” 是指在本发明一方面与人血清白蛋白非共价 结合的残基。与治疗性多肽连接的白蛋白结合残基通常对人血清白蛋白的亲和力 ( 结合常 数 ) 小于 10μM， 优选小于 1μM。已知一系列白蛋白结合残基是含有 4-40 个碳原子的线状 和分枝的亲脂部分、 具有环戊并菲骨架的化合物、 四唑、 具有 10-30 个氨基酸残基的肽等。
可通过本领域已知的若干方法测定白蛋白结合亲和力。在一种方法中， 待测衍生 125 3 物用例如 I 或 H 进行放射性标记并与固定化白蛋白一起孵育 (Kurtzhals 等， Biochem. J.， 312， 725-731(1995))。对照标准， 求出衍生物的结合。在另一种方法中， 相关化合物带 上放射性标记， 再用系列稀释的待测衍生物与所述化合物竞争性结合固定在例如 SPA 珠上 的白蛋白。竞争的 EC50 值就是衍生物亲和力的度量。在第三种方法中， 在不同浓度的白蛋 白中测定衍生物的受体亲和力或效力， 作为白蛋白浓度的函数， 衍生物相对亲和力或效力 的改变反映了其对白蛋白的亲和力。
在本发明的一个方面， 白蛋白结合残基包含可带负电荷的基团。
本文所用的术语 “C1-6- 烷基” 是指具有 1-6 个碳原子的饱和支链、 直链或环状烃 基。 代表性实例包括但不限于甲基、 乙基、 正丙基、 异丙基、 丁基、 异丁基、 仲丁基、 叔丁基、 正 戊基、 异戊基、 新戊基、 叔戊基、 正己基、 异己基、 环己烷等。
本文所用的术语 “接头 (linker)” 或 “间隔基 (spacer)” ( 间隔基和接头这两个术 语在本说明书中可互换使用 ) 是指将肽与白蛋白结合残基或聚乙二醇聚合物间隔开的化 学部分。
本文所用的术语 “亲水接头” 或 “亲水间隔基” 是指以包含至少 5 个重原子的化学 部分使肽和白蛋白结合残基间隔开的接头 / 间隔基， 其中这些重原子有 30-50％是 N 或 O。
在本发明的一个方面， 与母体胰岛淀粉样多肽相比， 接头包含一个或多个带负电 荷的实体， 以得到本发明的胰岛淀粉样多肽衍生物， 其中 0-8 个额外电荷已添加到所述分 子上。
在本发明的一个方面， 接头包含具有 1-7 个亚甲基， 优选 2 个亚甲基的非支链烷烃 α， ω- 二羧酸基团， 所述接头形成介于肽的氨基与白蛋白结合残基的氨基之间的桥。在本发明的另一方面， 接头包含一个或多个烷撑二醇单元， 例如 1-5 个烷撑二醇 单元。烷撑二醇单元在又一方面是乙二醇、 丙二醇或丁二醇， 但也可为更高的烷撑二醇。
在本发明的另一方面， 接头是选自以下的亲水接头 ：
-(CH2)lD[(CH2)nE]m(CH2)p-Qq-， 其中
l、 m 和 n 独立地为 1-20， p 为 0-10，
Q 为 -Z-(CH2)lD[(CH2)nG]m(CH2)p-，
Q 为 0-5 的整数，
每个 D、 每个 E 和每个 G 独立选自 -O-、 -NR3-、 -N(COR4)-、 -PR5(O)- 和 -P(OR6)(O)-， 其中 R3、 R5、 R5 和 R6 独立地为氢或 C1-6- 烷基，
Z 选自 -C(O)NH-、 -C(O)NHCH2-、 -OC(O)NH-、 -C(O)NHCH2CH2-、 -C(O)CH2-、 -C(O)CH ＝ CH-、 -(CH2)s-、 -C(O)-、 -C(O)O- 或 -NHC(O)-， 其中 s 为 0 或 1。
在本发明的另一方面， 接头是如上定义的亲水接头， 其中 l 为 1 或 2， n 和 m 独立地 为 1-10， p 为 0-10。
在本发明的另一方面， 接头是如上定义的亲水接头， 其中 D 为 -O-。
在本发明的另一方面， 接头是如上定义的亲水接头， 其中 E 为 -O-。
在本发明的又一方面， 亲水接头是 -CH2O[(CH2)2O]m(CH2)pQq-， 其中 m 为 1-10， p为 1-3， Q 为 -Z-CH2O[(CH2)2O]m(CH2)p-， 其中 Z 如上定义。
在本发明的另一方面， 接头是如上定义的亲水接头， 其中 q 为 1。
在本发明的另一方面， 接头是如上定义的亲水接头， 其中 G 为 -O-。
在本发明的另一方面， 接头是如上定义的亲水接头， 其中 Z 选自 -C(O)NH-、 -C(O) NHCH2- 和 -OC(O)NH-。
在本发明的另一方面， 接头是如上定义的亲水接头， 其中 q 为 0。
在本发明的另一方面， 接头是如上定义的亲水接头， 其中 l 为 2。
在本发明的另一方面， 接头是如上定义的亲水接头， 其中 n 为 2。
在本发明的一个方面， 使用了以化学部分使肽与白蛋白结合残基间隔开的 “亲水 接头” B。
在 本 发 明 的 一 个 方 面， 亲 水 接 头 B 为 -C(O)-(CH2)l-O-[(CH2CH2-O]m-(CH2) p-[NHC(O)-(CH2)l-O-[(CH2)n-O]m-(CH2)p]q-NH-，
其中 l、 m、 n 和 p 独立地为 1-5， q 为 0-5。
在本发明的又一方面， 亲水接头 B 为
-C(O)-CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2[NHC(O)-CH2-O-CH2CH2O-CH2CH2]q-NH-，
其中 q 为 0-5。
在本发明的又一方面， 亲水接头 B 为
-C(O)-CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-NHC(O)-CH2-O-CH2CH2O-CH2CH2-NH-。
在本发明的又一方面， 亲水接头 B 为 -[CH2CH2O]m+1(CH2)pQq
其中 m 和 p 独立地为 0-10， q 为 0-5 和
Q 为如上定义的 -Z-(CH2)lD[(CH2)nG]m(CH2)p-。
在本发明的又一方面， 亲水接头 B 为
-(CH2)l-O-[(CH2)n-O]m-(CH2)p-[C(O)NH-(CH2)l-O-[(CH2)n-O]m-(CH2)p]q-，其中 l、 m、 n 和 p 独立地为 1-5， q 为 0-5。
在本发明的又一方面， 接头包含除 Cys 之外的氨基酸残基， 或二肽 ( 例如 Gly-Lys、 Glu-Glu 或 Glu-Arg) 或三肽 ( 例如 Gly-Gly-Lys、 Glu-Glu-Glu 或 Glu-Glu-Arg)。
合适 PEG 聚合物通常是市售的或可通过本领域技术人员众所周知的技术来制备。
在本发明的一个方面， PEG 聚合物的分子量大于 700D， 又一方面， 分子量大于 5kD， 还一方面， 大于 10kD， 甚至又一方面， 大于 20kD。PEG 聚合物可以是线状或分枝的。当 PEG 聚合物大于 20Kda 时， PEG 聚合物优选具有分枝结构， 例如 43kD 分枝 PEG- 肽 (Shearwater 2001， 目录号 2D3XOT01， mPEG2-MAL)。
可通过将 PEG 连接在肽表面上与受体相互作用相反的一侧， 而完成 PEG 在完整肽 上的连接。
在本发明的一个方面， PEG 的连接可发生在人胰岛淀粉样多肽或其类似物的位置 2、 3、 4、 5 或 6 被赖氨酸残基或半胱氨酸取代的氨基酸残基上， 任选通过接头。在本发明的 又一方面， PEG 的连接可发生在人胰岛淀粉样多肽或其类似物的位置 23、 24、 25、 26、 27 或 28 被赖氨酸残基或半胱氨酸取代的氨基酸残基上， 任选通过接头。在本发明的还一方面， PEG 的连接可发生在人胰岛淀粉样多肽或其类似物的位置 32、 33、 34、 35、 36 或 37 被赖氨酸残基 或半胱氨酸取代的氨基酸残基上， 任选通过接头。 有 若 干 策 略 用 于 将 PEG 偶 联 到 肽 上 ( 参 见 例 如 Veronese， Biomaterials 22 ： 405-417， 2001)， 其全部内容都通过引用结合到本文中。因此， 本领域技术人员能够利用众 所周知的技术， 将 PEG 聚合物与本文所述的人胰岛淀粉样多肽或胰岛淀粉样多肽类似物连 接。
简而言之， 半胱氨酸 PEG 化是一种用于位点特异性 PEG 化的方法， 可通过以下步骤 来完成 ： 在人胰岛淀粉样多肽或胰岛淀粉样多肽类似物的一个特定位置上引入独特半胱氨 酸突变， 然后使所得肽与半胱氨酸特异性 PEG 化试剂 ( 例如 PEG- 马来酰亚胺 ) 反应。有 必要使肽突变， 以便允许位点特异性 PEG 化。例如， 如果肽含有半胱氨酸残基， 这些残基就 有必要用保守氨基酸取代， 以确保位点特异性 PEG 化。另外， 可将刚性接头， 包括但不限于 “GGS” 、 “GGSGGS” 和 “PPPS” ， 添加到其 C 端， 但在 PEG 连接位点 ( 即独特半胱氨酸残基 ) 之 前。
在本发明的一个方面， 白蛋白结合残基是亲脂残基。 又一方面， 亲脂残基通过缀合 化学 (conjugation chemistry)( 例如通过烷基化、 酰基化、 酯形成或酰胺形成 )， 任选通过 接头与赖氨酸残基连接， 或通过马来酰亚胺偶联与半胱氨酸残基连接。
在本发明的又一方面， 白蛋白结合残基在生理 pH 时带负电荷。在本发明的另一方 面， 白蛋白结合残基包含可带负电荷的基团。一个优选的可带负电荷的基团是羧酸基团。
在本发明的又一方面， 白蛋白结合残基与白蛋白非共价结合。在本发明的另一方 面， 白蛋白结合残基对人血清白蛋白的结合亲和力好于约 10μM 或好于约 1μM。
在本发明的又一方面， 白蛋白结合残基选自直链烷基、 支链烷基、 具有 ω- 羧酸基 团的基团和部分或完全氢化环戊并菲骨架。
在本发明的一个方面， 白蛋白结合残基包含四唑。一方面， 白蛋白结合残基为 (CH2)1-20- 四唑基。一方面， 白蛋白结合残基为 (CH2)15- 四唑基。
在本发明的又一方面， 白蛋白结合残基是汽巴克隆基 (cibacronyl) 残基。
在本发明的又一方面， 白蛋白结合残基具有 6-40 个碳原子、 8-26 个碳原子或 8-20 个碳原子。
在本发明的又一方面， 白蛋白结合残基是选自 CH3(CH2)rCO- 的酰基， 其中 r 为 4-38 的整数， 优选为 4-24 的整数 ； 更优选选自 CH3(CH2)6CO-、 CH3(CH2)8CO-、 CH3(CH2)10CO-、 CH3(CH2)12CO-、 CH3(CH2)14CO-、 CH3(CH2)16CO-、 CH3(CH2)18CO-、 CH3(CH2)20CO- 和 CH3(CH2)22CO-。
在本发明的另一方面， 白蛋白结合残基是直链或支链烷烃 α， ω- 二羧酸的酰基。
在 本 发 明 的 另 一 方 面， 白 蛋 白 结 合 残 基 是 选 自 HOOC(CH2)sCO- 的 酰 基， 其中 s 为 4-38 的 整 数， 优 选 为 4-24 的 整 数 ； 更 优 选 包 选 自 HOOC(CH2)14CO-、 HOOC(CH2)16CO-、 HOOC(CH2)18CO-、 HOOC(CH2)20CO- 和 HOOC(CH2)22CO-。
在本发明的另一方面， 白蛋白结合残基是式 CH3(CH2)vCO-NHCH(COOH)(CH2)2CO- 的 基团， 其中 v 为 10-24 的整数。
在本发明的另一方面， 白蛋白结合残基是式 CH3(CH2)wCO-NHCH((CH2)2COOH)CO- 的 基团， 其中 w 为 8-24 的整数。
在本发明的另一方面， 白蛋白结合残基是式 COOH(CH2)xCO- 的基团， 其中 x 为 8-24 的整数。
在本发明的另一方面， 白蛋白结合残基是式 -NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)yCH3 的 基团， 其中 y 为 8-18 的整数。
在 本 发 明 的 一 个 方 面， 结 合 的 白 蛋 白 结 合 残 基 和 接 头 是 -C(O)-(CH2) l-O-[(CH2CH2-O]m-(CH2)p-[NHC(O)-(CH2)l-O-[(CH2)n-O]m-(CH2)p]q-NH-W，
其中 l、 m、 n 和 p 独立地为 1-5， q 为 0-5，
和 W 选自
CH 3 (CH 2 ) 6 CO- 、CH 3 (CH 2 ) 8 CO- 、CH 3 (CH 2 ) 10 CO- 、CH 3 (CH 2 ) 12 CO- 、CH 3 (CH 2 ) 14 CO- 、 CH3(CH2)16CO-、 CH3(CH2)18CO-、 CH3(CH2)20CO-、 CH3(CH2)22CO-、 HOOC(CH2)14CO-、 HOOC(CH2)16CO-、 HOOC(CH2)18CO-、 HOOC(CH2)20CO- 和 HOOC(CH2)22CO-。
在本发明的一个方面， 结合的白蛋白结合残基和接头是 -C(O)-CH2-O-CH2CH2-O-CH2 CH2[NHC(O)-CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2]q-NH-Ac，
其中 q 为 0-5 并且其中 Ac 为乙酰基。
在本发明的另一方面， 结合的白蛋白结合残基和接头是式
-C(O)-CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-NHC(O)-CH2-O-CH2CH2O-CH2CH2-NH-Ac 的 基 团， 其中 Ac 为乙酰基。
在本发明的另一方面， 结合的白蛋白结合残基和接头是
其中 B 如上定义， Z、 V、 q 和 w 如下定义。 在本发明的另一方面， 结合的白蛋白结合残基和接头是其中 Z 为 CH3 或 COOH， V 为 H 或 COOH， q 为 7-21， w 为 0-5， k 为 0-5， B 为 -C(O)-(CH2) l-O-[(CH2CH2-O]m-(CH2)p-[NHC(O)-(CH2)l-O-[(CH2)n-O]m-(CH2)p]q-NH-，
其中 l、 m、 n 和 p 独立地为 1-5， q 为 0-5。
在本发明的另一方面， 结合的白蛋白结合残基和接头是
其中 Z 为 CH3 或 COOH， V 为 H 或 COOH， q 为 7-21， w 为 0-5， k 为 0-5。在本发明的 另一方面， Z 为 CH3， V 为 COOH。在本发明的另一方面， V 为 H， Z 为 COOH。在本发明的另一 方面， V 为 H， Z 为 CH3。在本发明的另一方面， V 和 Z 都为 COOH。在本发明的优选方面， q为 13-19， 更优选 q 为 13-15。在本发明的优选方面， k 为 1-4， 更优选 1-2。在本发明的优选方 面， w 为 1-4， 更优选 1-2。
在本发明的另一方面， 结合的白蛋白结合残基和接头是
其中 Z 为 CH3 或 COOH， q 为 7-21， k 为 0-5。在本发明的另一方面， Z 为 CH3。在本 发明的另一方面， Z 为 COOH。在本发明的优选方面， q 为 13-19， 更优选 q 为 13、 14 或 15。在 本发明的优选方面， k 为 1-4， 更优选为 1 或 2。
在 本 发 明 的 另 一 方 面， 白 蛋 白 结 合 残 基 是 肽， 例 如 包 含 小 于 40 个 氨 基 酸 残 基 的 肽。 作 为 白 蛋 白 结 合 残 基 的 大 量 小 肽 及 其 鉴 定 方 法 可 参 见 J.Biol Chem.277， 38(2002)35035-35043。
在本发明的另一方面， 白蛋白结合残基任选通过接头是通过赖氨酸残基的 ε- 氨 基连接。
又一方面， 本发明涉及胰岛淀粉样多肽衍生物， 其中亲脂残基通过接头与母体 肽 连 接， 所 述 接 头 是 除 Cys 之 外 的 氨 基 酸 残 基， 或 是 二 肽 ( 例 如 Gly-Lys、 Glu-Arg 或 Glu-Glu)， 或是三肽 ( 例如 Gly-Gly-Lys、 Glu-Glu-Arg 或 Glu-Glu-Glu)， 或是四肽 ( 例如 Glu-Glu-Glu-Glu、 Glu-Arg-Glu-Glu)， 或是由 5-10 个氨基酸组成的多肽， 并且其中母体肽 的羧基与 Lys 残基的氨基或含有 Lys 残基的二肽、 三肽、 四肽或多肽的氨基形成酰胺键， 并 且 Lys 残基的其它氨基或含有 Lys 残基的二肽、 三肽或多肽的其它氨基与亲脂残基的羧基 形成酰胺键。
又一方面， 本发明涉及胰岛淀粉样多肽衍生物， 其中亲脂残基通过接头与母体 肽 连 接， 所 述 接 头 是 除 Cys 之 外 的 氨 基 酸 残 基， 或 是 二 肽 ( 例 如 Gly-Lys、 Glu-Arg 或
Glu-Glu)， 或是三肽 ( 例如 Gly-Gly-Lys、 Glu-Glu-Arg 或 Glu-Glu-Glu)， 或是四肽 ( 例如 Glu-Glu-Glu-Glu、 Glu-Arg-Glu-Glu)， 或是由 5-10 个氨基酸组成的多肽， 并且其中母体肽 的氨基与氨基酸残基或二肽、 三肽、 四肽或多肽接头的羧基形成酰胺键， 并且氨基酸残基或 二肽、 三肽或多肽接头的氨基与亲脂残基的羧基形成酰胺键。
又一方面， 本发明涉及胰岛淀粉样多肽衍生物， 其中亲脂残基通过接头与母体 肽 连 接， 所 述 接 头 是 除 Cys 之 外 的 氨 基 酸 残 基， 或 是 二 肽 ( 例 如 Gly-Lys、 Glu-Arg 或 Glu-Glu)， 或是三肽 ( 例如 Gly-Gly-Lys、 Glu-Glu-Arg 或 Glu-Glu-Glu)， 或是四肽 ( 例如 Glu-Glu-Glu-Glu、 Glu-Arg-Glu-Glu)， 或是由 5-10 个氨基酸组成的多肽， 并且其中母体肽 的羧基与氨基酸残基接头或二肽、 三肽、 四肽或多肽接头的氨基形成酰胺键， 而氨基酸残基 接头或二肽、 三肽或多肽接头的羧基与亲脂残基的氨基形成酰胺键。
又一方面， 本发明涉及胰岛淀粉样多肽衍生物， 其中亲脂残基通过接头与母体 肽 连 接， 所 述 接 头 是 除 Cys 之 外 的 氨 基 酸 残 基， 或 是 二 肽 ( 例 如 Gly-Lys、 Glu-Arg 或 Glu-Glu)， 或是三肽 ( 例如 Gly-Gly-Lys、 Glu-Glu-Arg 或 Glu-Glu-Glu)， 或是四肽 ( 例如 Glu-Glu-Glu-Glu、 Glu-Arg-Glu-Glu)， 或是由 5-10 个氨基酸组成的多肽， 并且其中母体肽 的羧基与 Asp 或 Glu 的接头或含有 Asp 或 Glu 残基的二肽、 三肽、 四肽或多肽接头的氨基形 成酰胺键， 而接头的羧基与亲脂残基的氨基形成酰胺键。
在本发明的一个方面， 胰岛淀粉样多肽衍生物的 C- 端可以以酸或酰胺来终止。在 一个优选的方面， 胰岛淀粉样多肽衍生物的 C- 端是酰胺。
又一方面， 本发明涉及胰岛淀粉样多肽衍生物， 其中亲脂残基通过含有赖氨酸残 基的 N- 端延伸与母体肽连接， 所述赖氨酸残基是 Lys， 或是二肽 ( 例如 Gly-Lys)， 或是三 肽 ( 例如 Gly-Gly-Lys)， 或是四肽 ( 例如 Glu-Glu-Glu-Glu、 Glu-Arg-Glu-Glu)， 或是由在 N- 端位置含有 Lys 的 5-10 个氨基酸组成的多肽， 并且其中 Lys 残基或含有 Lys 残基的二 肽、 三肽、 四肽或多肽的 N- 端 Lys 残基的氨基与亲脂残基的羧基形成酰胺键。一方面， 酰胺 键介于赖氨酸残基的 ε- 氨基与亲脂残基之间。一方面， 酰胺键介于赖氨酸残基的 α- 氨 基与亲脂残基之间。
又一方面， 本发明涉及胰岛淀粉样多肽衍生物， 其中亲脂残基通过 N- 端延伸 与 母 体 肽 连 接， 所 述 N- 端 延 伸 是 氨 基 酸 残 基， 或 是 二 肽 ( 例 如 Gly-Lys、 Glu-Arg 或 Glu-Glu)， 或是三肽 ( 例如 Gly-Gly-Lys、 Glu-Glu-Arg)， 或是四肽 ( 例如 Glu-Glu-Glu、 Glu-Glu-Glu-Glu、 Glu-Arg-Glu-Glu)， 或是由 5-10 个氨基酸组成的多肽， 并且其中所述 N- 端延伸的 N- 端氨基酸的氨基与亲脂残基的羧基形成酰胺键。
又一方面， 本发明涉及胰岛淀粉样多肽衍生物， 其中亲脂残基通过 N- 端延伸 与 母 体 肽 连 接， 所 述 N- 端 延 伸 是 氨 基 酸 残 基， 或 是 二 肽 ( 例 如 Gly-Lys、 Glu-Arg 或 Glu-Glu)， 或是三肽 ( 例如 Gly-Gly-Lys、 Glu-Glu-Arg)， 或是四肽 ( 例如 Glu-Glu-Glu、 Glu-Glu-Glu-Glu、 Glu-Arg-Glu-Glu)， 或是由 5-10 个氨基酸组成的多肽， 并且其中所述 N- 端延伸的 N- 端氨基酸的羧基与亲脂残基的氨基形成酰胺键。
在本发明的一个方面， 胰岛淀粉样多肽衍生物的氨基酸序列选自 ：
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No.1)，
KCKTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No.2)，
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPKTNVGSNTY(SEQ ID No.3)，KCNTATCATQRLANFLVHSSKNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No.4)，
KCNTATCATQRLANFLKHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No.5)，
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGKILPPTNVGSNTY(SEQ ID No.6)，
KCNTATCATQRLANFLVRSSNNFGKILPPTNVGSNTY(SEQ ID No.7)，
CNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY(SEQ ID No.8)，
KCKTATCATQRLANFLVPSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No.9)，
KCNTATCATQRLANFLVRSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No.10)，
KCKTATCATQRLANFLVRSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No.11)，
KCGTATCATQRLANFLARSSNNFGPILSPTNVGSNTY(SEQ ID No.12)，
EERECNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No.13)，
KCKTATCATQRLANFLVRSSQNLGPVLPPTNVGSNTY(SEQ ID No.14)，
ECKTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No.15)，
EECNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No.16).
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY(SEQ ID No.17， 人胰岛淀粉样多肽 ).
EERECQTATCATQRLANFLVRSSQNLGPVLPPTNVGSNTY(SEQ ID No.19).
EEEECQTATCATQRLANFLVRSSQNLGPVLPPTNVGSNTY(SEQ ID No.20).
CKTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No.21).
CNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No.22).
ECNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No.23).
RCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No.24).
ERCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No.25).
RRCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No.26).
KKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No.27).
RKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No.28).
EKRKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No.29).
EKRCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No.30).
EERECKTATCATQRLANFLVRSSQNLGPVLPPTNVGSNTY(SEQ ID No.31).
ECQTATCATQRLANFLVRSSQNLGPVLPPTNVGSNTY(SEQ ID No.32)
其中至少一个氨基酸残基与白蛋白结合残基连接， 任选通过接头。
又一方面， 胰岛淀粉样多肽衍生物中仅有 1 个赖氨酸残基与白蛋白结合残基连 接， 任选通过接头。
在一个优选方面， 具有 SEQ ID NO 1-16 中任一氨基酸序列的胰岛淀粉样多肽衍生 物的 C- 端是酰胺。
在本发明的又一方面， 与接头结合的白蛋白结合残基选自 ：
在本发明的一个方面， 胰岛淀粉样多肽衍生物选自 ：
KCKTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No 2)， 其中位置 3 的赖氨酸 残基和具有结构式选自下式的白蛋白结合残基或与接头结合的白蛋白结合残基连接 ：
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPKTNVGSNTY(SEQ ID No 3)， 其中位置 29 的赖氨酸 残基和具有结构式选自下式的白蛋白结合残基或与接头结合的白蛋白结合残基连接 ：
KCNTATCATQRLANFLVHSSKNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No 4)， 其中位置 21 的赖氨酸残基和具有下式的与接头结合的白蛋白结合残基连接 ：
KCNTATCATQRLANFLKHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No 5)， 其中位置 17 的赖氨酸 残基和具有下式的与接头结合的白蛋白结合残基连接 ：
KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGKILPPTNVGSNTY(SEQ ID No 6)， 其中位置 25 的赖氨酸 残基和具有结构式选自下式的与接头结合的白蛋白结合残基连接 ：
KCNTATCATQRLANFLVRSSNNFGKILPPTNVGSNTY(SEQ ID No 7)， 其中位置 25 的赖氨酸 残基和具有下式的与接头结合的白蛋白结合残基连接 ：
CNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY(SEQ ID No 8)， 其中位置 1 的半胱氨酸 残基和具有结构式选自下式的白蛋白结合残基或与接头结合的白蛋白结合残基连接 ：
KCKTATCATQRLANFLVPSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No 9)， 其中位置 3 的赖氨酸 残基和具有结构式选自下式的与接头结合的白蛋白结合残基连接 ：
KCNTATCATQRLANFLVRSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No 10)， 其中位置 1 的赖氨酸 残基和具有结构式选自下式的白蛋白结合残基连接 ：
KCKTATCATQRLANFLVRSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No 11)， 其中位置 3 的赖氨酸 残基和具有结构式选自下式的白蛋白结合残基连接 ：
KCGTATCATQRLANFLARSSNNFGPILSPTNVGSNTY(SEQ ID No 12)， 其中位置 3 的甘氨酸 残基和具有结构式选自下式的与接头结合的白蛋白结合残基连接 ：
EERECNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No 13)， 其中位置 1 的谷 氨酸残基和具有结构式选自下式的与接头结合的白蛋白结合残基连接 ：
KCKTATCATQRLANFLVRSSQNLGPVLPPTNVGSNTY(SEQ ID No 14)， 其中位置 3 的赖氨酸 残基和具有结构式选自下式的与接头结合的白蛋白结合残基连接 ：
ECKTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No 15)， 其中位置 3 的赖氨酸 残基和具有结构式选自下式的白蛋白结合残基连接 ：
EECNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No 16)， 其中位置 1 的谷氨 酸残基和具有结构式选自下式的白蛋白结合残基连接 ：
EERECQTATCATQRLANFLVRSSQNLGPVLPPTNVGSNTY(SEQ ID No 19) 或 EEEECQTATCATQ RLANFLVRSSQNLGPVLPPTNVGSNTY(SEQ ID No 20)， 其中位置 1 的谷氨酸残基和具有下式的白 蛋白结合残基连接 ：
CKTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No 21)， 其中位置 2 的赖氨酸 残基和具有结构式选自下式的与接头结合的白蛋白结合残基连接 ：
CNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No 22)， 其中位置 1 的半胱氨 酸残基和具有下式的与接头结合的白蛋白结合残基连接 ：
ECNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No 23)， 其中位置 1 的谷氨酸 残基和具有下式的与接头结合的白蛋白结合残基连接 ：
RCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No 24)， 其中位置 1 的精氨酸 残基和具有下式的与接头结合的白蛋白结合残基连接 ：
ERCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No 25)， 其中位置 1 的谷氨 酸残基和具有下式的白蛋白结合残基连接 ：
RRCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No 26) 和 RKCNTATCATQRLAN FLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY， (SEQ ID No 28)， 其中位置 1 的精氨酸残基和具有下式的与接 头结合的白蛋白结合残基连接 ：
KKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No 27)， 其中位置 1 的赖氨 酸残基和具有下式的与接头结合的白蛋白结合残基连接 ：
EKRKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No 29) 和 EKRCNTATCATQR LANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY(SEQ ID No 30)， 其中位置 1 的谷氨酸残基和具有下式的白 蛋白结合残基连接 ：
EERECKTATCATQRLANFLVRSSQNLGPVLPPTNVGSNTY(SEQ ID No 31)， 其中位置 3 的赖 氨酸残基和具有下式的与接头结合的白蛋白结合残基连接 ：
ECQTATCATQRLANFLVRSSQNLGPVLPPTNVGSNTY(SEQ ID No 32)， 其中位置 1 的谷氨酸 残基和具有下式的与接头结合的白蛋白结合残基连接 ：
本发明又一方面涉及一种用于延长人胰岛淀粉样多肽或其类似物在患者体内的 作用时间的方法， 所述方法的特征在于 ：
a) 修饰位置 1 的氨基酸残基， 即通过用任何天然氨基酸任选取代， 并通过将所述 天然氨基酸与由 1-10 个氨基酸组成的 N- 端延伸连接， 并且进一步
a. 将所述延伸与白蛋白结合残基连接， 任选通过接头， 或
b. 修饰位置 2-37 的氨基酸残基， 即通过用赖氨酸残基取代， 并通过将所述赖氨酸 残基与白蛋白结合残基连接， 任选通过接头 ；
或
b) 修饰位置 3 的氨基酸残基， 即通过用赖氨酸残基取代并且通过将所述赖氨酸残 基与白蛋白结合残基连接， 任选通过接头， 和任选修饰位置 1 的氨基酸， 即通过用谷氨酰胺 残基取代 ；
或
c) 修饰位置 17、 21、 25 或 29 的氨基酸残基， 即通过用赖氨酸残基取代并且通过将 所述赖氨酸残基与白蛋白结合残基连接， 任选通过接头 ；
或
d) 修饰位置 18 的氨基酸残基， 即通过用精氨酸残基取代， 并且进一步修饰位置 1-17 或 19-37 的氨基酸残基， 即通过用赖氨酸残基取代并且通过将所述赖氨酸残基与白蛋 白结合残基连接， 任选通过接头 ；
e) 位置 18 的氨基酸是精氨酸， 位置 25、 位置 28 和位置 29 的氨基酸都是脯氨酸， 并且位置 1-17 或 19-37 的氨基酸残基已被赖氨酸残基取代， 并且其中所述赖氨酸残基与白 蛋白结合残基连接， 任选通过接头。
其中所述氨基酸编号与 SEQ ID NO ： 17 中的氨基酸编号一致。
另一方面， 本发明涉及一种方法， 其中人胰岛淀粉样多肽或其类似物在患者体内 的作用时间延长至超过约 40 小时。
肽 ( 例如人胰岛淀粉样多肽或其类似物 ) 的产生是本领域众所周知的。 因此， 可通 过传统肽合成方法产生本发明的肽， 所述方法例如固相肽合成， 使用 t-Boc 或 Fmoc 化学或 其它熟知的技术， 参见例如 Greene 和 Wuts“ ，Protective Groups in Organic Synthesis” ， John Wiley&Sons， 1999。肽也可通过以下方法产生 ： 所述方法包括培养宿主细胞， 所述宿 主细胞含有编码多肽的 DNA 序列并能在合适营养培养基中、 在允许表达肽的条件下表达多 肽。 对于含有非天然氨基酸残基的肽， 应当对重组细胞进行修饰， 致使将非天然氨基酸掺入 肽中， 例如通过使用 tRNA 突变体。
药物组合物
可通过例如以下文献所述的常规技术制备含有本发明衍生物的药物组合物 ： Remington′ s Pharmaceutical Sciences， 1985 或 Remington ： The Science and Practice
of Pharmacy， 第 19 版， 1995。
本发明的一个目的是提供包含本发明肽的药物制剂。一方面， 肽在制剂中的浓度 为约 0.1mg/ml 至约 25mg/ml。另一方面， 肽在制剂中的浓度为约 1mg/ml 至约 10mg/ml。
另一方面， 制剂的 pH 为 2.0-10.0。
另一方面， 制剂的 pH 为 2.0-7.0。
还一方面， 制剂的 pH 为 2.5-4.5。
还一方面， 制剂的 pH 为 2.5-4.0。
制剂还可包含缓冲系统、 防腐剂、 等渗剂、 螯合剂、 稳定剂和 / 或表面活性剂。这些 赋形剂在药物组合物中的用途是技术人员众所周知的。为了方便起见， 可参见 Remington ： The Science and Practice ofPharmacy， 第 19 版， 1995。
在本发明的一个方面， 药物制剂是含水制剂， 即制剂含水。 这样的制剂通常是溶液 剂或混悬剂。在本发明的又一方面， 药物制剂是含水溶液剂。术语 “含水制剂” 定义为包含 至少 50％ ( 重量 ) 水的制剂。同样， 术语 “含水溶液剂” 定义为包含至少 50％ ( 重量 ) 水 的溶液剂， 术语 “含水混悬剂” 定义为包含至少 50％ ( 重量 ) 水的混悬剂。
另一方面， 药物制剂是冻干制剂， 在临用前由医师或患者向其中加入溶剂和 / 或 稀释剂。
另一方面， 药物制剂是干燥制剂 ( 例如冻干或喷雾干燥 )， 无需任何预先溶解就可 使用。
在本发明的又一方面， 缓冲剂选自乙酸钠、 碳酸钠、 柠檬酸 ( 盐 / 酯 )、 甘氨酰甘氨 酸、 组氨酸、 甘氨酸、 赖氨酸、 精氨酸、 磷酸二氢钠、 磷酸氢二钠、 磷酸钠和三 ( 羟甲基 )- 氨基 甲烷、 N- 二 ( 羟乙基 ) 甘氨酸 (bicine)、 N-[ 三 ( 羟甲基 ) 甲基 ] 甘氨酸 (tricine)、 苹果 酸、 琥珀酸 ( 盐 / 酯 )、 马来酸、 富马酸、 酒石酸、 天冬氨酸或其混合物。 这些具体缓冲剂的每 一种都构成本发明的替代方面。
在本发明的又一方面， 制剂还包含药学上可接受的防腐剂。 在本发明的又一方面， 制剂还包含等渗剂。在本发明的又一方面， 制剂还包含螯合剂。
在本发明的又一方面， 制剂还包含稳定剂。稳定剂在药物组合物中的用途是技 术人员众所周知的。为了方便起见， 可参见 Remington ： The Science and Practice of Pharmacy， 第 19 版， 1995。
更具体地讲， 本发明的组合物是稳定的液体药物组合物， 其治疗活性成分包含在 液体药物制剂贮存期间可有可能出现聚集体形成的多肽。 “聚集体形成” 是指多肽分子间 的物理相互作用， 导致寡聚物的形成， 其可保持可溶性， 或是从溶液中沉淀的可见的大聚集 体。 “贮存期间” 是指液体药物组合物或制剂一旦制备之后， 并未立即用于患者。而是在制 备后， 以液体形式、 冷冻状态或干燥形式包装并贮存， 用于以后重配成适于给予患者的液体 形式或其它形式。
“干燥形式” 是指干燥的液体药物组合物或制剂， 即通过冻干 ( 即冷冻干燥 ； 参见 例如 Williams 和 Polli(1984)J.Parenteral Sci.Technol.38 ： 48-59)、 喷雾干燥 ( 参见 Masters(1991)in Spray-Drying Handbook( 第 5 版 ； Longman Scientific and Technical， Essez， U.K.)， 第 491-676 页 ； Broadhead 等 (1992)Drug Devel.Ind.Pharm.18 ： 1169-1206 ； 和 Mumenthaler 等 (1994)Pharm.Res.11 ： 12-20)、或 风 干 (Carpenter 和 Crowe(1988)Cryobiology 25 ： 459-470 ； 和 Roser(1991)Biopharm.4 ： 47-53)。多肽在液体药物组合物 贮存期间形成聚集体， 可对该多肽的生物活性造成不利影响， 导致药物组合物疗效丧失。 此 外， 聚集体的形成可引起其它问题， 例如当用输注系统给予含多肽的药物组合物时， 会阻塞 导管、 膜或泵。
本发明的药物组合物也可包含一定量的氨基酸基料 (amino acidbase)， 其足以减 少组合物贮存期间由多肽形成的聚集体。 “氨基酸基料” 是指这样的氨基酸或氨基酸组合 ： 其中任何给定氨基酸以其游离碱形式或以其盐形式存在。当使用氨基酸组合时， 所有氨基 酸都可以其游离碱形式存在， 所有都可以其盐形式存在， 或者某一些以其游离碱形式存在， 而另一些以其盐形式存在。一方面， 用于制备本发明组合物的氨基酸是携带带电荷侧链的 那些， 例如精氨酸、 赖氨酸、 天冬氨酸和谷氨酸。特定氨基酸 ( 例如甲硫氨酸、 组氨酸、 咪唑、 精氨酸、 赖氨酸、 异亮氨酸、 天冬氨酸、 色氨酸、 苏氨酸及其混合物 ) 的任何立体异构体 ( 即 L、 D 或其混合物 ) 或这些立体异构体的组合， 都可存在于本发明的药物组合物中， 只要所述 特定氨基酸以其游离碱形式或其盐形式存在。一方面， 使用 L- 立体异构体。本发明的组合 物也可与这些氨基酸的类似物一起配制。 “氨基酸类似物” 是指天然存在的氨基酸的衍生 物， 其对减少本发明液体药物组合物贮存期间由多肽引起的聚集体形成具有所需效果。合 适的精氨酸类似物包括例如氨基胍、 鸟氨酸和 N- 一乙基 L- 精氨酸， 合适的甲硫氨酸类似物 包括乙硫氨酸和丁硫氨酸， 合适的半胱氨酸类似物包括 S- 甲基 -L 半胱氨酸。与其它氨基 酸一样， 氨基酸类似物以其游离碱形式或其盐形式掺入到组合物中。 在本发明的又一方面， 氨基酸或氨基酸类似物的使用浓度足以阻止或延迟蛋白质的聚集。 药物组合物也可包含额外的稳定剂， 其可进一步增强其中的治疗活性多肽的稳 定性。稳定剂在药物组合物中的用途是技术人员众所周知的。为了方便起见， 可参见 Remington ： The Science and Practice ofPharmacy， 第 19 版， 1995。
在本发明的又一方面， 制剂还包含表面活性剂。 在本发明的又一方面， 制剂还包含 蛋白酶抑制剂。为了抑制自动催化， 蛋白酶抑制剂的使用在含有蛋白酶的酶原的药物组合 物中尤其有用。
在本发明的肽药物制剂中也可含有其它成分。这类额外成分可包含润湿剂、 乳化 剂、 抗氧化剂、 填充剂、 张力调节剂、 螯合剂、 金属离子、 油性溶媒、 蛋白质 ( 例如人血清白蛋 白、 明胶或蛋白 ) 和两性离子 ( 例如氨基酸， 例如甜菜碱、 牛磺酸、 精氨酸、 甘氨酸、 赖氨酸和 组氨酸 )。这类额外成分当然不应对本发明药物制剂的总体稳定性具有不利影响。
可将含有本发明人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物的药物组合物在若干部 位给予需要这类治疗的患者， 例如在局部 ( 例如皮肤和粘膜部位 )、 在旁路吸收部位 ( 例如 在动脉内、 静脉内、 心脏内给药 ) 和在相关吸收部位 ( 例如在皮内、 皮下、 肌内或腹腔内给 药 )。
本发明药物组合物的给予可通过若干给药途径给予需要所述治疗的患者， 所述途 径例如舌、 舌下、 含服、 口腔、 口服、 胃肠内、 鼻腔、 肺部 ( 例如通过细支气管和肺泡或其组 合 )、 上皮、 真皮、 经皮、 阴道、 直肠、 眼内 ( 例如通过结膜 )、 输尿管和胃肠外。
本发明的组合物可以若干剂型给予， 例如溶液剂、 混悬剂、 乳剂、 微型乳剂、 复合乳 剂、 泡沫剂、 油膏剂、 贴剂、 硬膏剂、 软膏剂、 片剂、 包衣片剂、 冲洗剂 (rinses)、 胶囊剂 ( 例如 硬质明胶胶囊剂和软质明胶胶囊剂 )、 栓剂、 直肠胶囊剂、 滴剂、 凝胶剂、 喷雾剂、 粉剂、 气溶胶、 吸入剂、 滴眼剂、 眼用软膏剂、 眼用冲洗剂、 阴道栓剂、 阴道环、 阴道软膏剂、 注射用溶液 剂、 原位转化溶液剂 ( 例如原位胶凝、 原位固化 (in situ setting)、 原位沉淀、 原位结晶 )、 输注用溶液剂和植入物。
本发明的组合物也可通过共价、 疏水和静电相互作用， 与药物载体、 递药系统和高 级递药系统 (advanced drug delivery system) 合用或与之连接， 从而进一步增强人胰岛 淀粉样多肽或其类似物的衍生物的稳定性， 增加生物利用度， 增加溶解度， 降低不良反应， 达到本领域技术人员熟知的长期治疗， 并增加患者顺从性或其任何组合。
本发明的组合物可呈固体制剂、 半固体制剂、 粉剂和溶液剂形式， 用于肺部给予人 胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物， 使用例如计量吸入器、 干粉吸入器和喷雾器， 所有这 些装置都是本领域技术人员众所周知的。
本发明的组合物可用于控释 (controlled release)、 缓释 (sustainedrelease)、 延释 (protracting release)、 阻释 (retarded release) 和慢释放 (slowrelease) 药物递 送系统的制剂。
胃肠外给药可用注射器、 任选笔型注射器 (pen-like syringe)， 通过皮下、 肌内、 腹膜内或静脉内注射来完成。或者， 胃肠外给药通过输注泵来完成。一个进一步的选项是 组合物， 其可以是溶液剂或混悬剂， 用于以鼻腔或肺部喷雾形式给予人胰岛淀粉样多肽或 其类似物的衍生物。一个更进一步的选项是， 含有本发明的人胰岛淀粉样多肽或其类似物 的衍生物的药物组合物也可用于经皮给药， 例如通过无针头注射或贴剂 ( 任选离子电渗贴 剂 )， 或用于经粘膜给药 ( 例如含服 )。
人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物可通过肺部途径、 在溶媒中作为溶液剂、 混悬剂或干粉剂给予， 使用任何适于肺部递药的已知类型的装置。这些装置的实例包括 但不限于常见的 3 类用于肺部递药的气溶胶发生装置， 可包括喷射或超声喷雾器、 计量吸 入器或干粉吸入器 ( 参见 Yu J， Chien YW.Pulmonary drug delivery ： Physiologic 和 mechanistic aspects.Crit Rev Ther Drug Carr Sys 14(4)(1997)395-453)。
术语 “稳定制剂” 是指与肽的水溶液相比， 其物理稳定性、 化学稳定性或理化稳定 性有所增加的制剂。
对于蛋白质制剂或药物制剂而言， 本文所用的术语 “物理稳定性” 是指当蛋白质暴 露给热机应力和 / 或与不稳定界面和表面 ( 例如疏水表面和界面 ) 相互作用时， 蛋白质不 形成生物失活和 / 或不溶性蛋白质聚集体的趋势。在将装入合适容器 ( 例如药筒或小瓶 ) 的含水蛋白质制剂以不同温度和不同时间周期暴露给机械 / 物理应力 ( 例如搅拌 ) 之后， 可通过目测和 / 或浊度测定， 评价所述制剂的物理稳定性。在黑暗背景下， 在强烈聚焦光线 中进行制剂的目测。制剂浊度的特征在于浊度的目测评分等级， 例如评分为 0-3( 无浊度制 剂对应的目测评分为 0， 而在日光下具有目测浊度的制剂对应的目测评分为 3)。当制剂在 日光下具有目测浊度时， 对于蛋白质聚集而言， 就认为制剂是物理不稳定的。或者， 可通过 技术人员熟知的简单的浊度测定来评价制剂浊度。 也可通过使用蛋白质构象状态的光谱试 剂或探针来评价含水蛋白质制剂的物理稳定性。 探针优选是优先与蛋白质的非天然构象异 构体结合的小分子。蛋白质结构的小分子光谱探针的一个实例是硫黄素 T。硫黄素 T 是一 种荧光染料， 已广泛用于检测淀粉样蛋白原纤维 (amyloid fibril)。在原纤维的存在下和 或许还存在其它蛋白质构型的情况下， 硫黄素 T 引起最大值在约 450nm 处的新激发光并增强了在约 482nm 处的发射光， 当与原纤维蛋白形式结合时。未结合的硫黄素 T 在这样的波 长下基本上无荧光。
其它小分子可用作蛋白质结构从天然状态向非天然状态转变的探针。 例如优先与 暴露的蛋白质的疏水部分 (hydrophobic patch) 结合的 “疏水部分” 探针。在蛋白质天然 状态下， 疏水部分通常都掩埋在蛋白质三级结构内， 但当蛋白质开始解折叠或变性时， 就会 暴露出来。这些小分子光谱探针的实例是芳族疏水染料， 例如蒽 (antrhacene)、 吖啶、 菲咯 啉等。其它光谱探针是金属 - 氨基酸络合物， 例如疏水氨基酸的金属钴络合物， 所述疏水氨 基酸例如苯丙氨酸、 亮氨酸、 异亮氨酸、 甲硫氨酸和缬氨酸等。
对于蛋白质制剂或药物制剂， 本文所用的术语 “化学稳定性” 是指在蛋白质结构 中没有化学共价变化， 因此， 与天然蛋白质结构相比， 不会导致潜在的生物学效力降低和或 潜在的免疫原性增加的化学降解产物的形成。根据天然蛋白质的种类和特性的不同以及 蛋白质所接触的环境的不同， 可形成各种化学降解产物。在本领域技术人员众所周知的蛋 白质制剂的贮存和使用期间， 大多数情况下可能无法完全避免对化学降解的消除， 经常可 观察到化学降解产物数量不断增加。大部分蛋白质都倾向于脱酰胺作用， 该过程中谷氨 酰胺酰基残基或天冬酰胺酰基残基的侧链酰胺基水解而形成游离羧酸。其它降解途径包 括形成高分子量转化产物， 其中两个或两个以上蛋白质分子通过转酰胺基作用和 / 或二 硫化物相互作用而彼此共价结合， 导致形成共价结合的二聚体、 寡聚体和多聚体降解产物 (Stability of Protein Pharmaceuticals， Ahern.T.J.&Manning M.C.， Plenum Press， New York 1992)。 可提及的化学降解的另一种变异形式就是氧化 ( 例如甲硫氨酸残基的氧化 )。 可通过在接触不同环境条件之后的不同时间点测定化学降解产物的含量， 来评价蛋白质制 剂的化学稳定性 ( 降解产物通常因例如增加温度而加速形成 )。通常按照分子大小和 / 或 电荷， 使用不同的色谱技术 ( 例如 SEC-HPLC 和 / 或 RP-HPLC) 来分离每种降解产物并测定 其含量。
在本发明的一个方面， 包含人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物的药物制剂在 超过 6 周使用和超过 3 年贮存后保持稳定。
在本发明的另一方面， 包含人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物的药物制剂在 超过 4 周使用和超过 3 年贮存后保持稳定。
在本发明的又一方面， 包含人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物的药物制剂在 超过 4 周使用和超过两年贮存后保持稳定。
在本发明的甚至又一方面， 包含人胰岛淀粉样多肽或其类似物的衍生物的药物制 剂在超过 2 周使用和超过两年贮存后保持稳定。
另一方面， 本发明涉及用作药物的本发明衍生物。
一方面， 本发明的衍生物用于制备用于治疗或预防以下疾病的药物 ： 高血糖症、 2 型糖尿病、 葡萄糖耐量减低、 1 型糖尿病、 肥胖症、 高血压、 X 综合征、 血脂异常、 认知障碍、 动 脉粥样硬化、 心肌梗塞、 中风、 冠心病和其它心血管疾病、 炎症性肠综合征、 消化不良和胃溃 疡。
另一方面， 本发明的衍生物用作药物， 用于延迟或阻止 2 型糖尿病的疾病进程。
另一方面， 本发明的衍生物用作药物， 用于减少食物摄取， 减少 β- 细胞凋亡， 增 加 β- 细胞功能和 β- 细胞量， 和 / 或用于恢复 β- 细胞的葡萄糖敏感性。在本发明的一个方面， 本发明的衍生物用作药物， 用于治疗或预防以下疾病 ： 高血 糖症、 2 型糖尿病、 葡萄糖耐量减低、 1 型糖尿病、 肥胖症、 高血压、 X 综合征、 血脂异常、 认知 障碍、 动脉粥样硬化、 心肌梗塞、 冠心病和其它心血管疾病、 中风、 炎症性肠综合征、 消化不 良和胃溃疡 ； 或用于延迟或阻止 2 型糖尿病的疾病进程 ； 或用于减少食物摄取， 减少 β- 细 胞凋亡， 增加 β- 细胞功能和 β- 细胞量， 和 / 或用于恢复 β- 细胞的葡萄糖敏感性。
在本发明的又一方面提供用于治疗或预防高血糖症、 2 型糖尿病、 葡萄糖耐量减 低、 1 型糖尿病、 肥胖症、 高血压、 X 综合征、 血脂异常、 认知障碍、 动脉粥样硬化、 心肌梗塞、 冠心病和其它心血管疾病、 中风、 炎症性肠综合征、 消化不良和胃溃疡的方法， 或用于延迟 或阻止 2 型糖尿病的疾病进程的方法， 或用于减少食物摄取、 减少 β 细胞凋亡、 增加 β 细 胞功能和 β 细胞量和 / 或用于恢复 β 细胞的葡萄糖敏感性的方法 ； 所述方法包括给予需 要所述治疗的患者治疗有效量的本发明衍生物。
用本发明衍生物的治疗也可与第二种或更多种例如选自以下的药理学活性物质 联用 ： 抗糖尿病药、 抗肥胖症药、 食欲调节药、 抗高血压药、 用于治疗和 / 或预防糖尿病所致 或相关并发症的药物、 以及用于治疗和 / 或预防肥胖症所致或相关并发症和疾病的药物。 这些药理学活性物质的实例是 ： 胰岛素、 磺酰脲、 双胍、 美格列奈、 葡糖苷酶抑制剂、 高血糖 素拮抗剂、 DPP-IV( 二肽基肽酶 -IV) 抑制剂、 参与刺激糖原异生和 / 或糖原分解的肝酶的抑 制剂、 葡萄糖摄取调节剂、 调节脂质代谢的化合物例如抗高血脂药例如 HMG CoA 抑制剂 ( 他 汀类 )、 减少食物摄取的化合物、 RXR 激动剂和作用于 β 细胞 ATP 依赖性钾通道的药物 ； 考 来烯胺、 考来替泊、 氯贝丁酯、 吉非贝齐、 洛伐他汀、 普伐他汀、 辛伐他汀、 普罗布考、 右甲状 腺素、 内他列奈 (neteglinide)、 瑞格列奈 ； β- 阻滞药类 ( 例如阿普洛尔、 阿替洛尔、 噻吗洛 尔、 吲哚洛尔、 普萘洛尔和美托洛尔 )、 ACE( 血管紧张素转化酶 ) 抑制剂 ( 例如贝那普利、 卡 托普利、 依那普利、 福辛普利、 赖诺普利、 alatriopril、 喹那普利和雷米普利 )、 钙通道阻滞 药类 ( 例如硝苯地平、 非洛地平、 尼卡地平、 伊拉地平、 尼莫地平、 地尔硫 和维拉帕米 ) 以 及 α- 阻滞药类 ( 例如多沙唑嗪、 乌拉地尔、 哌唑嗪和特拉唑嗪 ； CART( 可卡因苯丙胺调节 的转录物 ) 激动剂、 NPY( 神经肽 Y) 拮抗剂、 MC4( 黑皮质素 4) 激动剂、 食欲肽 (orexin) 拮 抗剂、 TNF( 肿瘤坏死因子 ) 激动剂、 CRF( 促肾上腺皮质激素释放因子 ) 激动剂、 CRF BP( 促 肾上腺皮质激素释放因子结合蛋白 ) 拮抗剂、 尿皮质素 (urocortin) 激动剂、 β3 激动剂、 MSH( 促黑素细胞激素 ) 激动剂、 MCH( 黑素细胞浓缩激素 ) 拮抗剂、 CCK( 缩胆囊素 ) 激动剂、 5- 羟色胺重摄取抑制剂、 5- 羟色胺和去甲肾上腺素重摄取抑制剂、 混合 5- 羟色胺和去甲肾 上腺素能化合物、 5HT(5- 羟色胺 ) 激动剂、 铃蟾肽激动剂、 甘丙肽拮抗剂、 生长激素、 生长激 素释放化合物、 TRH( 促甲状腺素 (thyreotropin) 释放激素 ) 激动剂、 UCP 2 或 3( 解偶联蛋 白 2 或 3) 调节剂、 瘦蛋白激动剂、 DA 激动剂 ( 溴隐亭 (bromocriptin)、 doprexin)、 脂肪酶 / 淀粉酶抑制剂、 RXR( 类视黄醇 X 受体 ) 调节剂、 TR β 激动剂 ； 组胺 H3 拮抗剂、 胃泌素和 胃泌素类似物。
应当理解， 本发明衍生物与一个或多个上述化合物和任选一个或多个另外的药理 学活性物质的任何合适组合都被认为是在本发明的范围之内。
本文所引用的所有参考文献， 包括出版物、 专利申请和专利都通过引用其全部结 合到本文中， 其程度如同每篇参考文献单独而具体指明通过引用其全部结合并列举在本文 中一样 ( 以法律所允许的最大程度 )。本文所采用的所有标题和副标题都仅为方便起见， 不应视为以任何方式限制本发明。 本文所提供的任何和所有实施例或示例性语言 ( 例如 “例如” ) 的使用， 都仅仅是 为了更好地说明本发明， 而不应视为对本发明范围的限制， 除非另有说明。 本说明书中的语 言都不应视为意指任何未要求保护的要素是本发明实践中必不可少的。
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按照可适用法律的许可， 本发明包括对本文所附权利要求书所述主题的所有修改 和等同实施方案。
测定
药理学测定 (I)- 用胰岛淀粉样多肽衍生物进行对食欲的功效测试实验方案， 使 用随意饮食饲养的大鼠模型。
用 Sprague Dawley(SD) 大鼠 ( 来自 Taconic Europe， Denmark) 进行本实验。实 验开始时， 大鼠体重为 200-250g。大鼠到货至少 10-14 天后才开始实验， 以便让其适应实 验设施。在此期间至少 2 次处理动物。当到货大鼠单独笼养 1 周后， 以颠倒的光 / 暗周期 ( 是指白天无光照而夜晚有光照 ) 笼养 2 周。既然大鼠在暗周期期间正常活动并吃掉它们 的每日食物摄取量的大部分， 在关灯之前早晨给大鼠用药。这种做法导致最低数据误差和 最高试验灵敏度。实验在大鼠饲养笼 (home cage) 内进行， 在整个适应周期和实验周期中， 让大鼠随意进食和饮水。每一剂量的衍生物都在一组 5-8 只大鼠中进行试验。每组试验都 包括 6-8 只大鼠的溶媒组。按照体重， 通过腹膜内 (ip)、 口服 (po) 或皮下 (sc) 给予大鼠一 次 0.01-3mg/kg 溶液剂。记录每组的给药时间。给药后， 把大鼠放回其饲养笼中， 在此它们 可以随意进食和饮水。通过每小时一次的在线记录或手工记录， 连续记录每只动物的食物 消耗达 7 小时， 然后在 24 小时后和有时在 48 小时后进行记录。在实验期结束时， 给动物实 施安乐死。
把各数据记录在微软 excel 表中。用 Grubbs 统计评价检验异常值后， 将其去掉， 结果用 GraphPad Prism 程序绘制图表。
药理学测定 (II)- 用胰岛淀粉样多肽衍生物进行对食欲的功效测试实验方案， 使 用按时间表饲养的大鼠模型。
用 TAC ： SPRD@mol 大鼠或 Wistar 大鼠 ( 来自 M&B Breeding andResearch Centre A/S， Denmark) 进行本实验。实验开始时， 大鼠体重为 200-250g。大鼠到货至少 10-14 天后 才开始实验， 体重为 180-200g。每一剂量的衍生物都在一组 6-8 只大鼠中进行试验。每组 试验都包括 6-8 只大鼠的溶媒组。
当动物到货后， 将其单独笼养。至少 7 天后才开始研究， 开始训练其进食时间表， 让其在介于 3-7 小时的预定时间周期内随意进食和饮水。在白天的剩余时间内， 大鼠将不 能随意进食， 但仅可饮水。1 周内， 大鼠将按照设定时间表吃掉完全每日定量。既然当撤去 光照时大鼠正常地开始食物摄取并在夜晚吃掉它们的每日食物摄取量的大部分， 这种做法 导致允许监测白天的食物摄取， 并且通常将会意味着与随意饮食饲养的大鼠相比， 溶媒组 误差较少。在 10-14 天的适应期期间， 让大鼠随意进食和饮水。在此期间， 至少 3 次处理动 物。实验在大鼠饲养笼中进行。恰好在给药之前， 将大鼠按照体重随机分配到不同治疗组
(n ＝ 6-8)。在让其随意进食前 15-30 分钟， 按照体重， 通过腹膜内 (ip)、 口服 (po) 或皮下 (sc) 给予它们 0.01-3mg/kg 溶液剂。记录每组的给药时间。给药后， 把大鼠放回其饲养笼 中， 在此它们可以随意进食和饮水。在时间表期间， 通过每小时一次的在线记录或手工记 录， 连续记录每只动物的食物消耗。在实验期结束时， 给动物实施安乐死。
把各数据记录在微软 excel 表中。用 Grubbs 统计评价检验异常值后， 将其去掉， 结果用 GraphPad Prism 程序绘制图表。
萤光素酶测定法 (II)
1. 胰岛淀粉样多肽测定法概要
先前已报道 (Poyner DR 等， 2002， Pharmacological Reviews 54(2)233-246)， 胰 岛淀粉样多肽所致的胰岛淀粉样多肽受体的活化 ( 降钙素受体和受体活性调节肽 RAMP 共 表达 )， 导致 cAMP 胞内浓度增加。因此， 转录在含有多拷贝 cAMP 反应元件 (CRE) 的启动子 下被激活。因此， 通过使用 CRE 萤光素酶报道基因来测定胰岛淀粉样多肽活性是可行的， 所 述 CRE 萤光素酶报道基因被引入到还表达胰岛淀粉样多肽受体的 BHK 细胞中。
2. 胰岛淀粉样多肽 3(a)/CRE-luc 细胞系的构建
用人降钙素受体 (CTa) 和 CRE- 反应性萤光素酶报道基因来稳定转染 BHK570 细胞 系。采用标准方法， 用 RAMP-3 进一步转染该细胞系。这会使降钙素受体转变为胰岛淀粉样 多肽 3(a) 受体。甲氨蝶呤、 新霉素和潮霉素分别是萤光素酶、 降钙素受体和 RAMP-3 的选择 标记。
3. 胰岛淀粉样多肽萤光素酶测定法
为了进行活性测定， 将 BHK 胰岛淀粉样多肽 3(a)//CRE-luc 细胞接种到白色 96 孔 培养板上， 密度约为 20,000 个细胞 / 孔。 这些细胞是在 100μl 生长培养基 ( 含有以下成分 的 DMEM ： 10％ FBS、 1％青霉素 / 链霉素、 1mM 丙酮酸钠、 250nM 甲氨蝶呤、 500μg/ml 新霉素和 400μg/ml 潮霉素 ) 中。 在 37℃和 5％ CO2 下孵育过夜之后， 将生长培养基更换为 50μl/ 孔 TM 的测定培养基 (DMEM( 不含酚红 )、 Glumamax 、 10％ FBS 和 10mM Hepes， pH 7， 4)。此外， 加 入溶于测定缓冲液中的 50μl/ 孔的标准品或样品。在 37℃和 5％ CO2 下孵育 4 小时后， 除 TM 去标准品或样品的测定培养基并更换为 100μl/ 孔 PBS。此外， 加入 100μl/ 孔 LucLite 。 将各板密封并在室温下孵育 30 分钟。最后， 在 TopCounter(Packard) 上用 SPC( 单光子计 数 ) 模式测量发光。
用于评价蛋白质制剂物理稳定性的 ThT 原纤维形成测定的概论
肽的物理稳定性低下可导致形成淀粉样蛋白原纤维， 在样品中观察到这样的原纤 维是井然有序的线状大分子结构， 并最终导致凝胶的形成。通常通过目测样品而对其进行 测定。然而， 这类测定是非常主观的， 取决于观察者。因此， 使用小分子指示探针要有利得 多。硫黄素 T(ThT) 就是这样一种探针， 当与原纤维结合时具有明显的荧光信号 [Naiki 等 (1989)Anal.Biochem.177， 244-249 ； LeVine(1999)Methods.Enzymol.309， 274-284]。
用具有下列表达式的 S 形曲线可描述原纤维形成的时程 [Nielsen 等 (2001) Biochemistry 40， 6036-6046] ：
等式 (1) 式中， F 是在时间 t 的 ThT 荧光。常数 t0 是达到最大荧光的 50％所需要的时间。描述原纤维形成的两个重要参数是用 t0-2τ 计算出的滞后时间和表观速率常数 kapp ＝ 1/ τ。
肽的部分折叠中间体的形成被认为是原纤维形成的常见起始机制。 这些中间体中 的少数成核而形成模板， 而更多中间体可装配在其上并且原纤维形成继续进行。滞后时间 相当于建立临界量的核的间隔时间， 而表观速率常数则是原纤维本身形成的速率。
样品制备
每次测定之前都要新制备样品。 各实施例中都描述了每种样品的组成。 样品的 pH 用适量的浓 NaOH 和 HClO4 或 HCl 调节至期望值。
将溶于水的硫黄素 T 贮液加入到样品中， 终浓度为 1μM。
取 200μl 的等分样品放入 96 孔微量板 (Packard OptiPlateTM-96， 白色聚苯乙 烯 )。 通常， 将各样品一式 4 份或 8 份 ( 对应于一种试验条件 ) 放入一列孔中。 该板用 Scotch Pad(Qiagen) 密封。
孵育和荧光检测
在给定温度下孵育， 振摇并在 Fluoroskan Ascent FL 荧光读板器或 Varioskan 读 板器 (Thermo Labsystems) 中对 ThT 荧光发射进行测定。温度调节至 37℃。在所有给出数 据中， 定轨振摇都调节至 960rpm， 振幅为 1mm。使用通过 444nm 滤色片的激发光并测定通过 485nm 滤色片的发射光， 进行荧光测定。
每轮一开始都是在测定温度下孵育该板长达 10 分钟。在所需时间周期， 每隔 20 分钟测量该板一次。每次测量之间， 按照所述， 将该板振摇和加热。
数据处理
将测量点数据保存在微软 Excel 格式中， 用于进一步处理， 并用 GraphPad Prism 进行绘制曲线和拟合。在原纤维不存在时， 来自 ThT 的背景发射光可忽略不计。数据点通 常是 4 份或 8 份样品的平均值并给出标准偏差误差棒 (standard deviation error bar)。 只有同一实验所得数据 ( 即在同一板上的样品 ) 才显示在同一图表中， 以确保各实验间原 纤维形成的相对度量。
数据集可拟合到等式 (1)。然而， 因为在这种情况下， 在测量期间并非总能达到完 全 S 曲线， 所以原纤维形成的程度表示为按照不同时间点的样品平均值的 ThT 荧光表并给 出标准偏差。
实施例 按照下述肽合成法， 制备出实施例 1-51 的化合物 ：
一 种 肽 合 成 方 法 是 通 过 在 基 于 微 波 的 Liberty 肽 合 成 仪 (CEMCorp.， North Carolina) 的 Fmoc 化学。树脂是 Tentagel S RAM， 装载量为 0.25mmol/g。偶联化学是溶于 NMP 的 DIC/HOAt， 使用溶于 NMP 的 0.3M 氨基酸溶液并且摩尔过量 6-8 倍。偶联条件是 5 分 钟， 可达 70℃。脱保护是用溶于 NMP 的 5％哌啶， 可达 70℃。所用的被保护氨基酸是 0.3M 标准 Fmoc- 氨基酸 ( 由例如 Anaspec 或 Novabiochem 供应 )， 其溶于含有 0.3M HOAt 的 NMP。
另一种肽合成方法是在 Applied Biosystems 433 肽合成仪上， 以 0.25mmol 或 1.0mmol 规模， 使用制造商供应的 FastMoc UV 方案， 该方案使用 HBTU( 六氟磷酸 2-(1H- 苯 并三唑 -1- 基 -)-1， 1， 3， 3 四甲基脲鎓 ) 或 HATU( 六氟磷酸 O-(7- 氮杂苯并三唑 -1- 基 )-1， 1， 3， 3- 四甲基脲鎓 ) 在 NMP 中介导偶联， 并用 UV 监测 Fmoc 保护基的脱保护。用于肽的酰 胺合成的起始树脂是 Rink-Amide 树脂。所用的被保护的氨基酸衍生物是标准 Fmoc- 氨基 酸 ( 由例如 Anaspec 或 Novabiochem 供应 )， 用于适用于 ABI433A 合成仪的预称重柱。
当需要赖氨酸侧链的化学修饰时， 将赖氨酸掺入作为 Lys(Mtt)， N- 端氨基酸也掺 入到序列中， 作为 Boc- 氨基酸， 或者， 如果掺入 N- 端氨基酸作为 Fmoc- 氨基酸， 则除去 Fmoc 基团并且 N- 端通过用 6 当量 Boc- 碳酸酯和 6 当量 DIPEA/NMP 处理 30 分钟而受到保护。 树脂用 NMP 和 DCM 洗涤， 通过将树脂悬浮在纯净六氟异丙醇中达 20 分钟， 再用 DCM 和 NMP 洗涤而除去 Mtt 基团。通过采用肽合成所用的相同方法， 即通过在 Liberty 或 ABI 433 上 的一个或多个自动化步骤或通过在室温下的一个或多个手工偶联步骤， 添加一个或多个下 述构建模块 (building block) 而进行赖氨酸的化学修饰。合成之后， 树脂用 DCM 洗涤并干 燥， 然后用 TFA/TIPS/ 水 (92.5/5/2.5) 处理 2 小时， 再通过用 4 倍体积二乙醚沉淀， 将肽从 树脂上裂解下来。进一步用二乙醚洗涤并干燥之后， 将肽重新溶于水中， 浓度为 1-2mg/ml， 将 pH 调节至约 4.5， 再通过用 1.1 当量 [Pt(IV)1， 2- 乙二胺 2Cl2]Cl2 处理过夜而形成二硫 桥。或者， 通过用 10 当量的碘 /NMP 处理 1 小时， 在树脂上形成二硫桥。在此情况下， 在裂 解和乙醚沉淀之后， 直接纯化粗制肽。
纯化 ： 粗制肽通过半制备型 HPLC， 在装有 5μ 或 7μC-18 硅胶的 20mmx250mm 柱上 进行纯化。将肽溶液泵至 HPLC 柱上， 并将沉淀的肽溶于 5ml 50％乙酸 H2O 中并用水稀释至 20ml， 注入柱中， 然后在 50 分钟内， 在 40 ℃用 40-60 ％ CH3CN/0.1 ％ TFA 梯度洗脱， 流速为 10ml/min。收集含有肽的流分。用水稀释洗脱液之后， 将纯化的肽冻干。
为 了 分 析 HPLC- 流 分 和 终 产 物， 用 214nm 紫 外 检 测 和 例 如 Vydac218TP54 4.6mmx250mm 5μ C-18 硅胶柱 (The Separations Group， Hesperia， USA) 并在 42℃， 按照 例如 1ml/min 的流速洗脱， 进行了 RP-HPLC 分析。通常使用下列 4 种不同洗脱条件中的 1 种：
A1 ： 用含有 0.1M(NH4)2SO4 的缓冲液 ( 其用浓 H2SO4 调节至 pH 2.5) 平衡柱子并在 50 分钟内， 用溶于同一缓冲液的 0％→ 60％ CH3CN 梯度洗脱。
B1 ： 用 0.1％ TFA/H2O 平衡柱子并在 50 分钟内， 用 0％ CH3CN/0.1％ TFA/H2O → 60％ CH3CN/0.1％ TFA/H2O 梯度洗脱。
B6 ： 用 0.1％ TFA/H2O 平衡柱子并在 50 分钟内， 用 0％ CH3CN/0.1％ TFA/H2O → 90％
CH3CN/0.1％ TFA/H2O 梯度洗脱。
或 者，用 214nm 紫 外 检 测 和 Symmetry300， 3.6mmx150mm， 3.5μC-18 硅 胶 柱 (Waters) 并在 42℃， 按照 1ml/min 的流速洗脱， 进行了 RP-HPLC 分析。
B4 ： 用 0.05 ％ TFA/H2O 平 衡 柱 子 并 在 15 分 钟 内， 用 5 ％ CH3CN/0.05 ％ TFA/ H2O → 95％ CH3CN/0.05％ TFA/H2O 梯度洗脱。
肽的结构特征通过 MALDI-MS 在 Bruker Microflex 上予以证实。
所用缩略语 ：
HBTU ： 六氟磷酸 2-(1H- 苯并三唑 -1- 基 -)-1， 1， 3， 3 四甲基脲鎓
Fmoc ： 9H- 芴 -9- 基甲氧基羰基
Boc ： 叔丁氧基羰基
Mtt ： 4- 甲基三苯甲基
DCM ： 二氯甲烷
TIPS ： 三异丙基硅烷
TFA ： 三氟乙酸
NMP ： 1- 甲基 - 吡咯烷 -2- 酮
HOAt ： 1- 羟基 -7- 氮杂苯并三唑
DIC ： 二异丙基碳二亚胺
Trt ： 三苯基甲基
按照上述方法， 用下列构建模块和下列序列， 制备实施例 1-51 的化合物 ：
53101855240 A CN 101855242序列 编号 01 02 03 04 05 06 07 08 肽序列说明书相比的修饰50/65 页与 SEQ ID NO.1KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY KCKTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPKTNVGSNTY KCNTATCATQRLANFLVHSSKNFGPILPPTNVGSNTY KCNTATCATQRLANFLKHSSNNFGPILPPTNVGSNTY KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGKILPPTNVGSNTY KCNTATCATQRLANFLVRSSNNFGKILPPTNVGSNTY CNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY( 普兰林肽 ) K3 K29 K21 K17 K25 R18， K25 desK1， R18， L23， V 2609 10 11 12 13 14KCKTATCATQRLANFLVPSSNNFGPILPPTNVGSNTY KCNTATCATQRLANFLVRSSNNFGPILPPTNVGSNTY KCKTATCATQRLANFLVRSSNNFGPILPPTNVGSNTY KCGTATCATQRLANFLARSSNNFGPILSPTNVGSNTY EERECNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY KCKTATCATQRLANFLVRSSQNLGPVLPPTNVGSNTYK3， P18 R18 K3， R18 G3， A17， R18， S28 EER-E1 K3， R18， Q21， L23， V26 E1， K3， E18 E-E1 A25， S28， S29 ( 人胰岛淀粉样多肽 ) EERE1， Q3， R18， Q21， L 23， V26 EEEE1， Q3， R18， Q21， L 23， V26 K3 desK115 16 17ECKTATCATQRLANFLVESSNNFGPILPPTNVGSNTY EECNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY18EERECQTATCATQRLANFLVRSSQNLGPVLPPTNVGSNTY19EEEECQTATCATQRLANFLVRSSQNLGPVLPPTNVGSNTY20CKTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY54101855240 A CN 101855242序列 编号 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 肽序列说明书相比的修饰51/65 页与 SEQ ID NO.1CNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY ECNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY RCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY ERCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY RRCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY KKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY RKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY EKRKCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY EKRCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPI LPPTNVGSNTY EERECKTATCATQRLANFLVRSSQNLGPVLPPTNVGSNTYdesK1 E1 R1 E-R1 R-R1 K R EKR EK-R1 EERE1， K3， R18， Q21， L 23， V26 E1， Q3， E18， Q21， L 23， V2631ECQTATCATQRLANFLVRSSQNLGPVLPPTNVGSNTY
实施例 1 ： N-α-(17- 羧基庚酰基 )-Glu-[Glu1]- 普兰林肽 (1-37)
实施例 2 ： N-ε3-(17- 羧基十七烷酰基 )-[Lys3]- 普兰林肽 (1-37)
实施例 3 ： N-ε3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(17- 羧基十七烷酰基氨基 ) 乙氧基 ] 乙氧 基 } 乙酰基氨基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙酰基 )-[Lys3]- 普兰林肽 (1-37)
实施例 4 ： N-ε29-(19- 羧基十九烷酰基 )-[Lys29]- 普兰林肽 (1-37)
实施例 5 ： N-ε29-(17- 羧基十七烷酰基 )-[Lys29]- 普兰林肽 (1-37)
实施例 6 ： N-ε29-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(19- 羧基十九烷酰基氨基 ) 乙氧基 ] 乙氧 基 } 乙酰基氨基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙酰基 )-[Lys29]- 普兰林肽 (1-37)
实施例 7 ： N-ε21-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(19- 羧基十九烷酰基氨基 ) 乙氧基 ] 乙氧 基 } 乙酰基氨基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙酰基 )-[Lys21]- 普兰林肽 (1-37)
实施例 8 ： N-ε17-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(19- 羧基十九烷酰基氨基 ) 乙氧基 ] 乙氧 基 } 乙酰基氨基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙酰基 )-[Lys17]- 普兰林肽 (1-37)
实施例 9 ： N-ε25-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(17- 羧基十七烷酰基氨基 ) 乙氧基 ] 乙氧 基 } 乙酰基氨基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙酰基 )-[Arg18， Lys25]- 普兰林肽 (1-37)
实施例 10 ： N-ε25-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(19- 羧基十九烷酰基氨基 ) 乙氧基 ] 乙 氧基 } 乙酰基氨基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙酰基 )-[Lys25]- 普兰林肽 (1-37)实施例 11 ： N-ε3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4- 羧基 -4-(17- 羧基十七烷酰基氨 基 ) 丁酰基氨基 ] 乙氧基 } 乙氧基 ) 乙酰基氨基 ] 乙氧基 } 乙氧基 ) 乙酰基 ]-[Lys3]- 普 兰林肽 (1-37)
实施例 12 ： N-ε3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4- 羧基 -4-(19- 羧基十九烷酰基氨 基 ) 丁酰基氨基 ] 乙氧基 } 乙氧基 ) 乙酰基氨基 ] 乙氧基 } 乙氧基 ) 乙酰基 ]-[Lys3]- 普 兰林肽 (1-37)
实施例 13 ： N-ε3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(19- 羧基十九烷酰基氨基 ) 乙氧基 ] 乙氧 基 } 乙酰基氨基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙酰基 )-[Lys3]- 普兰林肽 (1-37)
实施例 14 ： N-ε3-(19- 羧基十九烷酰基 )-[Lys3]- 普兰林肽 (1-37)
实施例 16 ： N-α-[(S)-4- 羧基 -4-(17- 羧基十七烷酰基氨基 ) 丁酰基 ]-[Arg18， Leu23， Val26]- 普兰林肽 (2-37)实 施 例 17 ： N-α-(2-{2-[2-(2-{2-[2-((S)-4- 羧 基 -4-{4- 羧 基 -4-[4- 羧 基 -4-(17- 羧基十七烷酰基氨基 ) 丁酰基氨基 ] 丁酰基氨基 } 丁酰基氨基 ) 乙氧基 ] 乙氧 基 } 乙酰基氨基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙酰基 )-[Arg18， Leu23， Val26]- 普兰林肽 (2-37)
实施例 18 ： N-ε3-[(S)-4- 羧基 -4-(17- 羧基十七烷酰基氨基 ) 丁酰基 ]-[Lys3， Pro18]- 普兰林肽 (1-37)
实 施 例 19 ： N-ε3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4- 羧 基 -4-(17- 羧 基 十 七 烷 酰 基 氨基 ) 丁酰基氨基 ] 乙氧基 } 乙氧基 ) 乙酰基氨基 ] 乙氧基 } 乙氧基 ) 乙酰基 ]-[Lys3， Pro18]- 普兰林肽 (1-37)
实 施 例 20 ： N-ε3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-((S)-4- 羧 基 -4-{4- 羧 基 -4-[4- 羧 基 -4-(17- 羧基十七烷酰基氨基 ) 丁酰基氨基 ] 丁酰基氨基 } 丁酰基氨基 ) 乙氧基 ] 乙氧 基 } 乙酰基氨基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙酰基 )-[Lys3， Pro18]- 普兰林肽 (1-37)
实施例 21 ： N-α-(17- 羧基庚酰基 )-[Arg18]- 普兰林肽 (1-37)
实施例 22 ： N-ε3-(17- 羧基庚酰基 )-[Lys3， Arg18]- 普兰林肽 (1-37)
实施例 23 ： N-ε1-[(S)-4- 羧基 -4-(17- 羧基十七烷酰基氨基 ) 丁酰基 ]-[Gly3， Ala17， Arg18， Ser28]- 普兰林肽 (1-37)
实施例 24 ： N-α-(17- 羧基庚酰基 )-[Arg18， Leu23， Val26]- 普兰林肽 (2-37)
实施例 25 ： N-α-(19- 羧基十九烷酰基 )-Glu-Glu-Arg-[Glu1]- 普兰林肽 (1-37)
实 施 例 26 ： N-ε25-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[(S)-4- 羧 基 -4-((S)-4- 羧 基 -4-{(S)-4- 羧基 -4-[(S)-4- 羧基 -4-(17- 羧基十七烷酰基氨基 ) 丁酰基氨基 ] 丁酰基 氨基 } 丁酰基氨基 ) 丁酰基氨基 ] 乙氧基 } 乙氧基 ) 乙酰基氨基 ] 乙氧基 } 乙氧基 ) 乙酰 基 ]-[Lys25]- 普兰林肽 (1-37)
实 施 例 27 ： N-ε25-[(S)-4- 羧 基 -4-(17- 羧 基 十 七 烷 酰 基 氨 基 ) 丁 酰 基 ]-[Lys25]- 普兰林肽 (1-37)
实施例 28 ： N-ε3-[(S)-4- 羧基 -4-(17- 羧基十七烷酰基氨基 ) 丁酰基 ]-[Lys3， Arg18， Gln21， Leu23， Val26]- 普兰林肽 (1-37)
实施例 29 ： N-ε3-(17- 羧基庚酰基 )-[Glu1， Lys3， Glu18]- 普兰林肽 (1-37)实施例 30 ： N-ε3-[2-(2-{2-[4-(16-1H- 四唑 -5- 基 - 十六烷酰基氨磺酰基 ) 丁 酰基氨基 ] 乙氧基 } 乙氧基 ) 乙酰基 ]-[Lys3] 普兰林肽 (1-37)
实 施 例 31 ： N-α-[4-(16-1H- 四 唑 -5- 基 - 十 六 烷 酰 基 氨 磺 酰 基 )- 丁 酰 基 ]-Glu-Glu-Arg-[Glu1] 普兰林肽 (1-37)
实施例 32 ： N-ε3(19- 羧基十九烷酰基 -Glu-Glu-Arg-Glu)[Lys3， Arg18， Gln21， Leu23， Val26] 普兰林肽实施例 33 ： N-ε3-(2-(2-(2-(19- 羧基十九烷酰基 -Glu-Glu- 氨基 ) 乙氧基 ) 乙 氧基 ) 乙酰基 )[Lys3， Arg18， Gln21， Leu23， Val26] 普兰林肽 (1-37)
实施例 34 ： N-ε3-(19- 羧基十九烷酰基 -Glu-Glu-Glu-Glu)[Lys3， Arg18， Gln21， Leu23， Val26] 普兰林肽 (1-37)
实 施 例 35 ： N-α-(19- 羧 基 十 九 烷 酰 基 )-Glu-Glu-Arg-[Glu1， Gln3， Arg18， Gln21， Leu23， Val26]- 普兰林肽 (1-37)
实施例 36 ： N-α-(2-(2-(2-(19- 羧基十九烷酰基 -Glu- 氨基 ) 乙氧基 ) 乙氧基 ) 乙酰基 )[Glu1， Gln3， Arg18， Gln21， Leu23， Val26]- 普兰林肽 (1-37)
实 施 例 37 ： N-α-(19- 羧 基 十 九 烷 酰 基 )-Glu-Glu-Glu-[Glu1， Gln3， Arg18， Gln21， Leu23， Val26]- 普兰林肽 (1-37)
实 施 例 38 ： N-α-[(S)-4- 羧 基 -4-(19- 羧 基 十 九 烷 酰 基 氨 基 ) 丁 酰 基 ]-Glu-Glu-Arg-[Glu1]- 普兰林肽 (1-37)
实施例 39 ： N-α-{4- 羧基 -4-[4-(16-1H- 四唑 -5- 基 - 十六烷酰基氨磺酰基 ) 丁 酰基氨基 ] 丁酰基 }-Glu-Glu-Arg-[Glu1]- 普兰林肽 (1-37)实施例 40 ： N-α-(4- 羧基 -4-{6-[4-(16-1H- 四唑 -5- 基 - 十六烷酰基氨磺酰基 ) 丁酰基氨基 ] 己酰基氨基 } 丁酰基 )-Glu-Glu-Arg-[Glu1]- 普兰林肽 (1-37)
实施例 41 ： N-α-(17- 羧基十七烷酰基 )-Glu-Glu-Arg-[Glu1] 普兰林肽 (1-37)
实施例 42 ： N-ε3-{4- 羧基 -4-[4-(16-1H- 四唑 -5- 基 - 十六烷酰基氨磺酰基 ) 丁酰基氨基 ] 丁酰基 }-[Lys3]- 普兰林肽 (2-37)
实施例 43 ： N-α-[(S)-4- 羧基 -4-(19- 羧基十九烷酰基氨基 ) 丁酰基 ]- 普兰林 肽 (2-37)实施例 44 ： N-α-(2-{2-[2-((S)-2-{(S)-4- 羧基 -2-[(S)-4- 羧基 -2-(19- 羧基 十九烷酰基氨基 ) 丁酰基氨基 ] 丁酰基氨基 }-5- 胍基戊酰基氨基 ) 乙氧基 ] 乙氧基 } 乙 酰基 )-[Glu1]- 普兰林肽 (1-37)
实 施 例 45 ： N-α-[(S)-4- 羧 基 -4-(19- 羧 基 十 九 烷 酰 基 氨 基 ) 丁 酰 基 ]-[Arg1]- 普兰林肽 (1-37)
实施例 46 ： N-α-(19- 羧基十九烷酰基 )-Glu-[Arg1]- 普兰林肽 (1-37)
实 施 例 47 ： N-α-[(S)-4- 羧 基 -4-(19- 羧 基 十 九 烷 酰 基 氨 基 ) 丁 酰 基 ]-Arg-[Arg1]- 普兰林肽 (1-37)
实施例 48 ： N-α-[(S)-4- 羧基 -4-(19- 羧基十九烷酰基氨基 ) 丁酰基 ]-Lys- 普 兰林肽 (1-37)
实施例 49 ： N-α-[(S)-4- 羧基 -4-(19- 羧基十九烷酰基氨基 ) 丁酰基 ]-Arg- 普 兰林肽 (1-37)
实施例 50 ： N-α-(19- 羧基十九烷酰基 )-Glu-Lys-Arg- 普兰林肽 (1-37)
实施例 51 ： N-α-(19- 羧基十九烷酰基 )-Glu-Lys-[Arg1]- 普兰林肽 (1-37)
实施例 1-51 的胰岛淀粉样多肽衍生物按照上述 “胰岛淀粉样多肽萤光素酶测定法” 进行了测试， 结果见表 1。这些衍生物的受体亲和力按照上述 “胰岛淀粉样多肽受体结 合测定法” 进行了测试， 结果见表 1。表 1 中的 HPLC 洗脱数据是在分析型 HPLC 系统中， 在 20 分钟内用乙腈 /TFA 的 10％→ 90％梯度洗脱而测得的。
表1
通过 MS 证实的 实施例编号 MW效力 萤光素酶测定 pM 400 50 100 5000 200 100 100 40 60 200 300 60 50HPLC 洗脱 (％乙腈 )1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 184376.0 4260.0 4550.3 4305.0 4277.0 4595.4 4578.4 4593.3 4586.3 4595.4 4679.4 4707.5 4578.4 4288.165 60 61 66 64 65 66 63 62 64 58 61 62 624217.9 4766.4 4349.130 900 70063 61 6166101855240 A CN 101855242说MW明书效力 萤光素酶测定 pM 10000 20000 30 60 70 100 80 300 90 40 30 100 90 300 300 600 90 400 2000 300 800 HPLC 洗脱 (％乙腈 )63/65 页通过 MS 证实的 实施例编号19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 394639.4 4897.6 4265.0 4279.0 4298.9 4088.8 4689.3 5083.8 4406.1 4374.1 4419.2 4564.3 4820.5 4816.6 4676.5 4789.5 4688.4 4548.3 4661.3 4818.5 4949.661 59 61 60 60 63 64 59 62 61 6367101855240 A CN 101855242说MW明书效力 萤光素酶测定 pM 2000 60 40 100 400 40 100 100 100 200 80 70 HPLC 洗脱 (％乙腈 )64/65 页通过 MS 证实的 实施例编号40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 515062.7 4661.3 4420.1 4274.9 4834.5 4431.1 4431.1 4587.3 4531.3 4559.3 4687.5 4559.3
肽合成 ：
一 种 肽 合 成 方 法 是 通 过 在 基 于 微 波 的 Liberty 肽 合 成 仪 (CEMCorp.， North Carolina) 的 Fmoc 化学。树脂是 Tentagel S RAM， 装载量为 0.25mmol/g。偶联化学是溶于 NMP 的 DIC/HOAt， 使用溶于 NMP 的 0.3M 氨基酸溶液并且摩尔过量 6-8 倍。偶联条件是 5 分 钟， 可达 70℃。脱保护是用溶于 NMP 的 5％哌啶， 可达 70℃。当需要赖氨酸侧链的化学修 饰时， 将赖氨酸掺入作为 Lys(Mtt)， 并且 N- 端氨基酸通过用 Boc- 碳酸酯处理而受到保护。 通过将树脂悬浮在纯净六氟异丙醇中达 20 分钟， 再用 DCM 和 NMP 洗涤而除去 Mtt 基团。通 过手工合成或通过在 Liberty 上的一个或多个自动化步骤， 再通过手工偶联， 进行赖氨酸 的化学修饰。另一种肽合成方法是通过在 ABI 433 上的 Fmoc 化学， 并用 HBTU 偶联。合成 之后， 树脂用 DCM 洗涤并干燥， 然后用 TFA/TIS/ 水 (92.5/5/2.5) 处理 2 小时， 再通过用二 乙醚沉淀， 将肽从树脂上裂解下来。进一步用二乙醚洗涤并干燥之后， 将肽重新溶于水中， 浓度为 1-2mg/ml， 将 pH 调节至约 4.5， 再通过用 1 当量 [Pt(IV)1， 2- 乙二胺 2Cl2]Cl2 处理 过夜， 形成二硫桥。立即通过标准 RP-HPLC， 在 C18 柱上， 使用乙腈 /TFA 来纯化肽。或者， 通 过用 10 当量的碘 /NMP 处理 1 小时， 在树脂上形成二硫桥， 在此情况下， 在裂解和乙醚沉淀
之后， 直接纯化粗制肽。肽的结构特征通过 MALDI-MS 予以证实。
所用缩略语 ：
DMF ： N， N 二甲基甲酰胺
HBTU ： 六氟磷酸 2-(1H- 苯并三唑 -1- 基 -)-1， 1， 3， 3 四甲基脲鎓
Fmoc ： 9H- 芴 -9- 基甲氧基羰基
Boc ： 叔丁氧基羰基
Mtt ： 4- 甲基三苯甲基
DCM ： 二氯甲烷
TIS ： 三异丙基硅烷 )
TFA ： 三氟乙酸
NMP ： 1- 甲基 - 吡咯烷 -2- 酮
HOAt ： 1- 羟基 -7- 氮杂苯并三唑
DIC ： 二异丙基碳二亚胺。69101855240 A CN 101855242序列 序列表表1/15 页<110> 诺沃—诺迪斯克有限公司 (Novo Nordisk A/S) <120> 改进的胰岛淀粉样多肽衍生物 <130>7710.204-WO <150>EP 07116067.5 <151>2007-09-11 <150>US 60/972294 <151>2007-09-14 <160>32 <170>PatentIn version 3.5 <210>1 <211>37 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物 <400>1 Lys Cys Asn Thr 1 Val His Ser Ser 20 Gly Ser Asn Thr 35 <210>2 <211>37 <212>PRT <213> 人工序列Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 5 10 15 Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val 25 30 Tyr70101855240 A CN 101855242序列表2/15 页<220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物 <400>2 Lys Cys Lys Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210>3 <211>37 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物 <400>3 Lys Cys Asn Thr 1 Val His Ser Ser 20 Gly Ser Asn Thr 35 <210>4 <211>37 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物 <400>4 Lys Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val His Ser Ser Lys Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val 20 25 3071Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 5 10 15 Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Lys Thr Asn Val 25 30 Tyr101855240 A CN 101855242序列表3/15 页Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210>5 <211>37 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物 <400>5 Lys Cys Asn Thr 1 Lys His Ser Ser 20 Gly Ser Asn Thr 35 <210>6 <211>37 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物 <400>6 Lys Cys Asn Thr 1 Val His Ser Ser 20 Gly Ser Asn Thr 35 <210>7 <211>37 <212>PRT <213> 人工序列72Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 5 10 15 Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val 25 30 TyrAla Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 5 10 15 Asn Asn Phe Gly Lys Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val 25 30 Tyr101855240 A CN 101855242序列表4/15 页<220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物 <400>7 Lys Cys Asn Thr 1 Val Arg Ser Ser 20 Gly Ser Asn Thr 35 <210>8 <211>36 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物 <400>8 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 Arg Ser Ser Asn Asn Leu Gly Pro Val Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210>9 <211>37 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物 <400>9 Lys Cys Lys Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 15 Val Pro Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val73Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 5 10 15 Asn Asn Phe Gly Lys Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val 25 30 Tyr101855240 A CN 101855242序列25表305/15 页20 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210>10 <211>37 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物 <400>10 Lys Cys Asn Thr 1 Val Arg Ser Ser 20 Gly Ser Asn Thr 35Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 5 10 15 Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val 25 30 Tyr<210>11 <211>37 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物 <400>11 Lys Cys Lys Thr 1 Val Arg Ser Ser 20 Gly Ser Asn Thr 35 <210>12 <211>37 <212>PRT <213> 人工序列74Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 5 10 15 Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val 25 30 Tyr101855240 A CN 101855242序列表6/15 页<220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物 <400>12 Lys Cys Gly Thr 1 Ala Arg Ser Ser 20 Gly Ser Asn Thr 35 <210>13 <211>40 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物 <400>13 Glu Glu Arg Glu 1 Asn Phe Leu Val 20 Thr Asn Val Gly 35 <210>14 <211>37 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物 <400>14 Lys Cys Lys Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 1 5 10 1575Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 5 10 15 Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Ser Pro Thr Asn Val 25 30 TyrCys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala 5 10 15 His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro 25 30 Ser Asn Thr Tyr 40101855240 A CN 101855242序列表7/15 页Val Arg Ser Ser Gln Asn Leu Gly Pro Val Leu Pro Pro Thr Asn Val 20 25 30 Gly Ser Asn Thr Tyr 35 <210>15 <211>37 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物 <400>15 Glu Cys Lys Thr 1 Val His Ser Ser 20 Gly Ser Asn Thr 35 <210>16 <211>38 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物 <400>16 Glu Glu Cys Asn 1 Leu Val His Ser 20 Val Gly Ser Asn 35 <210>17 <211>3776Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 5 10 15 Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val 25 30 TyrThr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe 5 10 15 Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn 25 30 Thr Tyr101855240 A CN 101855242序列表8/15 页<212>PRT <213> 人 (Homo Sapiens) <400>17 Lys Cys Asn Thr 1 Val His Ser Ser 20 Gly Ser Asn Thr 35 <210>18 <211>37 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胰岛淀粉样多肽衍生物序列 <220> <221> 变异体 <222>(1)..(1) <223> 缺失或 Lys、 Arg 或 Glu <220> <221> 变异体 <222>(3)..(3) <223>Asn、 Gly、 Gln 或 Lys <220> <221> 变异体 <222>(17)..(17) <223>Ala、 Val 或 Lys <220> <221> 变异体 <222>(18)..(18) <223>His、 Pro 或 ArgAla Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 5 10 15 Asn Asn Phe Gly Ala Ile Leu Ser Ser Thr Asn Val 25 30 Tyr77101855240 A CN 101855242序列表9/15 页<220> <221> 变异体 <222>(21)..(21) <223>Asn、 Gln 或 Lys <220> <221> 变异体 <222>(23)..(23) <223>Phe 或 Leu <220> <221> 变异体 <222>(25)..(25) <223>Ala、 Pro 或 Lys <220> <221> 变异体 <222>(26)..(26) <223>Val 或 Ile <220> <221> 变异体 <222>(28)..(28) <223>Ser 或 Pro <220> <221> 变异体 <222>(29)..(29) <223>Ser、 Pro 或 Lys <400>18 Xaa Cys Xaa Thr 1 Xaa Xaa Ser Ser 20 Gly Ser Asn Thr 35 <210>1978Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 5 10 15 Xaa Asn Xaa Gly Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Thr Asn Val 25 30 Tyr101855240 A CN 101855242序列表10/15 页<211>40 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物 <400>19 Glu Glu Arg Glu 1 Asn Phe Leu Val 20 Thr Asn Val Gly 35Cys Gln Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala 5 10 15 Arg Ser Ser Gln Asn Leu Gly Pro Val Leu Pro Pro 25 30 Ser Asn Thr Tyr 40<210>20 <211>40 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物 <400>20 Glu Glu Glu Glu 1 Asn Phe Leu Val 20 Thr Asn Val Gly 35 <210>21 <211>36 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物 <400>2179Cys Gln Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala 5 10 15 Arg Ser Ser Gln Asn Leu Gly Pro Val Leu Pro Pro 25 30 Ser Asn Thr Tyr 40101855240 A CN 101855242序列表11/15 页Cys Lys Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210>22 <211>36 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物 <400>22 Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu Val 1 5 10 15 His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val Gly 20 25 30 Ser Asn Thr Tyr 35 <210>23 <211>37 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物 <400>23 Glu Cys Asn Thr 1 Val His Ser Ser 20 Gly Ser Asn Thr 35Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 5 10 15 Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val 25 30 Tyr80101855240 A CN 101855242序列表12/15 页<210>24 <211>37 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物 <400>24 Arg Cys Asn Thr 1 Val His Ser Ser 20 Gly Ser Asn Thr 35 <210>25 <211>38 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物 <400>25 Glu Arg Cys Asn 1 Leu Val His Ser 20 Val Gly Ser Asn 35 <210>26 <211>38 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物81Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 5 10 15 Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn Val 25 30 TyrThr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe 5 10 15 Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn 25 30 Thr Tyr101855240 A CN 101855242序列表13/15 页<400>26 Arg Arg Cys Asn 1 Leu Val His Ser 20 Val Gly Ser Asn 35 <210>27 <211>38 <212>PRT <213> 人工序列Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe 5 10 15 Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn 25 30 Thr Tyr<220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物 <400>27 Lys Lys Cys Asn 1 Leu Val His Ser 20 Val Gly Ser Asn 35 <210>28 <211>38 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物 <400>28 Arg Lys Cys Asn 1 Leu Val His Ser 20 Val Gly Ser AsnThr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe 5 10 15 Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn 25 30 Thr TyrThr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe 5 10 15 Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr Asn 25 30 Thr Tyr82101855240 A CN 101855242序列表14/15 页35 <210>29 <211>40 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物 <400>29 Glu Lys Arg Lys 1 Asn Phe Leu Val 20 Thr Asn Val Gly 35 <210>30 <211>39 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物 <400>30 Glu Lys Arg Cys 1 Phe Leu Val His 20 Asn Val Gly Ser 35 <210>31 <211>40 <212>PRT <213> 人工序列Cys Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala 5 10 15 His Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro 25 30 Ser Asn Thr Tyr 40Asn Thr Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn 5 10 15 Ser Ser Asn Asn Phe Gly Pro Ile Leu Pro Pro Thr 25 30 Asn Thr Tyr83101855240 A CN 101855242序列表15/15 页<220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物 <400>31 Glu Glu Arg Glu Cys Lys Thr 1 5 Asn Phe Leu Val Arg Ser Ser 20 Thr Asn Val Gly Ser Asn Thr 35 <210>32 <211>37 <212>PRT <213> 人工序列 <220> <223> 胰岛淀粉样多肽类似物 <400>32 Glu Cys Gln Thr 1 Val Arg Ser Ser 20 Gly Ser Asn Thr 35Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala 10 15 Gln Asn Leu Gly Pro Val Leu Pro Pro 25 30 Tyr 40Ala Thr Cys Ala Thr Gln Arg Leu Ala Asn Phe Leu 5 10 15 Gln Asn Leu Gly Pro Val Leu Pro Pro Thr Asn Val 25 30 Tyr84