本申请为分案申请，原申请的申请日为2005年9月13日，申请号为200580037994.3(PCT/GB2005/003527)，发明名称为“放射性标记胰岛素”。
因此，根据本发明的一个方面，提供用于放射性标记的方法，该方法包括使下式(I)化合物与下式(II)化合物反应，得到下式(III)的缀合物：
R*-(连接基)-R2 (II)
其中
R1是与R2位点特异性反应的官能团。R1可为氨衍生物，例如伯胺、仲胺、羟胺、肼、酰肼、氨基氧基(aminoxy)、苯肼、氨基脲或氨基硫脲，优选为肼、酰肼或氨基氧基；
R2为醛部分、酮部分、被护醛例如缩醛、被护酮例如缩酮或者用氧化剂能快速有效地氧化为醛或酮的官能团，例如二醇或N-端丝氨酸残基；
R*为适于SPECT或PET检测的放射性标记部分；
其中X为-CO-NH-、-NH-、-O-、-NHCONH-或-NHCSNH-，优选为-CO-NH-、-NH-或-O-；Y为H、烷基或芳基取代基；R*的定义同式(II)化合物。
可以在合适的溶剂中，例如在pH范围为2-11、适宜为3-11、更适宜为3-6的含水缓冲液中，于5-80℃非极端温度、优选环境温度下进行反应。
式(I)和式(II)化合物中的连接基各自独立地为C1-60烃基，适宜为C1-30烃基，任选包括1-30个杂原子，适宜为1-10个杂原子，例如氧或氮。合适的连接基包括烷基链、烯基链、炔基链、芳环、多芳环和杂芳环，和聚合物，包括乙二醇、氨基酸或糖亚基。
术语“烃基”是指由碳和氢组成的有机取代基，这样的基团可以包括饱和、不饱和或芳环部分。
式(I)化合物和本发明有关方面的R1优选选自-NHNH2、-C(O)NHNH2和-ONH2，优选为-ONH2。
式(II)化合物和本发明有关方面的R2各自优选选自-CHO、＞C＝O、-CH(-O-C1-4烷基-O-)例如-CH(-OCH2CH2O-)和-CH(OC1-4烷基)2例如-CH(OCH3)2，在一个优选方面，R2为-CHO。
R2醛适于由含有1，2-二醇或1，2氨基醇基团的前体官能化载体原位氧化而产生。例如在合成过程中，采用氨基酸Fmoc-Dpr(Boc-Ser)-OH，可以将上述1，2-二醇或1，2氨基醇基团直接插入到肽序列中，参见Wahl等，Tetrahedron Letts.37，6861(1996)。合适的氧化剂可以用于产生式(II)化合物中的R2部分，它包括高碘酸盐、高碘酸、仲高碘酸、偏过碘酸钠和偏过碘酸钾。
R*为适于SPECT或PET检测的放射性标记部分，优选R*为18F、放射性碘(123I、124I、125I或131I)、75Br或含11C基团例如[11C]C1-6烷基胺，最优选R*为18F。
式(III)化合物和本发明有关方面的Y优选为H、C1-6烷基(例如甲基)或苯基。
在本发明的一个方面，式(II)化合物为下式(IIa)化合物：
其中m为0-10的整数，n为0-20的整数，Y为氢、C1-6烷基(例如甲基)或苯基。优选式(IIa)化合物中，m为0，n为0，Y为氢，因此式(IIa)化合物为4-[18F]氟苯甲醛。
在本发明的一个方面，式(I)化合物为下式(Ia)化合物：
其中X为-CO-NH-、-NH-或-O-，优选为-O-。
式(I)和式(Ia)化合物中优选的连接基包括：
-C(O)-(C1-20烷基)-NHC(O)CH2-和-C(O)-(C1-20烷基)-。
因此，在一个优选的方面，本发明提供用于放射性氟化的方法，该方法包括使下式(Ia)化合物与下式(IIa)化合物反应，得到下式(IIIa)的化合物：
其中X为-CO-NH-、-NH-或-O-，优选为-O-；
其中m为0-10(优选为0)的整数，n为0-20(优选为0)的整数，Y为氢、C1-6烷基(例如甲基)或苯基(优选Y为氢)；
其中X的定义同式(Ia)化合物，m和n的定义同式(IIa)化合物。
在另一个优选的方面，本发明提供用于放射性氟化的方法，该方法包括使下式(Ib)化合物与下式(IIb)化合物反应，得到下式(IIIb)的化合物：
对式(I)、式(Ia)、式(Ib)、式(II)、式(IIa)和式(IIb)化合物中的连接基进行选择，使得放射性氟化反应的效率最大化，并提供良好的体内药代动力学特性，例如所得式(III)、式(IIIa)或式(IIIb)缀合物具有良好的排泄特性。采用不同亲脂性和/或电荷的连接基可显著改变肽的体内药代动力学特性以适应成像需要。例如，当式(III)、式(IIIa)、式(IIIb)缀合物需要通过肾排泄从体内清除时，就采用亲水连接基，而当需要通过肝胆排泄清除时，则采用疏水连接基。已发现包括聚乙二醇部分的连接基会延缓血液清除，这在某些情况下是需要的。
式(I)、式(Ia)、式(Ib)、式(III)、式(IIIa)和式(IIIb)化合物中，胰岛素可为人胰岛素、牛胰岛素、猪胰岛素，尽管适宜为人胰岛素；且可为天然、重组或合成的胰岛素。胰岛素或可为天然胰岛素的类似物，例如记载于以下文献中的胰岛素：US 5,656,722、DE 3,837,825、WO95/07931、EP 383472或J Brange等，Nature 333(1988)，679。
可以用标准肽合成方法制备式(I)、式(Ia)和式(Ib)化合物，例如固相肽合成，例如参见Atherton，E.和Sheppard，R.C.“Solid PhaseSynthesis”，IRL Press：Oxford，1989。可以通过肽的游离伯氨基反应实现在式(I)、式(Ia)或式(Ib)化合物中掺入R1基团，该修饰不会影响胰岛素的结合特性。官能团R1优选通过形成稳定的酰胺键在肽合成时或在肽合成后引入，酰胺键是由肽胺官能团与活化羧酸反应而生成的。正如对本领域技术人员显而易见的是，在向式(I)、式(Ia)或式(Ib)化合物中引入R1时，需要保护胰岛素的某些官能团。合适的保护和脱保护方法可参见例如John Wiley&Sons Inc.出版的“ProtectingGroups in Organic Synthesis”，Theodora W.Greene和Peter G.M.Wuts。一种特别有用的被保护的胰岛素中间体为A1，B29-二Boc-胰岛素，可以通过Shai等，Biochemistry(1989)，28，4801-6所述方法制备，该中间体可以通过加入连接基和R1基团加以修饰。通过用酸(例如三氟乙酸)水解，可以在放射性氟化反应之前脱去Boc(叔丁氧羰基)保护基。
另一方面，本发明提供上述定义的式(I)、式(Ia)或式(Ib)化合物及其被保护的衍生物。优选的式(I)、式(Ia)和式(Ib)化合物是胰岛素为人胰岛素的化合物。式(I)、式(Ia)和式(Ib)化合物用作PET显像剂和诊断剂合成的前体，根据上述方法，例如可以现成的放射性氟化试剂盒的形式提供。
可以按照国际专利申请WO 2004/080492所述方法，制备R*为18F的式(II)、式(IIa)和式(IIb)化合物。可以在酸例如过乙酸存在下，使相应的三烷基锡前体与放射性碘盐、适宜为碱金属碘盐(例如碘化钠)反应，从而由三烷基锡前体制备R*为放射性碘的式(II)化合物。例如，可以通过相应伯胺的11C-烷基化，制备R*为含11C基团(例如11C-烷基胺基团)的式(II)化合物。该11C-标记技术的全面性综述可参见Antoni等“Aspects on the Synthesis of 11C-Lablled Compounds”，Handbook of Radiopharmaceuticals，M.J.Welch和C.S.Redvanly主编(2003，John Wiley和Sons)。
又一方面，本发明提供上述式(III)、式(IIIa)或式(IIIb)放射性标记缀合物。优选的式(III)、式(IIIa)或式(IIIb)化合物是胰岛素为人胰岛素的化合物。
本发明还提供放射性药物组合物，其包含有效量(例如有效用于体内PET成像的量)的上述式(III)、式(IIIa)或式(IIIb)化合物以及一种或多种药学上可接受的辅剂、赋形剂或稀释剂。
本发明优选的实施方案涉及上述通式(III)、通式(IIIa)或通式(IIIb)化合物，其用于医药用途，特别是在SPECT或PET体内成像中的用途，适于体内成像或诊断胰岛素相关疾病，例如心肌胰岛素抵抗、心脏肥大、高血压、癌症和II型糖尿病。
式(III)、式(IIIa)或式(IIIb)放射性标记缀合物可给予患者以用于SPECT或PET成像，其用量足于产生所需信号，每70kg体重0.01-100mCi、优选0.1-50mCi的典型放射性核素剂量一般便足够。
因此，可完全按照本领域技术的方法，用生理上可接受的载体或赋形剂配制用于给药的式(III)、式(IIIa)或式(IIIb)放射性标记缀合物。例如可将化合物与任选加入的药学上可接受的赋形剂一起悬浮或溶于水性介质中，然后将所得溶液或悬浮液灭菌。
从另一个方面看，本发明提供式(III)、式(IIIa)或式(IIIb)放射性标记缀合物在制备放射性药物中的用途，该放射性药物用于体内成像方法、适宜为SPECT或PET方法，优选用于胰岛素相关疾病的成像；包括给予人或动物体所述放射性药物，在人或动物体的至少某一部位形成影像。
从又一个方面看，本发明提供在人或动物体形成影像的方法，该方法包括给予人或动物体(例如血管系统)放射性药物，应用SPECT或PET时，在所述放射性药物所分布的人或动物体的至少某一部位形成影像，其中所述放射性药物包含式(III)、式(IIIa)或式(IIIb)放射性标记缀合物。
从再一个方面看，本发明提供用对抗胰岛素相关疾病的药物治疗人或动物体的效果的监测方法，该方法包括给予人或动物体式(III)、式(IIIa)或式(IIIb)放射性标记缀合物，检测所述缀合物的摄取，任选但优选重复进行所述的给药和检测，例如在用所述药物治疗前、治疗中和治疗后。
在本发明另外又一个实施方案中，提供试剂盒，用于制备包含式(II)、式(IIa)或式(IIb)辅基和式(I)、式(Ia)或式(Ib)化合物的放射性氟化示踪物。
实施例
下面通过实施例举例说明本发明，其中所用缩写词如下：
HPLC：高效液相色谱法
TFA：三氟乙酸
UV：紫外线
DMF：N，N-二甲基甲酰胺
BOC：叔丁氧羰基
DMSO：二甲亚砜
用氨基氧基缀合法制备18F-B1-修饰胰岛素
实验
材料
根据Shai等[Biochemistry 28(1989)4801]的方法，用人重组胰岛素(Sigma)制备A1，B29-二-BOC-胰岛素(A1，B29-di-BOC-insulin)。BOC-氨基氧基乙酸得自Fluka。六氟磷酸(4-氮杂-1，2，3-苯并三唑-3-基氧基)-三(吡咯烷基)鏻(PyAOP)、4-氟苯甲醛、和N-甲基吗啉(NMM)、无水乙腈和无水二甲亚砜均得自Sigma-Aldrich。
B1-BOC-氨基氧基-乙酰基-A1，B29-二-BOC-胰岛素(中间体1，流程1)的制备
制备型HPLC
柱子：Phenomenex Luna prep.C18；A：水(0.1％TFA)，B：MeCN(0.1％TFA)，
流速：5ml/分钟，梯度：30-60％B 30分钟，UV检测器：214nm
分析型HPLC
柱子：Phenomenex Luna C18；A：水(0.1％TFA)，B：MeCN(0.1％TFA)，
流速：1ml/分钟，梯度：25-80％B 20分钟，UV检测器：214nm和254nm
制备
将A1，B29-二-BOC-胰岛素(10mg，1.7μmol)的DMF溶液加入到BOC-氨基氧基乙酸(1.3mg，6.6μmol)、PyAOP(3.4mg，6.6μmol)和NMM(1.3mg，1.5μl，13μmol)的DMF(1.5ml)溶液中。4小时后，减压蒸发DMF，粗产物用制备型HPLC纯化(产量：5.3mg，51％)。
B1-(4-氟-亚苄基氨基氧基)-乙酰基-胰岛素(化合物1，流程1)的制备
向BOC-保护的胰岛素衍生物中间体1(5mg)中加入TFA/5％水溶液(0.2ml)。室温下静置1分钟后，液相经氮气流蒸发。残余物溶于乙酸铵缓冲液(pH4.0，0.5mM)，与1当量的4-氟苯甲醛反应。产物用制备型HPLC纯化，用LC-MS表征。
B1-(4-[18F]氟-亚苄基氨基氧基)-乙酰基-胰岛素(化合物2，流程3)的制备
[18F]氟苯甲醛
按照S.M.Haka等[J.Labelled Cpd.and Radiopharm.27(1989)823]的方法制备[18F]氟苯甲醛。简单地说，用18O(p，n)18F与19MeV的质子束和浓缩[18O]H2O(30％)作为靶材料，在回旋加速器进行核反应得到18F-氟。向辐射靶的水(370MBq，10mCi，1ml)中加入(10mg)、碳酸钾(1mg)和乙腈(0.8ml)的混合物。混合物在氮气流中加热至100℃。除去溶剂后，加入乙腈(0.5ml)，然后蒸发。这一步骤重复两次。
将装有无水[18F]KF-氪酸盐(kryptate)的小瓶冷却至室温，加入苯甲醛三氟甲基磺酸4-三甲基铵盐(1mg)的无水DMSO溶液(0.2ml)。混合物于90℃加热15分钟，再冷却至室温。
缀合步骤
加入脱保护氨基氧基-胰岛素(见上，1-2当量)的乙酸铵缓冲液(pH4.0，5mM，0.1ml)溶液，然后70℃下加热10分钟。反应混合物用HPLC流动相(0.2ml，20％B)猝灭，用制备型HPLC纯化。
(BOC-氨基氧基-乙酰胺)-己酸(化合物3，流程2)的制备
根据S.Deroo等[Tetr.Lett.44(2003)8379]所述方法，从BOC-3-(氨基氧基)乙酸得到BOC-3-(氨基氧基)乙酸N-琥珀酰亚胺酯。在室温下，使N-琥珀酰亚胺酯与7-氨基庚酸(1.1当量)和二异丙基乙胺(3当量)在二氯甲烷中反应16小时。偶合产物，即化合物3，用硅胶快速色谱法纯化。
B1-(BOC-氨基氧基-乙酰胺)-己酰基-A1，B29-二-BOC-胰岛素(化合物4，流程2)的制备
按照上述用于B1-BOC-氨基氧基-A1，B29-二-BOC-胰岛素(中间体1)的方法，进行氨基氧基连接基的偶合。
B1-(4-氟-亚苄基氨基氧基-乙酰胺)-己酰基-胰岛素(化合物5，流程2)的制备
按照上述用于化合物1的方法，脱去胰岛素前体的BOC保护基，然后与4-氟苯甲醛偶合。
B1-(4-[18F]氟-亚苄基氨基氧基-乙酰胺)-己酰基-胰岛素(化合物6，流程3)的制备
按照上述制备化合物2的方法，由化合物4和[18F]-4-氟苯甲醛进行化合物6的放射性合成。
流程1
流程2
流程3