酶活力测定体系的校正方法及该方法所用的校正剂 本发明涉及一种酶活力测定体系的校正方法及该方法所用的校正剂。
酶是活细胞产生的一类具有生物催化活性的蛋白质。酶活力是指酶在单位时间内催化一定的底物转变为产物的能力。国际酶委员会(InternationalEnzyme Committee，EC)规定1活力单位为：在1分钟内，催化1微摩尔底物转化为1微摩尔产物所需要的酶量。
在医学临床上，酶活力测定的意义在于辅助诊断疾病。酶活力测定由酶活力测定体系完成。酶活力测定体系是指酶活力测定时所包括的一切因素：1．待测酶，即样本；2．测定试剂，包括底物、指示酶、辅酶等。A．底物：必须有足够大的底物浓度以保证在规定的反应时间内酶促反应速度不至因底物的耗尽降低，一般地讲，底物浓度应等于10～20km；b．指示酶，即酶偶联反应中的非待测酶；3．酶促反应条件如温度、pH，反应时间、样本与试剂的体积；4．仪器。
酶活力测定一般使用连续监测法(Kenetic)。在连续监测法中，酶活力可由下式求得：U/L=ΔA×TVϵ×SV×d×106]]>=K×ΔA]]>K=TVϵ×SV×d×106]]>
ε：被监测物的克分子消光系数
式中K为校正系数。K与波长、光径、仪器加样(样本和试剂)的准确性等因素有关。酶活力测定体系校正的实质即为求出当前测定环境下的真实K值(而是不是理论K值)。上式中反应总体积(TV)、样本体积(SV)、光径(d)均为常量，但由于光栅、滤光片地老化、吸潮等原因使其所发出的波长不再是准确，而是包含某一波长范围的一束混合光，此时，直接查用理论ε已不再准确，需重新测定当前波长状态下的ε。那么，进而言之，酶活力测定体系校正就是重新测定当前波长状态下的ε。
为了保证酶活力测定的准确性，提高其辅助诊断疾病的价值，酶活力测定体系必须先校正后使用。然而，在酶活力测定领域，目前尚无成熟的校正方法，尤其在国内大多数实验室，酶活力测定体系均未得到校正，致使酶活力测定结果失去客观性。
本发明根据EC对酶活力单位的定义，用底物或产物为标准，设计制造了酶活力测定体系系列校正剂。
本发明采用如下所述的技术解决方案：
本发明根据EC对酶活力单位的定义，用底物或产物为标准，设计制造酶活力测定体系的校正方法及该方法所用的校正剂。
酶活力测定体系的校正方法：该校正方法包括以下步骤：
1、工作液制备
1)将校正试剂用蒸馏水或去离子水溶解，轻轻混匀，得到校正试剂溶液，待用；
2)标准物直接使用；
2、将1)中的校正试剂溶液与标准物混合，并且混匀，得到校正剂；
3、测得2)中的校正剂在测定波长处的光密度变化量(A)；
4、按下式计算出标准物在当前波长下的克分子消光系数(ε)；ϵ=A×1d×TVSV×1S×106]]>
式中 TV=总反应体积
SV=样本体积
d=光径(cm)
S=标准物浓度(μmol/L)
5、由4)中得到的ε即可得到校正系数(K)K=1d×TVSV×1ϵ×106]]>
酶活力测定体系的校正方法所用的校正剂由标准物和校正试剂组成。所述标准物是反应的底物、产物(或中间产物)或间接标准物。间接标准物(如实施例三中的GLU)是一种制作方便、性能稳定的物质，它虽然不是测定体系的底物或产物，但它与校正试剂反应后所生成的产物与测定体系中被监测的底物(或产物)相同。使用底物标准时，校正试剂为不含有该标准物的测定试剂，使用产物标准时，校正试剂为测定试剂，使用间接标准时，校正试剂为相关试剂，该试剂与标准物反应所生成的产物与测定体系中被监测的底物(或产物)相同，且一定摩尔数量的间接标准物与试剂反应完成后可以生成等摩尔数量的产物。
使用校正试剂的目的是为了提供一种环境(这种环境应尽量与酶活力测定时的环境相同，包括pH、离子强度、化合物的浓度、光径、样本量与试剂量、测定温度等)，并在这种环境下测定一定浓度标准物所造成的吸光度变化，藉以消除测定体系的系统误差。
本发明的优点在于：1、可对不同的分析仪器进行校正，消除波长、样本体积、试剂体积、测定温度、测定体系pH值等系统误差；2、本发明根据EC对酶活力单位的定义，用底物或产为标准，设计制造了酶活力测定体系校正方法所使用的校正剂；3、本发明源于EC对酶活力单位的定义，是最根本、最权威的校正方法；4、适用于一切以IFCC推荐方法为原理的测定试剂；5、校正方法简单、实用。
下面结合实施例对本发明作进一步描述；实施例一：
酸性磷酸酶活力测定体系的校正方法所用的校正剂校正原理α-Naphthol+FRTR→salt→azo dye已知浓度的α-萘酚(中间产物标准)，与足量的固红TR反应生成相同摩尔量的重氮色素，测定其吸光度，即可计算出当前波长状态下的ε重叠色素。校正剂组成：(R为校正试剂，S为标准物，下同)R固红TR 2mmol/L柠檬酸钠 60mol/LS α-萘酚 1000μmol/L工作液制备1．R用5ml蒸馏水或去离子水溶解，轻轻混匀。2．S直接使用。半自动生化分析仪校正程序1用试剂空白调零；2取5支试管，每管加入R1ml和S100ul，混匀；3读取405nm处吸光度(A)，算出5管的平均吸光度A4按下式计算εϵ=A×1d×TVSV×1S×106]]>式中 TV=反应总体积
SV=样本体积
S=标准品浓度(μmol/L)
d=光径(cm)5 K值计算K=1d×TVSV×1ϵ×106]]>实施例二：
GAMMA-谷氨酰转肽酶活力测定体系的校正方法所用的校正剂
(用于半自动生化分析仪和全自动生化分析仪)校正原理：给予已知浓度的5ANB标准品(产物标准)，测定其吸光度，可计算出当前波长的ε5ANB。试剂组成：R Tris缓冲物 100mol/L
甘氨酰甘氨酸 190mmol/L
L-Y-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺， 2.9mmol/LS 5ANB 1000μmol/L工作液制备1．R用5ml蒸馏水或去离子水溶解，轻轻混匀。2．S直接使用。校正程序1．半自动生化分析仪A．用蒸馏水调零；B．取5支试管，每管加入R1ml和S100ul于试管中，混匀；C．读取其在405nm处吸光度(A)，算出5管的平均吸光度 A，D．按下式计算εϵ=A×1d×TVSV×1S×106]]>
式中 TV=反应总体积
SV=样本体积
S为标准品浓度(μmol/L)
d=光径(cm)E．K值计算K=1d×TVSV×1ϵ×106]]>2．CL7200/7300全自动生化分析仪校正程序：A选定1000μmol/L 5ANB作标准物；B选择当前批号校正试剂；C F5-1-4定义标准物名称；D F11定义一个校正程序：
-->Sample volume [25][2][20]Rea1 volume [250][yes][]Rea2 volume [0][No][]Decemal point 2Sample type 0Normal range [][] [][]Volid range [][]Constant [1][0]W1 sen limit [Ins][2500]Limit []Limit []Limit []Replicate [4]Replicate [100][1]Slope [999][2500]Partner test [][1]Prezene limit []]]>
E F11-3定义标准物浓度 Standardl [5ANB] Concentration [1000]F F5-2定义CHANEL NO；G VIEWSTATU-1定义试剂位置；H F12选择上述定义的TEST NO.,F12-5定义标准物排列顺序；I 按定义的标准物排列顺序组成样本架(绿色)；J 启动FEEDER运动校正程序。3．RA-1000/2000全自动生化分析仪校正程序：A 选定1000μmol/L 5ANB作标准物；B 选定当前批号校正试剂；C 60 Function 4 ENTER设定打印格式；D 7 Function定义一个程序；
-->％Rgt vol 742nd rgt 0Unit 3Unit fac 1Decimal 4Rbl low 0Rhl Hi 1Range low 0Cal Fact 1Std val 0Normal L 0Normal H 1Slope 1Intercept 0EP LIM 1Auto LIM 01=Accept 1]]>
E 2 Function编写样本测定顺序表(重复11次)，运行此样本测定顺序表，结果以光密度报告；F 去掉第一个结果，计算其余10个光密度的均值(A)和标准差，若标准差大于0.006，重新测定；G CAL FACT=K/(21660× A),K=21.66×106H 8 Function输入CAL FACT4．Hitach7150/7020全自动生化分析仪校正程序A 选定1000μmol/L 5ANB作标准物；B 选用当前批号校正试剂；C 经Prameter JOB窗口，选JOB NO[1]，定义一个试验名称(GGT-C)D 经Parameter JOB窗口，选JOB NO[2]，定义如下参数：
-->STD.(6)CONC.-POS []-[]SD LIMIT []DUPLICATE LIMIT [100]SENSITIVITY LIMIT [0]ABS.LIMIT(INC/DEC) [3000][INCREASE]PROZONE LIMIT [][]EXPECTED VALUE [][]PANIC VALUE []-[]INSTRUMENT FACTOR[1.0] Note:p*is theactual position of the standard]]>
E 经Parameter JOB窗口，选JOB [4]，为校正程序定义一个通道。F 经ROUTINE JOB窗口申请校正。G 按START开始校正。H 经MONITOR JOB窗口，查看K值，并将此K值输入。5．Olympus AU1000/800校正程序1．选定1000μmol/L5ANB作标准物；2．选用当前批号校正试剂；3．[main menu][31][1]定义试验项目名称4．[main menu][31][2]定义通道5．[main menu][31][9][1]定义标准物名称6．[main menu][31][7]如下设置参数：1 TEST (GGT-C)2 SAMPLE VOLUME (25)3 SAMPLE VOLUME ( ) FOR REPEAT RUN4 REAGENT VOLUME R1 (250) REAGENT VOLUME R1 ( )5 WAVELENGTH 1 (410) 2 ( )6 METHOD (End)7 REACTION SLOPE (+ )8 MEASURING POINT S1 (0 ) E1 (16 ) S2 ( ) E2 ( )9 OD VALUE RANGE ( ) MAX ( ) MIN ( )10 LIMIT OF LINEARITY ( )7．[main menu][31][8]定义试剂位置8．[main menu][31][9][2]设置校正参数#Test No []#Calibration Type No [AB]#Formula No [1]No Point Cal.No OD Conc Factor2 Point-1 ( ) (-) (1000) (-)9．[main menu][1][3][Yes]选择校正项目10．按[start]键开始测试11．[main menu][4][2]观察GGT-C的factot(factor-GGT-C)12．[main menu][31][9][2]键入Factor实施例三：
乳酸脱氢酶活力测定体系的校正方法所用的校正剂校正原理1、测定体系的反应2、校正试剂与标准物的反应反应1和反应2的产物相同(都是NADH)。反应2中，间接标准物Glu的消耗量与NADH生成量相等。通过给予已知浓度的GIu标准品，监测产物NADH所造成的光密度变化，可计算出当前波长的εNADH。试剂组成R ATP 1.30mmol/L
NAD 0.65mmol/L
HK 1500U/L
G-6-PD 2500U/LS Glu 5550μmol/L工作液制备1．R用5ml蒸馏水或去离子水溶解，轻轻混匀。2．S直接使用。半自动生化分析仪校正程序1 试剂、标准品、试管孵育于37℃，温度需保持恒定；2 用试剂空白调零；3 取5支试管，每管加入R 1ml和S100ul，混匀；4 5分钟后，读取其在340nm处吸光度(A)，算出5管的平均吸光度A5 按下式计算εϵ=A×1d×TVSV×1S×106]]>式中 TV=反应总体积
SV=样本体积
S为Glu浓度(μmol/L)
d=光径(cm)6 K值计算K=1d×TVSV×1ϵ×106]]>注：谷丙转氨酶、谷草转氨酶、磷酸肌酸激酶活力测定体系校正方法所用的校正剂与乳酸脱氢酶相同，故不赘述。实施例四：
血管紧张素转换酶活力测定体系的校正方法所用的校正剂校正原理给予已知浓度的FAP标准品，与足量Fastγ反应生成yellow compound，测定其吸光度，可计算出当前波长的ε。试剂组成R Fast Y 3000μmol/LS FAP 1000μmol/L工作液制备1．R用5ml蒸馏水或去离子水溶解，轻轻混匀。2．S直接使用。半自动生化分析仪校正程序1 试剂空白调零；2 取5支试管，每管加入R 1ml和S 100ul，混匀；3 读取405nm处吸光度(A)，算出5管的平均吸光度A4 按下式计算当前状态下的εϵ=A×1d×TVSV×1S×106]]>式中 TV=反应总体积
SV=样本体积
S为FAP浓度(μmol/L)
d=光径(cm)5 K值计算K=1d×TVSV×1ϵ×106]]>实施例五：
碱性磷酸酶活力测定体系的校正方法所用的校正剂校正原理给予已知浓度的产物标准p-NP，测定其吸光度，可计算出当前波长的εP-NP。试剂组成R p-NPP 16mmol/L TRIS缓冲液 4mmol/LS p-NP 10000μmol/L工作液制备1．R用5ml蒸馏水或去离子水溶解，轻轻混匀。2．S直接使用。半自动生化分析仪校正程序1 用蒸馏水调零；2 取5支试管，每管加入R1ml和S100ul于试管中，混匀；3 读取405nm处吸光度(A)，算出5管的平均吸光度A4 按下式计算当前波长下的εP-NPϵ=A×1d×TVSV×1S×106]]>式中 TV为反应总体积
SV为样本体积
d为光径(cm)
S为标准品浓度(μmol/L)5 K值计算K=1d×TVSV×1ϵ×106]]>实施例六：常用酶活性测定项目反应式及建议校正物项目 反应式 校正物AST NADH GLU
ALT NADH GLU 丙酮酸
CK NADH GLULDH GGT NADH GLU 丙酮酸
γ-L-谷氨酰-4-硝基苯胺+Gly→ p-NAALP γ-L-谷氨酰-Gly-Gly+p-NAACP p-NP
l-Naphthol
acid+I-naphtholAMY
ACE
p-NPCHE
FAPGG
丙酰硫代胆碱→硫代胆碱 5-硫代-二硝基苯甲酸
实施例七：
湖北医科大学附一院使用该系列校正试剂后，酶六项(注：酶6项包括ALT、AST、ALP、AMY、CK、LDH)测定结果准确性明显提高，其VIS明显低于全国平均VIS(n=14,t=5.13,p=0.000,a=0.05)。湖北医科大学附一院酶6项平均VIS与全国VIS的比较批 号 我室平均VIS 全国平均VIS966511 79.33 99.17966512 97.17 102.67966623 45 138.33966624 66.67 88.67966735 38.17 105.17966736 37.67 84.33966847 25.67 91966848 12.50 119976911 90.67 100.17976912 59.33 92.67977023 75.67 94.17977024 39.67 95.67977135 24.50 79.83977136 11 84