金钗石斛提取物及其药物组合物 本发明涉及中药制药领域，具体而言，本发明涉及鲜品或干品金钗石斛提取物及其药物组合物以及它们用于冶疗急慢性炎症、急慢性关节炎、类风湿性关节炎及急慢性消化系统炎症及溃疡的医药用途。
金钗石斛是石斛属植物(兰科)，收载于《(中华人民共和国药典》2000年一部。由于金钗石斛在石斛类中资源丰富，我们在对金钗石斛的提取以及其化学成分和药理学活性进行了系统研究，根据我们摸索出来的提取方法可以得到石斛的非生物碱提取物和含生物碱提取物以及含生物碱和非生物碱混合的提取物，这些提取物具有对角叉菜胶致大鼠炎症模型、大鼠佐剂型关节炎模型引起的急慢性炎症和关节炎有抑制作用，对无水乙醇致胃黏膜损伤、醋酸烧灼型慢性溃疡模型引起的急慢性溃疡有抑制作用，可以用于治疗急慢性炎症、关节炎、类风湿性关节炎及消化系统炎症及溃疡等疾病。动物急性毒性试验结果表明毒副作用极低。并建立了适于工业化生产的提取制备工艺。
因此，本发明的目的是提供了一种金钗石斛提取物；
本发明的另一目的是提供了一种制备金钗石斛提取物的方法；
本发明的另一目的是提供了将金钗石斛提取物用于制备治疗急慢性炎症的药物的用途；
本发明的另一目的是提供了将金钗石斛提取物用于制备治疗急慢性关节炎、类风湿性关节炎的药物地用途；
本发明的另一目的是提供了将金钗石斛提取物用于制备治疗急慢性消化系统炎症及溃疡疾病的药物的用途；
本发明的另一目的是提供了含有鲜品和干品金钗石斛提取物的用于治疗急慢性炎症或急慢性关节炎或或类风湿性关节炎或急慢性消化系统炎症及溃疡疾病的药物组合物。
本发明的鲜品或干品金钗石斛可以用水、醇或醇水混合提取得到多种提取物，包括生物碱提取物部分、非生物碱提取物部分和它们的混合物。金钗石斛生物碱提取物可由鲜品和干品金钗石斛全草经醇水提取、离子交换树脂柱富集而成，提取工艺稳定，收率为干燥药材的0.3-1.5％，其中的生物碱含量可以达到40％-90％，其主要含有以下成分：石斛碱、石斛酮碱(石斛次碱)、季胺生物碱。非生物碱提取物部分包括提取得到的溶液、浸膏或粉末，收率为干燥药材的1.0-15％。
本发明鲜品和干品金钗石斛提取物可以通过如下方法得到，提取工艺流程见附图，其中：
附图1是制备金钗石斛提取物的方法a的工艺流程图；
附图2是制备金钗石斛提取物的方法b的工艺流程图；
附图3是制备金钗石斛提取物的方法c的工艺流程图；
附图4是制备金钗石斛提取物的方法d的工艺流程图；
附图5是制备非生物碱金钗石斛提取物的方法e的工艺流程图；
附图6是制备非生物碱金钗石斛提取物的方法f的工艺流程图；
附图7是制备金钗石斛生物碱和非生物碱混合提取物的方法g的工艺流程图。
因此，本发明涉及一种鲜品和干品金钗石斛提取物，其由a-g方法制备得到，其中方法a至方法d制备得到含生物碱提取物，由方法e和方法f制备得到非生物碱提取物，方法g得到金钗石斛生物碱和非生物碱混合提取物：
方法a.用醇水混合溶剂提取经粉碎的金钗石斛药材，过滤，滤液浓缩至干，用稀酸水溶液浸渍，调pH至弱酸性，过阳离子交换树脂柱富集，用醇水混合溶剂洗除杂质，然后用氨水醇溶剂洗脱，浓缩洗脱液得提取物浸膏；或
方法b.用醇水混合溶剂提取经粉碎的金钗石斛药材，浓缩提取液，用稀酸水溶液浸渍，调pH至碱性，用中、低极性有机溶剂萃取，有机相浓缩至干，用醇溶解，过滤，滤液浓缩至干得提取物浸膏；
方法c.用稀酸水溶液浸渍经粉碎的金钗石斛药材，过滤，滤液过阳离子交换树脂柱富集，用醇水混合溶剂洗除杂质，然后用氨水醇溶剂洗脱，浓缩洗脱液得提取物浸膏；或
方法d.用稀酸水溶液浸渍经粉碎的金钗石斛药材，过滤，滤液调pH至中性，浓缩，浓缩液调PH至碱性，用中、低极性有机溶剂萃取，有机相浓缩至干，用醇溶解，过滤，滤液浓缩至干得提取物浸膏；或
方法e.用醇水混合溶剂提取经粉碎的金钗石斛药材，浓缩提取液，得浸膏，用稀酸水溶液浸渍，过滤，得沉淀，水洗沉淀至中性，稀碳酸钠溶液浸泡，过滤，得沉淀；水洗沉淀至中性，干燥得提取物浸膏；或
方法f.用稀酸水溶液浸渍经粉碎的金钗石斛药材，过滤，水洗至中性得药渣，水煎，浓缩，醇沉，过滤，得上清液，上清液浓缩得提取物浸膏；或
方法g.用水煎煮金钗石斛药材，浓缩提取液，醇沉，静置，抽滤，其中上清液回收醇后得到醇部分，醇沉物加水溶解之后得到水溶液部分。
本发明的制备方法中，醇可以是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇、碳链小于32烷醇、碳链小于32稀醇及苯酚等或它们的混合物，优选乙醇。醇水混合溶剂可以是醇与水的任何比例的混合溶剂，优选乙醇与水的混合溶剂，更优选50％-98％的乙醇水溶液，尤其是85％的乙醇水溶液。其中所用阳离子交换树脂包括各种强酸性或弱酸性的国产或进口阳离子交换树脂。其中的醇溶剂优选是乙醇。其中的稀酸水溶液优选稀盐酸。
本发明的特点是，提供了可期待用于治疗急慢性炎症病、急慢性关节炎、类风湿性关节炎和急慢性消化系统炎症和溃疡等疾病医药用途的以植物生物碱、非生物碱以及它们的混合物类成分为主的金钗石斛提取物，并发现其具有很强的治疗急慢性炎症、急慢性关节炎、类风湿性关节炎及急慢性消化系统炎症以及溃疡尤其是类风湿性关节炎、胃溃疡等疾病的药效作用特点。使用本发明的提取方法，可以得到除去大量蛋白、糖类、淀粉等杂质的高纯度的有效部位，其中含生物碱提取物的生物碱含量在40％-90％。
本发明方法制备得到的金钗石斛提取物用制药领域中的常规方法，结合中药制药中常规的可药用辅料，可以制成各种药物组合物剂型，如片剂，颗粒剂，胶囊、丸剂、喷雾剂、注射剂、洗剂、栓剂、滴丸剂、合剂、擦剂、贴剂、膜剂、纸型剂、混悬剂、酊剂、干糖浆剂、泡腾片、硬膏剂、软膏剂、糖浆剂、乳剂、散剂、缓释、控释制剂及靶向制剂。这些药物组合物可以用于治疗急慢性炎症、关节炎、类风湿性关节炎及消化系统炎症以及溃疡尤其是类风湿性关节炎、胃溃疡等疾病的用途。
下面通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的百分数是重量百分数。
实施例1：金钗石斛乙醇提取物的制备
取药材粉碎成粗粉，加8倍药材重量的85％乙醇，于水浴加热提取2次，每次2.0小时，滤过，合并提取液，减压回收溶剂，至无醇味。稀盐酸(3.7％)溶解2次，过滤，滤液调pH至弱酸性，按照上柱样品量与湿树脂量(1g∶100ml/W∶V)的比例，行型号为001×7阳离子交换吸附柱色谱(001×7是该阳离子交换吸附柱色谱的树脂型号名称，该柱色谱购自上海医药工业研究院，下同)，用25％醇洗除杂质，用氨水乙醇(乙醇∶氨水＝25％∶75％)以8ml/分钟的流速洗脱4个柱床体积，洗脱部分即为有效部位，于80℃减压真空干燥，粉碎，得到提取物，其编号为No.4-1-1，收率不少于0.3％，(生物碱含量50％以上)。
实施例2：金钗石斛乙醇提取物的制备
取药材粉碎成粗粉，加10倍药材重量的50％乙醇，于水浴加热提取3次，每次2.0小时，滤过，合并提取液，减压回收溶剂至干，稀盐酸(2％)冷浸2次，过滤，滤液调pH至碱性，用丁醇萃取3次，合并丁醇部位，浓缩至干，用乙醇溶解，过滤，滤液于80℃减压真空干燥，粉碎，得到提取物，其编号为No.4，收率不少于0.5％，(生物碱含量50％以上)。
实施例3：金钗石斛提取物的制备
取药材粉碎成粗粉，加4倍药材重量的稀盐酸(5％)浸渍，浸泡3次，每次1天，过滤，浓缩，过滤，调pH至弱酸性，按照上柱样品量与湿树脂量(1g∶100ml/W∶V)的比例，行型号韦001×7阳离子交换吸附柱色谱(树脂购自上海医药工业研究院)，用25％醇洗除杂质，用氨水乙醇(乙醇∶氨水＝25％∶75％)以8ml/分钟的流速洗脱4个柱床体积，洗脱部分即为有效部位，于80℃减压真空干燥，粉碎，得到提取物，其编号为No.4-1-2，收率不少于0.5％，(生物碱含量50％以上)。
实施例4：金钗石斛提取物的制备
取药材粉碎粗粉，加8倍药材重量的稀盐酸(5％)浸渍，浸泡2次，每次1天，过滤，滤液调pH至中性，浓缩，浓缩液调PH至10，用丁醇萃取3次，合并丁醇部位，浓缩至干，用乙醇溶解，过滤，滤液于80℃减压真空干燥，粉碎，得到提取物，其编号为020620-2；收率不少于5％。
实施例5：金钗石斛乙醇提取物的制备
取药材粉碎成粗粉，加10倍药材重量的85％乙醇，于水浴加热提取4次，每次2.0小时，滤过，合并提取液，减压回收溶剂，至无醇味得浸膏。3.7％稀盐酸溶解，浸泡2次，过滤，得沉淀。沉淀水洗至中性，烘干；用5％碳酸钠溶液浸泡，过滤，得沉淀。沉淀水洗至中性，烘干，真空干燥，粉碎，得到提取物，其编号为NO：6(非生物碱提取物)，收率不少于1.0％。
实施例6：金钗石斛提取物的制备(水提醇沉)
取药材粉碎成粗粉，加4倍药材重量的3.7％稀盐酸浸渍，浸泡2次，每次1天，过滤，得药渣；药渣水洗至中性后，5倍药材重量的水煎煮，过滤，浓缩；加浓缩液2倍95％乙醇醇沉，过滤，得上清夜；上清夜浓缩至无醇味得浸膏，于80℃减压真空干燥，粉碎，得到提取物，其编号为020620-3(非生物碱提取物)，收率不少于10.46％。
实施例7：金钗石斛生物碱和非生物碱混合提取物的制备
取鲜金钗石斛30.6kg，洗净，切段，水煎煮3次，每次时间分别为2小时、1小时、1小时，加水量分别为8倍、6倍、6倍，水提取液过滤，合并滤液，浓缩至比重为1.06(50℃测)，得浸膏3345g。浸膏加4倍量95％乙醇，静置过夜。抽滤，上清液回收乙醇至无醇味，比重为1.15，体积为900ml(1ml液体相当于生药材34.0g)；醇沉物加水溶解，比重为1.07，体积为1000ml(1ml相当于生药材30.6g)。
含量测定：上清液 编号为4-2-1 生物碱含量：71.318mg/ml
醇沉物 编号为4-2-2 多糖含量：55mg/ml
药理试验
试验1.金钗石斛提取物对大鼠角叉菜胶致急性炎症的抑制作用
1.1试验方法：大鼠足跖角叉菜胶致急性炎症模型
大鼠随机分组，每组5只动物，于致炎前1小时给药，无菌操作，给大鼠右后足跖腱膜下注射1％角叉菜胶0.1ml致炎，用排水法测定致炎前及致炎后不同时间的右后足跖容积，以致炎前后的足容积差值为肿胀值，根据肿胀值计算肿胀率。
肿胀率％＝En_E0/EN×100
En＝致炎后不同时间的肿胀值
E0＝致炎前的肿胀值
抑制率％＝C-T/C×100
C＝对照组的肿胀率
T＝治疗组的肿胀率
阳性对照药为布洛芬
1.2实验结果：见表1-1和表1-2。
表1-1.金钗石斛提取物对大鼠角叉菜胶致急性炎症的抑制作用(X±SD) 组别 剂量 干生药g/kg n 致炎后不同时间的肿胀率％(小时) 2 3 4 020620-2 5 5 31.5±6.6 (20.0) 29.4±11.6 (18.6) 18.5±10.4* (38.7) 020620-3 5 5 22.4±6.8** (43.4) 17.2±5.7** (52.3) 12.7±1.9** (57.9) 布洛芬 200mg/kg 5 19.8±7.4** (50) 23.7±7.1** (34.3) 13.3±7.2** (55.9) 对照组 5 39.6±11.7 36.1±11.3 30.2±12.7
*P＜0.05 **p＜0.01( )内为抑制率
表1-2金钗石斛对角叉菜胶致大鼠致急性炎症的抑制作用(X±SD) 组别剂量生药g/kg n 致炎后不同时间的肿胀率％(小时) 1 2 3 4 对照组 5 20.5±4.7 36.6±4.4 31.2±3.1 38.2±7.8 4-2-21 5 20.0±12.5 17.4±5.1** 15.1± 10.7** 19.9±14.8* (52.5) (51.6) (47.9) 4-2-25 5 16.9±14.0 16.9± 13.5** 18.5±13.4 18.7± 12.3** (53.8) (40.7) (51.0) 4-2-11 5 20.7±13.9 18.9±15.4* 20.4±10.4* 18.3± 12.6** (48.4) (34.6) (52.1) 4-2-15 5 20.8±10.6 7.9±6.9** 13.4±13.6* 18.0± 11.6** (78.4) (57.0) (52.9)
试验2.金钗石斛提取物对大鼠佐剂性关节炎的抑制作用
2.1 试验方法：免疫性炎症模型—大鼠佐剂型关节炎
体重180-200g雄性SD大鼠，每鼠右后足跖皮内注射弗氏完全佐剂0.1ml致炎，次日开始给药，每天1次，连续20天，用排水法测定致炎前及致炎后不同天数的足跖肿胀体积，参照1.1法下计算肿胀率及抑制率，并以检验法用药组与模型对照组比较之。
剂量为5g生药/kg
2.2 实验结果：结果见有2-1、表2-2、表2-3、表2-4。
表2-1.金钗石斛提取物对大鼠佐剂性关节炎的抑制作用(X±SD)(5g/kg) 组别 致炎后不同时间的肿胀率％(天) 2 5 8 12 16 19 020620-2 60.7±14.2 94.2±7.4 (6.1) 96.2±5.6 (2.2) 94.3±8.5 77.7±5.6** (22.5) 80.5±13.0 (31.7) 020620-3 41.1±14.8 (16.6) 76.4±17.3* (23.0) 77.8±5.6** (18.5) 68.3±12.7** (26.1) 77.5±26.7* (22.7) 77.2±13** (34.5) 布洛芬 32.4±6.7 (34.2) 80.2±10.2* (20.0) 62.1±8.2** (36.9) 58.4±7.8** (36.0) 62.1±12.0** (38.1) 58.2±10.4 (50.6) 对照组 49.3±6.2 100.3±14.9 98.4±9.8 91.3±14.2 100.3±10.9 117.9±6.1
*P＜0.05 **p＜0.01与对照组比较( )内为抑制率
表2-2.石斛提取物NO.4-1-1(生物碱)对大鼠佐剂性关节炎的抑制作用 组 别 致炎后不同时间的肿胀率％(天) 1 3 5 8 11 13 15 18 NO. 4-1-1 63.87± 7.65 67.97± 15.21 66.54± 22.20 67.4± 16.49 87.55± 13.8 69.0± 15.65 71.46± 17.69 65.57± 10.19 (19.05) (10.55) (17.04) (21.18) (12.57) (20.18)* (26.61)** (25.11)* * 雷 公 藤 66.74± 14.62 65.26± 12.43 63.98± 19.63 68.50± 16.68 75.63± 17.05 69.48± 19.54 69.11± 22.87 59.62± 11.72 (15.42) (14.10) (20.23) (19.90) (24.46)** (19.62) (29.03)* (31.90)* * 布 洛 芬 56.24± 13.73 58.28± 9.76 66.51± 22.75 68.66± 13.77 70.19± 6.41 68.11± 16.49 60.26± 17.20 49.49± 14.70 (28.71) (23.89) (17.07) (19.71)* (29.90)** (21.21) (38.11)** (43.47)* * 对 照 组 78.90± 7.16 75.98± 3.13 80.20± 3.86 85.52± 10.42 100.13± 8.81 86.44± 11.18 97.38± 13.08 87.55± 7.26
*P＜0.05 **p＜0.01与对照组比较( )内为抑制率
表2-4 金钗石斛各组分对大鼠佐剂型关节炎的抑制作用
不同时间肿胀值％ 剂量：4g生药/kg 组别 2天 5天 8天 12天 16天 19天 4-2-2 45.4±9.2 113.1±20.6 67.2±23.8* 43.4±10.2* 61.5±19.4 55.7±11.9* (50.8) (31.8) (48.0) (29.1) (26.2) 4-2-1 78.7±21.9 102.2±37.9 67.7±24.4* 58.2±20.2 81.7±14.8 65.3±19.6 (20.4) (3) (31.3) (30.8) (5.7) (13.5) 双氯 磷酸 钠 55.3±15.1 52.3±11.1 ** 51.5±8.9** 52.7±15.5* 67.7±7.6 45.2±14.8 ** (40.3) (50.4) (47.8) (36.9) (21.9) (40.1) 对照 组 92.6±17.8 105.5±22.1 98.6±10.0 83.6±26.3 86.7±19.7 75.5±10.3
表2-3.石斛提取物对大鼠佐剂性关节炎的抑制作用(X±SD)(5g/kg) 组别 致炎后不同时间的肿胀率％(天) 1 35 8 11 13 15 18 No.4 62.74±8.87 (18.29) 66.76±15.04 (8.44)65.24±20.69(15.34) 66.13±15.37 (19.65) 83.02±15.57 (14.12) 68.01±18.35 (18.25) 70.78±19.5 67.56±14.21 (19.85) No.6 68.59±13.71 (10.68) 62.55±13.60 (14.20)58.44±12.90(24.16) 68.26±14.30 (17.05) 80.03±14.22 (17.22) 73.46±9.72 (11.70) 68.22±9.67 (27.41) 62.46±9.91* (25.9 0) 020620-2 62.52±16.70 (18.58) 61.41±7.49 (15.78)59.53±12.74(22.75) 59.53±12.74 (22.75) 81.08±15.15 (16.13) 70.75±18.59 (14.96) 69.69±13.41 (25.84) 63.03±12.19 (25.23) 雷公藤 66.30±11.23 (14.97) 63.98±12.36 (12.25)60.51±17.67(21.48) 60.51±17.67 (21.48) 72.30±17.18 (25.21) 66.37±18.95 (20.23) 65.91±23.88 (29.87) 57.35±13.53 (31.96**) 布洛芬 55.70±14.19 (27.47*) 57.72±10.27 (20.84*)65.92±22.96(14.46) 65.92±22.96 (14.46) 69.54±6.02 (28.06**) 67.47±16.56 (18.89) 59.72±17.72 (36.46**) 48.98±15.20 (41.90**) 对照组 76.79±8.08 72.91±3.5377.06±4.19 77.06±4.19 96.67±9.60 83.20±11.24 93.98± 84.30±
*P＜0.05 **p＜0.01与对照组比较( )内为抑制率
试验3.金钗石斛对无水乙醇致急性胃粘膜损伤
3.1 试验方法乙醇致胃粘膜急性损伤
SD大鼠随机分组，禁食48小时，自由饮水。实验时灌服无水乙醇1ml/只，在灌服无水乙醇前一小时先给药，服无水乙醇后3小时处死动物，解剖取胃，以1％甲醛溶液固定，损伤程度以溃疡指数表示，条索状损伤的长度大于1mm者测量其长度，每mm记1分，若其长度宽度大于1mm者将其记分加倍，记分总数为该动物的溃疡指数，各项间进行比较。
3.2 实验结果
见表3-1、表3-2。
表3-1.金钗石斛对无水乙醇致急性胃粘膜损伤的影响(X±SD) 组别 剂量 (g生药/kg) n 溃疡指数 抑制率％ 020620-2 5 5 9.2±7.4* 91 020620-3 5 5 1.6±0.2** 98.4 雷尼替丁 50mg/kg 5 0.6±0.1** 99.4 对照组 5 102.8±57.8
*P＜0.05 **p＜0.01与对照组比较
表3-2 金钗石斛各提取物对无水乙醇致急性胃粘膜损伤的影响
(X±SD) 组别 剂量 (g生药/kg) 溃疡指数 抑制率 ％ 对照组 91.5±28.1 4-2-2 1.0 62.8±19.7 31.4 4-2-2 5.0 55.0±49.5 39.8(一只0) 4-2-1 1.0 50.4±40.4 44.9 4-2-1 5.0 8.4±15.6** 90.8(三只0)
试验4.金钗石斛对醋酸致慢性炎症的抑制作用
4.1 试验方法：醋酸烧灼型慢性胃溃疡模型
SD大鼠空腹24小时，自由饮水，在3％戊巴比妥钠麻醉下打开腹腔，在胃浆膜下注入30％冰醋酸0.1ml，随即缝合，次日起给药，每天1次，连续10天。解剖取胃，用甲醛固定，测量溃疡面积，进行各组间比较。
4.2 实验结果：见表4-1、表4-2.
金钗石斛对醋酸诱发的慢性胃溃疡有一定的抑制作用。
表4-1.金钗石斛对醋酸诱发的慢性胃溃疡的影响(X±SD) 组别 剂量 5g生药/kg n 溃疡指数 抑制率％ 020620-2 5 5 43.8±14.2* 33.0 020620-3 5 5 35.2±8.9** 46.1 雷尼替丁 50mg/kg 5 20.2±12.0** 69.1 对照组 5 65.4±12.4
**p＜0.01与对照组比
表4-2 金钗石斛各组分对醋酸诱发的慢性胃溃疡影响
剂量：4g生药/kg (X±SD) 组别 溃疡指数 抑制率％ 4-2-2 36.4±40.6 29.7 浅表(1只0) 4-2-1 39.0±24.3 24.8 浅表 雷尼替丁 18.2±22.0 64.8 对照组 51.8±16.5 深