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1、(10)申 请 公 布 号 CN 101993476 A(43)申请公布日 2011.03.30CN101993476A*CN101993476A*(21)申请号 201010277790.X(22)申请日 2010.09.10C07K 7/06(2006.01)C12P 21/06(2006.01)A23C 9/13(2006.01)(71)申请人华南理工大学地址 510640 广东省广州市天河区五山路381号(72)发明人赵谋明 崔春 赵海锋 张清丽(74)专利代理机构广州粤高专利商标代理有限公司 44102代理人何淑珍(54) 发明名称一种酪蛋白活性单肽及其制备方法与应用(57) 摘要本。
2、发明提供一种酪蛋白活性单肽及其制备方法与应用，氨基酸序列为Asn-Pro-Ser-Lys-Glu-Asn-Leu。本发明应用现代酶催化技术对酪蛋白进行酶解，利用生物分子分离纯化技术对具有促进酸乳发酵和抑制酸乳后酸化活性较强的部分进行分离纯化，对纯化得到的活性单肽进行氨基酸序列分析。该活性肽具有明显缩短酸乳发酵时间和抑制酸乳后酸化作用，可以安全的添加的到酸乳中，将该生物活性肽作为酸乳发酵添加剂提高酸乳产品质量。(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 5 页CN 101993479 A 1/1页21.一种酪蛋白活性单肽。
3、，该活性单肽氨基酸序列如序列表中序列1所示。2.权利要求1所述一种酪蛋白活性单肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）在5055，pH 6.0-7.5的条件下加入木瓜蛋白酶对酪蛋白进行酶解，得酶解液；（2）当水解度达到910时，9095加热1520min灭酶，终止酶解反应以控制生物活性肽的分子量；（3）将灭酶活的酶解液依次通过膜分离、大孔树脂、凝胶色谱、反相高效液相进行分离纯化，即得所述生物活性肽。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤（3）中将灭酶活的酶解液在4下以6000 g离心20分钟，将上清液经超滤，取分子量小于3000道尔顿的组分，采用大孔树脂NKA-II, 用10-2。
4、0%（w/w）乙醇洗脱，收集洗脱液，接着采用Sephadex G-25,流动相为去离子水，检测波长220nm，按吸收峰顺序收集；经Sephadex G-25分离得到的具有较强活性的组分再经C18高效液相色谱分离纯化，分离条件为：5-40%乙腈和95-60%去离子水梯度洗脱，检测波长220nm，按吸收峰顺序收集。4.权利要求1所述的酪蛋白活性单肽应用于酸乳发酵中，促进酸奶发酵，抑制酸奶后酸化。权 利 要 求 书CN 101993476 ACN 101993479 A 1/3页3一种酪蛋白活性单肽及其制备方法与应用技术领域0001 本发明涉抑制酸乳发酵及储藏的技术领域，具体涉及从酪蛋白酶解液分离得。
5、到的具有促进酸乳发酵和抑制酸乳后酸化的生物活性单肽及其应用。背景技术0002 酸乳是指在保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的作用下，使用添加 ( 或不添加 )乳粉( 全脂或脱脂)的乳进行乳酸发酵而得到的凝固乳制品，最终产品中必须含有大量的活菌。乳酸菌的发酵作用可以使乳白蛋白变成微细的凝乳粒，易于消化吸收，发酵过程中乳酸菌可以产生机体营养所必需的维生素、烟酸和叶。酸乳除了保留了牛奶的全部营养外,其与鲜奶最显著的差异就是在于它还含有大量的乳酸及易于人体肠道健康的活性乳酸菌。0003 我国酸乳生产中所用的乳酸菌大多为国外购进的直投式发酵剂(Direct-to vat caulture，简称DVS)，继代式酸。
6、乳菌种的应用量相当小。与液体菌种相比，直投式发酵剂的潜伏期要长得多。其发酵时间通常比使用传统的翻代液体发酵剂要延长23小时左右，对于大型乳品厂，这是一个不容忽视的影响因素。因此，如何缩短直投式菌种的发酵时间，提高生产效率，以及如何采取有效手段在减少发酵剂使用量，同时保证产品品质，来降低成本也是重要的研究方向。0004 在酸乳发酵过程中嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌具有生长互补的作用或称为共生(Mutualism)，球菌的生长同时会促进杆菌的生长，而杆菌生长形成的代谢产物又保证球菌的生长。乳杆菌对酸乳的贡献是分解蛋白质、产酸，链球菌对酸乳的良好风味和感官品质具有重要作用。酸乳在货架期必须保持微生物活。
7、性和良好的质构和风味。即使冷藏在05条件下，乳酸菌的新陈代谢导致的后酸化现象依然存在，这造成过乳清析出、酸味过重甚至产生涩味。以上现象严重影响酸乳的品质导致其保质期被大大缩短。0005 因此，通过在酸乳中添加具有含有益生功能因子的酪蛋白生物活性肽，有效地促进酸乳发酵缩短发酵时间并且抑制酸乳再储藏期间产生后酸化延长酸乳保质期，对酸乳行业具有重大的经济价值和现实意义。发明内容0006 本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种有牛乳来源的、高安全性的、具有可产业化的酪蛋白活性单肽及其制备方法与应用。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。0007 一种酪蛋白活性单肽的制备方法与应用，包括如下。
8、步骤：（1）在5055，pH 6.0-7.5的条件下加入木瓜蛋白酶对酪蛋白进行酶解，得酶解液；（2）当水解度达到910时，9095加热1520min灭酶，终止酶解反应以控制生物活性肽的分子量；（3）将灭酶活的酶解液依次通过膜分离、大孔树脂、凝胶色谱、反相高效液相进行分离说 明 书CN 101993476 ACN 101993479 A 2/3页4纯化，即得所述生物活性肽。0008 上述的制备方法，步骤（3）中将灭酶活的酶解液在4下以6000 g离心20分钟，将上清液经超滤（取分子量小于3000道尔顿的组分）后，采用大孔树脂NKA-II, 收集10-20%（w/w）乙醇洗脱液，接着采用Sepha。
9、dex（葡聚糖凝胶） G-25,流动相为去离子水，检测波长220nm，按吸收峰顺序收集；经Sephadex G-25分离得到的具有较强活性的组分再经C18高效液相色谱分离纯化，分离条件为：5-40%乙腈和95-60%去离子水梯度洗脱，检测波长220nm，按吸收峰顺序收集。0009 本发明还提供了由上述制备方法制得的具有促进酸乳发酵和抑制酸乳后酸化的酪蛋白活性单肽。0010 上述酪蛋白活性单肽，通过液相色谱-电喷雾串联质谱测定其分子量为801.4道尔顿，该活性单肽氨基酸序列如序列表中序列1所示。0011 所述的酪蛋白活性单肽可应用于酸乳发酵中，促进酸奶发酵，抑制酸奶后酸化。0012 本发明采用了。
10、以上技术方案，具有如下优点和效果：1、本发明通过对酪蛋白酶解液的进一步分离、纯化得到了氨基酸序列为NPSKENL的肽，该活性肽具有明显缩短酸乳发酵时间和抑制酸乳后酸化作用。0013 2、本发明分离纯化所得的生物活性肽是从酪蛋白中分离得到的乳源性肽，可以安全的添加的到酸乳中。0014 附图说明 图1为Sephadex G-25对酪蛋白酶解液的初步分离图；图2为RP-HPLC对生物活性肽的分离纯化图；图3为实施方式中添加50ppm（w/w）生物活性单肽对酸乳发酵周期和空白对照对应酸乳发酵周期的影响曲线；图4为实施方式中添加50ppm（w/w）生物活性单肽对酸乳储存期产酸的影响曲线和空白对照对应的影。
11、响曲线。0015 图5为实施方式中添加50ppm（w/w）的生物活性单肽对酸乳储存期乳酸菌活菌数的影响曲线和空白对照对应的影响曲线。具体实施方案0016 下面结合附图和实施例对本发明的具体实施作进一步说明。0017 实施例1：利用酪蛋白酶解液生产具有显著的促进酸乳发酵和抑制酸乳后酸化的生物活性单肽1、可控酶解：在50，pH 6.0的条件下加入木瓜蛋白酶对酪蛋白进行酶解，得酶解液。0018 2、 酶解液灭酶：90加热15min灭酶，终止酶解反应。0019 3、将灭酶活的酶解液离心（6000 x g，4）20分钟，将上清液经超滤（取分子量小于3000道尔顿的组分）后，采用大孔树脂NKA-II, 收。
12、集10%（w/w）乙醇洗脱液，接着采用Sephadex G-25,流动相为去离子水，检测波长220nm，按吸收峰顺序收集，如图1所示。经Sephadex G-25分离得到的具有较强活性的组分再经C18高效液相色谱分离纯化，分离条件为：5%（w/ w）乙腈和95%（w/w）去离子水梯度洗脱，检测波长220nm，按吸收峰顺序收集，如图2所示。说 明 书CN 101993476 ACN 101993479 A 3/3页50020 实施例2：利用酪蛋白酶解液生产具有显著的促进酸乳发酵和抑制酸乳后酸化的生物活性单肽1、可控酶解：在55，pH 7.5的条件下加入木瓜蛋白酶对酪蛋白进行酶解，得酶解液。002。
13、1 2、 酶解液灭酶：95加热20min灭酶，终止酶解反应。0022 3、将灭酶活的酶解液离心（6000 x g，4）20分钟，将上清液经超滤（取分子量小于3000道尔顿的组分）后，采用大孔树脂NKA-II, 收集20%（w/w）乙醇洗脱液，接着采用Sephadex G-25,流动相为去离子水，检测波长220nm，按吸收峰顺序收集，如图1所示。经Sephadex G-25分离得到的具有较强活性的组分再经C18高效液相色谱分离纯化，分离条件为：40%（w/w）乙腈和60%（w/w）去离子水梯度洗脱，检测波长220nm，按吸收峰顺序收集，如图2所示。0023 实施例3：生物活性肽对酸乳发酵周期的影。
14、响在酸乳发酵前添加50ppm（w/w）实施例1所得生物活性肽HAQQKE替换等蛋白的奶粉，测定酸乳发酵周期，即TpH4.5, 酸乳发酵到pH4.5所需要的时间，单位为小时。如图3所示，添加NPSKENL后酸乳发酵周期缩短了23.00%。0024 实施例3：生物活性肽对酸乳储藏期的酸度变化的影响测定按实施例2所发酵酸奶在28天储藏期间的滴定酸度即洁尼尔度T0变化。0025 试验方法：用5ml吸管取搅拌均匀的发酵乳5ml，加入含25ml蒸馏水锥形瓶中，滴入34滴1%酚酞指示剂，用0.1NNaOH滴定至浅红色，保持20s不退色。消耗NaOH溶液的毫升数乘以20即为酸度T0。0026 由图4可见，添加。
15、NPSKENL后酸乳储存28天后产酸量相对于空白样减少了24.07%，这表明50ppm的NPSKENL可明显抑制酸乳乳储存过程中产酸，有助于保持酸乳产品风味，延长保质期。0027 实施例4：生物活性肽对酸乳储藏期的乳酸菌活菌数变化的影响测定按实施例2所发酵酸奶在28天储藏期间的乳酸菌活菌数变化，采用试管法。0028 试验方法：在无菌操作条件下，将酸乳充分搅拌均匀，移取1ml，加入含9ml稀释液试管内，制成110的均匀稀释液，并在涡流仪上充分混匀。再从后者中吸取1ml于9ml稀释液中，并依次做10倍递增稀释至10-6，10-7两个稀释度。每个稀释度吸取1ml于灭菌试管培养基中，做两个平行样，在3。
16、7恒温培养箱中培养72h。0029 图5表明，添加NPSKENL后，酸乳在储藏28天后乳酸菌活菌数是空白的2.35倍，结果表明生活活性肽NPSKENL能够显著促进乳酸菌生长繁殖，提高酸乳品质。说 明 书CN 101993476 ACN 101993479 A 1/5页6图1说 明 书 附 图CN 101993476 ACN 101993479 A 2/5页7图2说 明 书 附 图CN 101993476 ACN 101993479 A 3/5页8图3说 明 书 附 图CN 101993476 ACN 101993479 A 4/5页9图4说 明 书 附 图CN 101993476 ACN 101993479 A 5/5页10图5说 明 书 附 图CN 101993476 A。