在发酵法生产甘油中的变温方法 本发明属于发酵法生产甘油的工艺技术，特别涉及在发酵法生产甘油中的变温方法。
在现有的发酵法生产甘油的工艺中，发酵温度总是维持在30-40℃范围内的某一温度，并在整个发酵过程中保持恒定。为进一步提高甘油产量，常用的方法是：提高搅拌转速或加大通气量以增进溶氧传质，添加营养组分，改进发酵设备或发酵流程等等。但是，这些方法或以能源、原材料的较大消耗为代价，或使发酵工艺及其操作变得复杂化。
实际上，温度调节是发酵过程中最为简便的操作之一，如果通过合理调整不同发酵阶段的发酵温度便能较大幅度地提高发酵产率，将在不改变工艺流程、不增加能源或原材料的消耗的前提下带来显著的经济效益。
业已证明：在耐高渗酵母发酵生产甘油过程中，细胞生长的最适温度为30-32℃：而在相同的细胞浓度和培养基组成条件下，残糖消耗和甘油产出的最适温度分别为34-36、38-40℃。很显然，如果将整个甘油发酵过程中的温度保持恒定，并不一定能使整个发酵阶段都达到最有效的状态。
本发明的目的是针对好氧发酵法生产大量甘油过程中细胞生长、残糖及磷消耗、甘油产出的动力学特征，对整个发酵过程的发酵温度进行优化，从而提供一种在发酵法生产甘油中的变温方法，在保持较快的残糖消耗速率的前提下，达到较大幅度提高发酵甘油产率的目的。
本发明的技术解决方案为：
根据甘油间歇发酵过程动力学模型的基本形式，对不同形式、不同规模及不同通气量条件下的发酵反应器，利用已有的典型发酵数据，重新估计部分动力学可变参数的数值，建立符合待优化的发酵反应器和通气量条件下的动力学模型。再测定出发酵初始时的细胞、葡萄糖和磷的浓度，然后运用该模型，以甘油产量最大为目标，限定发酵时间及最终残糖浓度，通过优化计算确定整个发酵过程的最优化温度分布，并将该温度分布实施于实际甘油发酵过程。
本发明中，用于温度优化计算的甘油间歇发酵过程的宏观动力学模型的基本形式如下：细胞生长模型：dXdt=f1(T)·EXP(-tkt)(1+Ko1+X/Kdo1)μmax]]>×S(Ks1X+S)(1+S/Kis)PhKph1+PhX-f5(T)KdX]]>残糖消耗模型：甘油生成模型：dPdt=αlfdXdt+f3(T)·βSo(1+X/Kdo2)2phKph3+phX]]>-f2(T)ms·KspPKspP+S-PhKph2+phX]]>磷消耗模型：dPhdt=1f4(T)·Yx/Ph·S2Ks2·f6(T)+S2dXdt]]>
经多次实验分析证明，以上甘油发酵宏观动力学模型的参数分两部分。一部分只与微生物反应本身有关，其值不因发酵反应器的形式和操作状态的改变而改变，为固定参数；另一部分模型参数则还与反应器的形式、规模及通气量的大小相关，为可变参数。
其中甘油发酵动力学模型中的可变参数及其取值范围为：Kdo1为对细胞生长溶氧系数(108个/毫升)，取值范围1-20，Kph1为磷对细胞生长饱和常数(微克/毫升)，取值范围50-200，Yp/s为甘油对葡萄糖得率系数(无单位)，取值范围0.4-0.6，Yx/ph为细胞对磷得率系数(108个/微克)，取值范围0.04-0.08，td为葡萄糖消耗延滞时间(小时)，取值范围0-10，Kdo2为对甘油生成溶氧系数(108个/毫升)，取值范围5.7·Kdo1，Kph2为磷对葡萄糖消耗饱和常数(微克/毫升)，取值范围0.088·Kph1，Kph3为磷对甘油生成饱和常数(微克/毫升)，取值范围0.00293·Kph1，
甘油发酵动力学模型中的固定参数为：μmax细胞最大比生长速率(小时-1)，值为111.04，Kt细胞生长随时间衰减系数(小时)，值为33.964，Ko溶氧对细胞生长的增加系数，值为2.1738，Ksi葡萄糖对细胞生长的饱和常数(10-8毫升/个)，值为652.29，Kjs葡萄糖对细胞生长抑制系数(％·％)，值为93.203，Kd细胞生长死亡系数(h-1)，值为0.0000044，Yx/s细胞对葡萄糖得率系数(108个/毫升·％-1)，值为1.6245，Ms细胞代谢能量维持系数(％·10-8毫升/个/小时)，值为0.05924，Ksp细胞代谢中对甘油和葡萄糖利用能力之比，值为0.19204，alf甘油生成与细胞生长的相关系数(％·10-8毫升/个)，值为0.0231，β甘油生成与细胞浓度的相关系数(％·10-8毫升/个/小时)，值为0.00106，Ks2葡萄糖对磷消耗的饱和常数(％·％)，值为152.69，
模型中的温度函数为：f1(T)=2.984-0.0409T-0.000452T2，f2(T)=-8.575+0.564T-0.00830T2，f3(T)=-6.335+0.383T-0.00494T2，f4(T)=-10.597+0.595T-0.00754T2，f5(T)=0.3552+0.0342T-0.000451T2，f6(T)=EXP((35-T)/2.234)，f7(T)=5.667-0.300T+0.00476T2，
模型中的其它变量为：X代表细胞浓度(108个/毫升)，S代表残糖重量百分比浓度(％)，P代表甘油重量百分比浓度(％)，Ph代表细胞磷浓度(微克/毫升)，T温度范围为29-41℃，t为发酵时间(小时)，
本发明在发酵法生产甘油中的变温方法具体执行步骤包括：
步骤一：分析确定发酵开始时的细胞、葡萄糖浓度及磷含量；
发酵反应器中的培养基在110-120℃温度下灭菌10-20分钟后，在接种发酵开始前1-2小时，取10毫升发酵培养基作分析样，其中1毫升用蒸馏水稀释50倍后用菲林定糖法测定葡萄糖浓度，记为S1，另外9毫升样用磷钼酸铵法测定磷含量，记为Ph1；同时，于种子发酵液中也取样10毫升，将其中的1毫升用蒸馏水稀释10-50倍，用血球记数板记数法在50倍显微镜下记数确定出细胞浓度，记为X2；将另外9毫升种子发酵液在3000转/分钟的转速下离心3分钟以上，取离心后的上清液1毫升，用蒸馏水稀释5-10倍后用菲林定糖法测定葡萄糖浓度，记为S2，余下的上清液用磷钼酸铵法测定磷含量，记为Ph2；根据接种百分体积比例C％，按照质量衡算关系近似确定出发酵开始时的细胞浓度(X0)、葡萄糖浓度(S0)及磷含量(Ph0)，发酵初始甘油浓度确定为零，即P0=0。
步骤二：确定发酵过程的最优化温度分布，
运用优化甘油发酵温度的复形调优程序，优化甘油发酵过程温度，并通过积分甘油间歇发酵过程的宏观动力学模型方程组细胞生长模型：dXdt=f1(T)·EXP(-tkt)(1+Ko1+X/Kdo1)μmax]]>×S(KstX+S)(1+S/Kis)PhKph1+PhX-fs(T)KdX]]>残糖消耗模型：甘油生成模型：dPdt=αlfdXdt+f3(T)·βSo(1+X/Kdo2)2phKph3+phX]]>-f2(T)ms·KspPKspP+SPhKph2+phX]]>磷消耗模型：dPhdt=1f4(T)·Yx/Ph·S2Ks2·f6(T)+S2dXdt]]>使求得的最终残糖浓度Sf受到最终残糖浓度指标Send约束的甘油发酵指标Pf最大，式中 P∫表示积分甘油发酵动力学模型方程组后所得的发酵结束时的甘油浓度。
具体步骤是：
(1)．启动确定甘油发酵最优化温度的复形调优计算机程序，进入运行状态，
(2)．输入发酵过程平均划分的温度阶段数目N，
(3)．输入发酵总时间为tf小时，葡萄糖消耗的延滞时间td小时，或取td=2小时，输入可变参数Kdo1,Kph1,Yp/s,Yx/ph和Kdo2,Kph2,Kph3的数值；输入步骤一所得开始时的细胞浓度(X0)、葡萄糖浓度(S0)、甘油浓度(P0)及磷含量(Ph0)，发酵最终残糖浓度指标Send,T1,T2,…,TN共N个温度变量的初始值、下限值Tlow和上限值Tup，下限值Tlow=29，上限值Tup=40，温度初始值可在上限值和下限值的范围内任意选取，输入反射系数α，
(4)．数据输入完毕后，等待计算机输出T1,T2,…,TN共N个温度变量的优化值及优化后的最终残糖浓度Sf受到最终残糖浓度指标Send约束的甘油发酵指标Pf的数值，
(5)．在3-20的温度范围内改变N值，重复步骤(1)-(4)一次或一次以上，重新计算出新的N值所对应的优化温度T1,T2,…,TN以及优化后发酵指标Pf的数值，
(6)．关闭确定甘油发酵最优化温度的复形调优计算机程序，
(7)．按N值从小到大的顺序，比较不同N值下的Pf值，以Pf值的变化幅度不超过1％时的最小N值作为发酵过程划分的总阶段数目，然后再选择该N值下所对应的优化温度T1,T2,…,TN作为发酵的最优化温度。
采用复形调优方法确定发酵过程的最优化温度，其计算机程序框图如图2所示，其基本原理是：将发酵过程平均划分为N个阶段(3≤N≤20)，设每一段的温度为Ti(i=1,2,…,N)，限定发酵总时间为tf小时，葡萄糖消耗的延滞时间td小时，限定发酵结束时的残糖浓度Sf小于某具体指标Send(Sf,Send单位均为质量百分浓度),在29-40℃范围内优化T1,T2,…,TN共N个温度变量的值，使甘油发酵指标Pf最大。
优化温度程序框图中N,X0,S0,P0,Ph0,T10,T20,…,TNO,Tup,Tlow,Eps,tf,Send,α，及动力学模型可变参数为输入变量，T1,T2,…,TN以及Pf为输出变量，其余符号均为程序中的中间变量。
X0,S0,P0,Ph0分别表示发酵开始时的细胞、残糖、甘油、磷的浓度；Eps表示计算精度；下标i代表发酵阶段的序号，Ti表示第i阶段的温度；下标j代表复形顶点的序号，Tij表示第j+1个顶点中第i阶段的温度；T10,T20,…,TNO为N段温度的初始值，并由它们组成复形的第一个顶点X0的坐标；dX/dt,dS/dt,dP/dt,dPh/dt则分别代表细胞生长、残糖消耗、甘油生成和磷消耗模型；Pf表示最终残糖浓度Sf受到最终残糖浓度指标Send约束的甘油发酵指标，其中Pf0或Pf(X0)、Pfj或Pf(Xj)分别表示第一个、第j+1个顶点的发酵指标Pf的数值，PfR或Pf(XR)、PfG或Pf(XG)、Pf(XT)则分别表示在最坏点XR、次坏点XG、XR的对称点XT处的Pf值；XT(i)代表对称点XT中第i个温度；L代表复形顶点间的距离；α代表由最坏点XR以XF为对称轴确定对称点XT的反射系数。
步骤三：按照所求得的最优化温度分布控制发酵过程的温度，
根据发酵反应器的最大升温速率或降温速率，按照温度升降过程时间在相邻两阶段中各占一半的原则，确定相邻两阶段温度转换的时间，将步骤2求得N个阶段的温度T1,T2,…,TN运用到实际发酵过程，在保持较快的残糖消耗速率的前提下，最终提高发酵甘油的产率。
按照温度升降过程时间在相邻两阶段中各占一半的原则，确定相邻两阶段温度转换的时间。比如相邻两阶段的温度分别为31、37℃，最大升温速率为0.15℃/分钟，则前一阶段结束时间应提前约20分钟，随后升温约40分钟达37℃进入接下来的阶段。
本发明的方法，在步骤一前还可进一步包括确定符合待优化的发酵反应器和通气量条件下动力学模型的可变参数的步骤；这是由于发酵反应器的形式、规模及通气量的大小的变化将导致反应器内的溶氧传质、流动混合状态的变动。因此，必须确定动力学模型中可变参数的数值，以建立发酵反应器和通气量条件发生改变后的动力学模型。
选择至少一批以上的典型间歇发酵过程的测试数据，每批发酵数据必须包括葡萄糖消耗的延滞时间td小时或取td=2小时，发酵初始测试的细胞浓度(108个/毫升)、残糖浓度(重量百分比)、甘油浓度(重量百分比)和磷含量(微克/毫升)，以及发酵过程中三组以上的测试数据，其中每组数据包括细胞浓度、残糖浓度、甘油浓度、发酵温度(℃)、以及对应的时间。
启动确定甘油发酵动力学模型中可变参数的复形调优计算机程序，进入运行状态；分别输入以上所选择典型间歇发酵过程的测试数据、计算精度Eps、可变参数Kdo1,Kph1,Yp/s,Yx/ph的上限值、下限值和初始值，初始值可在上限值和下限值的范围内任意选取，输入反射系数α，待计算机输出优化后的Kdo1,Kdo1,Yp/s,Yx/ph和Kdo2,Kph2,Kph3的数值后，退出确定甘油发酵动力学模型中可变参数的复形调优计算机程序。
确定甘油发酵动力学模型中可变参数的复形调优计算机程序的基本原理为，调整Kdo1，Kph1，Yp/s，Yx/ph的数值，使如下目标函数F的值最小：F=∑[(Xij-Xcij)2 +(Sij-Scij)2+(Pij-Pcij)2]F表示所有细胞、残糖、甘油浓度的测试值(分别为X,S,P)和相应模型计算值(分别为Xc,Sc,Pc)的残差平方和，Kdo2,Kph2,Kph3的数值则由它们与Kdo1，Kph1的比例关系直接确定。具体的计算机程序框图如附图1所示。
程序框图中a10,a20,a30,a40,d1,d2,d3,d4,c1,c2,c3,c4,td,Eps,α,Xij,Sij,Pij,Tij,tij共5×i×j个变量及Phil共i个变量为输入变量；Kdo1,Kph1,Yp/s,Yx/ph和Kdo2,Kph2，Kph3为输出变量；其余符号均为计算程序中的中间变量。
下标i表示实验批次，j表示第i批实验中数据点的顺序；Xij,Sij,Pij,Phil,…Tij,分别表示第i批实验中第j组的细胞、残糖、甘油、磷的浓度、发酵温度，tij为对应时间；n为实验总批数，mi为第i批的数据总组数；a1,a2,a3,a4分别表示可变参数Kdol,Kph1,Yp/s,Yx/ph；a10,a20,a30,a40表示a1,a2,a3,a4的初始值；d1,d2,d3,d4和c1,c2,c3,c4分别表示a1,a2,a3,a4的上限值和下限值；Eps表示计算精度。A0表示复形的第一个顶点，其坐标为(a10,a20,a30,a40)；Xcij,Scij,Pcij分别表示由动力学模型方程计算出的第i批第j组的细胞、残糖、甘油浓度模型值；F0=∑[(Xij-Xcij)2+(Sij-SCij)2+(Pij-Pcij)2]，表示所有细胞、残糖、甘油浓度的测试值与相应模型值的残差平方和，且式中的Xcij,Scij,Pcij由第一个顶点(a10,a20,a30,a40)决定。Ak表示复形的第k个顶点，其对应坐标为(a1k,a2k,a3k,a4k)；r为[0,1]内的随机函数；Fk=∑[Xij-Xcij)2+(Sij-Scij)2+(Pij-Pcij)2]，表示所有细胞、残糖、甘油浓度的测试值与相应模型值的残差平方和，式中的Xcij,Scij,Pcij由第k个顶点(a1k,a2k,a3k,a4k)决定。AR为复形中的最坏点，由FR=F(AR)=max(Fk)0≤k≤7]]>确定；AG为复形中的次坏点，由FG=F(AG)=max(Fk)0≤k≤7,k≠R]]>确定；AT为AR的对称点；AT,AR,AG,AF,L1,L2,L均为程序中的中间变量；FT或F(AT)、FR或F(AR)、FG或F(AG)分别代表由AT、AR、AG决定的所有细胞、残糖、甘油浓度的测试值与相应模型值的残差平方和；下标q代表参数a或其上下限c,d的序号；AT(q)则表示对称点AT坐标中的第q个参数aq；α代表由最坏点AR以AF为对称轴确定对称点AT的反射系数。
本发明与现有技术相比具有如下优点：1．基本不增加投资。2．操作简单。不同发酵阶段的温度可利用初始条件和动力学模型，根据确定甘油 发酵最优化温度的复形调优计算机程序在发酵前或发酵开始不久后计算确定， 实际温度控制的操作则可通过温控装置的调节简便地实现。3．效果显著。从摇瓶到15升气升式反应器一系列实验的结果表明：与常规的恒 温发酵相比，通过温度优化，可使发酵在保持较快残糖消耗速率的前提下，显 著提高甘油的产量。4．易于推广。重新优化动力学模型中的可变参数可将模型放大到各种形式、规模 的反应器，确定可变参数和温度优化程序可分别按图1、图2编写。
由附图3可见，发酵的实验结果基本上与模型预测值一致，根据甘油发酵动力学模型通过复形调优计算机程序优化发酵温度是可行的。
下面结合附图对本发明作进一步的说明：
图1为运用复形调优方法确定甘油发酵动力学模型的可变参数的程序框图；
图2运用优化甘油发酵温度的复形调优方法确定甘油发酵动力学模型的优化温度可变参数的程序框图；
图3为15L气升式反应器中实验测试值与相应模型计算值的比较；
图(a)表示35℃恒温发酵，图(b)表示按优化温度进行的发酵。
口表示葡萄糖浓度的测试值 ○表示细胞浓度的测试值
△表示甘油浓度的测试值，实线表示根据动力学模型模拟的结果
实施例1．1000毫升摇瓶上的温度优化实验之一。
发酵条件：发酵菌种为耐高渗酵母Candida krusei；发酵种子培养基组成为：葡萄糖浓度10％，玉米浆浓度0.3％，尿素浓度0.3％，pH值为4.5；发酵培养基组成为：葡萄糖浓度26％，玉米浆浓度0.3％，尿素浓度0.3％，pH值为4.5；摇瓶体积为1000毫升，装液量为100毫升；摇瓶中发酵种子在转速为160转/分钟，温度为35±1℃的摇床内培养24小时，以10％的接种量接入发酵摇瓶中；摇瓶发酵时，摇床转速为160转／分钟，温度为35±1℃。
步骤一：
根据摇瓶发酵的经验，葡萄糖消耗的延滞时间td=2。选择已有的九批典型发酵数据用于重新估计动力学模型中的可变参数，葡萄糖消耗的延滞时间td=2，如下表所示： 批次 时间 h 细胞浓度 108个／毫升 残糖浓度 ％甘油浓度 ％ 磷含量微克／毫升温度 ℃第一批 0 0.45 15.92 0 30 31 24 4.7 12.09 0.6 48 5.06 7.87 2.03 72 5.16 4.3 2.52 96 5.06 1.78 2.65第二批 0 0.45 23.8l 0 62 31 24 5.82 16.51 0.98 48 6.83 10.5 2.37 72 6.77 6.42 2.92 96 6.74 2.63 2.96第三批 0 0.45 29.5l 0 85 31 24 5.48 21.66 1.94 48 6.52 10.47 2.76 72 6.47 9.54 4.03 96 6.65 6.61 5.42第四批 0 0.45 24.61 0 50 35 24 3.21 19.61 0.95 48 3.85 16.05 2.25 72 3.73 10.78 3.25 96 3.6 8.56 4.07第五批 0 0.45 30.93 0 72 35 24 4.18 23.78 1.57 48 4.78 17.8 2.58 72 4.96 12.05 4.49 96 4.86 9.68 5.93第六批 0 0.45 16.59 0 85 35 24 6.2 8.69 1.18 48 6.54 1.03 1.33 72 6.64 0.12 1.1l 96 6.77 0.18 0.8第七批 0 0.45 30.53 0 48 40 24 3.19 26.04 1.8l 48 3.4 21.75 3.19 72 3.22 17.26 3.64 96 3.24 15.69 4.6第八批 0 0.45 17.35 0 75 40 24 4.18 11.65 1.75 48 5.32 8.82 2.33 72 5.48 4.33 2.98 96 5.24 1.5 3.28第九批 0 0.45 23.77 0 110 40 24 5.64 15.5 2.04 48 6.02 7.18 3.36 72 6.36 2.3 4.02 96 6.29 0.49 4.65
启动确定甘油发酵动力学模型中可变参数的复形调优计算机程序；分别按批次、每一批的时间顺序输入以上所选发酵数据中的时间、细胞、葡萄糖、甘油、磷浓度及温度；输入葡萄糖消耗的延滞时间td=2；再输入计算精度Eps=0.0000001；分别输入可变参数Kdo1,Kph1,Yp/s,Yx/ph的初始值2.1738、652.29、0.48007、0.0525及其取值的上限值20、200、0.6、0.08和下限值1、50、0.4、0.04；输入反射系数α=1.3；随后计算机即可优化求解并在屏幕上输出Kdo1,Kph1,Yp/s,Yx/ph和Kdo2,Kph2,Kph35的数值，如下表所示：
步骤二：
发酵反应器中的培养基在115℃左右的温度下灭菌约15分钟后，在接种发酵开始前2小时，取10毫升发酵培养基作分析样，其中1毫升用蒸馏水稀释50倍后用菲林定糖法测定葡萄糖浓度，记为S1，另外9毫升样用磷钼酸铵法测定磷含量，记为Ph1；同时，于种子发酵液中也取样10毫升，将其中的1毫升用蒸馏水稀释50倍，用血球记数板记数法在50倍显微镜下记数确定出细胞浓度，记为X2；将另外9毫升种子发酵液在3000转/分钟的转速下离心3分钟以上，取离心后的上清液1毫升，用蒸馏水稀释10倍后用菲林定糖法测定葡萄糖浓度，记为S2，余下的上清液用磷钼酸铵法测定磷含量，记为Ph2；根据接种百分体积比例10％，按照公式近似确定出发酵开始时的细胞浓度(X0)、葡萄糖浓度(S0)及磷含量(Ph0)，发酵初始甘油浓度确定为零，即P0=0；
结果如下表所示(初始甘油浓度为0)。细胞浓度(108个/毫升)葡萄糖浓度(％)磷含量(微克/毫升)种子发酵液 6.08 2.35 12灭菌后培养基 0.00 28.20 92发酵初始值 0.55 25.85 85
步骤三：
运用优化甘油发酵温度的复形调优程序，优化甘油发酵过程温度，并通过积分甘油间歇发酵过程的宏观动力学模型方程组细胞生长模型：dXdt=f1(T)·EXP(-tk1)(1+Ko1+X/Kdo1)μmax]]>×S(Ks1X+S)(1+S/Kis)-PhKph1+PhX-fs(T)KdX]]>残糖消耗模型：甘油生成模型：dPdt=αlfdXdt+f3(T)·βSo(1+X/Kdo2)2phKph3+phX]]>-f2(T)ms·KspPKspP+SPhKph2+phX]]>磷消耗模型：dPhdt=1f4(T)·Yx/Ph·S2Ks2·f6(T)+S2dXdt]]>使求得的最终残糖浓度Sf受到最终残糖浓度指标Send约束的甘油发酵指标Pf最大，
具体步骤是：
(1)．启动确定甘油发酵最优化温度的复形调优计算机程序，进入运行状态，
(2)．输入发酵过程平均划分的温度阶段数目N=4，
(3)．输入发酵总时间为tf=96小时，葡萄糖消耗的延滞时间td=2小时，分别输入可变参数Kdo1,Kph1,Yp/s,Yx/ph和Kdo2,Kph2,Kph3的数值(分别为2.347,129.4,0.4748,0.05092,13.37,11.38,0.8604)；输入发酵开始时的细胞浓度X0=0.55、葡萄糖浓度S0=25.85及磷含量Ph0=85；输入发酵结束时的残糖浓度指标Send=2；分别输入T1,T2,T3,T4初始值32、37、37、37；输入温度的下限值Tlow=30和上限值Tup=40；输入反射系数α=1.3。
(4)．数据输入完毕后，等待计算机输出T1,T2,…,T4共4个温度变量的优化值及优化后发酵指标Pf的数值，
(5)．改变N值，N=8，重复步骤(1)-(4)一次，重新计算出新的N值所对应的优化温度T1,T2,…,T8以及优化后发酵指标Pf的数值，
(6)．关闭确定甘油发酵最优化温度的复形调优计算机程序，
(7)．按N值从小到大的顺序，比较N=4,N=8两种分段优化情况下的96小时后发酵结果的计算值：
N 细胞浓度 (108个/毫升)葡萄糖浓度 (％)甘油浓度 (％) 磷含量(微克/毫升)发酵指标 Pf 4 6.50 1.97 5.94 5.14 5.94 8 6.29 1.89 5.97 5.24 5.97
可见N=4,N=8情况下的发酵指标Pf之间的变化幅度小于1％，将发酵过程分为4段进行温度优化，在保证最后残糖消耗在3.5％以下的同时，便可基本实现甘油产量最大。对发酵过程分别分4段进行优化的温度结果如下：时间(小时) 0-24 24-48 48-72 72-96温度(℃) 32.5 39.9 39.9 39.9
步骤四：
由于本实例中摇床的最大升温速率较快，约为3℃/分钟，因此在相邻第一、二阶段中温度升降过程所占时间可以忽略，将摇床前24小时的温度控制为32.5±1℃，后72小时的温度控制为40±1℃，并与30、35、40℃的恒温发酵进行比较，所得最后的发酵结果如下： 类别 细胞浓度 (108个/毫升) 葡萄糖浓度 (％) 甘油浓度 (％) 30℃的恒温发酵 7.66 0.73 3.52 35℃的恒温发酵 6.22 1.13 4.93 40℃的恒温发酵 5.57 5.02 5.78 0-24h:32.5℃ 24-96h:40℃ 6.72 2.21 5.86
表中的发酵结果均为三组平行实验的平均值。可见，按优化温度发酵的实验结果基本上与模型计算值一致。与30、35℃的恒温发酵相比，甘油产量分别提高66.5％、18.9％；与40℃的恒温发酵相比，虽然甘油产量基本持平，但残糖消耗速率却明显加快。实施例2.1000毫升摇瓶上的温度优化实验之二。
发酵条件：发酵培养基中葡萄糖浓度约为21％，玉米浆浓度约为0.2％，其它条件同实施例1。
由于摇床的转速、摇瓶装液量与实施例1相同，因此动力学模型的可变参数也同实施例1。
步骤一：
发酵反应器中的培养基在115℃左右的温度下灭菌约15分钟后，在接种发酵开始前2小时，取10毫升发酵培养基作分析样，其中1毫升用蒸馏水稀释50倍后用菲林定糖法测定葡萄糖浓度，记为S1，另外9毫升样用磷钼酸铵法测定磷含量，记为Ph1；同时，于种子发酵液中也取样10毫升，将其中的1毫升用蒸馏水稀释50倍，用血球记数板记数法在50倍显微镜下记数确定出细胞浓度，记为X2；将另外9毫升种子发酵液在3000转/分钟的转速下离心3分钟以上，取离心后的上清液1毫升，用蒸馏水稀释10倍后用菲林定糖法测定葡萄糖浓度，记为S2，余下的上清液用磷钼酸铵法测定磷含量，记为Ph2；根据接种百分体积比例10％，按照公式近似确定出发酵开始时的细胞浓度(X0)、葡萄糖浓度(S0)及磷含量(Ph0)，发酵初始甘油浓度确定为零，即P0=0；如下表所示：细胞浓度(108个/毫升)葡萄糖浓度(％)磷含量(微克/毫升)种子发酵液 6.10 2.38 11灭菌后培养基 0.00 22.70 59发酵初始值 0.55 20.85 55
步骤二：
运用优化甘油发酵温度的复形调优程序，优化甘油发酵过程温度，并通过积分甘油间歇发酵过程的宏观动力学模型方程组，使求得的最终残糖浓度Sf受到最终残糖浓度指标Send约束的甘油发酵指标Pf最大，
具体步骤是：
(1)．启动确定甘油发酵最优化温度的复形调优计算机程序，进入运行状态，
(2)．输入发酵过程平均划分的温度阶段数目N=4，
(3)．输入发酵总时间为tf=96小时，葡萄糖消耗的延滞时间td=2小时，输入可变参数Kdo1,Kph1,Yp/s,Yx/ph和Kdo2,Kph2,Kph3的数值(分别为2.347,129.4,0.4748,0.05092,13.37,11.38,0.8604)；输入发酵开始时的细胞浓度X0=0.55、葡萄糖浓度S0=20.85及磷含量Ph0=55；输入发酵结束时的残糖浓度指标Send=3.5；分别输入T1,T2,T3,T4初始值32、37、37、37；输入温度的下限值Tlow=30和上限值Tup=40输入反射系数α=1.3。
(4)．数据输入完毕后，等待计算机输出T1,T2,T3,T4共4个温度变量的优化值及优化后发酵指标Pf的数值，
(5)．改变N值，N=8，重复步骤(1)-(4)一次，重新计算出新的N值所对应的优化温度T1,T2,…,T8以及优化后发酵指标Pf的数值，
(6)．关闭确定甘油发酵最优化温度的复形调优计算机程序，
(7)．按N值从小到大的顺序，比较N=4,N=8两种分段优化情况下的96小时后发酵结果的计算值：
N 细胞浓度 (108个/毫升)葡萄糖浓度 (％)甘油浓度 (％)发酵指标 Pf 磷含量 (微克/毫升) 4 5.84 2.40 4.53 4.53 3.66 8 5.59 3.21 4.57 4.57 3.29
可见N=4,N=8情况下的发酵指标Pf之间的变化幅度小于1％，将发酵过程分为4段进行温度优化，在保证最后残糖消耗在3.5％以下的同时，便可基本实现甘油产量最大。对发酵过程分别分4段进行优化的温度结果如下：
时间(小时) 0-24 24-48 48-72 72-96温度(℃) 31.3 39.8 39.9 40.0
步骤三：
按照N=4情况下的温度优化结果，将摇床前24小时的温度控制为31.3±1℃，后72小时的温度控制为40±1℃，并与30、35、40℃的恒温发酵进行比较，所得96小时后的发酵结果如下：
类别 细胞浓度 (108个/毫升)葡萄糖浓度 (％) 甘油浓度 (％)30℃的恒温发酵 6.11 4.86 3.6135℃的恒温发酵 5.15 6.58 3.9240℃的恒温发酵 4.07 8.47 4.350-24h:31.3℃24-96h:40.0℃ 5.71 3.48 4.89
表中的发酵结果同样为三组平行实验的平均值。可见，按优化温度发酵的实验结果基本上与模型计算值一致。与30、35、40℃的恒温发酵相比，甘油产量分别提高35.5％、24.7％、12.4％；而且能保持较快的残糖消耗速率。实施例3.15升气升式反应器上的温度优化实验。
发酵条件：发酵菌种为耐高渗酵母Candida krusei；发酵种子培养基组成为：葡萄糖浓度10％，玉米浆浓度0.3％，尿素浓度0.3％，pH值为4.5；发酵培养基组成为：葡萄糖浓度26％，玉米浆浓度0.2％，尿素浓度0.3％，pH值为4.5；发酵种子在体积为1.5升，装液量为1升，通气量为2vvm，温度为35±1℃的气升式反应器内培养12小时，以8％的接种量接入15升气升式反应器中；在15升气升式反应器中发酵时，装液量为11升，通气量为1.5vvm，温度为35±1℃。
按照实施例1的步骤确定15升气升式反应器中甘油发酵中最优化的温度分布。
步骤一：
为确定动力学模型中的可变参数，选取该反应器条件下的一组典型的35℃恒温间歇发酵实验(如下表)。时间(h)细胞浓度(108个/毫升)葡萄糖浓度(%)甘油浓度(%)其它条件00.5527.650发酵培养基中玉米浆浓度为0.2%,接种后测得初始磷含量为:55微克/毫升83.0127.320.1133.525.661.25244.1222.72.39314.5620.682.85374.9718.113.14485.2116.154.35565.3913.394.84615.1412.045.94725.269.196.77765.57.657.05
由上面表中可以看出，葡萄糖消耗的延滞时间td可取8小时。
启动确定甘油发酵动力学模型中可变参数的复形调优计算机程序；分别按时间顺序输入以上所选发酵数据中的时间、细胞、葡萄糖、甘油及温度(35)及初始磷浓度(Ph0=55)；输入葡萄糖消耗的延滞时间td=8；再输入计算精度Eps=0.0000001；分别输入可变参数Kdo1,Kph1,Yp/s,Yx/ph的初始值2.1738、652.29、0.48007、0.0525及其取值的上限值20、200、0.6、0.08和下限值1、50、0.4、0.04；输入反射系数α=1.3；随后计算机即可优化求解并输出Kdo1,Kph1,Yp/s,Yx/ph和Kdo2,Kph2,Kph35的数值，如下表所示(模型拟合情况见图3(a))： 参数 Kdo1 Kph1 Yp/s Yx/ph Kdo2 Kph2 Kph3 值 12.49 102.2 0.4632 0.07114 71.20 8.99 0.6797
步骤二：
发酵反应器中的培养基在115℃左右的温度下灭菌约15分钟后，在接种发酵开始前1.5小时，取10毫升发酵培养基作分析样，其中1毫升用蒸馏水稀释50倍后用菲林定糖法测定葡萄糖浓度，记为S1，另外9毫升样用磷钼酸铵法测定磷含量，记为Ph1；同时，于种子发酵液中也取样10毫升，将其中的1毫升用蒸馏水稀释50倍，用血球记数板记数法在50倍显微镜下记数确定出细胞浓度，记为X2；将另外9毫升种子发酵液在3000转/分钟的转速下离心3分钟以上，取离心后的上清液1毫升，用蒸馏水稀释10倍后用菲林定糖法测定葡萄糖浓度，记为S2，余下的上清液用磷钼酸铵法测定磷含量，记为Ph2；根据接种百分体积比例8％，按照公式近似确定出发酵开始时的细胞浓度(X0)、葡萄糖浓度(S0)及磷含量(Ph0)，发酵初始甘油浓度确定为零，即P0=0；如下表所示： 细胞浓度(108个/毫升)葡萄糖浓度(％) 磷含量(微克/毫升)种子发酵液 7.16 1.64 8灭菌后培养基 0.00 30.91 66发酵初始值 0.53 28.74 62
步骤三：
运用优化甘油发酵温度的复形调优程序，优化甘油发酵过程温度，并通过积分甘油间歇发酵过程的宏观动力学模型方程组，使求得的最终残糖浓度Sf受到最终残糖浓度指标Send约束的甘油发酵指标Pf最大，
具体步骤是：
(1)．启动确定甘油发酵最优化温度的复形调优计算机程序，进入运行状态，
(2)．输入发酵过程平均划分的温度阶段数目N=3，
(3)．输入发酵总时间为tf=76小时(为与以上进行参数估计的恒温发酵实验进行对照，同样限定发酵时间为76小时)、葡萄糖消耗的延滞时间td=8小时，输入葡萄糖消耗的延滞时间td=8；分别输入动力学可变参数发酵Kdo1,Kph1,Yp/s,Yx/ph和Kdo2,Kph2,Kph3的数值(分别为12.49,102.2,0.4632,0.07114,71.20,8.99,0.6797)；输入发酵开始时的细胞浓度X0=0.53、葡萄糖浓度S0=28.74及磷含量Ph0=62；输入发酵结束时的残糖浓度指标Send=7.5；分别输入T1,T2,T3初始值32、37、37；输入温度的下限值Tlow=30和上限值Tup=40；输入反射系数α=1.3。
(4)．数据输入完毕后,等待计算机输出T1,T2,T3共3个温度变量的优化值及优化后发酵指标Pf的数值，
(5)．改变N值，使N分别为6、12，重复步骤(1)-(4)二次，重新计算出新的N值所对应的优化温度T1,T2,…,T6和T1,T2,…,T12以及优化后发酵指标Pf的数值，
(6)．关闭确定甘油发酵最优化温度的复形调优计算机程序，
(7)．按N值从小到大的顺序，比较N分别按3、6、12计算出的发酵结果，
N 细胞浓度 (108个/毫升) 葡萄糖浓度 (％) 甘油浓度 (％) 磷含量 (微克/毫升) 发酵指标 Pf 3 5.67 6.61 8.77 2.2 8.77 6 6.07 7.50 8.97 1.6 8.97 12 5.90 7.05 8.89 2.3 8.89
可见，N=6和N=12之间Pf的变化幅度小于1％，将发酵过程分为6段进行温度优化，在保证最后残糖消耗在7.5％以下时，便可基本实现甘油产量最大。
以下是分六段优化后的温度分布：时间(h) 0-12.7 12.7-25.3 25.3-38 38-50.7 50.7-63.3 63.3-76温度/℃ 30.8 39.8 39.7 39.6 39.7 39.5
步骤四：
按照上面表中的温度优化结果，并考虑到实验反应器的最高升温速率为9℃/h，将发酵前12.2小时的温度控制在31+0.5℃，随后持续升温约60分钟，使反应器温度接近40℃，最后13.2-76小时的温度控制在39.5±0.5℃，并与35℃的恒温发酵进行比较，所得最后的发酵结果如下：类别细胞浓度(108个/毫升)葡萄糖浓度(%)甘油浓度(%)甘油对全糖转化率(%)初始结束35℃的恒温发酵5.527.657.657.0525.5温度优化6.7428.744.969.8234.2
与35℃的恒温发酵相比，优化温度后甘油产量对全糖转化率提高34％，同时也保持较快的残糖消耗速率。