控制水稻小孢子发育的cDNA片段及其编码产物与应用 【技术领域】
本发明涉及生物技术领域中的一种cDNA片段及其编码产物与应用，特别是涉及控制水稻小孢子发育的cDNA及其编码蛋白与应用。
背景技术
高等生物的繁殖需要经过一个减数分裂的过程以形成配子。杂交系在作物优良品种的选育上尤为重要，作为控制杂交系的手段之一，人们把注意力集中到小孢子上。如果能够人为地控制小孢子的育性，就能够为杂交育种提供一个强有力的手段。
在植物中，调控小孢子育性的基因和调控元件很多，其中，在酵母和人类中发现的SKP1基因能够和细胞周期蛋白A-cdk2复合体共同作用，控制细胞由有丝分裂向减数分裂地过渡[Hoyt，M.A.1997，Cell，91，149-151]。由于减数分裂是一个非常保守的过程，因而人们试图在植物中也找到类似的基因，并在1999年证实双子叶植物拟南芥中的ASK基因家族在对细胞周期的调控中起到了同样的作用[Yang，M.1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96，11416-11421]。但在单子叶植物中还没有类似的报道。
控制生物体内基因表达的方式很多，如基因突变、超表达、反义RNA技术、基因敲除技术等等。最近几年来，科学家们在线虫中首先发现一些小RNA能够对某类基因的表达起到强烈的抑制作用，并进而发现了一些双链RNA能够特异地诱导产生一种能够识别并降解这样的RNA序列的RNase，从而在转录后的水平上强烈地抑制该类基因的表达，由此而派生出了RNA干扰(RNA interference，即RNAi)技术。
当已知某个或某类基因的cDNA序列时，人为地将该cDNA片段与一段能够被预期的宿主细胞识别并切除的内含子序列构建成“cDNA-内含子-cDNA”的结构，并转化进入宿主细胞，宿主细胞内的核酸酶就会将转录出的RNAi结构中的由内含子片段的转录部分切除，形成一段由cDNA转录出的双链RNA的结构，而该双链结构诱导宿主合成RNase[Hutvagner，2001，science，293，834-838]，特异地识别并降解宿主细胞内正常转录的目的基因的mRNA，从而抑制了该基因的表达。
【发明内容】
本发明的目的是提供一个控制水稻小孢子发育的基因的cDNA片段及其编码的多肽。
将此cDNA的基因命名为OSK1，它控制水稻小孢子发育，它是下列核苷酸序列之一：
1)序列表中的SEQ ID №：1；
2)编码序列表中SEQ ID №：2多肽序列的多核苷酸；
3)与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列具有90％以上同源性。
序列表中序列1的DNA序列由466个碱基组成，自5’端第1位碱基到第207位碱基编码69个氨基酸的多肽，208位以后的259个碱基为3’非翻译区。
控制水稻小孢子发育的蛋白OSK1，是包含序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
序列表中序列2氨基酸残基序列是由69个氨基酸残基组成多肽，该多肽存在于OSK1蛋白质中。
含有上述cDNA的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围。
本发明的第二个目的是提供一种用于RNAi技术的新质粒。
一种用于RNAi技术的质粒，是将控制水稻小孢子发育的OSK的cDNA片段以不同的方向分别连到水稻泛素基因内含子的两侧，得到一重组片段，并将该重组片段连接到水稻Ubi启动子下游得到的质粒。
为使转化体便于筛选，所述质粒上含有抗生素筛选标记和/或报告基因。
借助农杆菌侵染及其它常规基因转化方法，可以将Ubi启动子及其下游片段整合在植物染色体上。由于RNA干扰作用使得转化体水稻表现了部分不育甚至完全不育的现象。细胞学观察显示转化体水稻的小孢子发育发生了变异，形成大量不正常的小孢子，甚至不能形成小孢子。本发明将在作物育种，特别是水稻育种中得到广泛应用。
【附图说明】
图1为用于RNAi的质粒图谱。
图2为不同处理的花粉粒。
图3转化体水稻的Northern杂交结果
图4转化体水稻叶片总DNA经SmaI消化后的Southern杂交结果
【具体实施方式】
实施例1、OSK1片段的获得：
1、水稻减数分裂期cDNA文库的构建：
以中花10号水稻为材料，取减数分裂期幼穗(长4-5cm)为材料，进行cDNA文库的构建。文库构建选用CLONTECH公司的SMART cDNA Library Construction Kit(Catalog#：k1051-1)，按照试剂盒说明书进行。该试剂盒最终将双链cDNA插入在载体pTriplEx2之上。
包装反应采用Promega公司的Packagene System(Catalog#K315/1-4)。构建后文库的滴度为0.8-1.4×106pfu/ml。
2、水稻减数分裂期cDNA文库cDNA的PCR扩增
常规步骤提取水稻减数分裂期cDNA文库的cDNA，以引物：
5’引物：5’CGG ATC CA(T/C)ATG(A/G)TNG A(A/G)GA(T/C)GA(T/C)TG
3’引物：5’GTCTAGATC(A/G)AANGCCCA(T/C)TG(G/A)TT(T/C)TC
进行PCR扩增。扩增条件为：98℃×2min→(94℃×1min→64℃×40sec→72℃×80sec)×32循环→72℃×10min，得到特异PCR扩增片段。
3、水稻减数分裂期cDNA文库的噬菌斑原位杂交筛选
取1ul水稻减数分裂期cDNA文库与500ul指示菌XL1-Blue混合，温育20分钟后，与适量顶层琼脂糖(0.65％)混匀，铺于150mm平板上，37℃培养至噬菌斑直径约1mm。把平板置4℃2小时后，移出至室温，取一圆形尼龙膜平铺于顶层琼脂糖表面，使其直接与噬菌斑接触30-60秒后，小心将尼龙膜取下，DNA的一面向上置于装有变性液(0.5mol/L NaOH、1.5mol/L NaCl)的盘子中5分钟，再将尼龙膜置于中和液[1.5mol/L NaCl、0.5mol/L Tris-Cl(pH7.4)]中5分钟，用2×SSC浸泡后，将DNA的一面向上置于纸巾上干燥。每个平皿重复上述转膜一次。待尼龙膜晾干后，80℃烤膜1-2小时后待用。
取一小盘，加入少量2×SSC，将烤好的尼龙膜置其液面上，使液体从下面湿透尼龙膜。浸泡5分钟。将尼龙膜转移到盛有适量预杂交液[5×SSC、0.5％SDS、1mmol/LEDTA(pH8)]的容器内，65℃温育2小时。
以所得PCR片段用32P随机标记后做为探针。100℃加热5分钟变性，迅速冰浴。然后将探针加入到预杂交液中，65℃温育12小时以上。
杂交完成后，弃杂交液，用2×SSC+0.1％SDS或0.2×SSC+0.1％SDS于65℃进行适当程度的洗膜。
-70℃进行X光片曝光。
通过噬菌斑原位杂交，在水稻减数分裂期cDNA文库中筛选到一个克隆，该克隆含有与拟南芥ASK1基因同源的由466个碱基组成的cDNA片段，将此cDNA的基因命名为OSK1，序列为序列表中的序列1，将含有该cDNA片段的质粒命名为pTrOSK。
实施例2、Northern杂交
将各种材料的总RNA分别测定浓度后，取等量的各个样品在1.0％的琼脂糖凝胶上进行电泳至溴酚蓝迁移到凝胶的2/3处，将凝胶转移至一个培养皿内，用灭菌的DEPC水淋洗3-4次，浸泡于数倍体积的20×SSC中，温和摇动45min；
通过毛吸作用转移24小时，使RNA带吸附在尼龙膜上，120℃烤膜30分钟。
将尼龙膜放入杂交管，经65℃预杂交2-3hr后，加入经纯化、变性的32P-标记的OSK1探针，65℃杂交过夜(17小时以上)，倒出杂交液，用2×SSC+0.1％SDS和1×SSC+0.1％SDS，65℃，各洗膜10min；
用保鲜膜包裹尼龙膜后，用X-光胶片进行放射自显影；-80℃曝光3-7天后，按常规洗片，显示杂交带的位置。结果如图3所示，图中ss：种子苗；ml：减数分裂时期叶片；pl：减数分裂后叶片；t：转化体叶片，由图3可见，转化体除了和对照都在约600bp的相同位置出现了相似的杂交条带外，它还有一条较大的额外杂交条带。这额外的的信号可以认为是RNAi结构的组成型转录产物。
实施例3、基于OSK1 cDNA片段的RNAi结构的构建
将长度为618bp的水稻泛素基因内含子片段，连接到质粒pTrOSK的EcoRI+SmaI切口处得到质粒p1。
自p1用RsaI+XhoI切下反向连接的OSK-Ubi内含子片段并插入到质粒pBluescriptII KS的EcoRV+XhoI处得到p2。
自p2的EcoRI+KpnI处切下反向连接的OSK+Ubi内含子片段并连接到pTrOSK的EcoRI+KpnI位点处，得到p3。
用KpnI+SacI自p3切下RNAi结构连接到质粒pUN1301的相同酶切位点处，得到RNAi的表达载体pUNOSK，其结构图谱如图1所示。在pUNOSK中，以启动子驱动随后的RNAi结构的转录。
实施例4、pUNOSK对水稻的转化及阳性苗GUS染色
把pUNOSK转入到农杆菌EHA105中后，再用来侵染水稻中花10号的愈伤组织，经共培养感染、抗性培养基筛选及分化培养基上分化得到抗性苗。
取分化出的幼苗切段，于GUS染色液(100mmol/L NaPO4 pH7.0，0.1％Triton X-100，10mmol/LEDTA，0.5mmol/L亚铁氰化钾，0.5mmol/L铁氰化钾，X-Gluc1mg/mL)中，抽气几分钟，然后置于37℃温育过夜，观察蓝色反应。进一步确定阳性转化体。结果表明，外源基因已整合到了抗性苗的基因组中。
实施例5、转化体Southern鉴定
提取转化体的总DNA，用SmaI酶切、电泳后将凝胶置于数倍体积的变性液(1.5MNaCl-0.5M NaOH)中浸泡45min，温和摇动，使DNA变性；
用去离子水对凝胶稍事漂洗后，浸泡于数倍体积的中和液中(1.5M NaCl-1.0MpH7.5 Tris-HCl)，温和摇动；更换中和液，继续浸泡15min；通过毛细作用使DNA转移至尼龙膜。
转移结束后，将尼龙膜用6×SSC漂洗5min；将尼龙膜放在滤纸上晾干，120℃烘烤30min。
将尼龙膜放入杂交管，加入适量预杂交液(15ml 20×SSC，5ml 50×denhardt，2.5ml 10％SDS，0.5ml 10mg/ml鲑精DNA，27ml ddH2O)，65℃预杂交2-3hr；
预杂交结束后，倒出预杂交液，加入适量杂交液(15ml 20×SSC，2.5ml 10％SDS，0.5ml10mg/ml鲑精DNA，32ml ddH2O)和纯化变性好的探针(以随机延伸法对OSK1片段进行32P放射性标记)，65℃杂交过夜；
倒出杂交液，用2×SSC+0.1％SDS和1×SSC+0.1％SDS，65℃，各洗膜10min。
用保鲜膜包裹尼龙膜后，用X-光胶片进行放射自显影；-80℃曝光3-7天后，按常规洗片。结果表明从对转化体的Southern杂交结果可以看出，基于OSK1 cDNA片段的RNAi结构插入到了转化体中(SmaI能够自RNAi结构中切下约700bp的条带)。而且，强、弱转化体中插入片段的拷贝数可能相同，结果如图4所示，图中a.MW markers；b.对照；c.强转化体；d.弱转化体。
实施例6、转化体小孢子观察
取转化体的成熟花药放到清洁的载玻片上，加上一滴醋酸洋红溶液，将花药轻轻捣碎，用镊子去除大的碎片后，盖上盖玻片再用拇指均匀压片。显微镜下观察，结果如图2所示，图中：a.正常花粉粒；b.转化体花粉粒；c.转化体花粉粒，示大小差别。从图中可以明显看出转化体的小孢子发育异常。
序列表
<160>2
<210>1
<211>466
<212>DNA
<213>稻属水稻(Oryza sativa L.)
<400>1
aaggtcgacc aggccaccct cttcgacctc atcctggccg cgaactacct caacatcaag 60
gggttgctgg accttacttg ccagactgtt gctgacatga tcaaggggaa gactcctgag 120
gagatccgca agaccttcaa catcaagaac gacttcaccc ctgaggagga agaggagacc 180
cgcagggaga accagtgggc ttttgagtag aaggcatcaa ggcctctgat gtcttggtgc 240
ttagatcctt actccgtatc tacgtatgct ctgcttttat atgtcgtgct ggttgtaagt 300
attttggagt ccgatggggg ttcatgtgca cgtttagttg gttaaatggt taagttctat 360
ccaggaaaaa aagaactgat gtggtcagaa ctactgaacc tgttatctgc attaattaat 420
actatcaatc tgcagtaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 466
<210>2
<211>69
<212>PRT
<213>稻属水稻(Oryza sativa L.)
<400>2
Lys Val Asp Gln Ala Thr Leu Phe Asp Leu Ile Leu Ala Ala Asn
1 5 10 15
Tyr Leu Asn Ile Lys Gly Leu Leu Asp Leu Thr Cys Gln Thr Val
20 25 30
Ala Asp Met Ile Lys Gly Lys Thr Pro Glu Glu Ile Arg Lys Thr
35 40 45
Phe Asn Ile Lys Asn Asp Phe Thr Pro Glu Glu Glu Glu Glu Thr
50 55 60
Arg Arg Glu Asn Gln Trp Ala Phe Glu
65 69