乌索烷型三萜皂苷在制备升高白细胞和/或血小板药物中的应用 技术领域：
本发明涉及一种化合物的新用途，具体地说，本发明涉及乌索烷型三萜皂苷化合物在制备预防或治疗人白细胞减少和(或)血小板减少的药物中的用途。
背景技术：
人体白细胞减少症是临床常见病和多发病，一般情况下，慢性白细胞减少症并无特殊症状，但有的患者可出现轻度疲倦乏力、头晕、低热、口腔易患溃疡等。白细胞减少严重时可发生各种感染，如呼吸道感染、支气管炎、肺炎、中耳炎及泌尿系统感染等。引起白细胞减少的因素较多，常见的包括以下几方面：其一，各种治疗药物引起的白细胞减少，如肿瘤化疗药物、解热镇痛药、磺胺药、抗甲状腺药、抗过敏药均有可能导致人体白细胞减少；其二，各种物理因素(多种放射线)和其他化学因素(苯、二甲苯、二硝基苯等有机溶剂)均可引起白细胞减少；其三，多种疾病引起的白细胞减少，如再生障碍性贫血、急性白血病、严重的缺铁性贫血、家族性白细胞减少症、慢性原发性白细胞减少症、肝硬化、血吸虫病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、过敏性疾病等等，此外，各种感染(细菌、病毒、原虫感染)也常引起白细胞减少。在引起白细胞减少的诸多因素中，肿瘤放、化疗所导致白细胞减少临床最为多见，因为，以放疗、化疗为主的药物综合治疗仍然是目前肿瘤治疗的主要手段和方法，而放疗、化疗自身存在难以克服的毒副作用，即对骨髓造血功能的抑制作用，表现为外周血白细胞及血小板的明显降低。
目前针对各类白细胞减少症主要采用药物治疗，包括多种中药制剂，如人参、当归、黄芪、阿胶、白术、补骨脂、刺五加枸杞子等组成的单味及复方制剂[中国中医药信息杂志.2001，8(5)：18]；西药制剂，如鲨肝醇、白血生、利血生、肌苷、维生素B4(新编药物学.人民卫生出版社.14版，402)，但上述中、西药物的临床疗效都较为有限。近年来，新的生物制剂如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)开始应用于临床，其升白作用显著，但价格昂贵。目前针对肿瘤放、化疗所致地白细胞减少症，以及其他原因引起的白细胞减少症，临床仍然缺乏疗效显著、价格低廉、使用方便的治疗药物。
乌索烷型三萜皂苷化合物存在于某些天然植物中，并可从这些天然植物中分离获得。日本Hidaka等人报道从毛冬青中分离的多种乌索烷型三萜皂苷及其衍生物具有治疗冠心病活性；日本Amimoto等人报道，从苦丁茶中分离的多种乌索烷型三萜皂苷及其衍生物具有抗病毒活性[chem.pharm.bull.1992，40(12)：3138-41]；日本Mimaki Y等人报道，从地榆根中分离得到的多种乌索烷型三萜皂苷具有细胞毒活性，即能够抑制HSC-2(人口底癌)细胞和HGF(杂交瘤生长因子)[phytochemistry.2001，57(5)：773-779]。但迄今为止尚未见有关乌索烷型三萜皂苷化合物及其衍生物具有升高人体白细胞和血小板活性有关文献记载或研究报道。
发明内容：
本发明目的是提供一种乌索烷型三萜皂苷化合物在制备升高人白细胞和(或)血小板的药物中的新用途。
本发明还提供一种具有升高人白细胞和(或)血小板活性的药物组合物。
本发明的技术方案：通式为(I)的乌索烷型三萜皂苷化合物在制备升高人白细胞和/或血小板的药物中的用途。
其中：R1为H，OH；R2为H，D-葡萄糖，D-半乳糖，L-阿拉伯糖，L-鼠李糖，D-木糖，D-葡萄糖醛酸，L-半乳糖醛酸，D-木糖-D-葡萄糖，乙酰-L-阿拉伯糖；R3为OH，R4为CH3，或R3、R4同时为＝CH2；R5为H，D-葡萄糖。
优选的，当R1是H，R2是α-L-阿拉伯糖，R3为OH，R4是CH3，R5是β-D-葡萄糖，所述通式为(I)的化合物，即为3β-[O-(α-L-阿拉伯糖)]-19α-羟基乌索-12-烯-28-羧酸-28-β-D-葡萄糖基酯(ziyuglycoside I，以下简称为化合物A)。
当R1、R5是H，R2是α-O-L-阿拉伯糖，R3是OH，R4是CH3，所述通式为(I)的化合物，即为3β-[O-(α-L-阿拉伯糖)]-19α-羟基乌索-12-烯-28-羧酸(ziyu-glycoside II，以下简称为化合物B)。
当R1、R2是H，R3为OH，R4是CH3，R5是β-D-葡萄糖，所述通式为(I)的化合物，即为3β，19α-二羟基乌索-12烯-28-羧酸-28-O-β-D-葡萄糖酯(以下简称为化合物C)。
当R1、R2、R5是H，R3为OH，R4是CH3，所述通式为(I)的化合物，即为3β，19α-二羟基乌索-12-烯-28-羧酸(以下简称为化合物D)。
当R1是H，R2是α-L-阿拉伯糖，R3、R4同时为＝CH2(意思为＝CH2是由R3、R4的羟基和甲基脱一分子水而成)，R5是β-D-葡萄糖，所述通式为(I)的化合物，即为3β[O-(α-L-阿拉伯糖)]乌索-12，19(29)-二烯-28-羧酸-28-O-β-D-葡萄糖酯(以下简称为化合物E)。
当R1、R3是OH，R2是H，R4是CH3，R5是β-D-葡萄糖，所述通式为(I)的化合物，即为2α，3α，19α-三羟基乌索-12-烯-28-羧酸-28-β-D-葡萄糖酯(以下简称为化合物F)。
当R1是H，R2是α-乙酰-L-阿拉伯糖，R3是OH，R4是CH3，R5是β-D-葡萄糖时，即为3β[O-(4-α-乙酰-L-阿拉伯糖)]-19α-羟基乌索-12-烯-28-羧酸-28-β-D-葡萄糖酯(Cornutaside乙，以下简称化合物G)。
当R1是H，R2是D-木糖2β-D-葡萄糖，R3是OH，R4是CH3，R5是β-D-葡萄糖时，即为3β[O-(β-D-木糖2β-D-葡萄糖基)--19α-羟基乌索-12-烯-28-羧酸-28-β-D-葡萄糖酯(ilexsaponins B3)(以下简称化合物H)。
化合物A、B、C、D、E、F、G、H参见下表：
R1 R2 R3 R4 R5
化合物A H α-L-Ara OH CH3 β-D-Glc
化合物B H α-L-Ara OH CH3 H
化合物C H H OH CH3 β-D-Glc
化合物D H H OH CH3 H
化合物E H α-L-Ara ＝CH2 β-D-Glc
化合物F OH H OH CH3 -D-Glc
化合物G H AC-α-L--Ara OH CH3 β-D-Glc
化合物H H β-D-Xyl_2β-D-Glc OH CH3 β-D-Glc
化合物A、B、C、D、E、G、H的结构为通式(II)，化合物F的结构为通式(III)。
本发明还提供一种具有升高人白细胞和/或血小板作用的药物组合物，其含有活性成分为上述乌索烷型三萜皂苷化合物的任意一种或几种，或其药学上可接受的盐。
进一步地，所述的药物组合物，是由上述乌索烷型三萜皂苷化合物的任意一种或几种，或其药学上可接受的盐为活性成份，加上药学上可接受的辅料或载体组成。
所述药物组合物的剂型为口服剂型或注射剂。
通式为(I)的乌索烷型三萜皂苷化合物，由于其结构中含有羧基，可以容易的与酸或碱成盐，采用化学领域的常规技术，能够将其制备成为该类化合物的各种药学上可接受的盐，如其各种金属离子(钠、钾、钙)盐、铵盐等等，但在通常情况下对药效不会有太大改变，一般成盐后，可增大溶解度，可以根据不同的制剂方式，或产品稳定性，或工艺的方便程度决定是否成盐。
用通式为(I)的乌索烷型三萜皂苷化合物针对白细胞减少症进行动物试验，结果表明通式为(I)的乌索烷型三萜皂苷化合物具有显著升高白细胞和血小板活性，可用于制备预防和治疗人白细胞和(或)血小板减少症的药物。
以上通式为(I)的乌索烷型三萜皂苷化合物及上述优选的化合物A、B、C、D、E、F、G、H，可以从天然植物地榆[Sanguisorba officinalisL]，长叶地榆Longifilia(Bettol.)Yü.et Li)，高山地榆[Sanguisorba alpinaBeg.]，冬青科植物枸骨(Ilex cornnta Lindl.)(苦丁茶)叶、毛冬青(Ilexpubescens Hook.et.Am.)，华车蓝刺头(Echinops grijisii)根、通泉草(mazus miqueli)，Ilex crenata等中任意一种或几种中分离获得；也可以通过化学方法合成获得。具体化学提取分离方法可按文献方法进行[The structures of glycosides and aglycone of SanguisorbaeRadix，Chem.Pharm.Bull.1971，19(8)：1700-1707；Triterpene glycosidesfrom the roots of Sanguisorba Officinals，Phytochemistry.2001，57(5)，773-779；地榆中皂苷类化合物分离、鉴定及其含量测定.中草药，2003，34(5)：397-399]。因此为实际治疗过程提供了多种可能的药效物质来源，可以使用含有上述乌索烷型三萜皂苷化合物的任意一种或任意几种的混合物，或使用大量含有此类化合物的植物有效部位或粗提物，或使用含有上述乌索烷型三萜皂苷化合物的任意一种或任意几种盐的混合物。
通式为(I)的乌索烷型三萜皂苷化合物的任意一种或任意几种混合物，或其药学上可接受的盐，加上药学上可接受的辅料或载体，可以制备成为多种口服制剂或注射剂型，即可制成片剂、胶囊、颗粒剂、丸剂、口服液、注射液等多种剂型。在制备方法上，可以将乌索烷型三萜皂苷化合物活性成分与淀粉、乳糖、葡萄糖、蔗糖、糊精、纤维素类、琼脂、硬脂酸镁、滑石、阿拉伯橡胶、明胶、水、植物油等制备成为适当的剂型。本发明中发现，乌索烷型三萜皂苷化合物的使用有效剂量极低，达到微克级，依患者的年龄、体重而定，通常按成人计算，其临床用量范围为1ug～500ug/kg/日/人，优选的临床用量为10ug～100ug/kg/日/人，临床应用极为有效和方便。
按照本发明，还可以将乌索烷型三萜皂苷化合物与其他化学药物和/或其他中药提取物共同组成中药、西药或中西复方制剂，并按照常规方法制成片剂、胶囊、口服液、注射液等多种剂型。
有益效果：由于乌索烷型三萜皂苷化合物具有良好的升高白细胞和血小板作用，可将其制成片剂、胶囊等多种剂型，适用于多种原因所致的白细胞和/或血小板减少症，尤其是肿瘤放、化疗引起白细胞减少症，以及药物所致白细胞减少症的治疗，具有疗效显著、使用剂量微小，价格低廉、使用方便等优势特点。
【具体实施方式】
下面通过实施例形式的具体实施方式对本发明作进一步说明。
实施例1：乌索烷型三萜皂苷化合物A、B、C的提取分离和结构确认
提取与分离：地榆药材购自成都市中药材公司，经鉴定为Sanguisorba officinalis L.。取地榆药材20kg，切片，用8倍量70％乙醇提取2次，每次1小时，滤过，回收乙醇，加水至0.3g生药/ml，冷藏12小时，取上清液通过大孔吸附树脂。先用水洗至Molish反应呈阴性，再用70％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，并浓缩得浓浸膏。浓浸膏加入25L热水充分搅拌，抽滤出沉淀(约4kg，TLC检测主要为鞣质)。滤液分别用等体积乙酸乙酯和正丁醇各萃取三次，然后减压浓缩蒸干，得乙酸乙酯浸膏300g，正丁醇浸膏320g。将所得乙酸乙酯浸膏用硅胶柱分离，用石油醚∶丙酮＝20∶1～2∶1梯度洗脱得19个组分，将第16组分在甲醇中静置，得固体物；将固体物再用硅胶柱分离，石油醚∶丙酮＝5∶1洗脱，在第34～36分钟析出白色碎晶体，即得化合物B 20mg；将所得正丁醇浸膏，用硅胶柱分离，初始洗脱剂采用氯仿∶甲醇＝10∶1，之后再用6∶1、4∶1、2∶1等梯度洗脱。在梯度为4∶1时有固体析出，反复用甲醇溶解之后析出，最后得到白色粉末852mg，即化合物A；将所得正丁醇浸膏，用RP-18柱分离，开始采用甲醇和水(40％甲醇)洗脱剂，之后分别用50％、70％、90％、100％甲醇洗脱，在70％甲醇段有混合固体出现，然后将其用Sephadex LH-20分离，得到38mg化合物C。
结构确认：测定得到的化合物A、B、C的碳谱和氢谱数据，与文献研究报道的一致(Dong-Liang Cheng、Xiao-Ping Cao，Pomolicacid derivatives from the root of Sanguisorba officinalis，Phytochemistry，1992，31(4)：1317-1320)，即：化合物A为3β-[O-(α-L-阿拉伯糖)]-19α-羟基乌索-12-烯-28-羧酸-28-β-D-葡萄糖酯(ziyu-glycoside I)；化合物B为3β-[O-(α-L-阿拉伯糖)]-19α-羟基乌索-12-烯-28-羧酸(ziyu-glycoside II)；化合物C为3β，19α-二羟基乌索-12-烯-28-羧酸-28-β-D-葡萄糖酯。化合物A、B、C的1H NMR和13C NMR数据见下表I。
表I化合物A、B、C的1H NMR和13C NMR数据(in pyridine-d5，ppm) C 化合物B[6] 化合物C[6] 化合物A[6] 1H NMR 13C NMR 1H NMR 13C NMR 1H NMR 13C NMR 1 38.9t 39.1t 38.9t 2 26.8t 28.2t 26.7t 3 3.3dd(4.1，4.3) 88.9d 3.4，m 1H 79.3d 88.7d 4 39.7s 39.4s 39.5s 5 56.0d 55.9d 55.9d 6 18.7t 19.0t 18.7t 7 33.6t 33.6t 33.5t 8 40.5s 40.6s 40.5s 9 47.8d 47.8d 47.7d 10 37.1s 37.4s 36.9s 11 24.1t 24.1t 24.0t 12 5.6，br 1H 128.1d 128.5d 128.4d 13 140.1s 139.3s 139.2s 14 42.2s 42.1s 42.1s 15 29.4t 29.3t 29.2t 16 26.5t 26.2t 26.1t 17 48.4s 48.7s 48.6s 18 3.0，s 1H 54.7d 2.9，s 54.5d 2.9，s 54.4d 19 72.8s 72.7s 72.6s 20 42.5d 42.1d 42.1d 21 27.1t 26.7t 26.1t 22 38.5t 37.7t 37.7t 23 28.4q 28.8q 28.2q 24 17.3q 17.5q 17.4q 25 15.6q 15.7q 15.6q 26 17.0q 16.7q 16.9q 27 24.8q 24.6q 24.6q 28 180.8s 177.0s 176.9s 29 1.7，s 27.3q 1.7，s 27.0q 1.7，s 27.0q 30 1.1，d(6.5) 16.9q 1.1，d(6.2) 16.5q 1.1，d(6.5) 16.7q 3-Ara-1 4.8，d(7.0) 107.6d 4.8，d(6.8) 107.5d 2 4.4，m 73.0d 72.9d 3 4.2，dd(3.1，3.2) 74.8d 74.6d 4 4.3，m 69.6d 69.5d 5 3.8，m 66.9t 66.7t 28-Glc-1 6.3，d(8.1) 95.9d 6.3，d(8.1) 95.8d 2 74.1d 74.1d 3 79.0d 78.9d 4 71.3d 71.2d 5 78.3d 4.1，m 79.2d 6 62.4t 62.3t
实施例2：乌索烷型三萜皂苷化合物A、B、C、D、E、F、G、H
对环磷酰胺致小鼠白细胞和血小板减少的治疗作用
材料与方法
受试药：化合物A、B、C三样品均为灰白色粉末或碎晶体，按实施例1方法制备，也可参照文献分离鉴定和制备[Triterpene glycosides from the rootsSanguisorba officindis，Phytochenistry，57(5)，773-779，2001]；化合物D、E、F参照文献[Triterpene glycosides from the roots Sanguisorbaofficindis，Phytochenistry，57(5)，773-779，2001]方法分离鉴定和制备。化合物G参照文献[phytochemi stry，26(7)，2023，1987；Chen.pharm.Bull.35(2)，524，1987]方法分离鉴定和制备。化合物H参照文献[phytochemistry，21(6)，1373，1982]方法分离鉴定和制备。
试剂：注射用环磷酰胺(cy)，上海华联制药有限公司生产，批号：021106，规格200mg/瓶，5瓶/盒。溶血素，济南希森美康医用电子有限公司提供，批号：G2003，规格6ml/瓶。稀释液，济南希森美康医用电子有限公司提供，批号：G1147，规格20L/盒。
动物：昆明种小鼠，雌雄各半，体重18～22g
仪器：Sysmex F-820半自动血液分析仪。
方法：因受试样品较多，实验分两批次进行。小鼠按体重随机分组：受试组，即化合物A、B、C、D、E、F、G、H各剂量组，模型对照组，空白对照组。各受试组及空白对照组分别灌服相应药物及蒸馏水，连续8天；除空白对照组外，其余各组均腹腔注射环磷酰胺100mg/kg，连续3天，末次注射Cy后第三天和第六天，眼眶静脉丛取血，测定各鼠WBC及血小板值。
结果
实验结果见下表1、表2、表3和表4：
表1化合物A、B、C、D对环磷酰胺所致小鼠WBC(白细胞)下降的影响( x±s)
药物 剂量(mg/kg) 样本量(n) 第三天 WBC 计数 第六天 WBC 计数
(109/L) (109/L)
化合物A 0.48 10 1.14±0.39 8.23±4.26**
化合物A 0.24 10 1.38±0.61* 9.35±3.161**
化合物A 0.12 9 1.33±0.45* 11.74±4.47**
化合物B 0.48 10 1.60±0.89* 7.11±4.25**
化合物B 0.24 9 1.73±0.85* 7.27±2.82**
化合物B 0.12 10 1.79±1.04* 7.73±4.73**
化合物C 0.48 9 1.61±0.90* 6.90±2.49**
化合物C 0.24 9 1.47±0.64* 8.45±3.01**
化合物C 0.12 9 1.04±0.49 6.52±2.31**
化合物D 0.48 9 1.41±0.98 7.34±4.56*
化合物D 0.24 10 1.37±0.51* 7.95±2.80**
化合物D 0.12 9 1.12±0.62 6.38±2.11**
模型组 —— 10 0.92±0.31▲▲ 3.15±0.77▲▲
对照组 —— 9 7.51±2.03 9.43±3.86
表2化合物E、F、G、H对环磷酰胺所致小鼠WBC(白细胞)下降的影响( x±s)
药物 剂量(mg/kg) 样本量(n) 第三天 WBC 计数 第六天 WBC 计数
(109/L) (109/L)
化合物E 0.24 11 1.99±1.19* 4.13±2.32*
化合物E 0.12 10 1.13±0.48 5.58±3.42**
化合物F 0.24 11 1.30±0.38 4.96±2.84**
化合物F 0.12 10 1.35±0.47 4.11±2.25*
化合物G 0.24 10 1.86±0.85* 4.27±1.90**
化合物G 0.12 9 1.29±0.34 3.56±1.56
化合物H 0.24 10 1.41±0.98 5.64±2.38**
化合物H 0.12 10 1.97±0.64* 4.36±2.01*
模型组 —— 11 1.19±0.40▲▲ 2.60±0.56▲▲
对照组 —— 10 8.31±1.92 8.63±2.82
与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与对照组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01
表3化合物A、B、C、D对环磷酰胺所致小鼠PLT(血小板)下降的影响( x±s)
药物 剂量(mg/kg) 样本量(n) 第三天 PLT 计数 第六天 PLT 计数
(109/L) (109/L)
化合物A 0.48 10 361.2±173.0 357.6±202.8*
化合物A 0.24 10 282.2±105.5 345.9±211.0*
化合物A 0.12 9 218.8±147.4 309.4±271.2
化合物B 0.48 10 271.8±130.2 231.8±177.3
化合物B 0.24 9 303.3±119.8 200.9±117.4
化合物B 0.12 10 372.0±89.9* 379.6±283.3**
化合物C 0.48 9 251.2±148.7 321.8±154.9*
化合物C 0.24 9 286.2±101.3 323.6±101.6*
化合物C 0.12 9 266.2±113.3 250.8±233.1
化合物D 0.48 9 295.3±123.5 328.9±103.6*
化合物D 0.24 10 306.8±114.3 339.7±196.3*
化合物D 0.12 9 269.5±143.5 230.4±179.6
模型组 —— 10 235.5±133.5▲▲ 160.0±108.3▲▲
对照组 —— 9 732.1±119.1 635.3±84.2
表4化合物E、F、G、H对环磷酰胺所致小鼠PLT(血小板)下降的影响( x±s)
药物 剂量(mg/kg) 样本量(n) 第三天 PLT 计数 第六天 PLT 计数
(109/L) (109/L)
化合物E 0.24 11 259.8±134.8 396.3±199.2*
化合物E 0.12 10 269.6±201.5 223.7±112.5
化合物F 0.24 11 249.8±111.5 209.4±169.4
化合物F 0.12 10 277.8±180.3 379.2±108.1*
化合物G 0.24 10 268.6±136.2 388.5±158.2*
化合物G 0.12 9 312.5±109.5 218.6±201.5
化合物H 0.24 10 289.8±203.1 356.2±196.8*
化合物H 0.12 10 251.9±154.6 212.6±185.3
模型组 —— 11 254.2±186.7▲▲ 196.5±123.1▲▲
对照组 —— 10 898.3±114.5 756.3±136.5
与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与对照组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01
从表1、表2中结果可以看出，各组样品连续灌胃给药8天，于小鼠腹腔注射环磷酰胺后第三天及第六天，各组小鼠WBC均极显著的降低，对环磷酰胺所致小鼠白细胞减少症模型，模型组与对照组比较有极显著性差异，证明该模型造模成功，化合物A、B、C、D、E、F、G、H于注射注射环磷酰胺后第三天及第六天有显著的升高白细胞的作用(P＜0.05或P＜0.01)。以上结果显示化合物A、B、C、D、E、F、G、H均具有确切的显著升高白细胞数的作用，能明显减轻环磷酰胺对机体血液系统及免疫系统的损伤，起到保护机体的作用。
从表3、表4可以看出，各组样品连续灌胃给药8天，于小鼠腹腔注射环磷酰胺后第三天及第六天，各组小鼠PLT均极显著的降低，模型组与对照组比较有极显著性差异，化合物A、B、C、D、E、F、G、H于注射注射环磷酰胺后第六天有显著的升高血小板的作用(P＜0.05)，而化合物B于注射注射环磷酰胺后第三天亦有显著的升高血小板的作用(P＜0.01)。本次实验结果显示化合物A、B、C、D、E、F、G、H均在升高白细胞的同时，尚具有显著升高血小板数的作用，能明显减轻环磷酰胺对机体血液系统及免疫系统的损伤，起到保护机体的作用。
以上实施例是对本发明的以举例方式作出的具体说明，并不限制本发明，本领域普通技术人员还可根据本发明的基本技术思想作出各种修改、替换和变形，但均落入本发明的保护范围之内。